Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

نهج للتخصيص للإنتاج الانزيمي وتنقيه المنتجات الطبيعية ديتيربينيد

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/59992
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Plant Biology, University of California Davis

Summary

هنا نقدم سهله الاستخدام بروتوكولات لإنتاج وتنقيه الأيض diterpenoid من خلال التعبير التوافقي من الانزيمات الاصطناعية في القولونية أو نيكوتيانا benthamiana، تليها المنتج الكروماتوغرافي تنقيه. نواتج الأيض الناتجة هي مناسبه للدراسات المختلفة بما في ذلك توصيف الهيكل الجزيئي ، والدراسات الوظيفية الانزيم ، واختبارات النشاط الحيوي.

Abstract

Diterpenoids تشكل فئة متنوعة من المنتجات الطبيعية جزيء صغير التي يتم توزيعها علي نطاق واسع في جميع انحاء ممالك الحياة ولها وظائف بيولوجية حرجه في العمليات التنموية ، والتفاعلات إينتيرورجانيسمال ، والتكيف البيئي. نظرا لهذه الانشطه الحيوية المختلفة ، والعديد من diterpenoids هي أيضا ذات اهميه اقتصاديه مثل الادويه والمضافات الغذائية والوقود الإحيائي ، وغيرها من المنتجات الحيوية. وقد مكنت النهج المتقدمة علم الجينوم والبيوكيميائية زيادة سريعة في معرفه الجينات diterpenoid-الأيض ، والانزيمات ، والمسارات. ومع ذلك ، فان التعقيد الهيكلي للدوتيريا والتوزيع التصنيفي الضيق للمركبات الفردية في كثير من الأحيان لا يبقي الا نوعا واحدا من العوامل المقيدة لإنتاجها بكفاءة. توفر مجموعه واسعه من الانزيمات الايضيه الآن توفير الموارد لإنتاج الدتيربينييدات في الكميات الكافية والنقاء لتسهيل تحقيق أعمق لهذه المجموعة المستقلب الهامه. الاعتماد علي الاداات التي أنشئت لانزيم الميكروبية والنباتية التي تعتمد علي التعبير المشترك ، ونحن نقدم بروتوكول تعمل بسهوله وقابله للتخصيص للإنتاج الانزيمي من الدتيربينييدات في اما القولونية أو نيكوتيانا benthamiana، و تنقيه المنتجات المطلوبة عن طريق اللوني السيليكا وشبه الاعداديه HPLC. باستخدام مجموعه من الذرة (زيميس) dolabralexin diterpenoids كمثال ، ونحن تسليط الضوء علي كيفيه تركيبات وحدات من synthase diterpenoids (ditps) و سيتوكروم P450 اكسيجيناز أحاديه (P450) يمكن استخدام الانزيمات لتوليد السقالات diterpenoids مختلفه. ويمكن استخدام المركبات المنقية في مختلف التطبيقات المصب ، مثل التحليلات الهيكلية المستقلب ، والدراسات وظيفة هيكل الانزيم ، وفي المختبر وفي التجارب الحيوية النباتات.

Introduction

[دتيربنيدس] يتالف مجموعه كيميائيا متنوعة من أكثر من 12,000 غالبا [بولدوري] [20-كربون] منتوجات طبيعيه ان يلعب ادوار حرجه في كثير كائن حي1. الفطريات والنباتات تنتج أكبر تنوع diterpenoids ، ولكن كما تبين البكتيريا لتشكيل diterpenoids النشطة بيولوجيا (انظر التعليقات2،3،4،5). الجذور في تنوعها الهيكلي الواسع ، وخدمه diterpenoids العديد من الوظائف البيولوجية. وهناك عدد قليل من diterpenoids ، مثل هرمونات النمو الجبريلين ، لديها وظائف أساسيه في العمليات التنموية5. ومع ذلك ، فان الغالبية العظمي من diterpenoids بمثابه وسطاء من الدفاع الكيميائي والتفاعلات إينتيرورجانيسمال. ومن بين هذه الأحماض الراتنج ديتيربيني في آلافات والممرض الدفاع من الأشجار الصنوبرية ويمزج الأنواع المحددة من ديتيربينييدات المضادة للميكروبات في المحاصيل الغذائية الرئيسية مثل الذرة (زيميس) والأرز (اوريزا ساتيفا) وقد تم علي نطاق واسع درست6,7. هذه الانشطه الحيوية توفير مستودع الكيميائية الغنية للتطبيقات التجارية ، واختيار diterpenoids تستخدم الادويه الهامه ، والمضافات الغذائية ، والمواد اللاصقة ، وغيرها من المنتجات الحيوية من الحياة اليومية الحديثة8،9 ،10. وللمضي قدما في البحوث المتعلقة بالتنوع الطبيعي والوظائف البيولوجية للدوريبينييدات ، وفي نهاية المطاف الترويج للتطبيقات التجارية الأوسع نطاقا ، يلزم توفير أدوات لاعداد المركبات النقية بكفاءة من حيث التكلفة. وقد وضعت العزلة علي نطاق واسع من المواد النباتية لعدد قليل من المنتجات الحيوية diterpenoid ، مثل الأحماض الراتنج diterpenoid التي يتم إنتاجها كمنتج ثانوي من صناعه اللب والورق8. ومع ذلك ، تراكم diterpenoids في انسجه محدده فقط وتحت التنظيم المحكم من قبل المحفزات البيئية في كثير من الأحيان يحد من العزلة من كميات المنتجات الكافية من المنتج الطبيعي2. الاضافه إلى ذلك ، فان التعقيد الهيكلي للديتيربنيدات يعوق إنتاجها من خلال التوليف الكيميائي ، علي الرغم من ان هذه النهج قد نجحت في العديد من الحالات11و12. مع توافر تقنيات الجينوم والكيمياء الحيوية المتقدمة ، وقد اكتسبت منصات الإنتاج الانزيميه اهتماما متزايدا لإنتاج مجموعه من المركبات diterpenoid (انظر التعليقات13،14، 15و16و17و18).

وتستمد جميع التربينات ، بما في ذلك الدتيربينييدات ، من اثنين من السلائف ايزوبرينواد الايزوميريه ، إيسوبينتينيل ثنائي فسفات (IPP) وديميثيلاليل ثنائي الفوسفات (dmapp)19 التي ، بدورها ، تتشكل من خلال الميلنات (المضافة) أو مسار ميثيل اريثريتول-5-الفوسفات. التخليق الحيوي تيرنويد العائدات من خلال مسار الطريق السريع في البكتيريا والطريق السريع للصناعة التحويلية في الفطريات ، في حين ان النباتات تمتلك المضافات الصحية السيتووليك ومسار البلازما ، مع ان الأخير هو الطريق الرئيسي نحو تشكيل diterpenoid20. التكثيف من IPP و dmapp من قبل الناقلات قبل الميلاد غله المركزية 20-الكربون السلائف لجميع دتيربينيدس ، جيرانيلجيرانيل ثنائي فسفات (ggpp)20. المصب من تشكيل ggpp ، واثنين من الأسر انزيم ، تربين synthases (tpss) و سيتوكروم P450 مونوكسيجيناسيس (P450s) السيطرة إلى حد كبير علي تشكيل التنوع الكيميائي واسعه من الأيض تربين21،22. ديتيربيني synthases (ditpss) تحفيز التزام القائم علي الكارميه المدفوعة وأعاده ترتيب ggpp لتشكيل مختلف المجسمات ثنائي ، بولي ، أو ماكرو دوري ديتيربيني السقالات1،3،23، 24-الآن ثم يتم تسهيل الأوكسجين والزخرفة الوظيفية الاضافيه لهذه السقالات بواسطة انزيمات P450 واختيار عائلات انزيم أخرى22،25. TPSs و P450s موجودة عاده الأنواع المحددة ، والأسر متعددة الجينات التي يمكن ان تشكل وحدات الشبكات الحيوية الاصطناعية ، حيث الجمع بين وحدات انزيم مختلفه علي طول مخطط مشترك يتيح تشكيل مجموعه واسعه من المركبات2، 26. الاكتشاف السريع من الانزيمات وظيفيا متميزة تعمل في مسارات تربين وحدات في السنوات الاخيره قد وفرت فرصا متزايدة لاستخدامها كقائمه أجزاء متعددة للهندسة الايضيه من مسارات جزئيه أو كامله في منصات الإنتاج الجرثومية والنباتية علي حد سواء. علي سبيل المثال ، تم تطبيق الخميرة (ساكاروميسز سيريفيسياي) بنجاح لمهندس مسارات متعددة الانزيمات لتصنيع المنتجات الحيوية تربين ، مثل ماده الارتيميسينين المخدرات المضادة للملاريا27، و سيسكويتيربينويد الوقود الإحيائي bisابولي و farnesene28، ولكن أيضا اختيار ديتيربينيادس29،30،31. المثل ، تم إنشاء منصات القولونية الهندسية للصناعة علي نطاق صناعي لعدد قليل من الأيض diterpenoid ، بما في ذلك تاكساديني السلائف taxol المستخدمة كدواء مضاد للسرطان والكحول diterpenoid ، الصلبة ، وتستخدم في صناعه العطور13،32،33،34. كما ان التقدم في الهندسة الوراثية وتكنولوجيات التحول جعلت النظم المضيفة للنباتات قابله للاستمرار علي نحو متزايد لإنتاج المنتجات الطبيعية النباتية9و14و35و36. علي وجه الخصوص ، أصبح القريب التبغ وثيق ، نيكوتيانا benthamiana، هيكل المستخدمة علي نطاق واسع لتحليل المسار تربين والهندسة ، ويرجع ذلك إلى سهوله التحول بوساطة agrobacteriumمن مجموعات الجينات متعددة ، التخليق الحيوي الفعال للسلائف الذاتية ، والكتلة الاحيائيه العالية14،35،36.

الرسم علي هذه المنصات التي أنشئت لتخليق الحيوي تربين ، ونحن وصفها هنا سهله الاستخدام وأساليب فعاله من حيث التكلفة للإنتاج الانزيمي من ديتيربينييدس وتنقيه المركبات واحد. البروتوكولات المقدمة توضح كيف يمكن استخدام المنصات e. القولونية و n. benthamiana المهندسة لتعزيز التخليق الحيوي السلائف diterpenoid للتعبير التوافقي لمختلف ditpss و P450 الانزيمات لتوليد المطلوب المركبات diterpenoid. ويظهر تطبيق هذا البروتوكول لإنتاج وتنقيه ديتيربينييدات المختلفة من الناحية الهيكلية علي سبيل المثال من الديتيربينييدات المتخصصة من الذرة (زيميس) ، وتسمي dolabralexins ، التخليق الحيوي الذاتية التي تجند اثنين من ditps واحد P450 انزيم. ومن ثم يتحقق تنقيه dolabralexins مختلفه تتراوح من اوليفينات إلى مشتقات الأوكسيجين عن طريق الجمع بين استخراج القمع المنفصلة مع الفصل اللوني السيليكا علي نطاق واسع والفصل اللوني السائل عالي الضغط المعد (HPLC). البروتوكولات الموصوفة هي الأمثل لإنتاج الدتيربينييدات ، ولكن يمكن أيضا ان تتكيف بسهوله لفئات تربين ذات الصلة ، فضلا عن المنتجات الطبيعية الأخرى التي موارد الانزيم المتاحة. المركبات المنتجة باستخدام هذا النهج هي مناسبه لمختلف التطبيقات المصب, بما في ذلك ولكن لا تقتصر علي, توصيف الهيكلية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحليل, استخدام ركائز للدراسات الوظيفية الانزيم, ومجموعه من اختبارات النشاط الحيوي.

Protocol

تحذير: تتضمن البروتوكولات الموصوفة هنا استخدام المواد الكيميائية الخطرة ، والأجسام الحاده ، والاجهزه الكهربائية ، والأجسام الساخنة ، وغيرها من المخاطر التي قد تؤدي إلى أصابه. وينبغي ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، واتباع إجراءات السلامة المناسبة ، بما في ذلك التدريب علي السلامة.

1-اعداد المواد والحلول

  1. اعداد والاوتوكلاف lysogeny مرق المتوسطة (LB) لمده 30 دقيقه: لكل 1 لتر من المتوسطة ، مزيج 10 غرام من التريتون ، 5 غرام من استخراج الخميرة البكتيرية ، و 10 غرام من كلوريد الصوديوم وتذوب في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI).
  2. ل 1 L الثقافات التعبير المشترك ، واعداد والاوتوكلاف رائع مرق (TB) المتوسطة لمده 30 دقيقه: في 2.8 L Erlenmeyer قارورة مزيج 12 غرام من التريتوني ، 24 غرام من استخراج الخميرة البكتيرية ، و 40 mL من 10 ٪ (v/v) الجلسرين وتذوب في 860 mL من المياه DI. اعداد والاوتوكلاف 1.3 L من 10x الفوسفات العازلة [1.3 L من المياه DI ، 30.03 غرام من الفوسفات مونوبوتاسيوم (KH2PO4) ، و 163.02 g من فوسفات ثنائي البوتاسيوم (K2hpo4)] وأضافه إلى الوسط أعلاه.
  3. اعداد مرق الأمثل السوبر مع القمع Catabolite (SOC) وسائل الاعلام.
    1. اعداد والاوتوكلاف لمده 30 دقيقه حل يحتوي علي 2 ٪ (ث/الخامس) التريتوني ، 0.5 ٪ (ث/ف) استخراج الخميرة البكتيرية ، 8.5 mM NaCl ، و 2.5 mM KCl.
    2. أضافه المعقمة MgSO4 والجلوكوز علي حد سواء مع تركيز نهائي من 20 ملم. استخدم 1 م NaOH للتكيف مع درجه الحموضة 7.0. تخزين وسائط SOC عند-20 درجه مئوية.
  4. اعداد 1 لتر من pyruvate الصوديوم 1 م. الاوتوكلاف لمده 15 دقيقه وتخزين في 4 درجه مئوية.
  5. اعداد 20 مل من 1 م ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) في المياه المعقمة دي. تخزين 1 – 2 مل من الارصفه عند-20 درجه مئوية.
  6. اعداد العازلة التسلل: 10 ملم MES (1.952 g) و 10 مم MgCl2 (2.033 g) المذاب في 1 لتر من المياه DI. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
  7. اعداد والاوتوكلاف LB أجار لمده 30 دقيقه: لكل 100 mL من المياه دي ، أضافه 1 غرام من التريتوني ، 0.5 غرام من استخراج الخميرة البكتيرية ، 1 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 1.5 غرام من أجار. مره واحده أجار LB هو بارد بما فيه الكفاية للتعامل مع زجاجه, أضافه المضادات الحيوية كما هو مطلوب للمجموعات البلازميد المطلوب. صب لوحات أجار باستخدام اطباق بتري وتخزين في 4 درجه مئوية.
    1. انظر الجدول 1 للاطلاع علي المواصفات المتعلقة بالإنتاج المركب في كولاي و n. benthamiana، علي التوالي. لوحات التفاف تحتوي علي ريفاميسين في إحباط لمنع تدهور عند التخزين.
تركيز العمل (ميكروغرام/مل)
المضادات الحيويه المخزون (مغ/مل) المذيبات 1 البلازميد 2 البلازميدات 3 أو 4 البلازميدات
كاربينيسيلين 50 H2O 50 25 20
الكلورامفينيكول 30 EtOH 30 20 20
كاناميسين 50 H2O 50 25 20
السبيكتينوميسين 30 H2O 30 25 20
الجنتاميسين 50 H2O 30
ريفامبيسين 10 MeOH 10

الجدول 1: تركيزات المضادات الحيوية للتعبير المشترك البلازميد في e. كولاي أو n. benthamiana.

2. إنتاج الأيض diterpenoid في e. كولاي

ملاحظه: تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا لإنتاج نواتج الأيض diterpenoid في e. كولاي من الانزيم الذي تم الإبلاغ عنه سابقا منصة التعبير المشترك التي وضعتها مجموعه من الدكتور روبن j. بيترز (جامعه ولاية أيوا ، IA ، الولايات الامريكيه)13 ،32.

  1. تحويل الخلايا المختصة مع تركيبات البلازميد.
    1. ذوبان الخلايا المختصة كيميائيا e. كولاي علي الجليد (BL21DE3-C41 الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول).
    2. أضافه 1 μL من 100 ng/μL حل لكل بناء يستخدم للتعبير المشترك إلى 25 μL من الخلايا المختصة في ميكروتيوب 1.5 mL. لا تقم بالدوامة أو المزج بالأنابيب.
      ملاحظه: للتعبير الأمثل والنشاط من الانزيمات TPS و P450 ، العديد من التعديلات تسلسل تحتاج إلى النظر. بالنسبة للنقاط الدقيقة ، غالبا ما يكون من الضروري أزاله الببتيد العابر الطرفية N. علي وجه التحديد ، البلازما أحاديه و دي-TPS عاده ما تتطلب أزاله الببتيد العابر المتوقع (باستخدام خوارزميات التنبؤ المشتركة37) ، في حين يمكن عاده استخدام سيتوسيوليك سيسكي-tps كجينات كامله الطول. فيما يتعلق P450s, كودون الأمثل ، فضلا عن أزاله أو استبدال مع الزعيم تسلسل makktsskgk من N-الطرفية وقد ثبت المجال غشاء فعاله في كثير من الحالات38,39. الاضافه إلى ذلك ، عند المشاركة في التعبير عن انزيمات P450 يجب تضمين الكروم P450 ريدكتيز (CPR) لضمان نشاط P450 كافيه.
    3. احتضان الخليط علي الجليد لمده 30 دقيقه. اخلط كل 10 دقائق عن طريق تجريف الأنبوب برفق عبر حامل ميكروتيوب.
    4. قبل احتضان وسائل الاعلام SOC ولوحات أجار LB في 37 درجه مئوية تحتوي علي المضادات الحيوية كما هو مطلوب للجمع المطلوب من الثوابت.
      ملاحظه: يجب ان يكون لكل بناء لتكون مشتركه التحول مقاومه المضادات الحيوية متميزة ، فضلا عن أصول متميزة من النسخ المتماثل لضمان التعبير الأمثل البروتين.
    5. الحرارة صدمه خليط الخلية في 42 درجه مئوية لمده 1 دقيقه ، ومن ثم احتضان علي الجليد لمده لا تقل عن 2 دقيقه.
    6. أضافه 200 μL من وسائط SOC الدافئة.
    7. يهز خليط الخلية ل 1 ح في 37 درجه مئوية و 200 دوره في الدقيقة.
    8. أضف ما يقرب من 10 حبات زجاجيه معقمه إلى لوحه أجار رطل الحرارة. أضافه 100 μL من خليط الخلية واستبدال الغطاء. يهز لوحه أفقيا مع غطاء لتوزيع الخلايا بالتساوي. أزاله الخرز الزجاجي عن طريق التنصت عليها في حاويه نفايات. بدلا من ذلك ، استخدم أساليب الطلاء المفضلة الأخرى.
    9. احتضان لوحه أجار LB في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها مع السطح المطلي وجها لأسفل. لوحه مع تحويل المستعمرات e. القولونية يمكن استخدامها في اليوم التالي أو تخزينها في 4 درجه مئوية مختومه في فيلم البارافين لمده تصل إلى 2 أسابيع.
  2. تحضير من تلقيح ثقافات
    1. في اليوم التالي ، أعد حلا لمتوسط LB بالمضادات الحيوية المطلوبة لتركيبه البلازميد المتحولة باستخدام التركيزات الواردة في الجدول 1.
    2. في غطاء معقم ، نقل 5 مل من المتوسطة LB إلى 15 مل معقمه أنبوب اختبار الزجاج مع غطاء تنفس من البلاستيك. اعداد أنبوب ثقافة صغير واحد لكل ثقافة كبيره (1 L) المطلوبة.
    3. حدد المستعمرات e. كولاي الفردية من لوحه أجار LB باستخدام طرف ماصه. تلقيح كل أنبوب LB مع مستعمره e. كولاي عن طريق إخراج طرف ماصه واحد يحتوي علي مستعمره مختاره في كل أنبوب.
    4. كاب كل تلقيح ثقافة اختبار أنبوب مع غطاء من البلاستيك تنفس. وضع التي توج الثقافات القولونية الصغيرة في 37 درجه مئوية الاهتزاز حاضنه لمده 12-24 ح.
  3. اعداد وحث ثقافات التعبير المشترك
    1. في اليوم التالي ، أضافه 100 mL من المخزن المؤقت الفوسفات 10x أعدت إلى 900 مل من السل المعدة لتركيز العازلة الفوسفات النهائي من 1x. أضافه المضادات الحيوية الضرورية مع تركيزات وفقا للجدول 1.
    2. يهز في 140 لفه في الدقيقة في 37 درجه مئوية حتى الحارة (حوالي 30 دقيقه).
    3. تلقيح كل قارورة من وسائل الاعلام ل 1 الثقافات L مع 5 مل من ثقافة التلقيح. الاحتفاظ بطرف ماصه تستخدم لتلقيح ثقافة التلقيح في أنبوب ثقافة التلقيح بحيث ، عند استخراج مع المذيبات العضوية في الخطوات اللاحقة ، لا توجد الملوثات البلاستيكية المستخرجة.
    4. احتضان مع الاهتزاز في 200 لفه في الدقيقة حتى الكثافة البصرية في 600 nm (OD600) يصل 0.6 ، حوالي 3 ساعة. لقياس600 OD مع مقياس طيفي ، استخدم خليط من السل المعقم مع عازل الفوسفات كفراغ.
    5. في600OD المطلوب ، اضبط إعدادات الحاضنة علي 16 درجه مئوية.
    6. عندما شارك في التعبير عن P450s ، واعداد الطازجة الريبوفلافين وحمض الامينوليفولينيتش ، والتي هي ضرورية لإنتاج كافيه P450 العامل المشترك. لكل تجربه ، وجعل 4 غرام/لتر الريبوفلافين و 150 g/L حمض الامينوليفولينيتش. الحفاظ علي الحل ملفوفه في إحباط حتى الاستخدام ، كما الريبوفلافين حساسة للضوء.
    7. بعد الحاضنة قد وصلت 16 درجه مئوية (ما يقرب من 30 دقيقه) ، أضافه 1 مل من 1 م IPTG ، 1 مل من 4 غرام/لتر الريبوفلافين ، و 1 مل من 150 g/L حمض امينووليفولينيتش لكل ثقافة. للإنتاج ديتيربينيد ، يجب أضافه 25 مل من بيروفات الصوديوم 1 م لكل ثقافة لضمان تشكيل السلائف كافيه.
      ملاحظه: جميع الثوابت المستخدمة في هذا الفحص كانت تحت نفس المروج IPTG-المحرض. ويمكن استخدام المروجين مختلفه حسب الرغبة.
    8. احتضان في 16 درجه مئوية و 140 لفه في الدقيقة ل 72 ح. أضافه 25 مل من بيروفات الصوديوم في كل يوم بعد الاستقراء إذا إنتاج diterpenoids. علي الفور استخدام الثقافات وتستخدم علي الفور لاستخراج قمع انفصال من الأيض. لا حصاد أو تخزين الثقافات.

3. فصل وتنقيه الأيض

  1. استخراج القمع المنفصل لنواتج الأيض
    ملاحظه: من المهم استخدام الأواني الزجاجية والماصات فقط عند استخدام المذيبات العضوية لمنع التلوث البلاستيكية.
    1. في غطاء الدخان ، أمن القمع المنفصل علي حامل الخاتم. ضع كاس نفايات تحت القمع المنفصل.
    2. صب 500 مل من 50/50 (v/v) ايثيل خلات/هيكانيس في قمع منفصلة.
      ملاحظه: يجب تعديل خليط المذيبات استنادا إلى قابليه الذوبان والقطبية لنواتج الأيض المستهدفة. وينبغي تجنب المذيبات المياه-miscible لضمان فصل المرحلة المناسبة.
    3. أضافه 500 mL من الثقافة e. كولاي إلى قمع منفصلة ومكان علي سداده الزجاج.
    4. هز القمع لمزج الثقافة مع المذيب استخراج ، ما يقرب من 5-10x. في كثير من الأحيان أزاله الغاز القمع عن طريق فتح حنفية بينما يتم عقد قمع راسا علي عقب وأشار إلى غطاء الدخان للإفراج عن الضغط. كرر الاهتزاز وأزاله الغاز الاجراء 2x.
    5. وضع القمع تستقيم في موقف الحلبة والانتظار حتى طبقه المذيبات (اعلي) قد فصل من طبقه مائية (الثقافة) (أسفل) ، ما يقرب من 1 دقيقه.
      ملاحظه: عند ملاحظه كميه كبيره من الفقاعات في المرحلة البينية ، يمكن أضافه حجم صغير من 5 – 10 مل EtOH لتحسين فصل المرحلة.
    6. أزاله سداده. استنزاف طبقه e. القولونية في الكاس النفايات ، والحفاظ علي طبقه المذيبات في القمع.
    7. كرر الاجراء باستخدام المتبقية 500 mL من الثقافة e. القولونية ونفس 500 ml المذيبات المستخدمة لاستخراج الاولي.
    8. استنزاف المذيبات التي تحتوي علي نواتج الأيض المستخرجة في قارورة نظيفه. تجنب التلوث مع e. كولاي الثقافة.
  2. تركيز التبخر الدوار
    1. اعداد التبخر الدوارة (rotovap) المعدات: ملء حمام المياه وتعيين درجه الحرارة إلى 25 درجه مئوية. للمركبات الحساسة للحرارة ، استخدم اعداد درجه حرارة اقل أو أضف الثلج إلى حمام الماء. ملء غرفه التكثيف مع الثلج الجاف وتعيين سرعه الدوران إلى 60-80 دوره في الدقيقة.
    2. أضافه حوالي 700 مل من الأيض المستخرجة إلى 1 لتر تبخر قارورة ، نعلق علي rotovap ، وانخفاض في حمام المياه. تشغيل سخان حمام المياه علي وتعيين إلى 25 درجه مئوية.
    3. بدء دوران قارورة تبخر ، بدوره علي نظام فراغ ، وزيادة تدريجيا شفط لتجنب الغليان السريع للحل المستقلب في قارورة النفايات. تبخرت مذيب سوفت بدات يكثف ويقطر داخل المكثفات-يجمع (نفاية) قارورة.
    4. عندما لا يبقي سوي عدد قليل من مل من محلول المستقلب في قارورة تبخر ، ووقف تناوب وإيقاف تشغيل نظام فراغ. رفع قارورة تبخر واكتئاب عن طريق إغلاق خط فراغ. الاحتفاظ محلول المستقلب المركزة المتبقية في قارورة تبخر. التخلص من النفايات في قارورة النفايات.
    5. مواصله التبخر الدوارة باضافه ما يصل إلى 700 مل من محلول المستقلب المستخرجة اضافيه لقارورة تبخر. كرر العملية حتى يتركز كل محلول المستقلب المستخرج.
    6. أزاله الأيض المركزة من قارورة تبخر عن طريق نقل مع ماصه الزجاج إلى أنبوب اختبار جديد. شطف قارورة تبخر مع 5 مل من 50/50 (v/v) ايثيل خلات/هيكانيس أو المطلوب خليط المذيبات مرتين ، ونقل محلول الشطف لأنبوب الاختبار.
    7. تخزين الأيض المركزة في-20 درجه مئوية أو-80 درجه مئوية (اعتمادا علي استقرار المنتج) حتى مزيد من الاستخدام.
  3. السيليكا العمود تنقيه
    1. اعداد الأواني الزجاجية عن طريق الشطف 1 لتر الكاس ، قمع الزجاج ، 50 mL أنابيب الاختبار ، والعمود اللوني 3.2 L (مجهزه التاكل الزجاج) مره واحده مع الهكسين ومره واحده مع خلات ايثيل. تسميه أنابيب اختبار 50 mL ، والتي سيتم استخدامها لجمع الكسور.
    2. أضافه 2 لتر من هلام السيليكا (230-400 شبكه ، الصف 60) إلى عمود اللوني 3.2 L مع سعة خزان 2 لتر وقرص التي تركت ، ثم تحميل الرمل لتشكيل طبقه 5 سم في الأعلى من العمود.
    3. اعداد العمود للكروماتوغرافي عن طريق تنظيف تماما مع 2 L من الهكسين. في جميع الأوقات ، يجب ان يكون هناك طبقه رقيقه (~ 0.5 سم) من السائل المذيب فوق طبقه الرمل من العمود لضمان العمود لا تجف أو الحصول علي جيوب الهواء. يمكن استخدام محول مدخل زجاجي متصل بخرطوم هواء لزيادة معدل التدفق بلطف من خلال العمود بدلا من الجاذبية وحدها.
    4. تحميل استخراج المستقلب المركزة (انظر القسم 3.2) علي العمود. شطف الزجاجة التي تحتوي علي عينه 3x مع الهكسان وأضافه إلى العمود لضمان تم نقل جميع العينة.
    5. باستخدام التدرج التالي ، تحميل 100 mL في وقت واحد وجمع 50 مل الكسور في أنابيب اختبار المسمي: 100 ٪ هيكانيس 3x ، 10 ٪ (v/v) خلات ايثيل في هيكانيس 3x ، 12.5 ٪ (v/v) خلات ايثيل في هيكانيس 3x ، 15 ٪ (v/v) خلات ايثيل في هيكانيس 3x ، 20 ٪ (v/v) خلات ايثيل في هيكانيس 3x ، 40 ٪ (v/v) خلات ايثيل في هيكانيس 3x ، 60 ٪ (v/v) خلات ايثيل في هيكانيس 3x ، و 100 ٪ خلات ايثيل 4x.
      ملاحظه: يجب تعديل التدرج استنادا إلى حجم المركب والقطبية والفصل المطلوب.
    6. باستخدام ماصه زجاجيه ، انقل 1 مل من كل كسر إلى قارورة GC المسمية. تحليل كل عينه عن طريق GC-MS لتحديد الكسور التي تحتوي علي الأيض المطلوب ومستوي النقاء.
      ملاحظه: تم وصف طريقه GC-MS مناسبه لنواتج الأيض في هذا الأسلوب في Mafu وآخرون 201839. وباختصار ، أجريت جميع التحاليل علي GC مع كاشف MS XL باستخدام عمود HP-5MS (انظر جدول المواد) ، وحجم عينه من 1 μl ، ودرجه حرارة الفرن المنحدر من 50 درجه مئوية إلى 300 درجه مئوية في 20 درجه مئوية دقيقه-1.
    7. بعد تحديد الكسور التي تحتوي علي مركب (ق) من الفائدة ، والجمع بين جميع الكسور التي تحتوي علي نفس المركب. التخلص بشكل صحيح من الكسور التي لا تحتوي علي اي مركبات في حاويه نفايات. كرر اجراء التبخر الدوار إذا لزم الأمر للتركيز علي الأيض المنقي.
    8. إذا كان من الضروري تنقيه اضافيه ، استخدم (شبه) الاعداديه HPLC لتحسين نقاء المنتج. وينبغي تكييف بروتوكولات HPLC استنادا إلى مواصفات المعدات الفردية والمركبات ذات الاهميه.
      1. أعاده تعليق عينات اللوني السيليكا المجففة في 1 مل الهكسين (الهيدروكربونات diterpene) أو اسيتلونيتريل (الأوكسيجين المؤكسد) ، وتصفيه من خلال حقنه فلتر لمنع التلوث مع الجزيئات الصغيرة.
      2. للحصول علي diterpenoids غير القطبية ، استخدم عمود CN (انظر جدول المواد) مع معدل تدفق الموصي بها من 1 مل/دقيقه والهكسان: ايثيل خلات التدرج ، مع الكسور التي تم جمعها كل 1 دقيقه.
      3. للحصول علي diterpenoids القطبية ، استخدم عمود C18 (انظر جدول المواد) مع معدل تدفق الموصي بها من 3 مل/دقيقه و اسيتلونيتريل: الانحدار المياه ، مع الكسور التي تم جمعها كل 1 دقيقه.
      4. جفف جميع الكسور المنقية من HPLC تحت تيار النيتروجين وأعاده التعليق في الهكسان 1 مل قبل تحليل GC-MS لتقييم وفره المنتج ونقاءه.

4. إنتاج الأيض diterpenoid باستخدام n. benthamiana

ملاحظه: تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا لإنتاج نواتج الأيض diterpenoid في n. benthamiana من الدراسات المبلغ عنها سابقا35،36،40،41. البروتوكول الوارد أدناه خاص بالحقنة-تسلل الأوراق. طرق التسلل الأخرى ، مثل تسرب الفراغ هي مناسبه علي قدم المساواة. ثنائي T-الحمض النووي ناقلات أنظمه, مثل pCAMBIA130035Su (pLIFE33) أو peaq-HT40,41,42, التي تمكن الانتشار في e. كولاي و ا. توميفاسينس والتعبير الجيني في المضيفين النبات هي مناسبه لهذا البروتوكول.

  1. زرع نيكوتيانا بنثاميانا
    1. ملء وعاء 1 750 مل مع التربة بوتينغ والمياه وعاء. أضافه ~ 20 بذور التبغ والاستفادة بلطف مع الاصبع بحيث تكون في التربة. لا تغطي مع التربة.
      ملاحظه: يمكن توليد البذور من خلال التلقيح الذاتي لنشر البذور. وقد تم الحصول علي بذور هذه التجربة من قسم البيولوجيا النباتية في جامعه كاليفورنيا في ديفيس ، وهي متاحه للجمهور من خلال مستودع البلازما الوراثية التابع لوزارة الزراعة (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450).
    2. ترك وعاء في غرفه النمو مع الحالات التالية ، سقي كل يوم لضمان التربة لا تجف. تنمو النباتات في 26 درجه مئوية و 60 ٪ الرطوبة مع 16:8 h اليوم: دوره ليليه لجميع الخطوات في هذا البروتوكول.
    3. بعد 1 أسبوع ، وملء ~ 20 الأواني مع التربة بوتينغ والمياه الأواني. باستخدام ملقط ، وفهم الشتلات التبغ من الجذعية وأزاله بلطف من وعاء المصدر ، ووضع الشتلات واحد في كل وعاء جديد والتجشؤ بعناية الجذور. لا تتلف الأوراق أو الجذور.
    4. المياه النباتات كل يوم من خلال وضع المياه في علبه الأواني في (وتسمي أيضا "سقي القاع"). كل أربعه سقي ، وتشمل الاسمده العامة في الماء وفقا لتعليمات الحزمة.
  2. تجميد-التحول ذوبان الGV3101 الخلايا المختصة سلاله اجروطره
    1. ذوبان البكتيريا الGV3101ه سلاله (أو سلاله مفضله أخرى) الخلايا المختصة علي الجليد (~ 1 h). قبل البرد 0.2 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير علي الجليد. الدافئة SOC وسائل الاعلام في 28 درجه مئوية.
    2. خلط الخلايا بلطف مع غيض ماصه pipet-x (لا ماصه pipet-x صعودا وهبوطا) و قسامه 15 μl من الخلايا لكل تحويل إلى المبردة 1.5 mL ميكروانابيب.
    3. أضافه 1-5 μL (~ 400 ng) من الحمض النووي لكل أنبوب من الخلايا المختصة وتخلط بلطف عن طريق تجريف أنبوب علي طول رف أنبوب.
      ملاحظه: لا تحتاج الثوابت المطلوبة إلى مقاومه مختلفه للمضادات الحيوية لان كل منها يتم تحويله بشكل منفصل سيتم مزجه قبل التسلل.
    4. ضع الأنابيب المجهرية في النيتروجين السائل لمده 5 دقائق.
    5. أزاله ميكروانابيب من النيتروجين السائل ووضع الأنابيب علي رف الغرفة-درجه الحرارة. ذوبان أنابيب لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية حاضنه.
    6. أضافه 250 μL من الحرارة السابقة (28 درجه مئوية) SOC لكل ميكروتيوب. يهز في 28-30 درجه مئوية ، 225 لفه في الدقيقة ، لمده 3 ساعات.
    7. لوحه 50 μL من الخلايا المحولة علي لوحات أجار LB تحتوي علي المضادات الحيوية اللازمة الموصوفة في الجدول 1 باستخدام الخرز الزجاجي المعقم ، كما هو موضح في الخطوة 2-1-8.
    8. لوحات احتضان مقلوبه في 28-30 درجه مئوية ل 48 ح. قد يكون النمو فياليوم الأول من الحضانة علامة علي التلوث. تحويل توميفاسينس يمكن استخدامها بعد حضانة لمده يومين أو تخزينها في 4 درجه مئوية مختومه في فيلم البارافين لمده تصل إلى 2 أسابيع.
  3. Agrobacterium-بوساطة عابر انزيم التعبير المشترك في نيكوتيانا benthamiana
    1. تقليم النباتات نيكوتيانا benthamiana البالغ من العمر 4 أسابيع 2 أيام قبل التسلل عن طريق أزاله الأوراق السفلي. اترك 4 أوراق علويه. المياه النباتات. لا المياه النباتات 24 ح قبل التسلل من أجل السماح لفتح المعدة وتسلل أسهل.
    2. أضافه 10 مل من LB مع تركيزات العمل من المضادات الحيوية المناسبة ليبني المختارة وسلاله اجروبطره (الموصوفة في الجدول 1) إلى 50 mL أنبوب اختبار الزجاج معقمه مع غطاء إحباط.
    3. تطعيم باستخدام طرف ماصه لمسحه مستعمره واحده من اجروطره المتحولة وإخراج الطرف في وسائل الاعلام LB. يجب ان يكون كل Agrobacterium التحويلية علي الأقل 2 الثقافات الصغيرة.
    4. احتضان بين عشيه وضحيها في 28 درجه مئوية و 220 لفه في الدقيقة.
    5. قياس الكثافة البصرية في 600 nm (OD600) من الثقافات بين عشيه وضحيها باستخدام مقياس طيفي. تمييع الثقافات بين عشيه وضحيها إلى600 OD من 1.
      ملاحظه: قد تختلف قيم OD600 الأمثل عند استخدام سلالات agrobacterium أخرى.
    6. توزيع 10 مل من الثقافة المخففة بين عشيه وضحيها في أنابيب المخروطية 50 mL.
    7. حصاد البكتيريا بطرد في 3500 لفه في الدقيقة لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. صب قباله وتجاهل سوبرناتانت.
    8. أعاده تعليق الثقافات في 10 مل العازلة تسلل عن طريق هز الأنبوب بلطف والمتداول علي رف أنبوب. يجب ان يساوي600 OD 1 لكل بناء.
    9. توليد مجموعات المطلوبة للتسلل عن طريق الجمع بين وحدات التخزين متساوية من كل خط الخلية المحولة. يجب ان يساوي600 OD 1 لكل تسلل. تقدير 5 مل من محلول التسلل لكل ورقه ، 2 أوراق لكل مصنع.
    10. نعلق أنابيب أفقيا إلى الروك والصخور بلطف لمده 2 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
    11. التسلل ~ 2 يترك في n. benthamiana النبات باستخدام ما يقرب من 5 مل من خليط التسلل لكل ورقه. التسلل إلى أوراق صحية مع حقنه بدون ابره علي الجانب السفلي من الأوراق في حين تمارس الضغط المضاد مع اصبع في الجزء العلوي من ورقه لضمان الحل تسلل يكفي الانسجه ورقه.
    12. وضع علامة علي جميع الأوراق المخترقة بعلامة سوداء أو مؤشر آخر. مكان النباتات المخترقة في غرفه النمو لمده 5 أيام. الحفاظ علي النباتات جيدا الماء.
      ملاحظه: قد ثبت وقت الحضانة من خمسه أيام كافيه للوصول إلى مستويات diterpenoid كافيه لمعظم التحليلات المصب ، مع الحفاظ علي كفاءه الوقت من تشكيل المنتج. ويمكن اختبار فترات الحضانة الأطول ، حيث تكون هناك حاجه إلى كميات اعلي من المنتج.
  4. استخراج المستقلب وتنقيه من تحول نيكوتيانا benthamiana
    1. الحصاد تسللت الأوراق من النباتات عن طريق قطع لهم من النبات. أضف ~ 100 مل من النيتروجين السائل وورقه واحده إلى مدفع هاون ، ثم طحن باستخدام هاون ومدقه أو مطحنه الانسجه حتى الحصول علي مسحوق ناعم.
    2. أضافه الانسجه المسحوقة إلى قارورة GC-MS إلى ترسيم 500 μL. أضافه 1.5 mL من 50/50 (v/v) ايثيل خلات/الهكسان أو المطلوب خليط المذيبات إلى القارورة والغطاء باحكام.
      1. للتعبيرات التي تم اختبارها لتوفير المنتجات المطلوبة ، تجمع الانسجه الارضيه في قارورة أكبر أو أنبوب اختبار ، ثم أضافه ~ 2x كميه من المذيبات من حجم الانسجه ويهز بين عشيه وضحيها. انتقل إلى الخطوة 4.4.5 لتنقيه.
    3. وضع جميع قوارير في رف ميكروتيوب والشريط أسفل باحكام لتامين. استخراج تحت تهتز قويه بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة.
    4. نقل 400 μL من استخراج و 600 μL من الهكسان إلى قارورة GC-MS الطازجة. لا الانسجه الورقية. تحليل العينات باستخدام GC-MS باستخدام الأسلوب الموضح في الخطوة 3.3.6.1.
    5. بعد التحليل عن طريق GC-MS لوجود نواتج الأيض المطلوبة ، ومقتطفات ورقه تجمع معا والمضي قدما من خلال التبخر الدوارة ، السيليكا اللوني العمود ، و HPLC للحصول علي مركبات نقيه كما هو موضح في الأقسام 3.2 و 3.3.

Representative Results

سير عمل تخطيطي للإنتاج diterpenoid باستخدام e. كولاي
يوضح الشكل 1 سير العمل الموصوف لإنتاج diterpenoid. تم تكييف البروتوكول الموضح هنا من منصة كولاي الموصوفة سابقا لتخليق الحيوي diterpenoid13،32 لاستخدام الثقافات أكبر حجما وتنقيه المنتجات المطلوبة من diterpenoid عن طريق السيليكا اللوني. لإثبات استخدام هذا البروتوكول ، استخدمنا المسار dolabralexin التي تم تحديدها مؤخرا من الذرة التي تضم اثنين من diTPSs ، ZmAN2 (Zm00001d029648) و ZmKSL4 (Zm00001d032858) ، P450 متعدد الوظائف (CYP71Z18 ، Zm00001d014134) ، والكروم الخلوي P450 ريدكتيز (ZmCPR2 ، Zm00001d026483) (الشكل 2). باختصار ، e. القولونية BL21DE3-C41 الخلايا المختصة تم تحويلها مسبقا مع pcdfduet: IRS و pacyc-duet: ggpps/ZmAN2 البلازميدات13،32. و pcdfduet: IRS البلازميد يحتوي علي الانزيمات الرئيسية لإنتاج السلائف diterpenoid ، بما في ذلك 1-ديكسي-د-اكسيليولوسي-5-فوسفات synthase (dxs) ، 1-ديكسي-د-اكسيليولوسي-5-فوسفات ريدكتيز (dxr) ، و إيسوبينتينيل ثنائي فوسفات ايسوميمسح (idi) ، وكان يظهر لزيادة تشكيل diterpenoid في e. القولونية13. و pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 البلازميد يحتوي علي الذرة الأنف-copalyl ثنائي فوسفات synthase ZmAN2 و synthase ggpps من شوح جرانديز. الانزيمات المحفزة لردود الفعل الملتزمة في dolabralexin التخليق الحيوي كانت ثم المشاركة في تحويل كما البلازميدات pET28b: ZmKSL4 و pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. للحصول علي تفاصيل حول التسلسلات والثوابت البلازميد انظر mafu et al. 201839.

يتم عرض كروماتوجرام GC-MS من منتجات الانزيمات المستخرجة في الشكل 3A، مما يدل علي تشكيل ثلاثه مركبات dolabralexin ، وهي dolabralexin (1.2 ± 0.25 Mg/l الثقافة) ، ابيكسيدولابريني (0.65 ± 0.2 Mg/l الثقافة) ، وابيكسيدولابرانول (11.4 ± 1.1 mg/L الثقافة) كما كميا استنادا إلى منحني قياسي باستخدام الصلبة diterpenoid. واستخدمت المادة الصلبة كمعيار مرجعي ، بسبب بنيتها المماثلة وخواصها الكيميائية بالمقارنة مع dolabralexins. وتشمل المنتجات الثانوية التي لوحظت عاده الكلورامفينيكول ، ومشتقات الانول اوكسيندول و اندول-5-الديهيد ، والسلائف جيرانيلجيرانيل ثنائي فسفات (ggpp) (الشكل 3). يمثل indole عاده المنتج الثانوي الأساسي ، ولكن لا يظهر هنا ، نظرا للوقت الاحتفاظ به أقصر من تاخير المذيبات المجموعة من 7 دقائق للحفاظ علي سلامه الصك GC-MS.

سير العمل التخطيطي للإنتاج diterpenoid باستخدام n. benthamiana
ويصور الشكل 4 لمحه عامه عن التعبير عن مسار dolabralexin في n. benthamiana. بالنسبة للمنتجات الموصوفة هنا ، تم تحويل الثوابت التالية بشكل منفصل إلى ا. توميفاسينس سلاله GV3101: pLife33: p19 (التعبير عن p19 الجينات إسكات البروتين المثبط) ، pLife33: ZmCYP71Z18 ، PLife33: ZmAN2 ، PLife33: ZmKSL4. واستخدمت متواليات كامله الأصلي من الجينات dolabralexin مسار الذرة في ثنائي T-الحمض النووي ناقلات pLife3341 مع المقاومة كاناميسين للانتشار في كولاي و ا. توميفاسينس. التعبير المشارك من الجينات المسار تربين المنبع هو اختياري ، لان السلائف جيرانيلجيرانيل ثنائي فسفات هو اندوجينوسلي تتشكل في n. benthamiana. ومع ذلك, وقد استخدمت عده دراسات بنجاح مثل هذه النهج لزيادة تشكيل diterpenoid في n. benthamiana14,36,41. كما هو موضح في الشكل 3، التعبير المشترك أنتجت بنجاح dolabradiene و 15 ، 16-ابكسيدولابيريني. وخلافا لانزيم التعبير المشترك في كولاي, 15, 16-ايبوكدولابرانول لم يتم الكشف عنها في مقتطفات المستقلب.

وجود 15 ، 16-ابكسيدولابهين في مقتطفات ورقه أظهرت نشاط CYP71Z18 في n. benthamiana. كما 15, 16-ابكسيدوليابرانول ثبت ان تكون مستقره بعد استخراج من الثقافات الميكروبية (الشكل 3) وكذلك بعد العزلة عن الذرة الجذر الانسجه في الدراسات السابقة39, يبدو من المعقول ان المنتج هيدروكسيلاتيد هو الغليكوزيلاتي الذاتية غليكوسسيلترانسفيراسيس والمعزولة في وقت لاحق في فجوه ، مما يجعلها غير قابله للوصول إلى استخراج مع مخاليط المذيبات العضوية المستخدمة هنا لاستخراج36،43،44،45 ,46. وقد تم الإبلاغ عن تعديلات مماثله في المنتجات غير المرغوب فيها في سياق هندسه المسارات في n. benthamiana في الدراسات السابقة47. كما هو مبين للتعبير المشترك في e. كولاي، التعبير عابر في n. benthamiana النتائج في استخراج العديد من المنتجات الثانوية ، بما في ذلك الخطية من طول سلسله مختلفه استنادا إلى مقارنه إلى قواعد البيانات الأطياف الجماعية المرجعية. تم العثور علي فكسانال مركب المستخرجة من المواد ورقه لتكون في المتوسط 2.4 +/-0.5 ملغ dolabradiene و 0.9 +/-0.3 ملغ 15 ، 16-ابكسيدولابهريني في الانسجه ورقه الجافة g. لا يمكن مقارنه هذه الفكسانال مباشره إلى نظام التعبير المشترك e. كولاي نظرا لمجموعه مختلفه ups التجريبية.

تنقيه ديتيربينيد
تم تحقيق تنقيه diterpenoid باستخدام اللوني عمود السيليكا واللاحقة HPLC شبه معدي. مستخلصات المستقلب من 12 لتر من الثقافات القولونية المجمعة تم تنقيتها باستخدام اللوني العمود السيليكا لفصل المركبات dolabralexin البؤري الثلاثة (الشكل 3a). اللوني السيليكا مثاليه لتحقيق نقاء عاليه من المركبات المستهدفة ، لأنه يتيح فصل بسيط من اوليفينات ديتيربين ومشتقات الأوكسيجين ، ويزيل بسهوله الملوثات الرئيسية ، oxindole ، والتي يتم الاحتفاظ بها علي مصفوفة السيليكا ( الشكل 3 (ا).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل لإنتاج الدتيربينيد في e. كولاي وتنقيه المستقلب من الثقافات البكتيرية السائلة. تصور المربعات المتقطعة الخطوات الاختيارية التي تتطلب تنقيه اضافيه. (ا) صوره تمثيليه للثقافة القولونية المستخرجة باستخدام قمع منفصل. (ب) صوره تمثيليه لتنقيه المستقلب استخراج باستخدام اللوني السيليكا.   يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المسار البيولوجي الاصطناعي Dolabralexin والتركيبات الجينية المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نتائج GC-MS. المعروضة هي تمثيليه الكروم GC-MS من المنتجات diterpenoid المنقي التي تم الحصول عليها باستخدام انزيم التعبير المشترك المقايسات في (ا) e. كولاي و (ب) n. benthamiana. وتستند تعاريف المنتجات إلى مقارنات مع المعايير الاصليه والأطياف الجماعية المرجعية للمكتبة الطيفية الشاملة للمعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا. 1, oxindole; 2 ، اندول-5-الديهيد. 3 ، بيرولو [1 ، 2-ا] pyrazine-1 ، 4-dione ، هيكسيهيدرو-3-(2-ميثيلبروبيل)-؛ 4, 6-O-اسيتيل-1-[[4-بروموفينيل] thio]-a-د-غلوكوزيد S, S-ثاني أكسيد; 5 ، dolabradiene ؛ 6, 15, 16-[ابكسيدولبرين]; 7 ، بيرولو [1 ، 2-ا] pyrazine-1 ، 4-dione ، هيكسيهيدرو-3-(فينيلالميثيل)-؛ 8, 15, 16-ابوكسيدولابرانول; 9 و 12 ، غير معروف ؛ 10 ، الكلورامفينيكول ؛ 11 ، 3 ، 7 ، 11 ، 15-تيتراميثيل-2-هيكساديسين-1-را ؛ 13-16. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إنتاج الدتيربينيد في n. benthamiana. (ا) سير العمل في إنتاج الدتيربنيد في n. benthamiana وتنقيه المستقلب من الموادالورقية. (ب) صوره تمثيليه لنباتات n. benthamiana جاهزه لتجارب التسلل ، قبل التشذيب. (ج) الصور التمثيلية لنباتات n. benthamiana بعد التشذيب. (د) صوره المحقنة-الأوراق المخترقة. وقد تسللت المناطق المظلمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

توسيع نطاق التحقيق وتطبيق المنتجات الطبيعية diterpenoid يتطلب بروتوكولات بسيطه وغير مكلفه لتوليف وتنقيه كميات كافيه من المركبات المطلوبة. الزيادة السريعة في عدد من الانزيمات الايضيه diterpenoid المتاحة من مجموعه واسعه من الأنواع الآن يوفر مخزون توسعيه للإنتاج الانزيمي من diterpenoid باستخدام الميكروبية والنباتية القائمة علي أنظمه المضيف. الاضافه إلى ذلك ، فان الهندسة المعمارية وحدات من العديد من مسارات diterpenoid تمكن من استخدام الانزيمات من نفس الأنواع أو مختلفه في ' التوصيل & اللعب ' نهج الهندسة التوافقية لتوليد مجموعه من الطبيعة الطبيعية والجديدة مثل diterpenoid الطبيعية المنتجات2،14،26،35.

E. كولاي هو المضيف الميكروبي المفضل لتخليق المنتجات الطبيعية بسبب قوتها ، وسهوله التحجيم ، والتعقيد الكيميائي محدوده لانخفاض التلوث الثانوي ، وثروة من الاداات المتاحة لتجميع الحمض النووي والتعبير الامثل. في تجربتنا ، المنصة الموصوفة هنا هي مناسبه تماما لإنتاج غله المنتج تصل إلى عده مئات من الملغ من اوليفينات ديتيربين والكحول ، والتي هي مناسبه للعديد من التطبيقات المصب بما في ذلك تلك المقترحة هنا. في حين لا يجتمع النطاق الصناعي ، ومنصة الإنتاج الموصوفة هنا يمكن ان تكون أساسا لمزيد من المسار ، والمضيف ، والتخمير الأمثل كما ثبت بنجاح ل diterpenoids ذات الصلة مثل تاكساديني والصلبة33 ,34. وقد تم بنجاح إنشاء التعبير المفرط عن الجينات التي تحد من المعدلات المضافة للصناعة التحويلية أو المسالك المتوسطة للتغلب علي العوامل التي تحد من الغلة بالنسبة لتخليق المركبات الحيوية ، مثل عدم كفاية إمدادات السلائف وتدفق السلائف إلى المساراتالمتنافسة 13 ، 32،33،39. علي الرغم من ان ثبت نجاحه في العديد من الدراسات ، وضعف التعبير والنشاط الحفاز من تربين-الأيض P450s النواة وغيرها من الانزيمات الغشائية في القولونية هو عامل الحد من المرجح33،39 ،48،49،50،51،52. وقد ثبت استخدام متواليات codon الأمثل والتعديلات البروتين ، مثل أزاله الببتيد اشاره الشبكية إندوبلازمي أو إدخال الببتيد اشاره plastidial ، مفيده لزيادة ذوبان P450 التعبير14،38 ،49،50،53. واستخدمت هذه التعديلات أيضا للتعبير الميكروبي المشترك للذرة CYP71Z1839 المستخدم كمثال للمسار في هذه الدراسة. وتستند البروتوكولات الموصوفة علي استخدام البلازميدات الذي يحمل واحدا أو اثنين من الجينات لكل بناء ، وجميعها تحت نفس المروج المحرض. وفي الحالات التي تكون فيها التركيبات الجينية الأوسع نطاقا مرغوبة ، فانه من المستصوب استخدام مختلف الشرائط الجينية المتعددة المتاحة أو نظم التراص الجينية للتخفيف من كفاءه التحول المنخفض ونمو الثقافة بسبب استخدام البلازميدات ومضادات حيوية متعددة13 .

ومع توافر الموارد الوراثية والجينوم علي نطاق أوسع ، أصبحت النظم المضيفة للنباتات أيضا مناسبه بشكل متزايد لتصنيع المنتجات الطبيعية. وتشمل المزايا قدره النباتات علي إنتاج السلائف الطبيعية المطلوبة مدعومة بالتمثيل الضوئي ، التالي تمكين تكوين المنتجات دون الحاجة إلى تكمله السلائف جزيئات54،55. N. benthamiana يستخدم بالفعل علي نطاق واسع لفي الجسم الطبيعي توصيف وظيفية والتعبير التوافقي من تربين وغيرها من مسارات المنتجات الطبيعة14,35,36,40 . وتشمل المزايا الملحوظة لاستخدام n. benthamiana كنظام مضيف الإنتاج الذاتية من السلائف diterpenoid ، واستخدام متواليات الجينات الاصليه ، والتعبير المبسط لP450s حقيقية النواة ، وسهوله التحول الجينات التوافقية (كما المضادات الحيوية منفصلة غير مطلوبه للتحول المشترك عابره) ، واستخراج بسيطه من المنتجات المستهدفة من المواد ورقه. عند الحاجة ، ويمكن تعزيز إنتاج diterpenoid من خلال التعبير المشترك من الجينات المسار الأساسي لزيادة السلائف العرض36،41. القيود المفروضة علي إنتاج diterpenoid قابله للتطوير في n. benthamiana هي أكثر تعقيدا بالمقارنة مع الثقافات الميكروبية السائلة بسبب الحاجة إلى توليد الكتلة الحيوية النباتية كافيه ، وأكثر كثافة العمالة الكثيفة تنقيه المنتجات من مركب كيميائيا الانسجه النباتية ، وامكانيه الأيض غير المرغوب فيها من المنتجات المستهدفة من خلال ، علي سبيل المثال ، الاكسده ، glycosylation أو ديفوسفورويليشن من قبل الانزيمات الذاتية36،43،44،45 ,46,47. ومع ذلك ، يمكن توسيع هذا الاجراء إلى كميات المنتج مغ عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة للتسلل الزراعي56.

بروتوكولات استخراج وتنقيه المنتجات الموصوفة هنا متوافقة مع e. كولاي و n. benthamiana، وكذلك s. سيريفيسياي وغيرها من النظم المضيفة النباتية أو الميكروبية ، وتوفير نهج فعاله من حيث التكلفة التي من السهل ان أنشئت في كل من مختبرات البيولوجيا والكيمياء ولا تتطلب معدات تنقيه باهظه الثمن. استخراج المستقلب باستخدام قمع منفصلة مناسبه تماما لاستخراج كفاءه وفصل المرحلة قبل تنقيه الكروماتوغرافي. ويمكن تعديل احجام القمع بسهوله للسماح بحجم أكبر للثقافة وتقليل الوقت التجريبي اللازم لاستخراجها من الثقافات الكبيرة. وجدنا استخدام التدرج خلات الهكسان/ايثيل لتكون مثاليه لاستخراج ديتيربنيدس من قطبيه مختلفه كما هو موضح هنا لمجموعه من dolabralexins التي تضم كلا من الهيدروكربونات والأوكسيجين المركبات (الشكل 3). اعتمادا علي خصائص المنتجات المستهدفة ، قد تكون الخلائط المذيبات الأخرى مفيده. ومع ذلك ، يجب الا تكون المذيبات بالماء لضمان الاستخراج الناجح وفصل المرحلة باستخدام تقنيه القمع المنفصلة. الاضافه إلى ذلك ، فان فقدان المنتج من خلال التبخر يجب ان يؤخذ في الاعتبار عند استخدام هذا النهج لإنتاج المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) ، مثل الوزن الجزيئي المنخفض أحاديه-و sesqui-تربين وغيرها من VOCs. فصل الكروماتوغرافي من ديتيربينيادس من مستويات مختلفه من الأوكسجين باستخدام أكبر مقياس (~ 2 L) عمود السيليكا كان مفيدا في تجربتنا ، لأنه يوفر فصل المنتجات المحسنة ويقلل من الحاجة إلى تنقيه تكراريه خطوات عند استخدام وحدات تخزين أصغر في العمود. يمكن تعديل وحدات تخزين الاعمده والمصفوفات حسب الحاجة لحجم الثقافة المطلوب ونوع المنتج الطبيعي. نقاء المنتجات المستهدفة التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول هو مناسبه للعديد من التطبيقات المصب ، مثل اختبارات النشاط الحيوي أو لاستخدامها في تحليلات نشاط الانزيم. ومع ذلك ، حيث مستويات نقاء اعلي مطلوبه ، مثل التحليلات الهيكلية عن طريق NMR ، ويمكن تعزيز نقاء المنتج بكفاءة عن طريق تنقيه اضافيه باستخدام (شبه)-الاعداديه HPLC.

هذا البروتوكول الموصوف هنا قد تم الأمثل لإنتاج المنتجات الطبيعية diterpenoid ، ولكن يمكن أيضا ان تكون مخصصه بسهوله إلى أحاديه ذات الصلة ، sesqui-وثلاثي التربين ، فضلا عن غيرها من فئات المنتجات الطبيعية ببساطه عن طريق توليد الانزيم المطلوب وحدات للتعبير التوافقي14،57. ومع ذلك ، يجب ان تؤخذ التعديلات علي إجراءات استخراج المنتج وتنقيه في الاعتبار للمركبات ذات التقلبات العالية ، مثل أحاديه و sesqui-تربين ، أو اعلي القطبية والتعديل الوظيفي علي النحو الذي يجسده الغليكولات من العديد من triterpenoids ، فينيلبروبانيدس ، وغيرها من فئات المنتجات الطبيعية.

وعلي الرغم من ان المنصات الصناعية لتصنيع المنتجات الطبيعية متاحه ، فان البروتوكولات الموصوفة هنا توفر أداه غير مكلفه وقابله للتخصيص يمكن اعدادها بسهوله في معظم المختبرات. كما يتضح من إنتاج dolabralexins الذرة هنا وأماكن أخرى39، وكميات المنتجات والنقاء التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا النهج هي عاده ما تكون كافيه لتسهيل التحليل المصب المختلفة والاستخدامات ، بما في ذلك ، ولكن ليس تقتصر علي ، والدراسات الحيوية المختلفة ، وتحليل التفاعلات بين الكائنات الحية ، وكذلك لاستخدامها كركائز الانزيم أو كماده البداية للنهج شبه التوليف.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ونحن نعترف بامتنان الدكتور روبن بيترز (جامعه ولاية أيوا ، الولايات الامريكيه) لتوفير الإنشاءات pIRS و pGGxZmAN2. الدعم المالي لهذا العمل من قبل برنامج التفاعلات النباتية الحيوية NSF (منحه # 1758976 إلى P.Z.) ، والكيان التشغيلي القديم برنامج البحوث المهنية (منحه # DE-SC0019178 إلى P.Z.) ، ومعهد الجينوم المشترك للمعهد برنامج العلوم المجتمعية (منحه # CSP2568 إلى P.Z.) ، NSF برنامج زمالات البحوث العليا (إلى K.M.M.) ، وزمالة جامعه كاليفورنيا ديفيس عميد جائزه الإرشاد (إلى K.M.M.) ومن المسلم به بامتنان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent -
7890B GC Agilent -
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 152 ، التخليق الحيوي diterpenoid ، المشاركة في التعبير ، synthase diterpenoid ، سيتوكروم P450 monooxygenase ، نيكوتيانا benthamiana، زي ميس، الأيض المصنع المتخصصة
نهج للتخصيص للإنتاج الانزيمي وتنقيه المنتجات الطبيعية ديتيربينيد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., … More

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter