Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En anpassningsbar metod för enzymatisk produktion och rening av Diterpenoid naturliga produkter

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/59992
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Plant Biology, University of California Davis

Summary

Här presenterar vi lättanvända protokoll för framställning och rening av diterpenoida metaboliter genom kombinatoriska uttryck av biosyntetiska enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, följt av kromatografisk produkt Rening. De resulterande metaboliterna är lämpliga för olika studier inklusive molekylär struktur karakterisering, enzym funktionella studier, och bioaktivitet analyser.

Abstract

Diterpenoids bildar en mångsidig klass av små molekyler naturliga produkter som är spridda över livets riken och har kritiska biologiska funktioner i utvecklingsprocesser, interorganismal interaktioner, och miljöanpassning. På grund av dessa olika bio aktiviteter, många diterpenoids är också av ekonomisk betydelse som läkemedel, livsmedelstillsatser, biobränslen, och andra bioprodukter. Avancerad genomik och biokemiska metoder har möjliggjort en snabb ökning av kunskapen om diterpenoid-metaboliska gener, enzymer och vägar. Men den strukturella komplexiteten av diterpenoids och den smala taxonomiska fördelningen av enskilda föreningar i ofta bara en enda art förblir begränsande faktorer för sin effektiva produktion. Tillgängligheten av ett bredare spektrum av metaboliska enzymer ger nu resurser för att producera diterpenoids i tillräckliga titrar och renhet för att underlätta en djupare undersökning av denna viktiga metabolitgrupp. På grundval av etablerade verktyg för mikrobiellt och växtbaserat enzym Co-Expression presenterar vi ett lättmanövrerad och anpassningsbart protokoll för enzymatisk produktion av diterpenoider i antingen Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, och rening av önskade produkter via kiselkromatografi och semi-Preparative HPLC. Använda gruppen av majs (Zea mays) dolabralexin diterpenoids som ett exempel, vi belyser hur modulära kombinationer av diterpen syntas (diken) och cytokrom P450 monooxygenas (P450) enzymer kan användas för att generera olika diterpenoida ställningar. Renade föreningar kan användas i olika nedströms applikationer, såsom metabolit strukturella analyser, enzym struktur-funktion studier, och in vitro-och i planta bioaktivitet experiment.

Introduction

Diterpenoids omfattar en kemiskt varierande grupp av mer än 12 000 övervägande polycykliska 20-Carbon naturliga produkter som spelar kritiska roller i många organismer1. Svampar och växter producerar den största mångfalden av diterpenoids, men bakterier har också visat sig bilda bioaktiva diterpenoids (se recensioner2,3,4,5). Rotade i sin stora strukturella mångfald, diterpenoids tjäna en mängd biologiska funktioner. Några diterpenoids, såsom Gibberellin tillväxthormoner, har viktiga funktioner i utvecklingsprocesser5. Emellertid fungerar majoriteten av diterpenoids som medlare av kemiskt försvar och interorganismal växelverkan. Bland dessa, diterpen harts syror i Pest och patogen försvar av barrträd och artspecifika blandningar av antimikrobiella diterpenoids i större livsmedelsgrödor såsom majs (Zea mays) och ris (Oryza sativa) har varit mest omfattande studerade6,7. Dessa bio aktiviteter ger en rik kemisk databas för kommersiella tillämpningar, och välj diterpenoids används som viktiga läkemedel, livsmedelstillsatser, lim och andra bioprodukter i vardagen moderna livet8,9 ,10. För att främja forskning om den naturliga mångfalden och biologiska funktioner av diterpenoids och i slutändan främjar bredare kommersiella tillämpningar, verktyg för en kostnadseffektiv beredning av rena föreningar krävs. Storskalig isolering från växtmaterial har etablerats för några diterpenoida bioprodukter, såsom diterpen harts syror som produceras som en biprodukt av massa-och pappersindustrin8. Emellertid, ackumulering av diterpenoids i endast specifika vävnader och under stram reglering av miljömässiga stimuli begränsar ofta isolering av tillräckliga produktmängder från den naturliga producenten2. Dessutom hämmar den strukturella komplexiteten av diterpenoids sin produktion genom kemisk syntes, även om sådana metoder har varit framgångsrika i flera fall11,12. Med tillgången till avancerad genomisk och biokemisk teknik, enzymatiska produktionsplattformar har fått ökad uppmärksamhet för att producera en rad diterpenoida föreningar (se recensioner13,14, 15,16,17,18).

Alla terpenoider, inklusive diterpenoids, härrör från två isomeriska isoprenoidprekursorer, isopentenyldifosfat (IPP) och dimetylallyldifosfat (DMAPP)19 som i sin tur bildas genom Mevalonat (MVA) eller väg till metylerytritol-5-fosfat (MEP). Terpenoid biosyntes fortskrider genom MEP vägen i bakterier och MVA vägen i svampar, medan växterna besitter en cytosoliska MVA och en plastidial MEP väg, med den senare är den primära vägen mot diterpenoida formation20. Kondensation av IPP och DMAPP av av transferaser ger den centrala 20-Carbon föregångare till alla diterpenoids, geranylgeranyl Diphosphate (ggpp)20. Nedströms om ggpp-bildning, två enzym familjer, terpensynthaser (tpss) och cytokrom P450-monooxygenaser (P450s) kontrollerar till stor del bildandet av den stora kemiska mångfalden av terpenoid metabolism21,22. Diterpen syntaser (ditpss) katalysera den engagerade carbocation-driven cykliseringen och omplaceringen av ggpp att bilda olika stereospecifika bi-, Poly-, eller makro-cykliska diterpen ställningar1,3,23, 24. Syresättning och ytterligare funktionell dekoration av dessa ställningar sedan underlättas av P450-enzymer och välj andra enzym familjer22,25. TPSs och P450s finns vanligen som artspecifika, multi-Gene familjer som kan bilda modulära biosyntetiska nätverk, där kombinera olika enzymmoduler längs en gemensam skiss möjliggör bildandet av ett brett spektrum av föreningar2, 26. den snabba upptäckten av funktionellt distinkta enzymer verksamma i modulära terpenoid vägar under de senaste åren har gett expanderande möjligheter för deras användning som en mångsidig reservdelslista för metabolisk konstruktion av partiella eller kompletta vägar i både mikrobiella och växtbaserade produktionsplattformar. Till exempel, jäst (Saccharomyces cerevisiae) har tillämpats framgångsrikt att iscensätta flera enzym vägar för tillverkning av terpenoid bioprodukter, såsom malaria läkemedel Artemisinin27, den sesquiterpenoid biobränslen bisabolene och farnesene28, men också välja diterpenoids29,30,31. Likaså, konstruerade Escherichia coli plattformar för industriell skala tillverkning har fastställts för några diterpenoida metaboliter, inklusive Taxol föregångare taxadiene används som ett läkemedel mot cancer och diterpen alkohol, Sclareol , används inom doftindustrin13,32,33,34. Framstegen inom genteknik och omvandlingsteknik har också gjort växt värdsystem allt mer livskraftiga för produktion av vegetabiliska naturprodukter9,14,35,36. I synnerhet den nära tobak släkting, Nicotiana benthamiana, har blivit ett allmänt använt chassi för terpenoid väg analys och ingenjörskonst, på grund av den lätthet av Agrobacterium-medierad omvandling av flera gen kombinationer , effektiv biosyntes av endogena prekursorer och hög biomassa14,35,36.

Genom att rita på dessa etablerade plattformar för terpenoid biosyntes, beskriver vi här lättanvända och kostnadseffektiva metoder för enzymatisk produktion av diterpenoids och rening av enstaka föreningar. De presenterade protokollen illustrerar hur E. coli och N. benthamiana -plattformar konstruerade för förbättrad diterpenoida-prekursor-biosyntes kan utnyttjas för kombinatoriska uttryck av olika Ditpss-och P450-enzymer för att generera önskade diterpenoida föreningar. Tillämpning av detta protokoll för att producera och rena strukturellt olika diterpenoids visas genom exempel på specialiserade diterpenoids från majs (Zea mays), kallas dolabralexins, endogena biosyntes som rekryterar två diken och en P450 Enzym. Rening av olika dolabralexins allt från olefiner till syrenerade derivat uppnås sedan genom att kombinera separatorisk tratt utvinning med storskalig kiselkolonnkromatografi och förberedande högtrycks vätskekromatografi (HPLC). De beskrivna protokollen är optimerade för produktion av diterpenoids, men kan också lätt anpassas för relaterade terpenoid klasser, liksom andra naturliga produkter för vilka enzym resurser finns tillgängliga. Föreningar som framställs med denna metod lämpar sig för olika nedströms tillämpningar, inklusive men inte begränsat till, strukturell karakterisering via kärnmagnetisk resonans (NMR) analys, användning som substrat för enzym funktionella studier, och en rad bioaktivitetsanalyser.

Protocol

FÖRSIKTIGHET: de protokoll som beskrivs här omfattar användning av farliga kemikalier, vassa föremål, elektriska apparater, heta föremål och andra faror som kan resultera i skada. Lämplig personlig skyddsutrustning bör bäras, och lämpliga säkerhetsrutiner, inklusive säkerhetsutbildningar, bör följas.

1. beredning av material och lösningar

  1. Förbered och autoklav lysogeny buljong medium (LB) för 30 min: per 1 liter medium, blanda 10 g av Tryptone, 5 g av bakteriell jästextrakt, och 10 g NaCl och lös i 1 L avjoniserat (DI) vatten.
  2. För 1 L Co-Expression kulturer, förbereda och autoklav Terrific buljong (TB) medium för 30 min: i en 2,8 L Erlenmeyer kolv Blanda 12 g av Tryptone, 24 g av bakteriell jästextrakt, och 40 mL 10% (v/v) glycerol och lös i 860 mL DI vatten. Förbered och autoklav 1,3 L av 10X fosfatbuffert [1,3 L av DI vatten, 30,03 g av monokalium fosfat (KH2Po4), och 163,02 g av dikalium fosfat (K2HPO4)] och tillsätt till ovanstående medium.
  3. Förbered Super optimal buljong med Catabolite repression (SOC) media.
    1. Förbered och autoklav i 30 min en lösning som innehåller 2% (w/v) Tryptone, 0,5% (w/v) bakteriell jästextrakt, 8,5 mM NaCl, och 2,5 mM KCl.
    2. Tillsätt steril MgSO4 och glukos båda med en slutkoncentration på 20 mm. Använd 1 M NaOH för att justera till pH 7,0. Förvara SOC-mediet vid-20 ° c.
  4. Bered 1 L 1 M natriumpyruvat. Autoklav i 15 min och förvara vid 4 ° c.
  5. Bered 20 mL av 1 M isopropylalkohol β-D-1-tiogalactopyranosid (IPTG) i sterilt vatten. 1 – 2 mL-portioner vid-20 ° c.
  6. Förbered infiltrations bufferten: 10 mM MES (1,952 g) och 10 mM MgCl2 (2,033 g) upplöst i 1 L di vatten. Förvaras vid 4 ° c.
  7. Förbered och autoklavera LB agar för 30 min: per 100 mL DI vatten, tillsätt 1 g Tryptone, 0,5 g av bakteriell jästextrakt, 1 g NaCl, och 1,5 g agar. När LB agar är tillräckligt svalt för att hantera flaskan, tillsätt antibiotika som krävs för önskad plasmid kombinationer. Häll agar tallrikar med petriskålar och förvara vid 4 ° c.
    1. Se tabell 1 för specifikationer avseende sammansatt produktion i E. coli respektive N. benthamiana. Wrap plattor som innehåller rifampicin i folie för att förhindra nedbrytning vid förvaring.
Arbets koncentration (μg/mL)
Antibiotika Lager (mg/mL) Lösningsmedel 1 plasmid 2 plasmider 3 eller 4 plasmider
Carbenicillin 50 H2O 50 25 20
Kloramfenikol 30 EtOH 30 20 20
Kanamycin 50 H2O 50 25 20
Spektinomycin 30 H2O 30 25 20
Gentamycin 50 H2O 30
Rifampicin 10 MeOH 10

Tabell 1: antibiotiska koncentrationer för plasmid-Co-Expression i E. coli eller N. benthamiana.

2. produktion av diterpenoida metaboliter i E. coli

Anmärkning: det protokoll som beskrivs här för att producera diterpenoida metaboliter i E. coli har anpassats från en tidigare rapporterad enzym Co-Expression-plattform utvecklad av gruppen Dr Reuben J. Peters (Iowa State University, IA, USA)13 ,32.

  1. Omvandling av kompetenta celler med plasmid kombinationer.
    1. Tina kemiskt kompetenta E. coli -celler på is (BL21DE3-C41 celler användes i detta protokoll).
    2. Tillsätt 1 μL av en 100 ng/μL lösning av varje konstruktion som används för samuttryck till 25 μL av de behöriga cellerna i en 1,5 mL mikrotub. Skaka inte eller blanda med pipettering.
      Anmärkning: för optimalt uttryck och aktivitet av TPS-och P450-enzymer måste flera sekvensmodifieringar övervägas. För TPS är avlägsnande av N-terminalen plastidial transit peptid ofta viktigt. Specifikt, plastidial mono-och di-TPS kräver vanligtvis avlägsnande av den förväntade transit peptiden (med gemensamma förutsägelse algoritmer37), medan cytosoliska Sesqui-TPS kan vanligtvis användas som hellångt gener. När det gäller P450s, kodon optimering samt avlägsnande eller ersättning med ledaren sekvens makktsskgk av N-terminalen transmembrandomänen har visat sig effektiv i många fall38,39. Dessutom, när Co-uttrycker P450-enzymer en cytokrom P450-reduktas (CPR) bör inkluderas för att säkerställa tillräcklig P450-aktivitet.
    3. Inkubera blandningen på is i 30 min. Blanda var 10 minut genom att försiktigt skrapa röret över en mikrorör rack.
    4. Pre-Inkubera SOC media och LB agar plattor på 37 ° c som innehåller antibiotika som krävs för önskad kombination av konstruktioner.
      Anmärkning: varje konstruktion som ska Co-omvandlas måste ha en distinkt antibiotikaresistens, samt distinkta ursprung replikering för att säkerställa optimalt proteinuttryck.
    5. Värme chock cell blandningen vid 42 ° c i 1 minut, och sedan Inkubera på is i minst 2 min.
    6. Tillsätt 200 μL varm SOC-media.
    7. Skaka cell blandningen i 1 h vid 37 ° c och 200 rpm.
    8. Tillsätt ca 10 autoklaverade glaspärlor till den värmda LB-agarplattan. Tillsätt 100 μL av cell blandningen och sätt tillbaka locket. Skaka plattan horisontellt med locket på för att fördela cellerna jämnt. Ta bort glaspärlor genom att knacka dem i en avfallsbehållare. Alternativt kan du använda andra föredragna pläteringsmetoder.
    9. Inkubera LB-agarplattan vid 37 ° c över natten med den belagda ytan vänd nedåt. Plattan med transformerade E. coli -kolonier kan användas följande dag eller lagras vid 4 ° c förseglad i paraffin film i upp till 2 veckor.
  2. Beredning av inympningkulturer
    1. Nästa dag, Bered en lösning av LB-medium med antibiotika som krävs för den omvandlade plasmid-kombinationen med hjälp av de koncentrationer som anges i tabell 1.
    2. I en steril huva, överför 5 mL av LB medium till en 15 mL sterilt glas provrör med en plast ventilerande lock. Förbered en liten kultur röret för varje önskad stor (1 L) kultur.
    3. Välj enskilda E. coli -KOLONIER från lb-agarplattan med hjälp av en pipettspets. Inokulera varje tub med LB med en E. coli -koloni genom att mata ut en pipettspets som innehåller en utvald koloni i varje tub.
    4. Cap varje inympning odlingsprov röret med ett ventilerande plastlock. Placera den utjämnade E. coli små kulturer i en 37 ° c skaka inkubator för 12 – 24 h.
  3. Förberedelse och induktion av co-Expression kulturer
    1. På dagen efter, tillsätt 100 mL beredd 10X fosfatbuffert till 900 mL beredd TB för en slutlig fosfatbuffertkoncentration av 1x. Tillsätt nödvändiga antibiotika med koncentrationer enligt tabell 1.
    2. Skaka vid 140 rpm vid 37 ° c tills det är varmt (cirka 30 min).
    3. Inokulera varje kolv av media för 1 L kulturer med 5 mL inokuleringskultur. Behåll pipettspetsen som används för inokulering av inympningskulturen i inympningskulturröret så att det vid extraktion med organiskt lösningsmedel i efterföljande steg inte finns några extraherade plastföroreningar.
    4. Inkubera med skakning vid 200 rpm tills den optiska densiteten vid 600 Nm (OD600) når 0,6, cirka 3 h. För att mäta OD600 med en spektrofotometer, Använd en blandning av steril TB med fosfatbuffert som en blank.
    5. Vid önskad OD600ställer du in inkubatorinställningarna på 16 ° c.
    6. När Co-uttrycker P450s, nyförbered riboflavin och aminolevulinsyra, som är nödvändiga för tillräcklig P450 Co-Factor produktion. För varje experiment, gör 4 g/L riboflavin och 150 g/L aminolevulinsyra. Förvara lösningen insvept i folie tills den används, eftersom riboflavin är ljuskänsligt.
    7. Efter inkubatorn har nått 16 ° c (cirka 30 min), tillsätt 1 mL 1 M IPTG, 1 mL 4 g/L riboflavin och 1 mL 150 g/L aminolevulinsyra till varje kultur. För diterpenoida produktion, 25 mL 1 M natriumpyruvat bör tillsättas till varje kultur för att säkerställa tillräcklig prekursorer bildas.
      Anmärkning: alla konstruktioner som används i denna analys var under samma IPTG-inducible promotor. Olika projektansvariga kan användas som önskat.
    8. Inkubera vid 16 ° c och 140 RPM för 72 h. Tillsätt 25 mL natriumpyruvat varje påföljande dag efter induktion om du producerar diterpenoids. Omedelbart använda kulturer används omedelbart för separatorisk tratt utvinning av metaboliter; inte skörda eller lagra kulturer.

3. separation och rening av metaboliter

  1. Separatorisk tratt extraktion av metaboliter
    Observera: det är viktigt att endast använda glas och glaspipetter när du använder organiska lösningsmedel för att förhindra mjukgörare-föroreningar.
    1. Fäst separeringstratten på ett ring stativ i en draghuv. Placera en avfalls bägare under separatoritratten.
    2. Häll 500 mL av 50/50 (v/v) etylacetat/hexanes i separatoritratten.
      Anmärkning: lösningsmedels blandning bör justeras baserat på de riktade metaboliternas löslighet och polaritet. Vatten-blandbara lösningsmedel bör undvikas för att säkerställa lämplig fasseparation.
    3. Tillsätt 500 mL av E. coli -kulturen till separatoritratten och placera den på glas proppen.
    4. Skaka tratten för att blanda kulturen med extraktionsmedel, ungefär 5 – 10X. Ofta de-gas tratten genom att öppna tapp medan tratten hålls upp och ner och pekade in i draghuv för att frigöra tryck. Upprepa skakningen och de-gasproceduren 2x.
    5. Placera tratten upprätt i ring stativet och vänta tills lösningsmedels skiktet (överst) har separerat från vatten (kultur) lagret (botten), cirka 1 min.
      Anmärkning: när en stor mängd bubblor observeras i interfasen, tillsats av en liten volym av 5 – 10 mL EtOH kan tillsättas för att förbättra fasseparation.
    6. Ta bort proppen. Töm E. coli -skiktet i en avfalls bägare och behåll lösningsmedels skiktet i tratten.
    7. Upprepa proceduren med den återstående 500 mL av E. coli -kulturen och samma 500 ml spädningsvätska som används för den första extraktionen.
    8. Töm lösningsmedlet som innehåller de extraherade metaboliterna i en ren kolv. Undvik kontaminering med E. coli -kulturen.
  2. Koncentration av roterande avdunstning
    1. Förbered den roterande avdunstning (rotovap) utrustning: Fyll vattenbadet och ställa in temperaturen till 25 ° c. För värmekänsliga föreningar, Använd en lägre temperaturinställning eller tillsätt is till vattenbadet. Fyll kondenseringskammaren med torris och Ställ in rotationshastigheten på 60 – 80 varv/min.
    2. Tillsätt ca 700 mL av de extraherade metaboliterna till en 1 L evaporationskolv, fäst på rotovap och sänk in i vattenbadet. Vrid vattenbad värmaren på och Ställ till 25 ° c.
    3. Starta rotationen av avdunsningskolven, slå på vakuumsystemet och öka gradvis sugningen för att undvika att metaboliten snabbt kokas in i avfalls kolven. Avdunsta lösningsmedel bör börja kondensera och droppas i den kondensat-samlande (avfalls) kolven.
    4. När endast några få mL av metaboliten återstår i avdunningskolven, stoppa rotationer och Stäng av vakuumsystemet. Höj evaporationskolven och tryck ned den genom att stänga vakuum ledningen. Behåll koncentrerad metabolit lösning kvar i evaporationskolven. Kassera avfallet i avfalls kol ven.
    5. Fortsätt med roterande avdunstning genom att tillsätta upp till 700 mL ytterligare extraherad metabolitlösning till avdunstnings kol ven. Upprepa processen tills alla extraherade metaboliten lösningen har koncentrerats.
    6. Avlägsna de koncentrerade metaboliterna från evaporationskolven genom att föra över med en glaspipett till ett nytt provrör. Skölj avdunstnings kol ven med 5 mL 50/50 (v/v) etylacetat/hexaner eller önskad lösningsmedels blandning två gånger och överför Sköljlösningen till provröret.
    7. Förvara koncentrerade metaboliter vid-20 ° c eller-80 ° c (beroende på produktens stabilitet) tills den används ytterligare.
  3. Kvarts kolumn rening
    1. Förbered glas genom att skölja en 1 L bägare, glastratt, 50 mL provrör, och 3,2 L kromatografi kolonn (utrustad med ett glas fret) en gång med hexan och en gång med etylacetat. Märk 50 mL provrör, som kommer att användas för att samla fraktioner.
    2. Tillsätt 2 L kiselgel (230-400 mesh, sort 60) till en 3,2 L kromatografikolonn med en 2 L reservoarkapacitet och en fritted disk, sedan Ladda sand för att bilda ett 5 cm lager på toppen av kolonnen.
    3. Bered kolonnen för kromatografi genom att spola den grundligt med 2 L hexan. Hela tiden bör det finnas ett tunt (~ 0,5 cm) skikt av lösningsmedels vätskan ovanför sand skiktet i kolonnen för att säkerställa att kolonnen inte torkar ut eller förvärvar luftfickor. Ett glas inlopps adapter ansluten till en luftslang kan användas för att försiktigt öka flödet genom kolonnen snarare än gravitation ensam.
    4. Fyll på extraktet för koncentrerad metabolit (se avsnitt 3,2) på kolonnen. Skölj flaskan som innehöll provet 3x med hexan och tillsätt i kolonnen för att säkerställa att allt prov har överförts.
    5. Med hjälp av följande gradient, Ladda 100 mL i taget och samla 50 mL fraktioner i märkta provrör: 100% hexanes 3x, 10% (v/v) etylacetat i hexanes 3x, 12,5% (v/v) etylacetat i hexanes 3x, 15% (v/v) etylacetat i hexanes 3x , 20% (v/v) etylacetat i hexaner 3x, 40% (v/v) etylacetat i hexanes 3x, 60% (v/v) etylacetat i hexanes 3x, och 100% etylacetat 4x.
      Obs: gradient bör justeras baserat på sammansatt storlek och polaritet och önskad separation.
    6. Använd en glaspipett och överför 1 mL från varje fraktion till en märkt GC-flaska. Analysera varje prov via GC-MS för att avgöra vilka fraktioner innehåller de önskade metaboliterna och deras renhetsgrad.
      Anmärkning: den GC-MS-metod som lämpar sig för de metaboliter som framställs med denna metod har beskrivits i mafu et al. 201839. I korthet utfördes alla analyser på en GC med en XL MS-detektor med en HP-5MS-kolonn (se tabell över material), en provvolym på 1 μl och ugns temperaturramp från 50 ° c till 300 ° c vid 20 ° c min-1.
    7. När du har fastställt vilka fraktioner innehåller sammansatta (s) av intresse, kombinera alla fraktioner som innehåller samma förening. Kassera fraktioner som inte innehåller några föreningar i en avfallsbehållare. Upprepa det roterande avdunstnings förfarandet om det behövs för att koncentrera de renade metaboliterna.
    8. Om ytterligare rening är nödvändig, Använd (semi-) Preparative HPLC för att förbättra produktens renhet. HPLC-protokollen bör anpassas utifrån individuella utrustnings specifikationer och intresseföreningar.
      1. Omsuspendera torkade kiselkromatografiprover i 1 mL hexan (diterpenkolväten) eller acetonitril (oxygenerade diterpenoider), och filtrera genom en filter spruta för att förhindra kontaminering med små partiklar.
      2. För icke-polära diterpenoids, Använd en CN kolumn (se tabell över material) med en rekommenderad flödeshastighet på 1 ml/min och en hexan: etylacetat gradient, med fraktioner samlas var 1 minut.
      3. För Polar diterpenoids, Använd en C18-kolonn (se tabell över material) med en rekommenderad flödeshastighet på 3 ml/min och en acetonitril: vattengradient, med fraktioner som samlats in var 1 minut.
      4. Torka alla HPLC-renade fraktioner under en kväveström och Omsuspendera i 1 mL hexan före GC-MS-analys för att bedöma produktens överflöd och renhet.

4. produktion av diterpenoida metaboliter med hjälp av N. benthamiana

Anmärkning: det protokoll som beskrivs här för att producera diterpenoida metaboliter i N. benthamiana har anpassats från tidigare rapporterade studier35,36,40,41. Nedanstående protokoll är specifikt för spruta-infiltration av N. benthamiana blad. Andra infiltrations metoder, såsom vakuum infiltration är lika lämpliga. Binära T-DNA vektorsystem, såsom pCAMBIA130035Su (pLIFE33) eller peaq-HT40,41,42, som möjliggör förökning i E. coli och A. tumefaciens och genuttryck i anläggningen värdar är lämpligt för detta protokoll.

  1. Plantering Nicotiana benthamiana
    1. Fyll 1 750 mL kruka med krukväxtjord och vatten potten. Tillsätt ~ 20 tobaks frö och knacka försiktigt med fingret så att de är i marken. Täck inte med jord.
      Anmärkning: frön kan genereras genom själv pollinering för utsäde förökning. Frön för detta experiment erhölls från UC Davis Institutionen för växtbiologi, och är allmänt tillgängliga genom USDA arvsmassa repository (https://npgsweb.Ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450).
    2. Lämna potten i en tillväxt kammare med följande villkor, vattning varannan dag för att säkerställa att jorden inte torkar ut. Odla växter vid 26 ° c och 60% luftfuktighet med 16:8 h dag: natt cykel för alla steg i detta protokoll.
    3. Efter 1 vecka, Fyll ~ 20 krukor med krukväxtjord och vatten krukor. Med hjälp av tång, ta tag i en tobak plantor av stammen och försiktigt bort från källan potten, placera en planta i varje ny kruka och försiktigt gradning rötterna. Skada inte bladen eller rötterna.
    4. Vattenväxterna varannan dag genom att placera vatten i facket krukorna är i (även kallad "botten vattning"). Var fjärde vattning, inkludera generiska gödselmedel i vattnet enligt förpackningen instruktioner.
  2. Frys-Tina omvandling av Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 kompetenta celler
    1. Tina Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 (eller annan prioriterad stam) behöriga celler på isen (~ 1 h). Pre-Chill 0,2 mL microcentrifug rör på is. Varm SOC-media vid 28 ° c.
    2. Blanda försiktigt celler med Pipettera-spetsen (Pipettera inte upp och ned) och alikvot 15 μL celler för varje omvandling till de kylda 1,5 mL-mikrorören.
    3. Tillsätt 1-5 μL (~ 400 ng) DNA till varje tub med kompetenta celler och blanda försiktigt med skrapröret längs ett rör rack.
      Anmärkning: önskade konstruktioner behöver inte ha olika antibiotika motstånd eftersom de är varje omvandlas separat och kommer att blandas före infiltration.
    4. Placera mikrotuber i flytande kväve i 5 min.
    5. Ta bort mikrotuber från flytande kväve och placera rören på rummet-Temp rack. Tina rör i 5 min i 37 ° c inkubator.
    6. Tillsätt 250 μL av den förvärmda (28 ° c) SOC till varje mikrorör. Skaka vid 28 – 30 ° c, 225 rpm, för 3 h.
    7. Platta 50 μL av transformerade celler på LB-agarplattor som innehåller de nödvändiga antibiotika som beskrivs i tabell 1 med hjälp av sterila glaspärlor, enligt beskrivningen i steg 2.1.8.
    8. Inkubera plattorna inverterade vid 28 – 30 ° c för 48 h. tillväxt inom1: a dagen av inkubering kan vara ett tecken på kontaminering. Omvandlad A. tumifaciens kan användas efter 2-dagarsinkubering eller förvaras vid 4 ° c förseglad i paraffin film i upp till 2 veckor.
  3. Agrobacterium-medierad övergående enzym Co-uttryck i Nicotiana benthamiana
    1. Plommon 4-veckors gamla Nicotiana benthamiana växter 2 dagar före infiltration genom att ta bort nedre bladen. Lämna 4 översta bladen. Vattera växterna. Vatten inte växterna 24 h före infiltration för att möjliggöra öppen stomata och lättare infiltration.
    2. Tillsätt 10 mL LB med fungerande koncentrationer av lämplig antibiotika för valda konstruktioner och stammar av Agrobacterium (beskrivs i tabell 1) till ett 50 ml sterilt glas prov rör med ett folielock.
    3. Inokulera med hjälp av en pipett spets för att Svabb en enda koloni av transformerade Agrobacterium och mata spetsen i lb media. Varje Agrobacterium transformant bör ha minst 2 små kulturer.
    4. Inkubera över natten vid 28 ° c och 220 RPM.
    5. Mät den optiska densiteten vid 600 Nm (OD600) i nattkulturerna med hjälp av en spektrofotometer. Späd över natten kulturer till en OD600 av 1.
      Obs: optimala OD600 -värden kan variera när man använder andra Agrobacterium -stammar.
    6. Fördela 10 mL utspädd natt kultur i 50 mL koniska rör.
    7. Skörda bakterierna genom centrifugering vid 3500 rpm i 15 min vid rumstemp. Häll av och Kassera supernatanten.
    8. Återsuspendera kulturerna i 10 mL infiltrations buffert genom att försiktigt skaka röret och rulla på ett rör rack. OD600 bör vara lika med 1 för varje konstruktion.
    9. Generera de kombinationer som önskas för infiltreringar genom att kombinera lika volymer för varje transformerad cellinje. OD600 bör motsvara 1 för varje infiltration. Uppskatta 5 mL infiltrations lösning per blad, 2 blad per planta.
    10. Fäst rören horisontellt på en vippan och vagga försiktigt i 2 h vid rumstemperatur.
    11. Infiltrera ~ 2 blad per N. benthamiana anläggning med cirka 5 ml infiltrations blandning per blad. Infiltrera friska blad med en nålfri spruta på undersidan av bladen samtidigt som utövar ett mottryck med ett finger på ovansidan av bladet för att säkerställa infiltration lösning sufsäkringar blad vävnaden.
    12. Markera alla infiltrerade löv med en svart markör eller annan indikator. Placera infiltrerade växter i tillväxt kammaren i 5 dagar. Håll växterna väl vattnade.
      Observera: en inkubationstid på fem dagar har visat sig tillräcklig för att nå diterpenoida nivåer som är tillräckliga för de flesta nedströms analyser, samtidigt som tids effektiviteten i produkt bildningen bibehålls. Längre inkubationstider kan testas, där högre produktmängder krävs.
  4. Metabolit extraktion och rening från transformerade Nicotiana benthamiana
    1. Skörda infiltrerade löv från växter genom att klippa dem från växten. Tillsätt ~ 100 mL flytande kväve och ett enda blad till en murbruk, sedan slipa med hjälp av en murbruk och stöt eller vävnad kvarn tills få ett fint pulver.
    2. Tillsätt pulver vävnad till en GC-MS injektionsflaska till 500 μL avgränsning. Tillsätt 1,5 mL 50/50 (v/v) etylacetat/hexan eller önskad lösningsmedels blandning till injektionsflaskan och locket tätt.
      1. För uttryck som har testats för att ge de önskade produkterna, pool marken vävnad i en större kolv eller provrör, tillsätt sedan ~ 2x mängden lösningsmedel än vävnad volym och skaka över natten. Gå vidare till steg 4.4.5 för rening.
    3. Placera alla flaskor i en mikrorör rack och tejp ner tätt för att säkra. Extrahera under kraftig skakning över natten vid rumstemperatur.
    4. Överför 400 μL extrakt och 600 μL hexan till en ny injektionsflaska av GC-MS. Inte alikvot någon lövvävnad. Analysera prover med GC-MS med hjälp av metoden som beskrivs i steg 3.3.6.1.
    5. Efter analys via GC-MS för förekomst av önskade metaboliter, poolblad extrakt tillsammans och gå igenom roterande avdunstning, kiseldioxid kolonnkromatografi, och HPLC för att få rena föreningar som beskrivs i avsnitten 3,2 och 3,3.

Representative Results

Schematiskt arbetsflöde för diterpenoida produktion med E. coli
Figur 1 illustrerar det beskrivna arbetsflödet för diterpenoida produktion. Det protokoll som beskrivs här har anpassats från en tidigare beskrivna E. coli plattform för diterpenoida biosyntes13,32 för användning av större volym kulturer och rening av önskade diterpenoida produkter via kiseldioxid Kromatografi. För att demonstrera användningen av detta protokoll använde vi en nyligen identifierad dolabralexin-väg från majs som består av två diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) och ZmKSL4 (Zm00001d032858), en multifunktionell P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) och en cytokrom P450- reduktas (ZmCPR2, Zm00001d026483) (figur 2). I korthet var E. coli BL21DE3-C41 kompetenta celler föromvandlade med pcdfduet: IRS och pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 plasmider13,32. Den pCDFDuet: IRS plasmid innehåller viktiga enzymer för diterpenoida prekursorer produktion, inklusive 1-deoxy-D-Xylulose-5-fosfat syntas (DXS), 1-deoxy-D-Xylulose-5-fosfat reduktas (DXR), och isopentenyl Diphosphate Isomerase (IDI), och visade sig öka diterpenoida bildning i E. coli13. Den pACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmid innehåller majs ENT-copalyl Diphosphate syntas ZmAN2 och en ggpp syntas från Abies grandis. Enzymer som katalyserar de engagerade reaktionerna i dolabralexin-biosyntes var då samomvandlade som plasmider pET28b: ZmKSL4 och pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. För detaljer om sekvenser och plasmid konstruktioner se mafu et al. 201839.

En GC-MS kromatogram av de extraherade enzym produkterna visas i figur 3asom illustrerar bildandet av tre dolabralexin-föreningar, nämligen dolabradien (1,2 ± 0,25 mg/l-kultur), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l-kultur) och epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L kultur) som kvantifieras baserat på en standardkurva med hjälp av diterpenoida Sclareol. Sclareol användes som en referensstandard, på grund av dess liknande struktur och kemiska egenskaper jämfört med dolabralexins. Vanligtvis observerade mindre biprodukter inkluderar kloramfenikol, indol derivat oxindole och indol-5-aldehyd, och föregångaren geranylgeranyl Diphosphate (GGPP) (figur 3). Indole representerar vanligen den primära biprodukten, men visas inte här, på grund av dess retentionstid kortare än den inställda lösningsmedels fördröjningen på 7 min för att bevara integriteten hos GC-MS-instrumentet.

Schematiskt arbetsflöde för diterpenoida produktion med hjälp av N. benthamiana
Figur 4 visar en översikt över uttrycket av dolabralexin-vägen i N. benthamiana. För de produkter som beskrivs här, omformades följande konstruktioner separat i A. tumefaciens stam GV3101: pLife33: P19 (som uttrycker P19 genen som tystas suppressor protein), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Fullängds infödda sekvenser av majs dolabralexin Pathway gener användes i den binära T-DNA-vektorn pLife3341 med kanamycin resistens för förökning i E. coli och A. tumefaciens. Co-Expression av uppströms terpenoid Pathway gener är frivilligt, eftersom föregångaren geranylgeranyl Diphosphate är endogent bildas i N. benthamiana. Emellertid, flera studier har framgångsrikt använt sådana metoder för att öka diterpenoida bildandet i N. benthamiana14,36,41. Som illustreras i figur 3producerade Co-Expression framgångsrikt dolabradiene och 15, 16-epoxydolabrene. Till skillnad från enzym Co-Expression i E. coli, var 15, 16-epoxydolabranol inte detekteras i metabolit extrakt.

Förekomst av 15, 16-epoxydolabrene i blad extrakt visat aktiviteten hos CYP71Z18 i N. benthamiana. Eftersom 15, 16-epoxydolabranol visades vara stabil efter extraktion från mikrobiella kulturer (figur 3) samt efter isolering från majs rot vävnader i tidigare studier39, förefaller det rimligt att den hydroxylerade produkten är glykosylerat av endogena glykosyltransferaser och därefter beslagtagna i vacuole, vilket gör den otillgänglig för extraktion med blandningar av organiska lösningsmedel som används här för extraktion36,43,44,45 ,46. Liknande oönskade produktändringar i samband med vägteknik i N. benthamiana har rapporterats i tidigare studier47. Som visas för co-Expression i E. coli, övergående uttryck i N. benthamiana resulterar i utvinning av flera biprodukter, inklusive linjära alkaner av olika kedjelängd som bygger på jämförelse med referensmassa Spectra databaser. Sammansatta titrar utvinns ur blad material befanns vara i genomsnitt 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene och 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene per g torr bladvävnad. Dessa titrar kan inte jämföras direkt med co-Expression-systemet E. coli givet de olika experimentella uppställningar.

Diterpenoid rening
Diterpenoid rening uppnåddes med hjälp av kiselkolonnkromatografi och efterföljande semi-Preparative HPLC. Metaboliten extrakt från 12 L av poolade E. coli kulturer renades med hjälp av kiselkolonnkromatografi att separera de tre fokala dolabralexin föreningar (figur 3a). Kiselkromatografi är idealisk för att uppnå hög renhet av mål föreningarna, eftersom det möjliggör enkel separation av diterpen olefiner och syrade derivat, och lätt avlägsnar det stora föroreningar, oxindole, som behålls på kiseldioxid matris ( Figur 3a).

Figure 1
Figur 1: arbetsflöde för diterpenoida produktion i E. coli och metabolit rening från flytande bakteriekulturer. Streckade rutor avbildar valfria steg där ytterligare rening krävs. (A) representativ bild av extraherad E. coli -kultur med en separatorisk tratt. (B) representativ bild av metaboliten extrakt rening med hjälp av kiselkromatografi.   Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Dolabralexin biosyntetisk väg och gen konstruktioner som används i denna studie. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: GC-MS resultat. Visas är representativa GC-MS kromatogram av renade diterpenoida produkter som erhållits med hjälp av enzym Co-Expression-analyser i (a) E. coli och (B) N. benthamiana. Produkt identifieringar baseras på jämförelser med autentiska standarder och referensmassa spektra av det nationella institutet för standarder och teknik (NIST) Mass spektralbibliotek. 1, oxindole; 2, indol-5-aldehyd; 3, pyrrolo [1,2-a] pyrazin-1,4-Dione, hexahydro-3-(2-metylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromofenyl] Thio]-a-d-glukosid S, S-dioxid; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] pyrazin-1,4-Dione, hexahydro-3-(fenylmetyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 och 12, okänd; 10, kloramfenikol; 11, 3, 7, 11, 15-tetrametyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkaner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Diterpenoid produktion i N. benthamiana. (A) arbetsflöde av diterpenoida produktion i N. benthamiana och metabolit rening från blad material. Brepresentativ bild av N. benthamiana -plantor som är redo för infiltrations experiment, före beskärning. Crepresentativa bilder av N. benthamiana -växter efter beskärning. (D) bild av sprutinfiltrerade löv. Mörkare områden har infiltrerats. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Bredare undersökning och tillämpning av diterpenoida naturliga produkter kräver enkla, billiga protokoll för att syntetisera och rena tillräckliga mängder av önskade föreningar. Den snabba ökningen av antalet tillgängliga diterpenoid-metaboliska enzymer från ett brett spektrum av arter ger nu en expansiv inventering för enzymatisk produktion av diterpenoids med hjälp av mikrobiella och växtbaserade värdsystem. Dessutom, den modulära arkitekturen i många diterpenoida vägar möjliggör användning av enzymer från samma eller olika arter i "Plug & Play" kombinatorisk teknik metoder för att generera en rad naturliga och nya natur-liknande diterpenoida Natural produkter2,14,26,35.

E. coli är en rekommenderad mikrobiell värd för naturlig produkt biosyntes på grund av dess robusthet, lätthet av skalbarhet, begränsad kemisk komplexitet för minskad biprodukt förorening, och den rikedom av tillgängliga verktyg för DNA-montering och uttryck Optimering. Enligt vår erfarenhet, den plattform som beskrivs här är väl lämpad för att producera produkt avkastning på upp till flera hundra mg diterpen olefiner och alkoholer, som är lämplig för många nedströms tillämpningar inklusive de som föreslås här. Även om inte uppfyller industriell skala, den produktionsplattform som beskrivs här kan fungera som en grund för ytterligare väg, värd och jäsning optimering som har framgångsrikt visat för relaterade diterpenoids såsom taxadiene och Sclareol33 ,34. Överuttryck av hastighetsbegränsande MVA-eller MEP-utbildninggener har framgångsrikt etablerats för att övervinna avkastnings begränsande faktorer för diterpenoida biosyntes, såsom otillräcklig prekursorer tillgång och prekursor Flux i konkurrerande vägar13, 32,33,39. Även om det visat sig framgångsrikt i flera studier, dålig uttryck och katalytisk aktivitet av terpenoid-metabolisk eukaryotisk P450s och andra membran-bundna enzymer i E. coli är en sannolik begränsande faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Användning av Codon-optimerade sekvenser och proteinmodifikationer, såsom avlägsnande av endoplasmatiska Retikulum signal peptid eller införande av en plastidial signal peptid, har visat sig användbar för att öka lösliga P450-uttryck14,38 ,49,50,53. Sådana modifieringar användes också för det mikrobiella samuttrycket av majs CYP71Z1839 som användes som exempel väg i denna studie. De beskrivna protokollen bygger på användning av plasmider som transporterar en eller två gener per konstruktion, allt under samma inducerbara promotor. Om större gen kombinationer önskas, är det tillrådligt att använda olika tillgängliga multi-Gene kassetter eller gen stapling system för att minska minskad omvandling effektivitet och kultur tillväxt på grund av användning av flera plasmider och antibiotika13 .

Med den bredare tillgången på genetik och genomik resurser, växt värdsystem blir också allt mer lämpade för tillverkning av naturprodukter. Fördelar inkluderar förmågan hos växter att producera de nödvändiga naturliga prekursorer som drivs av fotosyntes, vilket möjliggör produkt bildning utan att behöva komplettera föregångare molekyler54,55. N. benthamiana används redan i stor utsträckning för in vivo funktionell karakterisering och kombinatoriskt uttryck av terpenoid och andra naturliga produkt vägar14,35,36,40 . Anmärkningsvärda fördelar med att använda N. benthamiana som värdsystem inkluderar endogena produktionen av diterpenoida prekursorer, användning av infödda gensekvenser, förenklat uttryck för eukaryota P450s, enkel kombinatorisk gen omvandling (som separata antibiotika krävs inte för övergående Co-Transformation), och enkel extraktion av målprodukter från blad material. Vid behov kan diterpenoida produktion förbättras genom Co-Expression av viktiga MEP-utbildninggener för att öka föregångaren Supply36,41. Begränsningar för skalbar diterpenoida produktion i N. benthamiana är mer komplexa jämfört med flytande mikrobiella kulturer på grund av behovet av att generera tillräcklig växtbiomassa, mer arbetsintensiva produkt rening från kemiskt komplexa växtvävnad, och eventuell oönskad metabolisering av målprodukter genom exempelvis oxidation, glykosylering eller Defosforylering av endogena enzymer36,43,44,45 ,46,47. Emellertid, detta förfarande kan skalas upp till mg produktkvantiteter genom att öka antalet växter som används för agroinfiltration56.

De protokoll för extraktion och rening av produkter som beskrivs här är kompatibla med E. coli och N. benthamiana, samt S. cerevisiae och andra växt-eller mikrobiella värdsystem, och ger ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt som är lätt att inrättas i både biologi och kemi laboratorier och kräver inte dyr renings utrustning. Metaboliten extraktion med separatoritratten lämpar sig väl för effektiv extraktion och fasseparation före kromatografisk rening. Trattstorlekar kan lätt justeras för att möjliggöra större kultur volymer och minska experimentell tid som behövs för att extrahera från stora kulturer. Vi fann att användningen av en hexan/etylacetat lutning vara idealisk för extraktion diterpenoids av olika polaritet som visas här för den grupp av dolabralexins som omfattar både kolväten och syrade föreningar (figur 3). Beroende på egenskaperna hos målprodukter kan andra lösningsmedelsblandningar vara fördelaktiga. Lösningsmedel får dock inte vara blandbara med vatten för att säkerställa en lyckad extraktion och fasseparation med hjälp av separatorisk tratt teknik. Dessutom måste produktförlust genom avdunstning beaktas vid användning av denna metod för framställning av flyktiga organiska föreningar (VOC), såsom lägre molekylvikt mono-och Sesqui-terpenoider och andra VOC. Kromatografisk separation av diterpenoider av olika nivåer av syresättning med hjälp av en större skala (~ 2 L) kiseldioxid kolumn har varit fördelaktigt i vår erfarenhet, eftersom det ger förbättrad produkt separation och minimerar behovet av iterativ rening steg när du använder mindre kolumn volymer. Kolumn volymer och matriser kan justeras efter behov för önskad kultur volym och typ av naturprodukt. Renheten hos målprodukter som kan uppnås med hjälp av detta protokoll lämpar sig för många nedströmsapplikationer, såsom bioaktivitetsanalyser eller för användning i enzym aktivitetsanalys. Men där högre renhetsnivåer krävs, såsom strukturella analyser via NMR, kan produktens renhet förbättras effektivt genom ytterligare rening med hjälp av (semi)-Preparative HPLC.

Detta protokoll som beskrivs här har optimerats för produktion av diterpenoida naturliga produkter, men kan också lätt anpassas till relaterade mono-, sesqui-och Tri-terpenoider, samt andra naturliga produktklasser helt enkelt genom att generera den önskade enzym moduler för kombinatoriskt uttryck14,57. Ändringar av förfarandena för extraktion och rening av produkter måste dock beaktas för föreningar med högre volatilitet, såsom mono-och Sesqui-terpenoider, eller högre polaritet och funktionell modifiering som exemplifieras av glykosylering av många triterpenoider, fenylpropanoider och andra naturliga produktklasser.

Även industriell skala plattformar för tillverkning av naturliga produkter finns, de protokoll som beskrivs här erbjuder ett billigt, anpassningsbart verktyg som lätt kan inrättas i de flesta laboratorier. Som framgår av produktionen av majs dolabralexins här och på andra ställen39, de produktkvantiteter och renhet som kan uppnås med hjälp av denna metod är vanligtvis tillräckligt för att underlätta olika nedströms analys och användningsområden, inklusive, men inte begränsad till, olika bioaktivitet studier, analys av interaktioner mellan organismer, samt för användning som enzymsubstrat eller som utgångsmaterial för semi-syntesmetoder.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi erkänner tacksamt Dr Reuben Peters (Iowa State University, USA) för att tillhandahålla pIRS och pGGxZmAN2 konstruktioner. Finansiellt stöd för detta arbete av NSF växt-biotic interaktioner program (Grant # 1758976 till P.Z.), DOE Early karriär Research program (Grant # DE-SC0019178 till P.Z.), DOE gemensamma Genome Institute gemenskapen Science program (Grant # CSP2568 till P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship program (till K.M.M.), och en UC Davis Dean ' s mentorskap Award Fellowship (till K.M.M.) är tacksamt erkänt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent -
7890B GC Agilent -
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

Biokemi diterpenoida biosyntes Co-Expression diterpen syntas cytokrom P450 monooxygenas Nicotiana benthamiana Zea mays växt specialiserad metabolism
En anpassningsbar metod för enzymatisk produktion och rening av Diterpenoid naturliga produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., … More

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter