Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/59992
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Plant Biology, University of California Davis

Summary

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Abstract

Diterpenoidler, yaşam krallıkları arasında yaygın olarak dağıtılan ve gelişimsüreçlerinde, organizmalar arası etkileşimlerde ve çevresel adaptasyonda kritik biyolojik işlevlere sahip olan çeşitli küçük moleküllü doğal ürünler sınıfı oluştururlar. Bu çeşitli biyoaktiviteler nedeniyle, birçok diterpenoidler de ilaç, gıda katkı maddeleri, biyoyakıt ve diğer biyoürünler gibi ekonomik öneme sahiptir. Gelişmiş genomik ve biyokimyasal yaklaşımlar diterpenoid-metabolik genler, enzimler ve yollar bilgisinde hızlı bir artış sağlamıştır. Ancak, diterpenoidlerin yapısal karmaşıklığı ve tek tek bileşiklerin dar taksonomik dağılımı genellikle sadece tek bir tür verimli üretim için kısıtlayıcı faktörler olmaya devam etmektedir. Metabolik enzimlerin daha geniş bir yelpazede durumu şimdi yeterli titre ve saflık taditerpenoidler üretmek için bu önemli metabolit grubunun daha derin bir araştırma kolaylaştırmak için kaynak sağlar. Mikrobiyal ve bitki bazlı enzim ko-ekspresyonu için yerleşik araçlardan yararlanılarak, Escherichia coli veya Nicotiana benthamiana'daditerpenoidlerin enzimatik üretimi için kolay işletilen ve özelleştirilebilir bir protokol salıyoruz ve silika kromatografisi ve yarı preparatif HPLC ile istenilen ürünlerin saflaştırılması. Örnek olarak mısır(Zea mays)dolabralexin diterpenoids grubunu kullanarak, farklı diterpenoid iskeleler oluşturmak için diterpen synthase (diTPS) ve sitokrom P450 monooksijenaz (P450) enzimlerinin modüler kombinasyonlarının nasıl kullanılabileceğini vurguluyoruz. Saflaştırılmış bileşikler, metabolit yapısal analizleri, enzim yapısı-fonksiyon çalışmaları, in vitro ve planta biyoaktivite deneyleri gibi çeşitli downstream uygulamalarında kullanılabilir.

Introduction

Diterpenoidler 12.000'den fazla kimyasal olarak çeşitli bir grup oluşur ağırlıklı olarak polisiklik 20-karbon doğal ürünler birçok organizmalar da kritik rol oynamaktadır1. Mantarlar ve bitkiler diterpenoidlerin en büyük çeşitliliği üretmek, ancak bakteriler de biyoaktif diterpenoidler oluşturmak için gösterilmiştir (değerlendirmeleri bakınız2,3,4,5). Kökleri geniş yapısal çeşitliliklerine dayanan diterpenoidler çok sayıda biyolojik fonksiyona hizmet ederler. Gibberellin büyüme hormonları gibi birkaç diterpenoids, gelişimsel süreçlerde temel fonksiyonlara sahip5. Ancak, diterpenoidlerin çoğunluğu kimyasal savunma ve organizmalar arası etkileşimlerin arabulucuları olarak hizmet vermektedir. Bunlar arasında, kozalaklı ağaçların haşere ve patojen savunma sındaki diterpene reçine asitleri ve mısır (Zea mays)ve pirinç(Oryza sativa)gibi büyük gıda ürünlerinde antimikrobiyal diterpenoidlerin türe özgü karışımları en yaygın olarak 6,7okudu . Bu biyoaktiviteler ticari uygulamalar için zengin bir kimyasal depo sağlar ve belirli diterpenoidler önemli ilaçlar, gıda katkı maddeleri, yapıştırıcılar ve günlük modern yaşamın diğer biyoürünleri olarak kullanılır8,9 ,10. Diterpenoidlerin doğal çeşitliliği ve biyolojik işlevleri üzerine araştırmayı ilerletmek ve sonuçta daha geniş ticari uygulamaları teşvik etmek için, saf bileşiklerin uygun maliyetli hazırlanması için araçlar gereklidir. Posa ve kağıtendüstrisininbir yan ürünü olarak üretilen diterpene reçine asitler gibi birkaç diterpenoid biyoürünler için bitki materyalinden büyük ölçekli izolasyon oluşturulmuştur. Ancak, sadece belirli dokularda diterpenoidlerin birikimi ve çevre uyaranları tarafından sıkı düzenleme altında genellikle doğal üretici den yeterli ürün miktarlarının izolasyon sınırlar2. Buna ek olarak, diterpenoidlerin yapısal karmaşıklığı kimyasal sentez yoluyla üretim engeller, bu tür yaklaşımlar çeşitli durumlarda başarılı olmasına rağmen11,12. Gelişmiş genomik ve biyokimyasal teknolojilerin kullanılabilirliği ile, enzimatik üretim platformları diterpenoid bileşikleri bir dizi üretmek için artan dikkat kazanmıştır (değerlendirmeleri 13 bakınız13,14, 15,16,17,18).

Diterpenoidler de dahil olmak üzere tüm terpenoidler, iki izorik izoprenoid öncülleri türetilmiştir, izopentenil difosfat (IPP) ve dimetildil difosfat (DMAPP)19, sırayla, mevalonat (MVA) veya oluşur methylerythritol-5-fosfat (MEP) yolu. Terpenoid biyosentez bakterilerde MEP yolu ve mantarlarda MVA yolu ile ilerler, bitkiler bir sitosolik MVA ve plastidial MEP yolu sahip ise, ikincisi diterpenoid oluşumuna doğru birincil yol olmak20. Prenyl transferazları ile IPP ve DMAPP yoğuşması tüm diterpenoidler, geranylgeranyl difosfat (GGPP)20merkezi 20 karbon öncüsü verir. GGPP oluşumunun downstream, iki enzim aileleri, terpen synthases (TPSs) ve sitokrom P450 monooksijenazlar (P450s) büyük ölçüde terpenoid metabolizmasının geniş kimyasal çeşitliliğin oluşumunu kontrol21,22. Diterpen synthases (diTPSs) kararlı karbocation odaklı siklizasyon ve ggpp yeniden düzenlenmesi katalize çeşitli stereospesifik bi-, poli- veya makro-siklik diterpen iskeleler1,3,23, 24. yıl. Oksijenasyon ve bu iskelelerin daha fonksiyonel dekorasyon sonra P450 enzimleri tarafından kolaylaştırılmış ve diğer enzim aileleri seçin22,25. TPSs ve P450s yaygın olarak türlere özgü olarak var, modüler biyosentetik ağlar oluşturabilirsiniz çok genli aileler, ortak bir plan boyunca farklı enzim modülleri birleştirerek bileşiklerin geniş bir yelpazede oluşumunu sağlar2, 26- Son yıllarda modüler terpenoid yollarda faaliyet gösteren işlevsel olarak farklı enzimlerin hızlı keşfi, kısmi veya tam yolların metabolik mühendisliği için çok yönlü bir parça listesi olarak kullanımları için genişleyen fırsatlar sağlamıştır hem mikrobiyal hem de bitki bazlı üretim platformları. Örneğin, maya(Saccharomyces cerevisiae) terpenoid biyoürünlerin üretimi için çok enzimli yollar mühendisi başarıyla uygulanmıştır, antimalarial ilaç artemisinin gibi27, sesquiterpenoid biyoyakıt bisabolene ve farnesene28, ama aynı zamanda diterpenoidsseçin 29,30,31. Aynı şekilde, endüstriyel ölçekli üretim için tasarlanmış Escherichia coli platformları birkaç diterpenoid metabolitleri için kurulmuştur, Taxol öncütakteri taksonen bir anti-kanser ilaç ve diterpen alkol olarak kullanılan dahil, sclareol , koku sektöründe kullanılan13,32,33,34. Genetik mühendisliği ve dönüşüm teknolojilerindeki gelişmeler de bitki konak sistemleri giderek bitki doğal ürünler9,14,35,36üretmek için uygun hale getirmiştir. Özellikle, yakın tütün akrabası, Nicotiana benthamiana, terpenoid yol analizi ve mühendislik için yaygın olarak kullanılan bir şasi haline gelmiştir, Agrobacteriumkolaylığı nedeniyle -birden fazla gen kombinasyonları aracılı dönüşüm , endojen öncüllerin verimli biyosentezi, ve yüksek biyokütle14,35,36.

Terpenoid biyosentez için bu kurulan platformlardan yola çıkarılarak, burada diterpenoidlerin enzimatik Ã1/4retimi ve tek bileşiklerin arınması için kullanılabilir ve maliyet etkin lÃ1/4ksler kullanılıyor. Sunulan protokoller, gelişmiş diterpenoid öncül biyosentez için tasarlanmış E. coli ve N. benthamiana platformlarının farklı diTPS'lerin ve P450 enzimlerinin kombinatoryal ekspresyonunda nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. istenilen diterpenoid bileşikler. Yapısal olarak farklı diterpenoidler üretmek ve arındırmak için bu protokolün uygulanması mısır(Zea mays),dolabralexins, endojen biyosentez olarak adlandıran uzman diterpenoidler örneği ile gösterilir hangi acemi iki diTPS ve bir P450 Enzim. Olefinlerden oksijenli türevlerine kadar farklı dolabalexinlerin saflaştırılması, daha sonra ayırıcı huni ekstraksiyonunun büyük ölçekli silika sütun kromatografisi ve preparatif yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile birleştirilmesiyle elde edilir. Açıklanan protokoller diterpenoidüretimi için optimize edilmiştir, ancak ilgili terpenoid sınıfları ve enzim kaynaklarının mevcut olduğu diğer doğal ürünler için de kolayca uyarlanabilir. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen bileşikler, nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi ile yapısal karakterizasyon, enzim fonksiyonel çalışmalar için substrat olarak kullanılması ve biyoaktivite tahlilleri.

Protocol

DİkKAT: Burada açıklanan protokoller tehlikeli kimyasalların, keskin nesnelerin, elektrikli cihazların, sıcak nesnelerin ve yaralanmaya neden olabilecek diğer tehlikelerin kullanımını içerir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmeli ve güvenlik eğitimleri de dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürleri izlenmelidir.

1. Malzeme ve çözümlerin hazırlanması

  1. Hazırlamak ve otoklav lysogeny suyu orta (LB) için 30 dakika: Orta 1 L başına, mix 10 g tripton, bakteriyel maya ekstresi 5 g, ve NaCl 10 g ve deiyonize 1 L (DI) su içinde çözünür.
  2. 1 L co-ekspresyon kültürleriçin, hazırlamak ve otoklav Müthiş Suyu (TB) 30 dakika için orta: Bir 2.8 L Erlenmeyer şişe karışımı 12 g tripton, 24 g bakteriyel maya ekstresi, ve 40 mL 10% (v / v) gliserol ve 860 mL DI su çözünür. Hazırlamak ve otoklav 1.3 L 10x fosfat tampon [1.3 L DI su, 30.03 g monopotasyum fosfat g (KH2PO4),ve dipotasyum fosfat 163.02 g (K2HPO4)] ve yukarıdaki orta ekleyin.
  3. Catabolit baskı (SOC) medya ile Super Optimal suyu hazırlayın.
    1. Hazırlamak ve 30 dk bir çözelti içeren 2% (w / v) tripton, 0.5% (w / v) bakteriyel maya ekstresi, 8.5 mM NaCl ve 2.5 mM KCl.
    2. Steril MgSO4 ve 20 mM son konsantrasyonu ile glikoz ekleyin. pH 7.0'a ayarlamak için 1 M NaOH kullanın. SOC ortamını -20 °C'de saklayın.
  4. 1 L 1 M sodyum pirüvat hazırlayın. 15 dk için otoklav ve 4 °C'de saklayın.
  5. Steril DI suda 20 mL 1 M izopropil β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) hazırlayın. -20 °C'de 1-2 mL aliquots saklayın.
  6. Infiltrasyon tamponunu hazırlayın: 10 mM MES (1.952 g) ve 10 mM MgCl2 (2.033 g) 1 L DI suda çözünmüştür. 4 °C'de saklayın.
  7. Hazırlamak ve otoklav LB agar için 30 dk: DI su 100 mL başına, tripton 1 g ekleyin, bakteriyel maya ekstresi 0.5 g, NaCl 1 g, ve agar 1.5 g. LB agar şişe işlemek için yeterince serin bir kez, istenilen plazmid kombinasyonları için gerekli antibiyotik ekleyin. Petri kaplarını kullanarak agar tabakları dökün ve 4 °C'de saklayın.
    1. E. coli ve N. benthamiana'dakibileşik üretime ilişkin spesifikasyonlar için tablo 1'e bakınız. Depolama üzerinde bozulmasını önlemek için folyo içinde rifampisin içeren sargı plakaları.
Çalışma konsantrasyonu (μg/mL)
Antibiyotik Stok (mg/mL) Solvent 1 plazmid 2 plazmid 3 veya 4 plazmid
Carbenicillin 50 H2O 50 25 20
Kloramfenikol 30 EtOH 30 20 20
Kanamisin 50 H2O 50 25 20
Spektinomisin 30 H2O 30 25 20
Gentamisin 50 H2O 30
Rifampisin 10 MeOH 10

Tablo 1: E. coli veya N. benthamianaplazmid ko-ekspresyonu için antibiyotik konsantrasyonları .

2. E. coli diterpenoid metabolitlerinin üretimi

NOT: E. coli diterpenoid metabolitleri üretmek için burada açıklanan protokol Dr. Reuben J. Peters (Iowa State University, IA, ABD)13 grubu tarafından geliştirilen daha önce bildirilen enzim ko-ekspresyon platformu ndan uyarlanmıştır ,32.

  1. Plazmid kombinasyonları ile yetkin hücrelerin dönüşümü.
    1. Bu protokolde kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerinin buz üzerinde çözülmesi (BL21DE3-C41 hücreleri kullanılmıştır).
    2. 1,5 mL'lik bir mikrotüpteki 25 μL'lik yetkin hücreye ortak ifade için kullanılan her yapının 1 00 ng/μL çözeltisinin 1 000 ng/l çözeltisini ekleyin. Borulama ile girdap veya karıştırmayın.
      NOT: TPS ve P450 enzimlerinin optimal ekspresyonu ve aktivitesi için birkaç dizi modifikasyonunun dikkate alınması gerekir. TPS için, N-terminal plastidial transit peptid çıkarılması genellikle gereklidir. Özellikle, plastidial mono- ve di-TPS genellikle öngörülen transit peptid kaldırılması gerektirir (ortak tahmin algoritmaları kullanarak37), sitosolik sesqui-TPS genellikle tam uzunlukta genler olarak kullanılabilir. P450s ile ilgili olarak, kodon optimizasyonu yanı sıra kaldırma veya n-terminal transmembran etki alanının lider dizisi MAKKTSSKGK ile değiştirme birçok durumda etkili olduğu kanıtlanmıştır38,39. Buna ek olarak, p450 enzimleri birlikte ifade ederken yeterli P450 aktivitesisağlamak için bir sitokrom P450 redüktaz (CPR) dahil edilmelidir.
    3. Karışımı 30 dk buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Tüpü mikrotüp rafına hafifçe kazıyarak her 10 dakikada bir karıştırın.
    4. Pre-incubate SOC medya ve LB agar plakaları 37 °C'de istenilen yapı kombinasyonu için gerekli antibiyotikler içerir.
      NOT: Birlikte dönüştürülecek her yapının farklı bir antibiyotik direncinin yanı sıra optimal protein ekspresyonunu sağlamak için farklı çoğaltma kökenleri olmalıdır.
    5. Isı şok 42 °C'de hücre karışımı 1 dakika, ve sonra en az 2 dakika buz üzerinde kuluçka.
    6. 200 μL sıcak SOC ortamı ekleyin.
    7. Hücre karışımını 37 °C'de 1 saat ve 200 rpm'de çalkalayın.
    8. Isıtılmış LB agar plakaya yaklaşık 10 otoklavcam boncuk ekleyin. Hücre karışımının 100 μL'sini ekleyin ve kapağı değiştirin. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için kapağı ile yatay olarak plakayı çalkalayın. Bir atık kabıiçine dokunarak cam boncuk çıkarın. Alternatif olarak, diğer tercih edilen kaplama yöntemleri kullanın.
    9. LB agar plakasını bir gecede 37 °C'de, kaplamalı yüzeyi yüzüstü kılıklı olarak kuluçkaya yatırın. Dönüştürülmüş E. coli kolonili plaka ertesi gün kullanılabilir veya 4 °C'de 2 haftaya kadar parafin filmle saklanabilir.
  2. Aşılama kültürlerinin hazırlanması
    1. Ertesi gün, Tablo 1'deverilen konsantrasyonları kullanarak dönüştürülmüş plazmid kombinasyonu için gerekli antibiyotikler ile LB ortamının bir çözeltisi hazırlayın.
    2. Steril bir başlıkta, 5 mL LB orta sını plastik nefes alabilen bir kapaklı 15 mL steril cam test tüpüne aktarın. Her istenilen büyük (1 L) kültür için küçük bir kültür tüpü hazırlayın.
    3. Bir pipet ucu kullanarak LB agar plaka bireysel E. coli kolonileri seçin. LB'nin her tüpünü, her tüpe seçilmiş bir koloni içeren bir pipet ucu atarak bir E. coli kolonisi ile aşılayın.
    4. Kap bir nefes plastik kapak ile her aşıkültür test tüpü. Kapaklı E. coli küçük kültürleri 37 °C'lik sallayarak kuvöze 12-24 saat yerleştirin.
  3. Ortak ifade kültürlerinin hazırlanması ve indüksiyonu
    1. Ertesi gün, 1x son fosfat tampon konsantrasyonu için 900 mL hazırlanmış TB için hazırlanan 10x fosfat tampon 100 mL ekleyin. Tablo 1'egöre konsantrasyonları ile gerekli antibiyotikleri ekleyin.
    2. 37 °C'de 140 rpm sıcak (yaklaşık 30 dk) kadar çalkalayın.
    3. Aşılama kültürünün 5 mL'si ile 1 L kültürleriçin her bir ortam şişesi aşıla. Aşılama kültür tüpünde aşılama kültürü aşılamaiçin kullanılan pipet ucunu saklayın, böylece sonraki adımlarda organik çözücü ile ekstraksiyon üzerine, ayıklanmış plastik kirletici madde bulunmaz.
    4. 600 nm (OD600)optik yoğunluğu 0,6, yaklaşık 3 saat ulaşana kadar 200 rpm sallayarak inkübül. OD600'ü spektrofotometre ile ölçmek için, steril tüberküloz karışımını fosfat tamponu ile boş olarak kullanın.
    5. İstenilen OD600'dekuvöz ayarlarını 16 °C olarak ayarlayın.
    6. P450'leri birlikte ifade ederken, yeterli P450 kofaktör üretimi için gerekli olan riboflavin ve aminolevulinik asiti taze olarak hazırlayın. Her deney için, 4 g / L riboflavin ve 150 g / L aminolevulinik asit olun. Riboflavin ışığa duyarlı olduğu için çözeltiyi kullanıma kadar folyoya sarın.
    7. Kuluçka makinesi 16 °C'ye (yaklaşık 30 dk) ulaştıktan sonra, her kültüre 1 mL 1 M IPTG, 1 mL 4 g/L riboflavin ve 1 mL 150 g/L aminolevulinik asit ekleyin. Diterpenoid üretimi için, yeterli öncül oluşumunu sağlamak için her kültüre 25 mL 1 M sodyum pirüuvat eklenmelidir.
      NOT: Bu istifte kullanılan tüm yapılar aynı IPTG indükleyici altında ydı. Farklı organizatörler isteþadi.
    8. 72 saat boyunca 16 °C ve 140 rpm'de kuluçkaya yatırın. Hemen kullanılan kültürler hemen metabolitlerin ayırıcı huni ekstraksiyon için kullanılır; kültürleri hasat etmeyin veya saklamayın.

3. Metabolitlerin ayrılması ve saflaştırılması

  1. Metabolitlerin ayırıcı huni ekstraksiyonu
    NOT: Plastikleştirici kontaminasyonu önlemek için organik çözücüler kullanırken sadece cam ve cam pipetler kullanmak önemlidir.
    1. Bir duman başlık içinde, bir halka standı üzerine ayırıcı huni güvenli. Ayırıcı huninin altına bir atık kabı yerleştirin.
    2. 500 mL 50/50 (v/v) etil asetat/heksanları ayırıcı huniye dökün.
      NOT: Solvent karışımı hedeflenen metabolitlerin çözünürlüğü ve polaritelerine göre ayarlanmalıdır. Uygun faz ayrıştırma sağlamak için su yla miscible çözücülerden kaçınılmalıdır.
    3. Ayırıcı hunive cam durdurucu üzerine yerleştirin E. coli kültürü 500 mL ekleyin.
    4. Yaklaşık 5-10x ekstraksiyon çözücü ile kültür karıştırmak için huni sallayın. Huni baş aşağı tutulur ve basınç serbest bırakmak için duman kaputuniçine işaret ederken sık sık musluk açarak huni gaz giderin. Sallayarak ve gaz giderme işlemini 2x tekrarlayın.
    5. Huniyi halka standına dik olarak yerleştirin ve çözücü tabakasının (üstte) sulu (kültür) tabakasından (altta) ayrılana kadar bekleyin, yaklaşık 1 dk.
      NOT: İnterfazda büyük miktarda kabarcık lar gözlendiğinde faz ayrıştırmalarını iyileştirmek için 5-10 mL EtOH küçük bir hacim eklenebilir.
    6. Durdurucuyu çıkarın. E. coli tabakasını bir atık kabına boşaltın ve hunideki çözücü tabakasını koruyun.
    7. E. coli kültürünün kalan 500 mL'lik kısmını ve ilk ekstraksiyon için kullanılan aynı 500 mL çözücüyu kullanarak işlemi tekrarlayın.
    8. Çıkarılan metabolitleri içeren çözücüyu temiz bir şişeye boşaltın. E. coli kültürü ile kontaminasyonkaçının.
  2. Döner Buharlaşma Konsantrasyonu
    1. Döner buharlaşma (rotovap) ekipmanını hazırlayın: su banyosunu doldurun ve sıcaklığı 25 °C'ye ayarlayın. Isıya duyarlı bileşikler için, daha düşük bir sıcaklık ayarı kullanın veya su banyosuna buz ekleyin. Yoğuşma odasını kuru buzla doldurun ve dönüş hızını 60-80 rpm'ye ayarlayın.
    2. 1 L buharlaşan bir şişeye yaklaşık 700 mL çıkarılmış metabolit ekleyin, rotovap'a takın ve su banyosuna daha düşük bir şekilde ekleyin. Su banyosu ısıtıcısını açın ve 25 °C'ye ayarlayın.
    3. Buharlaşan şişenin rotasyonuna başlayın, vakum sistemini açın ve metabolit çözeltisinin atık şişeye hızlı kaynamasını önlemek için emmeyi kademeli olarak artırın. Buharlaşmış çözücü yoğuşma ve yoğuşma toplama (atık) şişesiiçine damlama başlamalıdır.
    4. Metabolit çözeltisinin sadece birkaç mL'si buharlaşan şişede kaldığında, dönüşleri durdurun ve vakum sistemini kapatın. Buharlaşan şişeyi kaldırın ve vakum hattını kapatarak basıncı nemlendirin. Buharlaşan şişede kalan konsantre metabolit çözeltisini koruyun. Atıkları atık şişesine atın.
    5. Buharlaşan şişeye 700 mL'ye kadar ek ekstrakte edilmiş metabolit çözeltisi ekleyerek döner buharlaşmaya devam edin. Çıkarılan metabolit çözeltisinin tamamı yoğunlaşana kadar işlemi tekrarlayın.
    6. Yeni test tüpüne cam pipet le aktararak buharlaşan şişeden konsantre metabolitleri çıkarın. 5 mL 50/50 (v/v) etil asetat/heksanes veya istenilen çözücü karışımı ile buharlaşan şişeyi iki kez durulayın ve durulama çözeltisini test tüpüne aktarın.
    7. Konsantre metabolitleri daha fazla kullanıma kadar -20 °C veya -80 °C 'de (ürün stabilitesi ne bağlı olarak) saklayın.
  3. Silika Sütun Arınma
    1. Bir kez heksane ve bir kez etil asetat ile bir kez 1 L beaker, cam huni, 50 mL test tüpleri ve 3.2 L kromatografi sütun (cam fret ile donatılmış) durulayarak cam hazırlayın. Kesirleri toplamak için kullanılacak olan 50 mL test tüplerini etiketlayın.
    2. 2 L rezervuar kapasitesi ve fritted disk ile 3,2 L kromatografi sütununa 2 L silika jel (230-400 örgü, derece 60) ekleyin, sonra sütunun üst kısmında 5 cm tabaka oluşturmak için kum yükleyin.
    3. 2 L heksalan ile iyice kızartarak kolonkromatografi için hazırlayın. Her zaman, kolon kuruması veya hava cepleri elde değil emin olmak için sütunun kum tabakası üzerinde solvent sıvı ince (~ 0,5 cm) tabakası olmalıdır. Bir hava hortumuna bağlı bir cam giriş adaptörü, sadece yerçekimi yerine kolon daki akış hızını nazikçe artırmak için kullanılabilir.
    4. Konsantre metabolit ekstresini (bkz. bölüm 3.2) sütuna yükleyin. Numuneyi içeren şişeyi heksane ile durulayın ve tüm numunenin aktarıldığından emin olmak için sütuna ekleyin.
    5. Aşağıdaki degradeyi kullanarak, bir seferde 100 mL yükleyin ve etiketli test tüplerinde 50 mL fraksiyonları toplayın: 100% heksantan 3x, 10% (v /v) heksantanes 3x etil asetat, 12.5% (v / v) heksanes 3x etil asetat, 15% (v / v) heksanes 3x etil asetat , 20% (v / v) heksanes 3x etil asetat, 40% (v / v) heksantans 3x etil asetat, % 60 (v / v) heksantans 3x etil asetat, ve 100% etil asetat 4x.
      NOT: Degrade bileşik boyutu ve polariteleri ve istenilen ayırma göre ayarlanmalıdır.
    6. Cam pipet kullanarak, her fraksiyondan 1 mL'yi etiketli bir GC şişesine aktarın. Hangi fraksiyonların istenilen metabolitleri ve saflık düzeylerini içerdiğini belirlemek için her örneği GC-MS üzerinden analiz edin.
      NOT: Bu yöntemde üretilen metabolitlere uygun GC-MS yöntemi Mafu ve ark. 201839'datanımlanmıştır. Kısacası, tüm analizler BIR HP-5MS sütunu (malzeme tablosunabakınız), 1 μL numune hacmi ve 20 °C dk-1'de50 °C'den 300 °C'ye kadar fırın sıcaklığı rampası kullanılarak XL MS dedektörü ile bir GC üzerinde yapılmıştır.
    7. Hangi kesirlerin faiz bileşik(ler) içerdiğini belirledikten sonra, aynı bileşik içeren tüm kesirleri birleştirin. Atık kabına herhangi bir bileşik içermeyen kesirleri düzgün bir şekilde atın. Saflaştırılmış metabolitleri yoğunlaştırmak için gerekirse döner buharlaşma işlemini tekrarlayın.
    8. Ek arınma gerekiyorsa, ürün saflığını artırmak için (yarı)preparative HPLC kullanın. HPLC protokolleri bireysel ekipman spesifikasyonlarına ve ilgi çekici bileşiklere göre uyarlanmalıdır.
      1. 1 mL heksan (diterpen hidrokarbonlar) veya asetonitril (oksijenli diterpenoidler) kurutulmuş silika kromatografi örnekleri resuspend ve küçük parçacıklar ile kontaminasyonu önlemek için bir filtre şırınga ile filtre.
      2. Polar olmayan diterpenoidler için, önerilen 1 mL/dk akış hızına sahip bir CN sütunu (Bkz. Malzeme Tablosu)ve bir heksan:etil asetat gradyanı, kesirler her 1 dakikada bir toplanır.
      3. Polar diterpenoidler için, önerilen 3 mL/dk akış hızına sahip bir C18 sütunu (Bkz. Malzeme Tablosu)ve her 1 dakikada bir kesirler toplanan bir asetonitile:su gradyanı kullanın.
      4. Ürün bolluğunu ve saflığını değerlendirmek için GC-MS analizi öncesinde tüm HPLC saflaştırılmış fraksiyonları azot akışı altında kurulayın ve 1 mL heksandilere yeniden askıya alın.

4. N. benthamiana kullanarak diterpenoid metabolitlerinin üretimi

NOT: N. benthamiana diterpenoid metabolitleri üretmek için burada açıklanan protokol daha önce bildirilen çalışmalardan adapte edilmiştir35,36,40,41. Aşağıdaki protokol N. benthamiana yapraklarının şırınga-infiltrasyonuna özgüdür. Vakum infiltrasyonu gibi diğer infiltrasyon yöntemleri de aynı derecede uygundur. PCAMBIA130035Su (pLIFE33) veya pEAQ-HT40,41 ,42gibi Ikili T-DNA vektör sistemleri, E. coli ve A. tumefaciens ve bitki konaklarında gen ekspresyonunu sağlayan bu protokol için uygundur.

  1. Nicotiana benthamiana dikimi
    1. Bir 750 mL tencereyi toprak ve su ile doldurun. ~20 tütün tohumu ekleyin ve hafifçe parmak ile dokunun böylece toprakta bulunmaktadır. Toprakla örtünme.
      NOT: Tohum yayılımı için kendi kendine tozlaşma yoluyla tohum üretilebilir. Bu deney için tohumlar UC Davis Bitki Biyolojisi Bölümü elde edildi ve kamuya USDA germplasm deposu (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450) aracılığıyla mevcuttur.
    2. Aşağıdaki koşullarla bir büyüme odasında pot bırakın, toprak kuruması değil sağlamak için her gün sulama. Bu protokoldeki tüm adımlar için 26 °C ve %60 nem de 16:8 saat gündüz:gece döngüsü nde bitki yetiştirin.
    3. 1 hafta sonra, toprak çömlekleme ve su tencere ile ~ 20 tencere doldurun. Forceps kullanarak, kök tarafından bir tütün fidesi kavramak ve yavaşça kaynak tencereden kaldırmak, her yeni tencerede bir fide yerleştirerek ve dikkatle kökleri çapan. Yaprak veya kökler zarar etmeyin.
    4. Su her gün tencere (ayrıca "alt sulama" denir) içinde tepsiye su koyarak bitkilerin. Her dördüncü sulama, paket talimatlarına göre su jenerik gübre içerir.
  2. Agrobacterium tumefaciens zorlanma GV3101 yetkili hücrelerin donma-çözülme dönüşümü
    1. Çözülme Agrobacterium tumefaciens zorlanma GV3101 (veya diğer tercih edilen zorlanma) buz (~ 1 h) üzerinde yetkili hücreler. Buz üzerinde önceden soğutulmuş 0.2 mL mikrosantrifüj tüpler. 28 °C'de sıcak SOC ortamı.
    2. Hücreleri pipet ucuyla hafifçe karıştırın (yukarı ve aşağı borular içme) ve soğutulmuş 1,5 mL mikrotüplere her dönüşüm için 15°L hücre yi karıştırın.
    3. Yetkili hücrelerin her tüpüne 1-5 μL (~400 ng) DNA ekleyin ve bir tüp raf boyunca tüp kazıyarak hafifçe karıştırın.
      NOT: İstenen yapılar farklı antibiyotik direncine sahip değildir, çünkü her biri ayrı ayrı dönüştürülür ve sızmadan önce karıştırılır.
    4. 5 dakika sıvı nitrojen mikrotüpler yerleştirin.
    5. Sıvı nitrojenden mikrotüpleri çıkarın ve tüpleri oda sıcaklığı rafına yerleştirin. 37 °C inkübatörde 5 dakika boyunca çözülme tüpleri.
    6. Her mikrotüpe önceden ısıtılmış (28 °C) SOC'den 250 000 000'i ekleyin. 28-30 °C'de, 225 rpm'de 3 saat çalkalayın.
    7. Plaka 50 μL lb agar plakaları üzerine gerekli antibiyotikler içeren Tablo 1 steril cam boncuklar kullanarak, adım 2.1.8 açıklandığı gibi.
    8. 28-30 °C'de 48 saat boyunca ters çevrilmiş kuluçka plakaları. Dönüştürülmüş A. tumifaciens 2 günlük kuluçka dan sonra kullanılabilir veya 2 haftaya kadar parafin film mühürlü 4 °C'de saklanabilir.
  3. Nicotiana benthamiana'da agrobacteriumaracılı geçici enzim ko-ekspresyonu
    1. Erik 4 haftalık Nicotiana benthamiana bitkiler 2 gün önce alt yaprakları kaldırarak infiltrasyon. En üstteki 4 yaprağı bırakın. Bitkileri sulayın. Açık stomata ve daha kolay infiltrasyon sağlamak için sızmadan önce bitkileri 24 saat su etmeyin.
    2. Seçilen yapılar ve Agrobacterium zorlanma (Tablo 1'deaçıklanan) için uygun antibiyotiklerin çalışma konsantrasyonları ile LB 10 mL ekleyin 50 mL steril cam test tüpü bir folyo kapağı ile.
    3. Dönüştürülmüş Agrobacterium'un tek bir kolonisini samamak ve ucu LB ortamına çıkarmak için pipet ucu kullanarak aşıla. Her Agrobacterium transformant en az 2 küçük kültürlerolmalıdır.
    4. 28 °C ve 220 rpm gece kuluçka.
    5. Bir spektrofotometre kullanarak gecelik kültürlerin 600 nm (OD600)optik yoğunluğunu ölçün. Bir gecede kültürleri 1 OD600'e seyreltin.
      NOT: Optimal OD600 değerleri diğer Agrobacterium suşları kullanırken değişebilir.
    6. 50 mL konik tüpler içine seyreltilmiş gecede kültür 10 mL dağıtın.
    7. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3500 rpm'de santrifüj ile bakterileri hasat edin. Dökün ve supernatant atın.
    8. Tüpü hafifçe sallayarak ve bir tüp rafında yuvarlanarak 10 mL infiltrasyon tamponundaki kültürleri yeniden askıya alın. OD600 her yapı için 1 eşit olmalıdır.
    9. Dönüştürülmüş her hücre hattının eşit hacimlilerini birleştirerek infiltrasyonlar için istenen kombinasyonları oluşturun. OD600 her sızma için 1 eşit olmalıdır. Yaprak başına 5 mL infiltrasyon çözeltisi, bitki başına 2 yaprak tahmin edin.
    10. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir rocker ve kaya ya yatay tüpler takın.
    11. Yaprak başına sızma karışımı yaklaşık 5 mL kullanarak N. benthamiana bitki başına ~ 2 yaprakları sızma. Sızma çözeltisi yaprak dokusu nu suffuses sağlamak için yaprağın üst tarafında bir parmak ile karşı basınç uygularken yaprakların alt kısmında bir iğnesiz şırınga ile sağlıklı yaprakları sızma.
    12. Tüm sızmış yaprakları siyah bir işaret veya başka bir göstergeyle işaretleyin. 5 gün boyunca büyüme odasına sızmış bitkiler yerleştirin. Bitkileri iyi sulandırın.
      NOT: Beş günlük kuluçka süresi, ürün oluşumunun zaman verimliliğini korurken, çoğu aşağı analiz için yeterli diterpenoid seviyelerine ulaşmak için yeterli kanıtlanmıştır. Daha uzun kuluçka süreleri, daha yüksek ürün miktarlarının gerekli olduğu yerlerde test edilebilir.
  4. Dönüştürülmüş Nicotiana benthamiana metabolit çıkarma ve saflaştırma
    1. Bitkilerden sızmış yaprakları bitkiden kırparak hasat edin. Bir harç için sıvı azot ve tek bir yaprak ~ 100 mL ekleyin, sonra ince bir toz elde edene kadar bir harç ve havaneli veya doku değirmeni kullanarak eziyet.
    2. 500 μL'lik sınır çizimine GC-MS şişesine toz doku ekleyin. Şişeye ve kapağına 1,5 mL 50/50 (v/v) etil asetat/heksane veya istenilen çözücü karışımıekleyin.
      1. İstenilen ürünleri sağlamak için test edilmiş ifadeler için, daha büyük bir şişe veya test tüpü içine havuz zemin doku, sonra doku hacmi daha çözücü miktarı ~ 2x ekleyin ve bir gecede sallamak. Arınma için adım 4.4.5'e geçin.
    3. Bir mikrotüp raf ve bant sıkıca güvenli olarak tüm şişeleri yerleştirin. Oda sıcaklığında bir gecede güçlü sallayarak altında özü.
    4. 400 μL ekstresi ve 600°L heksaneyi taze bir GC-MS şişesine aktarın. Herhangi bir yaprak dokusu aliquot etmeyin. Adım 3.3.6.1'de açıklanan yöntemi kullanarak GC-MS kullanarak örnekleri analiz edin.
    5. İstenilen metabolitlerin varlığı için GC-MS ile analiz den sonra, havuz yaprağı ekstreleri birlikte ve döner buharlaşma yoluyla devam, silika sütun kromatografi, ve HPLC gibi bölüm 3.2 ve 3 açıklandığı gibi saf bileşikler elde etmek için.

Representative Results

E. coli kullanarak diterpenoid üretimi için şematik iş akışı
Şekil 1, diterpenoid üretimi için açıklanan iş akışını göstermektedir. Burada özetlenen protokol, daha büyük hacimli kültürlerin kullanımı ve istenilen diterpenoid ürünlerin silika yoluyla saflaştırılması için daha önce tanımlanmış bir E. coli platformundan uyarlanmıştır13,32 Kromatografi. Bu protokolün kullanımını göstermek için, mısırdan yeni tanımlanmış ve iki diTPS'den oluşan bir dolabralexin yolu kullandık. ZmAN2 (Zm00001d029648) ve ZmKSL4 (Zm0001d032858), çok fonksiyonlu bir P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) ve sitokrom P450 redüktaz (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Şekil 2). Kısacası, E. coli BL21DE3-C41 yetkili hücreler pCDFDuet:IRS ve pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 plazmidler13,32ile önceden dönüştürülmüştür. PCDFDuet:IRS plazmid diterpenoid öncül üretimi için anahtar enzimler içerir, dahil olmak üzere 1-deoksi-D-ksilüloz-5-fosfat synthase (dxs), 1-deoksi-D-xylulose-5-fosfat redüktaz (dxr), ve isopentenil difosfat isomerase (idi), ve E. coliditerpenoid oluşumunu artırmak için gösterilmiştir13. PACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 plazmid mısır ent-copalyl difosfat synthase ZmAN2 ve Abies grandisbir GGPP synthase içerir. Dolabralexin biyosentezinde işlenen reaksiyonları katalize eden enzimler daha sonra plazmidp28b:ZmKSL4 ve pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z1Z18 olarak birlikte dönüştürüldü. Diziler ve plazmid yapıları hakkında ayrıntılı bilgi için bkz.

Çıkarılan enzim ürünlerinin GC-MS kromatogramı Şekil 3A'dagösterilmiştir, üç dolabralexin bileşiğinin oluşumunu gösteren, yani dolabradiene (1.2 ± 0.25 mg/L kültür), epoksidolabrene (0.65 ± 0.2 mg/L kültür) ve epoksidolabranol (11.4 ± 1.1 mg/L kültür) diterpenoid sclareol kullanılarak standart bir eğriye göre ölçülür. Sclareol, dolabralexinlere göre benzer yapısı ve kimyasal özellikleri nedeniyle referans standart olarak kullanılmıştır. Tipik olarak gözlenen küçük yan ürünler kloramfenikol, indole türevleri oksindole ve indole-5-aldehit ve öncüger geranylgeranyl difosfat (GGPP)(Şekil 3)içerir. Indole genellikle birincil yan ürünü temsil eder, ancak GC-MS cihazının bütünlüğünü korumak için belirlenen çözücü gecikmesi 7 dk'dan daha kısa tutma süresi nedeniyle burada gösterilmez.

N. benthamiana kullanarak diterpenoid üretimin şematik iş akışı
Şekil 4 N. benthamianadolabralexin yolu ifadesinin bir bakış gösteriş . Burada açıklanan ürünler için, aşağıdaki yapılar ayrı ayrı A. tumefaciens zorlanma GV3101 dönüştürüldü: pLife33:p19 (p19 gen susturucu bastırıcı protein ifade), pLife33:ZmCYP71Z18, pLife33:ZmAN2, pLife33:ZmKSL4. E. coli ve A. tumefaciens'te kanamisin direnci ile ikili T-DNA vektörp Life3341'de mısır dolabralexin yolgenlerinin tam uzunlukta yerli dizileri kullanıldı. Öncül geranylgeranyl difosfat endojen N. benthamiana oluşur beri upstream terpenoid yol genlerinin co-ekspresyonu isteğe bağlıdır. Ancak, çeşitli çalışmalar başarıyla N. benthamiana14 diterpenoid oluşumunu artırmak için bu tür yaklaşımlar istihdam var14,36,41. Şekil 3'tegösterildiği gibi, ortak ifade dolabradiene ve 15,16-epoksidolabrene başarıyla üretilir. E. colienzim ko-ekspresyonunun aksine, metabolit ekstrelerinde 15,16-epoksidolabranol saptanmadı.

Yaprak ekstrelerinde 15,16-epoksidolabrene varlığı N. benthamianaCYP71Z18 aktivitesini gösterdi. 15,16-epoksidolabranol mikrobiyal kültürlerden çıkarma sonra istikrarlı olduğu gösterilmiştir(Şekil 3) yanı sıra önceki çalışmalarda mısır kökü dokularından izolasyon sonra39, hidroksilileli ürün glikozile olduğu makul görünür endojen glikoziltransferazlar tarafından ve daha sonra vakuol de tecrit, ekstraksiyon için burada kullanılan organik çözücü karışımları ile ekstraksiyon için erişilemez hale36,43,44,45 ,46. N. benthamiana yol mühendisliği bağlamında benzer istenmeyen ürün modifikasyonları önceki çalışmalarda bildirilmiştir47. E. coli'deortak ifade için gösterildiği gibi, N. benthamiana'da geçici ifade, referans kütle spektrum veritabanlarıile karşılaştırıldığında farklı zincir uzunluğundaki lineer alkanlar da dahil olmak üzere çeşitli yan ürünlerin çıkarılmasıyla sonuçlanır. Yaprak materyalinden elde edilen bileşik titrelerin ortalama 2.4 +/- 0.5 mg dolabradiene ve 0.9 +/- 0.3 mg 15.16-epoksidolabrene g kuru yaprak dokusu başına olduğu saptandı. Bu titreler, farklı deneysel kurulumlar göz önüne alındığında doğrudan E. coli ko-ekspresyon sistemi ile karşılaştırılamaz.

Diterpenoid arıtma
Diterpenoid arıtma silika kolon kromatografisi ve sonraki yarı preparatif HPLC kullanılarak sağlandı. Havuzlu E. coli kültürlerinin 12 L'sinden metabolit özleri, üç fokal dolabralexin bileşiğinin ayrılması için silika kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır (Şekil 3A). Silika kromatografisi hedef bileşiklerin yüksek saflıkta elde etmek için idealdir, diterpen etekfinler ve oksijenli türevlerin basit ayrılmasını sağlar beri, ve kolayca büyük kirletici kaldırır, oksindole, hangi silika matris üzerinde tutulur ( Şekil 3A).

Figure 1
Şekil 1: E. coli'de diterpenoid üretimi için iş akışı ve sıvı bakteri kültürlerinden metabolit saflaştırma. Kesik kutular, ek arınma gerektiren isteğe bağlı adımları betimlemektedir. (A) Ayrıştırıcı bir huni kullanarak çıkarılan E. coli kültürünün temsili görüntüsü. (B) Silika kromatografisi kullanılarak metabolit ekstresinin saflaştırılmasının temsili görüntüsü.   Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Bu çalışmada kullanılan dolabralexin biyosentetik yol ve gen yapıları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: GC-MS sonuçları. Gösterilen (A) E. coli ve (B) N. benthamianaenzim ko-ekspresyon tahlilleri kullanılarak elde edilen saflaştırılmış diterpenoid ürünlerin temsili GC-MS kromatogramlar vardır . Ürün tanımlamaları, Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) kütle spektral kütüphanesinin otantik standartları ve referans kütle spektrumları ile karşılaştırmalara dayanmaktadır. 1, öküzdole; 2, indole-5-aldehit; 3, Pyrrolo[1,2-a]pirrazin-1,4-dione, heksahidro-3-(2-metilpropil)-; 4, 6-O-Asetil-1-[[4-bromofenil]tio]-a-d-glucoside S,S-dioksit; 5, dolabradiene; 6, 15,16-epoksidolabrene; 7, Pyrrolo[1,2-a]pirrazin-1,4-dione, heksahidro-3-(fenilmetil)-; 8, 15,16-epoksidolabranol; 9 ve 12, bilinmiyor; 10, kloramfenikol; 11, 3,7,11,15-tetrametil-2-heksadecen-1-ol; 13-16, alkanlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: N. benthamiana'da diterpenoid üretimi. (A) N. benthamiana'da diterpenoid üretiminin iş akışı ve yaprak materyalinden metabolit saflaştırma.( B) N. benthamiana bitkilerinin budama dan önce sızma deneylerini yapmaya hazır temsili görüntüsü. (C) Budama sonrası N. benthamiana bitkilerinin temsili görüntüleri. (D) Şırıngasız yaprakların görüntüsü. Daha karanlık bölgelere sızıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Diterpenoid doğal ürünlerin daha geniş bir şekilde araştırılması ve uygulanması, istenilen bileşiklerin yeterli miktarda sentezlemek ve arındırmak için basit, ucuz protokoller gerektirir. Mevcut diterpenoid-metabolik enzimlerin çok çeşitli türlerin indeki hızlı artış, mikrobiyal ve bitki bazlı konak sistemleri kullanılarak diterpenoidlerin enzimatik üretimi için geniş bir envanter sağlamaktadır. Buna ek olarak, birçok diterpenoid yolların modüler mimarisi doğal ve yeni doğa benzeri diterpenoid doğal bir dizi oluşturmak için 'tak & çalıştır' kombinatoryal mühendislik yaklaşımları aynı veya farklı türlerden enzimlerin kullanımını sağlar ürünler2,14,26,35.

E. coli sağlamlığı, ölçeklenebilirlik kolaylığı, azaltılmış yan ürün kontaminasyonu için sınırlı kimyasal karmaşıklık ve DNA montajı ve ekspresyonu için kullanılabilir araçların zenginliği nedeniyle doğal ürün biyosentezi için tercih edilen bir mikrobiyal konaktır. Optimizasyonu. Deneyimlerimizde, burada açıklanan platform, burada önerilenler de dahil olmak üzere birçok downstream uygulamaları için uygundur diterpene olefins ve alkoller, birkaç yüz mg kadar ürün verimleri üretmek için uygundur. Endüstriyel ölçekte karşılanmamakla birlikte, burada açıklanan üretim platformu, taksonen ve sclareol 33 gibi ilgili diterpenoidler için başarıyla gösterildiği gibi daha fazla yol, ev sahibi ve fermantasyon optimizasyonu için bir temel olarak hizmet verebilir33 ,34. Oran sınırlayıcı MVA veya MEP yol genlerinin aşırı ekspresyonu, diterpenoid biyosentez için verim sınırlayıcı faktörlerin üstesinden gelmek için başarıyla kurulmuştur, örneğin rakip yollara yetersiz öncül kaynağı ve öncül akısı gibi13, 32,33,39. Çeşitli çalışmalarda başarılı olduğu kanıtlansa da, terpenoid-metabolik ökaryotik P450'lerin ve E. coli'deki diğer membrana bağlı enzimlerin zayıf ekspresyonu vekatalitik aktivitesi muhtemel bir sınırlayıcı faktördür33,39 ,48,49,50,51,52. Endoplazmik retikulum sinyal peptidin inkişası veya plastidial sinyal peptidin getirilmesi gibi kodon için optimize edilmiş dizilerin ve protein modifikasyonlarının kullanımı, çözünür P450 ekspresyonunu artırmak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır14,38 ,49,50,53. Bu çalışmada örnek bir yol olarak kullanılan cyp71Z1839'un mikrobiyal ortak ekspresyonu için de bu tür değişiklikler kullanılmıştır. Açıklanan protokoller, yapı başına bir veya iki gen taşıyan plazmidlerin kullanımına dayanmaktadır, hepsi de aynı indükleyici altında. Daha büyük ölçekli gen kombinasyonlarının istendiği durumlarda, çoklu plazmid ve antibiyotiklerin kullanımı nedeniyle azaltılmış dönüşüm verimliliğini ve kültür büyümesini azaltmak için çeşitli mevcut çoklu gen kasetlerinin veya gen istifleme sistemlerinin kullanılması tavsiye edilir13 .

Genetik ve genomik kaynakların daha geniş kullanılabilirliği ile, bitki konak sistemleri de giderek doğal ürünlerin üretimi için uygun hale gelir. Avantajları fotosentez tarafından desteklenmektedir gerekli doğal öncüleri üretmek için bitkilerin yeteneği, böyleceöncümoleküller54,55takviyesi gerek kalmadan ürün oluşumunu sağlayan içerir. N. benthamiana zaten yaygın olarak in vivo fonksiyonel karakterizasyonu ve terpenoid ve diğer doğal ürün yollarının kombinatoryal ekspresyonu için kullanılır14,35,36,40 . N. benthamiana'yı ana sistem olarak kullanmanın önemli avantajları arasında diterpenoid öncüllerinin endojen üretimi, yerli gen dizilerinin kullanımı, ökaryotik P450'lerin basitleştirilmiş ekspresyonu, kombinatoryal gen dönüşümünün kolaylığı (as geçici eş dönüşüm için ayrı antibiyotikler gerekli değildir) ve yaprak malzemeden hedef ürünlerin basit çıkarılması. Gerektiğinde, diterpenoid üretim öncül kaynağı artırmak için anahtar MEP yolu genlerinin ortak ifade yoluyla geliştirilebilir36,41. N. benthamiana'da ölçeklenebilir diterpenoid üretimi için kısıtlamalar, kimyasal kompleksten daha fazla emek yoğun ürün arınması, yeterli bitki biyokütlesi, daha fazla emek yoğun ürün saflaştırma sıyrık mikrobiyal kültürlere göre daha karmaşıktır. bitki dokusu ve hedef ürünlerin olası istenmeyen metabolizasyonu, örneğin, oksidasyon, glikozilasyon veya defosforilasyon endojen enzimler tarafından36,43,44,45 ,46,47. Ancak, bu işlem tarımsal filtrasyon için kullanılan bitki sayısı artırılarak mg ürün miktarlarına kadar ölçeklendirilebilir56.

Burada açıklanan ürün çıkarma ve arıtma protokolleri E. coli ve N. benthamiana, s. cerevisiae ve diğer bitki veya mikrobiyal konak sistemleri ile uyumludur ve kolay bir maliyet-etkin bir yaklaşım sağlar hem biyoloji hem de kimya laboratuvarlarında kurulmuş ve pahalı arıtma ekipmanı gerektirmez. Ayırıcı huni kullanarak metabolit ekstraksiyonu, kromatografik saflaştırma öncesinde verimli ekstraksiyon ve faz ayırma için uygundur. Huni boyutları, daha büyük kültür hacimleri için izin vermek ve büyük kültürlerden ayıklamak için gereken deneysel süreyi azaltmak için kolayca ayarlanabilir. Hem hidrokarbon hem de oksijenli bileşikleri oluşturan dolabralexin grubu için gösterildiği gibi farklı polaritediterpenoidleri ayıklamak için ideal bir heksan/etil asetat gradyan kullanımı bulduk(Şekil 3). Hedef ürünlerin özelliklerine bağlı olarak, diğer çözücü karışımları avantajlı olabilir. Ancak, ayırıcı huni tekniği kullanılarak başarılı ekstraksiyon ve faz ayırma sağlamak için çözücüler su ile yanlış olmamalıdır. Buna ek olarak, buharlaşma yoluyla ürün kaybı, düşük molekül ağırlıklı mono- ve sesqui-terpenoids ve diğer VOCs gibi uçucu organik bileşikler (VOCs) üretmek için bu yaklaşımı kullanırken dikkate alınmalıdır. Daha büyük ölçekli (~2 L) silika kolonu kullanarak farklı oksijenleme seviyelerindeki diterpenoidlerin kromatografik olarak ayrılması, geliştirilmiş ürün ayrıştırma sağladığı ve yinelemeli saflaştırma ihtiyacını en aza indirdiği için deneyimimizde avantajlı olmuştur. daha küçük sütun birimleri kullanırken adımlar. Kolon hacimleri ve matrisler istenilen kültür hacmi ve doğal ürün türü için gerektiği gibi ayarlanabilir. Bu protokol kullanılarak elde edilebilen hedef ürünlerin saflığı, biyoaktivite tahlilleri veya enzim aktivitesi analizlerinde kullanım gibi birçok alt akım uygulaması için uygundur. Ancak, NMR üzerinden yapılan yapısal analizler gibi daha yüksek saflık düzeylerinin gerekli olduğu durumlarda, ürün saflığı (yarı)-preparatif HPLC kullanılarak ek arıtma ile verimli bir şekilde geliştirilebilir.

Burada açıklanan bu protokol diterpenoid doğal ürünlerin üretimi için optimize edilmiştir, ama aynı zamanda kolayca ilgili mono-, sesqui- ve tri-terpenoids yanı sıra diğer doğal ürün sınıfları sadece istenilen enzim üreterek özelleştirilebilir kombinatoryal ekspresyon modülleri14,57. Ancak, mono ve sesqui-terpenoidler veya daha yüksek polarite ve fonksiyonel modifikasyon gibi daha yüksek uçuculuğa sahip bileşikler için ürün çıkarma ve saflaştırma prosedürlerinde yapılan değişiklikler dikkate alınmalıdır. birçok triterpenoidler glikozilasyon, fenilpropanoidler, ve diğer doğal ürün sınıfları.

Doğal ürünlerin üretimi için endüstriyel ölçekli platformlar mevcut olmasına rağmen, burada açıklanan protokoller kolayca çoğu laboratuvarda kurulabilir ucuz, özelleştirilebilir bir araç sunuyoruz. Burada ve başka bir yerde mısır dolabralexins üretimi gösterildiği gibi39, bu yaklaşım kullanılarak elde edilebilir ürün miktarları ve saflık genellikle dahil olmak üzere çeşitli downstream analizi ve kullanımları kolaylaştırmak için yeterlidir, ancak değil sınırlı, çeşitli biyoaktivite çalışmaları, organizmalar arasındaki etkileşimlerin analizi, hem de enzim substratları olarak kullanmak için ya da yarı-sentez yaklaşımları için başlangıç malzemesi olarak.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Biz minnetle Dr Reuben Peters (Iowa State University, ABD) pIRS ve pGGxZmAN2 yapıları sağlamak için kabul ediyoruz. NSF Bitki-Biyotik Etkileşimler Programı (1758976'dan P.Z.'ye hibe, DOE Erken Kariyer Araştırma Programı (grant# DE-SC0019178 to P.Z.), DOE Joint Genome Institute Community Science Program (grant# CSP2568 to P.Z.), NSF tarafından bu çalışma için mali destek Lisansüstü Araştırma Bursu Programı (K.M.M.'ye) ve UC Davis Dean'in Mentorluk Ödülü Bursu (K.M.M.'ye) minnetle kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent -
7890B GC Agilent -
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

Biyokimya Sayı 152 diterpenoid biyosentez ko-ekspresyon diterpen synthase sitokrom P450 monooksijenaz Nicotiana benthamiana Zea mays bitki özel metabolizma
Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., … More

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter