Summary
ここでは、エシェリヒア大腸菌またはニコチアナ・ベンタミアナにおける生合成酵素の組み合わせ発現を通じて、ジテルペノイド代謝物を製造および精製するためのプロトコルを簡単に提示し、クロマトグラフィー製品を提供します。浄化。得られた代謝産物は、分子構造特性解析、酵素機能研究、生理活性アッセイを含む様々な研究に適しています。
Abstract
ジテルペノイドは、生命の王国全体に広く分布し、発達過程、組織間相互作用、および環境適応に重要な生物学的機能を有する、多様なクラスの低分子天然物を形成する。これらの様々な生物活動により、多くのジテルペノイドは医薬品、食品添加物、バイオ燃料、その他のバイオ製品として経済的に重要です。高度なゲノムと生化学的アプローチにより、ジテルペノイド代謝遺伝子、酵素、経路に関する知識が急速に増加しています。しかし、ジテルペノイドの構造的な複雑さと、多くの場合、単一の種における個々の化合物の狭い分類分布は、その効率的な生産のための制約要因のままである。代謝酵素のより広い範囲の利用可能性は今、この重要な代謝産物基のより深い調査を容易にするために十分な力価と純度でジテルペノイドを生産するためのリソースを提供します。微生物および植物ベースの酵素共発現のための確立されたツールに基づいて、我々は、エシェリヒア大腸菌またはニコチアナベンタミアナのいずれかでジテルペノイドの酵素生産のための容易に操作され、カスタマイズ可能なプロトコルを提示し、シリカクロマトグラフィーおよび半準備HPLCを介した所望の製品の精製。トウモロコシ(Zea mays)ドラボレキシンジテルペノイドの群を例にとり、ジテルペン合成酵素(diTPS)とシトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450)酵素のモジュラー組み合わせが異なるジテルペノイド足場を生成するためにどのように使用できるかを強調する。精製化合物は、代謝物構造解析、酵素構造機能研究、インビトロおよびプランタ生体活性実験など、さまざまな下流アプリケーションで使用できます。
Introduction
ジテルペノイドは、多くの生物1で重要な役割を果たす12,000以上の主に多環性20炭素天然物の化学的に多様なグループを含む。真菌および植物はジテルペノイドの最大の多様性を産生するが、細菌はまた、生理活性ジテルペノイドを形成することが示されている(レビュー2、3、4、5を参照)。その広大な構造多様性に根ざし、ジテルペノイドは、生物学的機能の多くを果たしています。ジバレリン成長ホルモンのようないくつかのジテルペノイドは、発達過程に不可欠な機能を持っています 5.しかし、ジテルペノイドの大半は、化学的防御と組織間相互作用のメディエーターとして機能します。これらの中で、トウモロコシ(Zea mays)や米(オリザサティバ)などの主要な食品作物における抗菌性ジテルペノイドの害虫および病原体防御におけるジテルペン樹脂酸は、最も広範囲に及んでいる。勉強6,7.これらの生物活動は、商業用途のための豊富な化学貯蔵所を提供し、選択されたジテルペノイドは、現代の生活の重要な医薬品、食品添加物、接着剤、および他のバイオ製品として使用されています8,9 、10.ジテルペノイドの自然多様性と生物学的機能に関する研究を進め、最終的にはより広範な商用アプリケーションを促進するためには、純粋な化合物の費用対効果の高い調製のためのツールが必要とされています。植物材料からの大規模な分離は、パルプおよび製紙産業8の副産物として製造されるジテルペン樹脂酸などのいくつかのジテルペノイドバイオ製品のために確立されている。しかしながら、特定の組織のみおよび環境刺激による厳しい規制下でのジテルペノイドの蓄積は、多くの場合、天然生産者2からの十分な製品量の分離を制限する。さらに、ジテルペノイドの構造的な複雑さは、化学合成を通じてその生産を妨げるが、そのようなアプローチはいくつかのケースで成功しているが、11、12。高度なゲノムおよび生化学的技術の利用可能性により、酵素生産プラットフォームは、ジテルペノイド化合物の範囲を生産するための注目を集めています(レビュー13,14を参照してください, 15,16,17,18)
ジテルペノイドを含む全テルペノイドは、2つの異性異性イソポ価前駆体、イソペニルジリン酸イソフォニルジリン酸イソ開天体ジリン酸(IPP)およびジメチリンジリン酸ジリン酸ジメチルジリン酸ジリン酸ジメチル(DMAPP)19に由来し、メバロネード(MVA)またはを介して形成される。メチルリトリトール-5-リン酸(MEP)経路。テルペノイド生合成は、細菌中のMEP経路および真菌中のMVA経路を通って進行し、植物は細胞系MVAおよび形成性MEP経路を有し、後者はジテルペノイド形成20に向かう主要な経路である。プレニルトランスフェラーゼによるIPPおよびDMAPPの凝縮は、全てのジテルペノイドに対する中心20炭素前駆体をもたらし、ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)20を得る。GGPP形成の下流には、2つの酵素ファミリー、テルペンシンタゼス(TPpS)およびシトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450s)がテルペノイド代謝の広大な化学多様性の形成を大きく制御する21,22。ジターペン合成酵素(diTPSs)は、コミットされた炭水化物駆動の循環とGGPPの再配置を触媒し、様々な立体特異的二重、ポリ、またはマクロ環状ジターペン足場1、3、23を形成する。 24.これらの足場の酸素化およびさらなる機能的装飾は、P450酵素によって促進され、他の酵素ファミリー22、25を選択する。TPSとP450sは、一般的にモジュラー生合成ネットワークを形成することができる種特異的なマルチ遺伝子ファミリーとして存在し、共通の青写真に沿って異なる酵素モジュールを組み合わせることで、化合物2の広い範囲の形成を可能にします。26. 近年のモジュラーテルペノイド経路で動作する機能的に異なる酵素の急速な発見は、部分的または完全な経路の代謝工学のための汎用性の高い部品リストとしての使用の機会を拡大しています。微生物および植物ベースの生産プラットフォームの両方。例えば、酵母(サッカロマイセスセレビシエ)は、抗マラリア薬アルテミシニン27、セキテルペノイドバイオ燃料などのテルペノイド生体製品の製造のための多酵素経路の設計に成功している。ビサボレンおよびファルネセン28が、ジテルペノイド29、30、31も選択する。同様に、工業規模の製造のための設計されたエシェリヒア大腸菌プラットフォームは、抗癌薬として使用されるタキソール前駆体タキサジエン、ジテルペンアルコール、スクラノールを含むいくつかのジテルペノイド代謝物のために確立されています。、香料業界で使用される 13,32,33,34.遺伝子工学と変換技術の進歩はまた、植物天然物9、14、35、36を生産するための植物ホストシステムをますます実行可能にしました。特に、近いタバコの相対的なニコチアナ・ベンタミアナは、アグロバクテリウム-複数の遺伝子組み合わせの媒介変換の容易さのために、テルペノイド経路解析および工学のために広く使用されているシャーシとなっています。、内因性前駆体の効率的な生合成、および高バイオマス14、35、36。
テルペノイド生合成のためのこれらの確立されたプラットフォームに基づいて、我々は、ジテルペノイドの酵素生産と単一化合物の精製のための使いやすく、コスト効率の高い方法をここで説明する。提示されたプロトコルは、増強されたジテルペノイド前駆体生合成のために設計された大腸菌およびN.ベンタミアナプラットフォームが、異なるdiTPSおよびP450酵素の組み合わせ発現にどのように利用できるかを示している。所望のジテルペノイド化合物。構造的に異なるジテルペノイドを産生および精製するためのこのプロトコルの適用は、トウモロコシ(Zea mays)、ドラブレキシンと呼ぶ、2つのdiTPSと1つのP450を新生する内因性生合成の例によって示されている。酵素。オレフィンから酸素化誘導体に至るまでの異なるドラブレレキシンの精製は、分離漏斗抽出を大規模なシリカカラムクロマトグラフィーと、準備高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)と組み合わせることによって達成される。記載されたプロトコルは、ジテルペノイドの生産のために最適化されていますが、関連するテルペノイドクラス、ならびに酵素資源が利用可能な他の天然物に容易に適合することができます。このアプローチを用いて製造された化合物は、核磁気共鳴(NMR)解析による構造特性解析、酵素機能研究の基板としての使用、および広範囲を含むがこれらに限定されない様々な下流用途に適している。生能アッセイ。
Protocol
注意:ここに記載されているプロトコルには、有害化学物質、鋭利な物体、電気機器、ホットオブジェクト、および怪我を引き起こす可能性のあるその他の危険物の使用が含まれます。適切な個人用保護具を着用し、安全訓練を含む適切な安全手順に従う必要があります。
1. 材料・ソリューションの準備
- 30分間リソジェニーブロス培地(LB)を調作し、1L当たり、トリプトン10g、細菌酵母エキス5g、NaCl10gを混合し、脱イオン化(DI)水の1Lに溶解する。
- 1L共発現培養の場合、30分間、2.8Lエルレンマイヤーフラスコミックス12gのトリプトン、24gの細菌酵母エキス、40 mLの10%(v/v)グリセロールを調製し、860 mLのDIで溶解します。10xリン酸バッファーの1.3Lを調作し、リン酸一体化(KH2PO4)の30.03g、リン酸ジカリウム163.02g(K2 HPO4))を調べ、上記培地に添加する。
- カタボライト抑圧(SOC)メディアで超最適なスープを準備します。
- 2%(w/v)トリプトン、0.5%(w/v)細菌酵母エキス、8.5 mM NaCl、および2.5 mM KClを含む溶液を30分間調作し、オートクレーブします。
- 20 mMの最終濃度で無菌MgSO4とブドウ糖の両方を追加します。pH 7.0 に調整するには、1 M NaOH を使用します。SOCメディアを-20 °Cに保存します。
- 1Mの1Lを調出し、ピルビン酸ナトリウムを調出す。オートクレーブは15分間で、4°Cで保存します。
- 1Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクピラノシド(IPTG)の20mLを無菌DI水中に調製する。-20 °Cで1-2 mLのアリコートを保存します。
- 浸潤バッファーを調出す:10mM MES(1.952g)および10mM MgCl 2(2.033g)をDI水の1Lに溶解させた。4 °Cで保存します。
- 30分間LB寒天を準備し、オートクレーブ:DI水の100 mLあたり、トリプトン1g、細菌酵母エキス0.5g、NaClの1g、寒天の1.5gを追加します。LB寒天がボトルを処理するのに十分冷めたら、所望のプラスミドの組み合わせに必要な抗生物質を追加します。ペトリ皿を使って寒天皿を注ぎ、4°Cに保存します。
- 大腸菌およびN.ベンタミアナの化合物生産に関する仕様については、表1を参照してください。リファピシンを含むプレートをホイルに包み、保管時の劣化を防ぎます。
| 作業濃度(μg/mL) | |||||
| 抗生物質 | 在庫 (mg/mL) | 溶媒 | プラスミド1 | プラスミド2 | 3または4プラスミド |
| カルベニシリン | 50 | H2O | 50 | 25 | 20 |
| クロラムフェニ コール | 30 | 江藤 | 30 | 20 | 20 |
| カナマイシン | 50 | H2O | 50 | 25 | 20 |
| スペクチノマイシン | 30 | H2O | 30 | 25 | 20 |
| ゲンタマイシン | 50 | H2O | 30 | ||
| リファンピシン | 10 | メタノール | 10 | ||
表1:大腸菌またはN.ベンタミアナにおけるプラスミド共発現に対する抗生物質濃度。
2.大腸菌におけるジテルペノイド代謝物の生産
注:大腸菌中のジテルペノイド代謝物を産生するためのプロトコルは、ルーベン・J・ピータース博士(アイオワ州立大学、IA、米国)13のグループによって開発された以前に報告された酵素共発現プラットフォームから適応されています。、32.
- プラスミドの組み合わせを持つ有能な細胞の形質転換。
- 氷上で化学的に有能な大腸菌細胞を解凍した(BL21DE3-C41細胞は、このプロトコルで使用された)。
- 1.5 mLマイクロチューブで25μLの有能な細胞に共発現に使用される各構成物の100 ng/μL溶液の1μLを追加します。渦やピペッティングによって混合しないでください。
注:TPSおよびP450酵素の最適な発現および活性を考慮するには、いくつかの配列改変を考慮する必要がある。TPSの場合、N末端プラスティアルトランジットペプチドの除去がしばしば不可欠である。具体的には、プラスティアルモノおよびdi-TPSは、典型的には予測されたトランジットペプチドの除去を必要とする(一般的な予測アルゴリズム37を使用して)、一方、サイトソリックsesqui-TPSは通常、全長遺伝子として使用することができる。P450に関しては、コドン最適化ならびにN末端膜ドメインのリーダー配列MAKKTSSKGKとの除去または置換は、多くの場合38、39で有効であることが証明されている。また、P450酵素を共発現する場合には、十分なP450活性を確保するためにシトクロムP450還元酵素(CPR)を含める必要があります。 - マイクロチューブラックを通してチューブをそっと削り、10分ごとに混合物を30分間氷の上にインキュベートします。
- 構成物の所望の組み合わせに必要な抗生物質を含む37°CでSOC培地およびLB寒天プレートをプレインキュベートする。
注:共形される各構成物は、最適なタンパク質発現を確保するために、明確な抗生物質耐性と複製の明確な起源を持つ必要があります。 - 42°Cでセル混合物を1分間熱衝撃し、その後、氷の上で少なくとも2分間インキュベートする。
- 200 μL の温かい SOC メディアを追加します。
- 37 °C と 200 rpm で 1 時間のセル混合物を振ります。
- 温めたLB寒天プレートに約10本のオートクレーブガラスビーズを加えます。セル混合物の100 μLを追加し、蓋を交換します。蓋をしてプレートを水平に振り、細胞を均等に分配します。ガラスビーズを取り外し、ゴミ容器に入れます。あるいは、他の好ましいめっき方法を用いる。
- LB寒天プレートを一晩37°Cでインキュベートし、コーティングされた表面を下にしてインキュベートします。形質転換された大腸菌コロニーを用いることができるプレートは、翌日に使用するか、パラフィンフィルムで密封した4°Cで最大2週間保存することができる。
- 接種培養の準備
- 翌日、表1に提供される濃度を用いて形質転換プラスミド組み合わせに必要な抗生物質を用いたLB培地の溶液を調記する。
- 無菌フードで、プラスチック通気キャップ付きの15 mL滅菌ガラス試験管にLB培地の5 mLを転送します。所望の大きな(1L)培養ごとに1本の小さな培養管を調出す。
- ピペット先端を使用してLB寒天プレートから個々の大腸菌コロニーを選択します。選択したコロニーを含む1つのピペット先端を各チューブに排出することにより、大腸菌コロニーでLBの各管を接種する。
- 通気性プラスチックキャップを備えた各接種培養試験管をキャップします。キャップされた大腸菌小さな培養物を37°Cの振盪インキュベーターに12~24時間置きます。
- 共発現文化の準備と誘導
- 翌日、10xリン酸バッファーの100mLを調製TBの900mLに加え、最終的なリン酸緩衝液濃度を1倍にする。表1に従って濃度で必要な抗生物質を追加します。
- 37°Cで140rpmで振り、暖かくなるまで(約30分)。
- 接種培養の5 mLで1L培養用の培養物の各フラスコを接種する。接種培養チューブ内の接種培養に使用するピペットチップを保持し、その後の工程で有機溶媒を抽出した際に、抽出されたプラスチック汚染物質がないようにします。
- 600 nm(OD 600)の光学密度が0.6、約3時間に達するまで、200 rpmで振盪でインキュベートします。分光光度計でOD600を測定するには、無菌TBとリン酸バッファーをブランクとして使用します。
- 所望のOD600で、インキュベーターの設定を16 °Cに設定します。
- P450を共発現する場合は、十分なP450共因子産生に不可欠なリボフラビン酸とアミノレブリン酸を作製する。すべての実験のために、4 g/Lリボフラビンと150 g/Lアミノレブリン酸を作ります。リボフラビンは光に敏感なため、使用するまでホイルで包んだ溶液を保管してください。
- インキュベーターが16°C(約30分)に達した後、各培養に1mLの1ML、4g/Lリボフラビンの1mL、150g/Lのアミノレブリン酸を各培養に加えます。ジテルペノイド産生のために、十分な前駆体形成を保証するために、1Mピルビン酸ナトリウムの25 mLを各培養物に添加する必要があります。
注:このアッセイで使用されるすべての構造体は、同じIPTG誘導性プロモーターの下にあった。異なるプロモーターは、所望に応じて使用することができる。 - 16°Cおよび140 rpmで72 h. ジテルペノイドを製造する場合は、誘導後1日ごとに25mLのピルビン酸ナトリウムを加える。すぐに使用培養は、代謝産物の分離漏斗抽出のためにすぐに使用されます。文化を収穫したり保管したりしないでください。
3. 代謝物の分離と精製
- 代謝産物の分離漏斗抽出
注:可塑剤の汚染を防ぐために有機溶剤を使用する場合は、ガラス製品とガラスピペットのみを使用することが重要です。- ヒュームフードで、分離漏斗をリングスタンドに固定します。分離漏斗の下に廃棄物ビーカーを置きます。
- 50/50(v/v)エチル酢酸エチル/ヘキサンの500 mLを分離漏斗に注ぎます。
注:溶媒混合物は、標的代謝産物の溶解性および極性に基づいて調整されるべきである。水分解性溶媒は、適切な相分離を確保するために避ける必要があります。 - 大腸菌培養の500mLを分離漏斗に加え、ガラスストッパーの上に置きます。
- 漏斗を振り、培養剤と抽出溶媒を混ぜ、約5~10倍。漏斗を逆さまに保持し、圧力を解放するためにヒュームフードに向いている間、頻繁にスピゴットを開くことによって漏斗を脱ガスします。振盪と脱ガス手順2を繰り返します。
- 漏斗をリングスタンドに直立させ、溶媒層(上)が水性(培養)層(下)から分離するまで、約1分待ちます。
注:相間で大量の気泡が観察された場合、5~10 mL EtOHの少量を添加して位相分離を改善することができます。 - ストッパーを取り外します。大腸菌層を廃棄物ビーカーに排出し、漏斗中の溶媒層を保持します。
- 大腸菌培養の残りの500mLと、第1抽出に用いられる同じ500mL溶媒を用いて手順を繰り返す。
- 抽出された代謝物を含む溶媒をきれいなフラスコに排出します。大腸菌培養による汚染を避ける。
- ロータリー蒸発濃度
- ロータリー蒸発(rotovap)装置を準備する:水浴を充填し、温度を25 °Cに設定します。熱に敏感な化合物の場合は、低温設定を使用するか、水浴に氷を追加します。凝縮室をドライアイスで満たし、回転速度を60~80rpmに設定します。
- 抽出された代謝物の約700 mLを1L蒸発フラスコに加え、ロトバップに取り付け、水浴に下げます。水浴ヒーターをオンにし、25 °Cに設定します。
- 蒸発フラスコの回転を開始し、真空システムをオンにし、代謝液を廃棄物フラスコに急速に沸騰させないように吸引を徐々に増加させる。蒸発した溶媒は凝縮を開始し、凝縮物収集(廃棄物)フラスコに滴下する必要があります。
- 代謝液の数mLだけが蒸発フラスコに残っている場合は、回転を停止し、真空システムをオフにします。蒸発フラスコを上げ、真空ラインを閉じて減圧します。蒸発フラスコに残存する濃縮代謝液を保持する。廃棄物フラスコに廃棄物を処分します。
- 蒸発フラスコに最大700mLの追加抽出代謝液を添加してロータリー蒸発を続けます。抽出された代謝液のすべてが濃縮されるまで、プロセスを繰り返します。
- ガラスピペットを新しい試験管に移して、蒸発フラスコから濃縮された代謝物を取り除きます。50/50(v/v)エチル酢酸エチルまたは所望の溶媒混合物を2回5mLで蒸発フラスコをすすり、すすり溶液を試験管に移す。
- 濃縮代謝物は-20°Cまたは-80°C(製品の安定性に応じて)で、さらに使用するまで保管してください。
- シリカカラム精製
- 1Lビーカー、ガラス漏斗、50mL試験管、3.2Lクロマトグラフィーカラム(ガラスフレットを装備)をヘキサンで1回、酢酸エチルで1回洗い流してガラス製品を準備します。分数を収集するために使用される50 mL試験管にラベルを付けます。
- 2 L のシリカ ゲル (230-400 メッシュ、グレード 60) を 3.2 L クロマトグラフィー カラムに 2 L のリザーバ容量とフリット ディスクを加え、砂をロードして、柱の上部に 5 cm の層を形成します。
- 2Lのヘキサンで十分に洗い流してクロマトグラフィー用のカラムを準備します。カラムが乾燥したりエアポケットを取得したりしないように、常にカラムの砂層の上に溶媒液の薄い(約0.5センチメートル)層が必要です。エアホースに接続されたガラス入り入り器は、重力だけではなく、カラムを通る流量を穏やかに高めるために使用することができます。
- 濃縮された代謝産物抽出物(セクション3.2を参照)をカラムにロードします。サンプル3xを含むボトルをヘキサンで洗い流し、カラムに追加して、すべてのサンプルが転送されていることを確認します。
- 次の勾配を使用して、一度に100 mLをロードし、ラベル付けされた試験管で50 mL分画を収集する:ヘキサン3xで100%ヘキサン3x、10%(v/v)酢酸エチル酢酸エチル3x、15%(vxan)の酢酸エチル、ヘキサン3xで20%(v/v)酢酸エチル、ヘキサン3xで40%(v/v)酢酸エチル、ヘキサン3xで60%(v/v)酢酸エチル、100%酢酸エチル4x。
注: グラデーションは、複合サイズと極性と所望の分離に基づいて調整する必要があります。 - ガラスピペットを使用して、各分数からラベル付きGCバイアルに1 mLを転送します。GC-MSを介して各サンプルを分析し、所望の代謝産物とその純度を含む分数を決定します。
注:この方法で産生される代謝産物に適したGC-MS法は、Mafu et al. 201839に記載されている。簡単に言えば、HP-5MSカラム(材料の表を参照)、サンプル体積1μL、オーブン温度ランプを20°C分-1で50°Cから300°Cに使用して、XL MS検出器を用いてGC上ですべての解析を行いました。 - 対象の化合物を含む分数を決定した後、同じ化合物を含むすべての画分を結合します。化合物を含まない分数を廃棄物容器に適切に廃棄します。精製された代謝物を濃縮するために必要に応じて、回転性蒸発手順を繰り返します。
- 追加の精製が必要な場合は、(半)準備HPLCを使用して製品の純度を向上させる。HPLC プロトコルは、個々の機器の仕様および対象の化合物に基づいて適合する必要があります。
- 乾燥したシリカクロマトグラフィーサンプルを1mLヘキサン(ジテルペン炭化水素)またはアセトニトリル(酸素化ジテルペノイド)で再中断し、フィルターシリンジを通してフィルターを通して小さな粒子による汚染を防ぎます。
- 非極性ジテルペノイドの場合は、推奨流量1mL/分のCNカラム(材料の表を参照)とヘキサン:酢酸エチルグラデーションを使用し、分数を1分ごとに収集します。
- 極性ジターペノイドの場合は、推奨流量3mL/分のC18カラム(材料表参照)とアセトニトリル:水勾配を使用し、分数を1分ごとに収集します。
- 窒素流れの下ですべてのHPLC精製分画を乾燥させ、GC-MS分析の前に1mLヘキサンで再中断し、製品の豊富さと純度を評価します。
4. N.ベンタミアナを用いてジテルペノイド代謝物の生産
注:N.ベンタミアナでジテルペノイド代謝物を産生するためのここに記載されたプロトコルは、以前に報告された研究35、36、40、41から適応されている。以下のプロトコルは、N.ベンタミアナ葉の注射器浸潤に特異的である。真空浸潤などの他の浸潤方法も同様に適している。pCAMBIA130035Su(pLIFE33)またはpEAQ-HT40、41、42などのバイナリT-DNAベクターシステムは、植物宿生における大腸菌およびA.ツメファシアンおよび遺伝子発現における伝播を可能にする。このプロトコルに適しています。
- ニコチアナ・ベンタミアーナの植え付け
- 750 mLポット1ポットをポッティング土壌で充填し、ポットに水を与えます。20本のタバコの種を加え、指で軽くタップして土の中に入ります。土で覆わな
注:種子は、種子伝播のための自己受粉を介して生成することができます。この実験の種子は、UCデイビス植物生物学科から入手され、USDA胚芽貯蔵所(https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450)を通じて一般に入手可能です。 - 次の条件で成長室にポットを残し、土壌が乾燥しないように1日おきに水やりします。16:8 h日で26 °Cと60%の湿度で植物を成長させる:このプロトコルのすべてのステップのための夜のサイクル。
- 1週間後、ポットの土で約20ポットを充填し、ポットに水を与えます。鉗子を使用して、茎でタバコの苗をつかみ、ソースポットから穏やかに取り除き、各新しいポットに1本の苗を入れ、慎重に根を埋めます。葉や根を傷つけないようにしてください。
- ポットが入っているトレイに水を入れることによって、一日おきに植物に水をかけます(「ボトムウォーターリング」とも呼ばれます)。すべての第四の水やりは、パッケージの指示に従って水中に一般的な肥料を含む。
- 750 mLポット1ポットをポッティング土壌で充填し、ポットに水を与えます。20本のタバコの種を加え、指で軽くタップして土の中に入ります。土で覆わな
- アグロバクテリウム・ツメファシエン株GV3101有能細胞の凍結融解形
- 解凍アグロバクテリウム・ツメファシエンス株GV3101(または他の好ましい株)氷上の有能な細胞(〜1時間)。氷上の0.2 mLマイクロ遠心管を冷やす前に。28 °Cで暖かいSOC媒体。
- ピペット先端(ピペットの上下に行わない)とアリコート15 μLの細胞を穏やかに混合し、チルド1.5 mLマイクロチューブへの変換ごとにセルを15 μLとします。
- 有能な細胞の各チューブにDNAの1-5 μL(〜400 ng)を追加し、チューブラックに沿ってチューブを削ることによって穏やかに混合します。
注:所望の構造体は、それぞれが別々に変換され、浸潤前に混合されるので、異なる抗生物質耐性を持つ必要はありません。 - 液体窒素中にマイクロチューブを5分間入れます。
- 液体窒素からマイクロチューブを取り出し、チューブを部屋の温度ラックに置きます。37°Cインキュベーターで5分間チューブを解凍します。
- 各マイクロチューブに予温められた(28°C)SOCの250 μLを加える。28~30°C、225rpm、3時間振ります。
- ステップ2.1.8に記載されているように、表1に記載の必要な抗生物質を含むLB寒天プレート上の形質転換細胞のプレート50 μL。
- インキュベーション1日目以内の成長は、28〜30°Cで48〜30°Cで反転し、汚染の兆候でありうる。形質転換A.ツミファシエンは、2日間のインキュベーションに続いて使用するか、または2週間までパラフィンフィルムで密封された4°Cで保存することができる。
- ニコチアナ・ベンタミアナにおけるアグロバクテリウム-媒介過性酵素共発現
- プルーン4週齢のニコチアナ・ベンタミアナ植物は、下部葉を除去して浸潤する2日前に植物を植える。一番上の葉を4つ残します。植物に水をやれ浸潤前に植物に24時間水を与え、開いた座腹部と容易な浸潤を可能にする。
- 選択した構造体およびアグロバクテリウム株(表1に記載)に適切な抗生物質の作業濃度を有するLBの10 mLを、ホイル蓋付きの50mL無菌ガラス試験管に加える。
- 形質転換されたアグロバクテリウムの単一のコロニーを綿棒にし、LB媒体に先端を排出するためにピペット先端を使用して接種する。各アグロバクテリウム形質転換剤は、少なくとも2つの小さな培養物を有する必要があります。
- 28 °C および 220 rpm で一晩インキュベートします。
- 分光光度計を使用して、一晩培養物の600nm(OD600)で光学密度を測定します。一晩培養物を1のOD600に希釈する。
注:最適なOD600値は、他のアグロバクテリウム株を使用する場合に異なる場合があります。 - 希釈された一晩培養物の10mLを50mL円錐管に分配する。
- 室温で15分間3500rpmで遠心分離によって細菌を収穫する。注ぎ、上清を捨てます。
- チューブを静かに振り、チューブラックに転がすことで、10 mL浸潤バッファー内の培養物を再中断します。OD600は、各コンストラクトに対して 1 に等しい必要があります。
- 各変換されたセルラインの等しい体積を組み合わせることにより、浸潤に必要な組み合わせを生成します。OD600は浸潤ごとに1に等しいはずです。葉1枚につき浸潤溶液の5mL、植物当たり2葉を推定する。
- ロッカーにチューブを水平に取り付け、室温で2時間ゆっくりと揺れます。
- 葉1枚につき約5mLの浸潤混合物を用いてN.ベンタミアナ植物当たり〜2葉を浸潤する。葉の下側に針のない注射器で健康な葉を浸潤し、葉の上面に指で反圧を行い、浸潤液が葉組織を満たしていることを確認します。
- すべての浸透した葉に黒いマーカーまたはその他のインジケーターをマークします。5日間成長室に浸潤植物を置きます。植物に十分な水をまき続けてください。
注:5日間のインキュベーション時間は、製品形成の時間効率を維持しながら、ほとんどの下流分析に十分なジテルペノイドレベルに達するのに十分であることが証明されています。より高い製品量が必要な場合、より長いインキュベーション期間をテストすることができます。
- 形質転換されたニコチアナ・ベンタミアナからの代謝産物抽出と精製
- 収穫は、植物からそれらをクリッピングすることにより、植物から浸透葉。モルタルに液体窒素と単葉を約100mL加え、微粉末が得るまでモルタルと害虫またはティッシュミルを用いて粉砕する。
- 500 μL 境界に粉末組織を GC-MS バイアルに追加します。50/50(v/v)エチル酢酸エチルまたは所望の溶媒混合物の1.5 mLをバイアルとキャップにしっかりと加えます。
- 所望の製品を提供するためにテストされた発式の場合、より大きなフラスコまたは試験管に地盤組織をプールし、組織体積よりも約2倍の溶媒量を加え、一晩振る。精製のためにステップ4.4.5に進みます。
- すべてのバイアルをマイクロチューブラックに入れ、テープをしっかりと下に置いて固定します。室温で一晩激しく揺れる下で抽出する。
- 抽出物400μL、ヘキサン600μLを新鮮なGC-MSバイアルに移します。葉組織をアリコートしないでください。手順 3.3.6.1 で説明した方法を使用して、GC-MS を使用してサンプルを分析します。
- 所望の代謝産物の存在をGC-MSを介して分析した後、プール葉抽出物は一緒に、ロータリー蒸発、シリカカラムクロマトグラフィー、およびHPLCを介して進み、セクション3.2および3.3に記載されている純粋な化合物を得る。
Representative Results
大腸菌を用いたジテルペノイド産生のスケマティックワークフロー
図1は、ジテルペノイド産生の説明ワークフローを示す。ここで概説されたプロトコルは、ジテルペノイド生合成用の前述の大腸菌プラットフォーム13、32により大量培養物の使用およびシリカを介した所望のジテルペノイド産物の精製に適合した。クロマトグラフィー。このプロトコルの使用方法を示すには、 我々は、2つのdiTPS、ZmAN2(Zm0001d029648)とZmKSL4(Zm0001d032858)、多機能P450(CYP71Z18、Zm00001d14)を含むトウモロコシから最近同定されたドラブラレキシン経路を使用しました。還元酵素 (ZmCPR2, Zm00001d026483) (図 2)簡単に言えば、大腸菌BL21DE3-C41有能な細胞はpCDFDuet:IRSおよびpACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2プラスミド13、32で予め形質転換された。pCDFDuet:IRSプラスミドは、1-デオキシ-D-xylulose-5-リン酸シンターゼ(dxs)、1-デオキシ-D-xylulose-5-リン酸還元酵素(dxr)を含むジテルペノイド前駆体産生のための主要な酵素を含有し、およびイソペンテニルジリン酸イソメラーゼ(idi)は、大腸菌13におけるジテルペノイド形成を増加させることが示された。pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2プラスミドには、トウモロコシのエント-コパリル二リン酸合成酵素ZmAN2とアビーグランディスからのGGPPシンティーゼが含まれています。ドラボラレキシン生合成におけるコミットされた反応を触媒する酵素は、プラスミドpET28b:ZmKSL4およびpETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18として共形した。シーケンスとプラスミド構造の詳細については、Mafu et al. 201839を参照してください。
抽出された酵素産物のGC-MSクロマトグラムを図3Aに示し、ドラブラキエン(1.2±0.25mg/L培養)、エポキシドラブラノール(0.65±0.2mg/L培養)、エポキシドララノール(11.4.4)の3つのドラブレキシン化合物の形成を示す。±1.1 mg/L培養)をジテルペノイドスクラノールを用いて標準曲線に基づいて定量した。スクラレオールは、ドラブレキシンと比較して、その類似の構造と化学的特性のために、基準標準として使用されました。典型的に観察されるマイナーな副産物には、クロラムフェニコール、インドール誘導体オキシドールおよびインドール−5-アルデヒド、および前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)が含まれる(図3)。Indoleは一般的に一次副産物を表すが、GC-MS器具の完全性を維持するために7分の設定された溶媒遅延よりも短い保持時間のために、ここに示されていない。
N.ベンタミアナを用いたジテルペノイド産生の概略ワークフロー
図4は、N.ベンタミアナにおけるドラブレキシン経路の発現の概要を示す。ここで説明する製品については、以下の構成物をA.ツメファシアン株GV3101に別々に変換した:pLife33:p19(p19遺伝子サイレンシングサプレッサータンパク質を発現)、pLife33:ZmCYP71Z18、pLife33:ZmAN2、pLife33:ZmKSL4。トウモロコシドラブレキシン経路遺伝子の全長天然配列は、大腸菌およびA.ツメファシエンスにおける伝播のためのカナマイシン耐性を持つバイナリT-DNAベクターpLife3341に用いた。上流テルペノイド経路遺伝子の共発現は任意であり、前駆体のゲラニエル二リン酸はN.ベンタミアナにおいて内因性に形成される。しかし、いくつかの研究は、N.ベンタミアナ14、36、41でジテルペノイド形成を増加させるために、このようなアプローチを成功裏に採用している。図3に示すように、共発現はドラブラディアンおよび15,16-エポキシドラバレンの産生に成功した。大腸菌の酵素共発現とは異なり、15,16-エポキシドラブラノールは代謝産物抽出物では検出されなかった。
葉抽出物中の15,16-エポキシドラブレンの存在は、N.ベンタミアナにおけるCYP71Z18の活性を実証した。15,16-エポキシドラブラノールは、微生物培養からの抽出後に安定であることが示された(図3)ならびに以前の研究39でトウモロコシ根組織から分離した後、ヒドロキシル化産物がグリコシル化されているのはもっともらしいと思われる。内因性グリコシルトランスフェラーゼによって、その後、真空中に隔離され、抽出36、43、44、45の抽出のためにここで使用される有機溶媒混合物との抽出にアクセスできないようにする 、46.N.ベンタミアナにおける経路工学の文脈における同様の望ましくない製品の改変は、以前の研究47で報告されている。大腸菌における共発現に示すように、N.ベンタミアナにおける一過性発現は、参照質量スペクトルデータベースとの比較に基づいて異なる鎖長の線形アルカンを含むいくつかの副産物の抽出をもたらす。葉材料から抽出された化合物価価は、平均2.4 +/- 0.5 mgドラブラディエンおよび0.9 +/- 0.3 mg 15,16-エポキシドラバレン/g乾燥葉組織当たりであることが判明した。これらのチテーターは、異なる実験セットアップを考えると、大腸菌共発現系と直接比較することはできません。
ジテルペノイド精製
ジテルペノイド精製は、シリカカラムクロマトグラフィーおよびその後の半準備HPLCを用いて達成された。プールされた大腸菌培養物の12Lからの代謝産物抽出物を、3つの焦点ドラブレレキシン化合物を分離するためにシリカカラムクロマトグラフィーを用いて精製した(図3A)。シリカクロマトグラフィーは、ジテルペンオレフィンと酸素化誘導体の簡単な分離を可能にし、シリカマトリックスに保持されている主要な汚染物質であるオキシンドを容易に除去できるため、標的化合物の高純度を達成するのに理想的です(図 3A)。
図1:大腸菌におけるジテルペノイド産生のワークフローおよび液体細菌培養物からの代謝産物精製破線のボックスは、追加の精製が必要なオプションの手順を示しています。(A)分離漏斗を用いた抽出大腸菌培養物の代表的な画像。(B)シリカクロマトグラフィーを用いた代謝産物抽出物精製の代表画像。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:この研究で用いられるドラブレキシン生合成経路および遺伝子構築物。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: GC-MS の結果。図示は、(A)大腸菌及び(B)N.ベンタミアナにおける酵素共発現アッセイを用いて得られた精製ジテルペノイド産物の代表的なGC-MSクロマトグラムである。製品の同定は、米国国立標準技術研究所(NIST)質量スペクトルライブラリーの本物の基準と参照質量スペクトルとの比較に基づいています。1、オキシドール;2、インドール-5-アルデヒド;3,ピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン、ヘキサヒドロ-3-(2-メチルプロピル)-;4,6-O-アセチル-1-[[4-ブロモフェニル]チオ]-a-d-グルコシドS、S-二酸化物;5、 ドラブラディエン;6, 15,16-エポキシドラブレン;7,ピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン、ヘキサヒドロ-3-(フェニルメチル)-;8, 15,16-エポキシドラブラノール;9 と 12, 不明;10、クロラムフェニコール;11, 3,7,11,15-テトラメチル-2-ヘキサデセン-1-ol;13 -16、アルカネ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:N.ベンタミアナにおけるジテルペノイド産生(A) N.ベンタミアナにおけるジテルペノイド産生のワークフローおよび葉材からの代謝清質精製. (B)浸透実験の準備ができているN.ベンタミアナ植物の代表的な画像は、剪定する前に。(C)剪定後のN.ベンタミアナ植物の代表的な画像。(D)注射器浸潤葉の画像。暗い地域が浸透している。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
ジテルペノイド天然物のより広範な調査と適用は、所望の化合物の十分な量を合成し、精製するために、単純で安価なプロトコルを必要とする。幅広い種から利用可能なジテルペノイド代謝酵素の数の急激な増加は、微生物および植物ベースの宿主システムを使用してジテルペノイドの酵素生産のための広範なインベントリを提供します。さらに、多くのジテルペノイド経路のモジュラーアーキテクチャは、自然と新しい自然のようなジテルペノイド自然の配列を生成するために、「プラグ&プレイ」組み合わせ工学アプローチで同じまたは異なる種からの酵素の使用を可能にします製品2,14,26,35.
大腸菌は、その堅牢性、スケーラビリティの容易さ、副産物汚染の低減のための限られた化学的複雑さ、およびDNAの組み立ておよび発現に利用可能な豊富なツールにより、天然物生体合成に好ましい微生物宿主です。最適化。私たちの経験では、ここで説明するプラットフォームは、ここで提案されたものを含む多くの下流アプリケーションに適しているジテルペンオレフィンとアルコールの数百mgまでの製品収量を生産するのに適しています。工業規模を満たしていないが、ここで説明する生産プラットフォームは、タキサジエンやスクラロール33などの関連するジテルペノイドに対して成功裏に実証されているように、さらなる経路、宿主、発酵の最適化の基盤として役立つことができる。 、34.レート制限MVAまたはMEP経路遺伝子の過剰発現は、競合経路への前駆体供給の不十分さや前駆体フラックスなどのジテルペノイド生合成の収量制限因子を克服するために成功裏に確立された13、 32、33、39.いくつかの研究で成功したが、テルペノイド代謝真核性P450sおよび大腸菌中の他の膜結合酵素の発現および触媒活性が低いことが、可能性の高い制限因子33、39である,48,49,50,51,52.コドン最適化配列およびタンパク質修飾の使用、例えば、小平性網膜シグナルペプチドの除去またはプラスティアルシグナルペプチドの導入は、可溶性P450発現14、38を増加させるのに有用であることが証明されている 、49、50、53。このような修飾は、本研究において例的経路として用いられるトウモロコシCYP71Z1839の微生物共発現にも用いられた。記載されたプロトコルは、同じ誘導性プロモーターの下で、構成毎に1つまたは2つの遺伝子を運ぶプラスミドの使用に基づいている。大規模な遺伝子組み合わせが望まれる場合は、複数のプラスミドと抗生物質の使用による変換効率と培養の増加を軽減するために、利用可能な様々なマルチ遺伝子カセットまたは遺伝子積み重ねシステムを使用することをお勧めします13.
遺伝学およびゲノム資源のより広い利用可能性に伴い、植物宿主システムはまた、天然物の製造にますます適しています。利点は、光合成によって動力を与えられる必要な天然前駆体を産生する植物の能力を含み、従って前駆体分子54、55を補う必要なしに製品形成を可能にする。N. ベンタミアナは、テルペノイドおよびその他の天然物経路の生体内機能特性および組み合わせ発現に既に広く使用されている14,35,36,40.N.ベンタミアナを宿主系として使用することの顕著な利点は、ジテルペノイド前駆体の内因性産生、天然遺伝子配列の使用、真核生物P450sの簡略化発現、組み合わせ遺伝子形質転換の容易さ(以下一時的な共変換には別個の抗生物質は必要ありません)、および葉材料からのターゲット製品の簡単な抽出。必要に応じて、ジテルペノイド産生は、前駆体供給36、41を増加させるために主要なMEP経路遺伝子の共発現を通じて増強することができる。N.ベンタミアナにおけるスケーラブルなジテルペノイド生産の制約は、十分な植物バイオマスを生成する必要があるため、液体微生物培養に比べてより複雑であり、化学的に複雑な製品の精製が行われる。植物組織、及び、例えば、内因性酵素36、43、44、45による酸化、グリコシル化または脱リン酸化を通じて標的産物の望ましくない代謝を可能にする 、46、47。しかしながら、この手順は、アグロインフィルトレーション56に使用される植物の数を増やすことによってmg製品量にスケールアップすることができる。
ここで説明する製品抽出および精製プロトコルは、大腸菌およびN.ベンタミアナ、ならびにS.セレビシエおよび他の植物または微生物宿主システムと互換性があり、簡単にコスト効率の高いアプローチを提供します。生物学と化学の両方の実験室で設定され、高価な精製装置を必要としません。分離漏斗を用いた代謝物抽出は、クロマトグラフィー精製前の効率的な抽出および位相分離に適しています。じょうごのサイズは、より大きな培養量を可能にし、大規模な培養物から抽出するために必要な実験時間を短縮するために容易に調整することができます。炭化水素と酸素化化合物の両方を含むドラブレキシン群に対して、異なる極性のジテルペノイドを抽出するのに理想的なヘキサン/酢酸エチル勾配の使用が見つかりました(図3)。対象製品の特性に応じて、他の溶媒混合物が有利な場合がある。しかし、分離漏斗技術を用いて抽出および位相分離を成功させるために、溶媒を水と共に解析してはなりません。また、蒸発による製品損失を考慮して、低分子単一およびセスキテルペノイドおよび他のVOCなどの揮発性有機化合物(VOC)を製造する際に考慮する必要があります。より大きなスケール(〜2L)シリカカラムを使用した異なるレベルの酸素化のクロマトグラフィー分離は、製品分離を改善し、反復精製の必要性を最小限に抑えるため、当社の経験において有利です。小さい列ボリュームを使用する場合の手順。カラムの容積および行列は、所望の培養量および天然物のタイプに対して必要に応じて調整することができる。このプロトコルを使用して達成することができる標的製品の純度は、生理活性アッセイや酵素活性分析での使用など、多くの下流アプリケーションに適しています。しかし、NMRによる構造解析など、より高い純度レベルが求められる場合は、(半)準備HPLCを用いた追加の精製により、製品の純度を効率的に高めることができます。
ここで説明するこのプロトコルは、ジテルペノイド天然物の生産のために最適化されていますが、単体、セスキ、トライテルペノイド、ならびに単に所望の酵素を生成するだけで他の天然物クラスに容易にカスタマイズすることができます。組み合わせ式14,57用モジュール .しかし、モノ・セスキ・テルペノイドのような揮発性の高い化合物、または例示されるより高い極性および機能的修飾を伴う化合物については、製品抽出および精製の手順の変更を考慮する必要があります。多くのトリテルペノイド、フェニルプロパノイド、および他の天然物クラスのグリコシル化。
天然物の製造のための産業規模のプラットフォームは利用可能ですが、ここで説明するプロトコルは、ほとんどの実験室で容易に設定することができる安価でカスタマイズ可能なツールを提供します。トウモロコシのドラブレキシンの生産によって示されるように、このアプローチを使用して達成することができる製品の量と純度は、通常、様々な下流の分析と使用を容易にするために十分であるが、そうでない種々の生物活性研究、生物間の相互作用の分析、ならびに酵素基質としての使用、または半合成アプローチの開始材料として限定される。
Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
我々は、pIRSとpGGxZmAN2の構造を提供してくれたルーベン・ピータース博士(アイオワ州立大学、米国)に感謝します。NSFプラント・バイオティック・インタラクション・プログラム(P.Z.への助成金#1758976)、DOE早期キャリア研究プログラム(助成金#DE-SC0019178 to P.Z.)、DOE共同ゲノム研究所コミュニティサイエンスプログラム(助成金#CSP2568 to P.Z.)、NSFによるこの研究に対する財政的支援大学院研究フェローシッププログラム(K.M.M.)とUCデイビス・ディーンのメンターシップ・アワード・フェローシップ(K.M.M.)は感謝の気持ちを持っています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 Trays | Greenhouse Megastore | CN-FLHD | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M8250-500g | MES |
| 4" Tech Square Pot | McConkey Wholesale Grower's Supply | JMCTS4 | |
| 5977 Extractor XL MS | Agilent | - | |
| 7890B GC | Agilent | - | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004 | |
| Agar | Fisher | BP1423-2 | |
| Bacterial yeast extract | Fisher | BP9727-2 | |
| Beaker | CTechGlass | BK-2001-015B | |
| Cap, 9 mm blue screw, PFTE | Agilent | 5185-5820 | GC vial cap |
| Carbenicillin | Genesee | 25-532 | Carb |
| Chloramphenicol | Fisher | 50247423 | Chlor |
| Chromatography column | CTechGlass | CL-0015-022 | |
| Clear humidity dome | Greenhouse Megastore | CN-DOME | |
| ColiRollers Plating Beads | Sigma | 71013 | Glass beads |
| CoorsTek Porcelain Mortars | Fisher | 12-961A | mortar |
| CoorsTek Porcelain Pestles | Fisher | 12-961-5A | pestle |
| Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma | 50981039 | Aminoleuvolinic acid |
| Ethanol | Fisher | A962-4 | EtOH |
| Ethyl acetate | Fisher | E1454 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | Falcon tubes |
| Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | cuvette |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | petri dish |
| Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks | Fisher | 05-541 | microtube rack |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 (CS) | |
| HP-5MS | Agilent | 19091S-433 | GC column |
| Inlet adapter | CTechGlass | AD-0006-003 | glass inlet adapter |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher | BP1755-100 | IPTG |
| Kanamycin | Fisher | BP9065 | Kan |
| KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase | VWR | 60825-798 | breathable test tube lids |
| Magnesium chloride | Acros | 223210010 | MgCl2 |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506-500g | MgSO4 |
| Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2756810 | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 20.746.0001 | tissue mill |
| Nalgene Fernbach culture flask | Sigma | Z360236 | 2.8 L flask |
| New Brunswick I26 | Eppendorf | M1324-0000 | Shaking incubator |
| Nicotiana benthamiana seed | USDA Germplasm Repository | Accession TW16 | N. benthamiana |
| OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60442 | C41-DE3 cells |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | S37440 | Parafilm |
| Potassium chloride | Sigma | P-9541 | KCl |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | P288-3 | Dipotassium phosphate |
| Potassium phosphate monobasic | Monopotassium phosphate | ||
| Pyrex disposable culture tubes, rimless | Sigma | CLS9944516 | test tubes |
| Pyruvate Acid Sodium Salt | Fisher | 501368477 | Sodium pyruvate |
| Retort Ring Stands | CTechGlass | ST00 | ring stand |
| Riboflavin | Amresco | 0744-250g | |
| Rifampicin | Sigma | R7382 | Rif |
| Rotovap | |||
| Sand, 50-70 mesh particle size | Sigma | 274739-1KG | |
| Silica | Fisher | AC241660010 | silica gel |
| Sodium chloride | Fisher | 5271-3 | NaCl |
| Sodum hydroxide | Fisher | SS266-1 | NaOH |
| Spectinomycin | Fisher | 501368607 | Spec |
| Squibb Separatory Funnel | CTechGlass | FN-1060-006 | Separatory funnel |
| Sunshine Mix #1 | Sungro Horticulture | Potting soil | |
| Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher | 21-402-902 | microtube |
| Triangle funnel | CTechGlass | FN-0035 | funnel |
| Tryptone | Fisher | BP14212 | |
| Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn | Agilent | 5182-0716 | GC vial |
| visible spectrophotometer, V-1200 | VWR | 634-6000P | spectrophotometer |
| ZORBAX Eclipse XDB-C18 | Agilent | 990967-202 | HPLC column |
| ZORBAX Eclipse XDB-CN | Agilent | 990967-905 | HPLC column |
References
- Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
- Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
- Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
- Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
- Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
- Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
- Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
- Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
- Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
- Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
- Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
- Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
- Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
- Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
- George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
- Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
- Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
- Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
- McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
- Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
- Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
- Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
- Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
- Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
- Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
- Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
- Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
- Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
- Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
- Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
- Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
- Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
- Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
- Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
- Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
- Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
- Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
- Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
- Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
- Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
- Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
- Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
- Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
- Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
- De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
- Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
- Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
- Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).
