Här presenterar vi lättanvända protokoll för framställning och rening av diterpenoida metaboliter genom kombinatoriska uttryck av biosyntetiska enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, följt av kromatografisk produkt Rening. De resulterande metaboliterna är lämpliga för olika studier inklusive molekylär struktur karakterisering, enzym funktionella studier, och bioaktivitet analyser.
Diterpenoids bildar en mångsidig klass av små molekyler naturliga produkter som är spridda över livets riken och har kritiska biologiska funktioner i utvecklingsprocesser, interorganismal interaktioner, och miljöanpassning. På grund av dessa olika bio aktiviteter, många diterpenoids är också av ekonomisk betydelse som läkemedel, livsmedelstillsatser, biobränslen, och andra bioprodukter. Avancerad genomik och biokemiska metoder har möjliggjort en snabb ökning av kunskapen om diterpenoid-metaboliska gener, enzymer och vägar. Men den strukturella komplexiteten av diterpenoids och den smala taxonomiska fördelningen av enskilda föreningar i ofta bara en enda art förblir begränsande faktorer för sin effektiva produktion. Tillgängligheten av ett bredare spektrum av metaboliska enzymer ger nu resurser för att producera diterpenoids i tillräckliga titrar och renhet för att underlätta en djupare undersökning av denna viktiga metabolitgrupp. På grundval av etablerade verktyg för mikrobiellt och växtbaserat enzym Co-Expression presenterar vi ett lättmanövrerad och anpassningsbart protokoll för enzymatisk produktion av diterpenoider i antingen Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, och rening av önskade produkter via kiselkromatografi och semi-Preparative HPLC. Använda gruppen av majs (Zea mays) dolabralexin diterpenoids som ett exempel, vi belyser hur modulära kombinationer av diterpen syntas (diken) och cytokrom P450 monooxygenas (P450) enzymer kan användas för att generera olika diterpenoida ställningar. Renade föreningar kan användas i olika nedströms applikationer, såsom metabolit strukturella analyser, enzym struktur-funktion studier, och in vitro-och i planta bioaktivitet experiment.
Diterpenoids omfattar en kemiskt varierande grupp av mer än 12 000 övervägande polycykliska 20-Carbon naturliga produkter som spelar kritiska roller i många organismer1. Svampar och växter producerar den största mångfalden av diterpenoids, men bakterier har också visat sig bilda bioaktiva diterpenoids (se recensioner2,3,4,5). Rotade i sin stora strukturella mångfald, diterpenoids tjäna en mängd biologiska funktioner. Några diterpenoids, såsom Gibberellin tillväxthormoner, har viktiga funktioner i utvecklingsprocesser5. Emellertid fungerar majoriteten av diterpenoids som medlare av kemiskt försvar och interorganismal växelverkan. Bland dessa, diterpen harts syror i Pest och patogen försvar av barrträd och artspecifika blandningar av antimikrobiella diterpenoids i större livsmedelsgrödor såsom majs (Zea mays) och ris (Oryza sativa) har varit mest omfattande studerade6,7. Dessa bio aktiviteter ger en rik kemisk databas för kommersiella tillämpningar, och välj diterpenoids används som viktiga läkemedel, livsmedelstillsatser, lim och andra bioprodukter i vardagen moderna livet8,9 ,10. För att främja forskning om den naturliga mångfalden och biologiska funktioner av diterpenoids och i slutändan främjar bredare kommersiella tillämpningar, verktyg för en kostnadseffektiv beredning av rena föreningar krävs. Storskalig isolering från växtmaterial har etablerats för några diterpenoida bioprodukter, såsom diterpen harts syror som produceras som en biprodukt av massa-och pappersindustrin8. Emellertid, ackumulering av diterpenoids i endast specifika vävnader och under stram reglering av miljömässiga stimuli begränsar ofta isolering av tillräckliga produktmängder från den naturliga producenten2. Dessutom hämmar den strukturella komplexiteten av diterpenoids sin produktion genom kemisk syntes, även om sådana metoder har varit framgångsrika i flera fall11,12. Med tillgången till avancerad genomisk och biokemisk teknik, enzymatiska produktionsplattformar har fått ökad uppmärksamhet för att producera en rad diterpenoida föreningar (se recensioner13,14, 15,16,17,18).
Alla terpenoider, inklusive diterpenoids, härrör från två isomeriska isoprenoidprekursorer, isopentenyldifosfat (IPP) och dimetylallyldifosfat (DMAPP)19 som i sin tur bildas genom Mevalonat (MVA) eller väg till metylerytritol-5-fosfat (MEP). Terpenoid biosyntes fortskrider genom MEP vägen i bakterier och MVA vägen i svampar, medan växterna besitter en cytosoliska MVA och en plastidial MEP väg, med den senare är den primära vägen mot diterpenoida formation20. Kondensation av IPP och DMAPP av av transferaser ger den centrala 20-Carbon föregångare till alla diterpenoids, geranylgeranyl Diphosphate (ggpp)20. Nedströms om ggpp-bildning, två enzym familjer, terpensynthaser (tpss) och cytokrom P450-monooxygenaser (P450s) kontrollerar till stor del bildandet av den stora kemiska mångfalden av terpenoid metabolism21,22. Diterpen syntaser (ditpss) katalysera den engagerade carbocation-driven cykliseringen och omplaceringen av ggpp att bilda olika stereospecifika bi-, Poly-, eller makro-cykliska diterpen ställningar1,3,23, 24. Syresättning och ytterligare funktionell dekoration av dessa ställningar sedan underlättas av P450-enzymer och välj andra enzym familjer22,25. TPSs och P450s finns vanligen som artspecifika, multi-Gene familjer som kan bilda modulära biosyntetiska nätverk, där kombinera olika enzymmoduler längs en gemensam skiss möjliggör bildandet av ett brett spektrum av föreningar2, 26. den snabba upptäckten av funktionellt distinkta enzymer verksamma i modulära terpenoid vägar under de senaste åren har gett expanderande möjligheter för deras användning som en mångsidig reservdelslista för metabolisk konstruktion av partiella eller kompletta vägar i både mikrobiella och växtbaserade produktionsplattformar. Till exempel, jäst (Saccharomyces cerevisiae) har tillämpats framgångsrikt att iscensätta flera enzym vägar för tillverkning av terpenoid bioprodukter, såsom malaria läkemedel Artemisinin27, den sesquiterpenoid biobränslen bisabolene och farnesene28, men också välja diterpenoids29,30,31. Likaså, konstruerade Escherichia coli plattformar för industriell skala tillverkning har fastställts för några diterpenoida metaboliter, inklusive Taxol föregångare taxadiene används som ett läkemedel mot cancer och diterpen alkohol, Sclareol , används inom doftindustrin13,32,33,34. Framstegen inom genteknik och omvandlingsteknik har också gjort växt värdsystem allt mer livskraftiga för produktion av vegetabiliska naturprodukter9,14,35,36. I synnerhet den nära tobak släkting, Nicotiana benthamiana, har blivit ett allmänt använt chassi för terpenoid väg analys och ingenjörskonst, på grund av den lätthet av Agrobacterium-medierad omvandling av flera gen kombinationer , effektiv biosyntes av endogena prekursorer och hög biomassa14,35,36.
Genom att rita på dessa etablerade plattformar för terpenoid biosyntes, beskriver vi här lättanvända och kostnadseffektiva metoder för enzymatisk produktion av diterpenoids och rening av enstaka föreningar. De presenterade protokollen illustrerar hur E. coli och N. benthamiana -plattformar konstruerade för förbättrad diterpenoida-prekursor-biosyntes kan utnyttjas för kombinatoriska uttryck av olika Ditpss-och P450-enzymer för att generera önskade diterpenoida föreningar. Tillämpning av detta protokoll för att producera och rena strukturellt olika diterpenoids visas genom exempel på specialiserade diterpenoids från majs (Zea mays), kallas dolabralexins, endogena biosyntes som rekryterar två diken och en P450 Enzym. Rening av olika dolabralexins allt från olefiner till syrenerade derivat uppnås sedan genom att kombinera separatorisk tratt utvinning med storskalig kiselkolonnkromatografi och förberedande högtrycks vätskekromatografi (HPLC). De beskrivna protokollen är optimerade för produktion av diterpenoids, men kan också lätt anpassas för relaterade terpenoid klasser, liksom andra naturliga produkter för vilka enzym resurser finns tillgängliga. Föreningar som framställs med denna metod lämpar sig för olika nedströms tillämpningar, inklusive men inte begränsat till, strukturell karakterisering via kärnmagnetisk resonans (NMR) analys, användning som substrat för enzym funktionella studier, och en rad bioaktivitetsanalyser.
Bredare undersökning och tillämpning av diterpenoida naturliga produkter kräver enkla, billiga protokoll för att syntetisera och rena tillräckliga mängder av önskade föreningar. Den snabba ökningen av antalet tillgängliga diterpenoid-metaboliska enzymer från ett brett spektrum av arter ger nu en expansiv inventering för enzymatisk produktion av diterpenoids med hjälp av mikrobiella och växtbaserade värdsystem. Dessutom, den modulära arkitekturen i många diterpenoida vägar möjliggör användning av enzymer från samma eller olika arter i “Plug & Play” kombinatorisk teknik metoder för att generera en rad naturliga och nya natur-liknande diterpenoida Natural produkter2,14,26,35.
E. coli är en rekommenderad mikrobiell värd för naturlig produkt biosyntes på grund av dess robusthet, lätthet av skalbarhet, begränsad kemisk komplexitet för minskad biprodukt förorening, och den rikedom av tillgängliga verktyg för DNA-montering och uttryck Optimering. Enligt vår erfarenhet, den plattform som beskrivs här är väl lämpad för att producera produkt avkastning på upp till flera hundra mg diterpen olefiner och alkoholer, som är lämplig för många nedströms tillämpningar inklusive de som föreslås här. Även om inte uppfyller industriell skala, den produktionsplattform som beskrivs här kan fungera som en grund för ytterligare väg, värd och jäsning optimering som har framgångsrikt visat för relaterade diterpenoids såsom taxadiene och Sclareol33 ,34. Överuttryck av hastighetsbegränsande MVA-eller MEP-utbildninggener har framgångsrikt etablerats för att övervinna avkastnings begränsande faktorer för diterpenoida biosyntes, såsom otillräcklig prekursorer tillgång och prekursor Flux i konkurrerande vägar13, 32,33,39. Även om det visat sig framgångsrikt i flera studier, dålig uttryck och katalytisk aktivitet av terpenoid-metabolisk eukaryotisk P450s och andra membran-bundna enzymer i E. coli är en sannolik begränsande faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Användning av Codon-optimerade sekvenser och proteinmodifikationer, såsom avlägsnande av endoplasmatiska Retikulum signal peptid eller införande av en plastidial signal peptid, har visat sig användbar för att öka lösliga P450-uttryck14,38 ,49,50,53. Sådana modifieringar användes också för det mikrobiella samuttrycket av majs CYP71Z1839 som användes som exempel väg i denna studie. De beskrivna protokollen bygger på användning av plasmider som transporterar en eller två gener per konstruktion, allt under samma inducerbara promotor. Om större gen kombinationer önskas, är det tillrådligt att använda olika tillgängliga multi-Gene kassetter eller gen stapling system för att minska minskad omvandling effektivitet och kultur tillväxt på grund av användning av flera plasmider och antibiotika13 .
Med den bredare tillgången på genetik och genomik resurser, växt värdsystem blir också allt mer lämpade för tillverkning av naturprodukter. Fördelar inkluderar förmågan hos växter att producera de nödvändiga naturliga prekursorer som drivs av fotosyntes, vilket möjliggör produkt bildning utan att behöva komplettera föregångare molekyler54,55. N. benthamiana används redan i stor utsträckning för in vivo funktionell karakterisering och kombinatoriskt uttryck av terpenoid och andra naturliga produkt vägar14,35,36,40 . Anmärkningsvärda fördelar med att använda N. benthamiana som värdsystem inkluderar endogena produktionen av diterpenoida prekursorer, användning av infödda gensekvenser, förenklat uttryck för eukaryota P450s, enkel kombinatorisk gen omvandling (som separata antibiotika krävs inte för övergående Co-Transformation), och enkel extraktion av målprodukter från blad material. Vid behov kan diterpenoida produktion förbättras genom Co-Expression av viktiga MEP-utbildninggener för att öka föregångaren Supply36,41. Begränsningar för skalbar diterpenoida produktion i N. benthamiana är mer komplexa jämfört med flytande mikrobiella kulturer på grund av behovet av att generera tillräcklig växtbiomassa, mer arbetsintensiva produkt rening från kemiskt komplexa växtvävnad, och eventuell oönskad metabolisering av målprodukter genom exempelvis oxidation, glykosylering eller Defosforylering av endogena enzymer36,43,44,45 ,46,47. Emellertid, detta förfarande kan skalas upp till mg produktkvantiteter genom att öka antalet växter som används för agroinfiltration56.
De protokoll för extraktion och rening av produkter som beskrivs här är kompatibla med E. coli och N. benthamiana, samt S. cerevisiae och andra växt-eller mikrobiella värdsystem, och ger ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt som är lätt att inrättas i både biologi och kemi laboratorier och kräver inte dyr renings utrustning. Metaboliten extraktion med separatoritratten lämpar sig väl för effektiv extraktion och fasseparation före kromatografisk rening. Trattstorlekar kan lätt justeras för att möjliggöra större kultur volymer och minska experimentell tid som behövs för att extrahera från stora kulturer. Vi fann att användningen av en hexan/etylacetat lutning vara idealisk för extraktion diterpenoids av olika polaritet som visas här för den grupp av dolabralexins som omfattar både kolväten och syrade föreningar (figur 3). Beroende på egenskaperna hos målprodukter kan andra lösningsmedelsblandningar vara fördelaktiga. Lösningsmedel får dock inte vara blandbara med vatten för att säkerställa en lyckad extraktion och fasseparation med hjälp av separatorisk tratt teknik. Dessutom måste produktförlust genom avdunstning beaktas vid användning av denna metod för framställning av flyktiga organiska föreningar (VOC), såsom lägre molekylvikt mono-och Sesqui-terpenoider och andra VOC. Kromatografisk separation av diterpenoider av olika nivåer av syresättning med hjälp av en större skala (~ 2 L) kiseldioxid kolumn har varit fördelaktigt i vår erfarenhet, eftersom det ger förbättrad produkt separation och minimerar behovet av iterativ rening steg när du använder mindre kolumn volymer. Kolumn volymer och matriser kan justeras efter behov för önskad kultur volym och typ av naturprodukt. Renheten hos målprodukter som kan uppnås med hjälp av detta protokoll lämpar sig för många nedströmsapplikationer, såsom bioaktivitetsanalyser eller för användning i enzym aktivitetsanalys. Men där högre renhetsnivåer krävs, såsom strukturella analyser via NMR, kan produktens renhet förbättras effektivt genom ytterligare rening med hjälp av (semi)-Preparative HPLC.
Detta protokoll som beskrivs här har optimerats för produktion av diterpenoida naturliga produkter, men kan också lätt anpassas till relaterade mono-, sesqui-och Tri-terpenoider, samt andra naturliga produktklasser helt enkelt genom att generera den önskade enzym moduler för kombinatoriskt uttryck14,57. Ändringar av förfarandena för extraktion och rening av produkter måste dock beaktas för föreningar med högre volatilitet, såsom mono-och Sesqui-terpenoider, eller högre polaritet och funktionell modifiering som exemplifieras av glykosylering av många triterpenoider, fenylpropanoider och andra naturliga produktklasser.
Även industriell skala plattformar för tillverkning av naturliga produkter finns, de protokoll som beskrivs här erbjuder ett billigt, anpassningsbart verktyg som lätt kan inrättas i de flesta laboratorier. Som framgår av produktionen av majs dolabralexins här och på andra ställen39, de produktkvantiteter och renhet som kan uppnås med hjälp av denna metod är vanligtvis tillräckligt för att underlätta olika nedströms analys och användningsområden, inklusive, men inte begränsad till, olika bioaktivitet studier, analys av interaktioner mellan organismer, samt för användning som enzymsubstrat eller som utgångsmaterial för semi-syntesmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt Dr Reuben Peters (Iowa State University, USA) för att tillhandahålla pIRS och pGGxZmAN2 konstruktioner. Finansiellt stöd för detta arbete av NSF växt-biotic interaktioner program (Grant # 1758976 till P.Z.), DOE Early karriär Research program (Grant # DE-SC0019178 till P.Z.), DOE gemensamma Genome Institute gemenskapen Science program (Grant # CSP2568 till P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship program (till K.M.M.), och en UC Davis Dean ‘ s mentorskap Award Fellowship (till K.M.M.) är tacksamt erkänt.
1020 Trays | Greenhouse Megastore | CN-FLHD | |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M8250-500g | MES |
4" Tech Square Pot | McConkey Wholesale Grower's Supply | JMCTS4 | |
5977 Extractor XL MS | Agilent | – | |
7890B GC | Agilent | – | |
Acetonitrile | Sigma | 271004 | |
Agar | Fisher | BP1423-2 | |
Bacterial yeast extract | Fisher | BP9727-2 | |
Beaker | CTechGlass | BK-2001-015B | |
Cap, 9 mm blue screw, PFTE | Agilent | 5185-5820 | GC vial cap |
Carbenicillin | Genesee | 25-532 | Carb |
Chloramphenicol | Fisher | 50247423 | Chlor |
Chromatography column | CTechGlass | CL-0015-022 | |
Clear humidity dome | Greenhouse Megastore | CN-DOME | |
ColiRollers Plating Beads | Sigma | 71013 | Glass beads |
CoorsTek Porcelain Mortars | Fisher | 12-961A | mortar |
CoorsTek Porcelain Pestles | Fisher | 12-961-5A | pestle |
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma | 50981039 | Aminoleuvolinic acid |
Ethanol | Fisher | A962-4 | EtOH |
Ethyl acetate | Fisher | E1454 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | Falcon tubes |
Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | cuvette |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | petri dish |
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks | Fisher | 05-541 | microtube rack |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Glycerol | Fisher | G33-500 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 (CS) | |
HP-5MS | Agilent | 19091S-433 | GC column |
Inlet adapter | CTechGlass | AD-0006-003 | glass inlet adapter |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher | BP1755-100 | IPTG |
Kanamycin | Fisher | BP9065 | Kan |
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase | VWR | 60825-798 | breathable test tube lids |
Magnesium chloride | Acros | 223210010 | MgCl2 |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506-500g | MgSO4 |
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2756810 | |
Mixer Mill MM 200 | Retsch | 20.746.0001 | tissue mill |
Nalgene Fernbach culture flask | Sigma | Z360236 | 2.8 L flask |
New Brunswick I26 | Eppendorf | M1324-0000 | Shaking incubator |
Nicotiana benthamiana seed | USDA Germplasm Repository | Accession TW16 | N. benthamiana |
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60442 | C41-DE3 cells |
Parafilm M wrapping film | Fisher | S37440 | Parafilm |
Potassium chloride | Sigma | P-9541 | KCl |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | P288-3 | Dipotassium phosphate |
Potassium phosphate monobasic | Monopotassium phosphate | ||
Pyrex disposable culture tubes, rimless | Sigma | CLS9944516 | test tubes |
Pyruvate Acid Sodium Salt | Fisher | 501368477 | Sodium pyruvate |
Retort Ring Stands | CTechGlass | ST00 | ring stand |
Riboflavin | Amresco | 0744-250g | |
Rifampicin | Sigma | R7382 | Rif |
Rotovap | |||
Sand, 50-70 mesh particle size | Sigma | 274739-1KG | |
Silica | Fisher | AC241660010 | silica gel |
Sodium chloride | Fisher | 5271-3 | NaCl |
Sodum hydroxide | Fisher | SS266-1 | NaOH |
Spectinomycin | Fisher | 501368607 | Spec |
Squibb Separatory Funnel | CTechGlass | FN-1060-006 | Separatory funnel |
Sunshine Mix #1 | Sungro Horticulture | Potting soil | |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher | 21-402-902 | microtube |
Triangle funnel | CTechGlass | FN-0035 | funnel |
Tryptone | Fisher | BP14212 | |
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn | Agilent | 5182-0716 | GC vial |
visible spectrophotometer, V-1200 | VWR | 634-6000P | spectrophotometer |
ZORBAX Eclipse XDB-C18 | Agilent | 990967-202 | HPLC column |
ZORBAX Eclipse XDB-CN | Agilent | 990967-905 | HPLC column |