Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En tilpasselig tilgang til enzymatisk produktion og rensning af Diterpenoid naturprodukter

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/59992
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Plant Biology, University of California Davis

Summary

Her præsenterer vi let at bruge protokoller til fremstilling og rensning af isomere metabolitter gennem kombinatorisk ekspression af biosyntetiske enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, efterfulgt af kromatografisk produkt Rensning. De resulterende metabolitter er egnede til forskellige undersøgelser, herunder molekylær struktur karakterisering, enzym funktionelle undersøgelser, og Bioaktivitet assays.

Abstract

Diterpenoider danner en mangfoldig klasse af små molekyle naturlige produkter, der er bredt fordelt på tværs af livets riger og har kritiske biologiske funktioner i udviklingsmæssige processer, interorganismal interaktioner, og miljøtilpasning. På grund af disse forskellige bioaktiviteter er mange diterpenoider også af økonomisk betydning som lægemidler, fødevaretilsætningsstoffer, biobrændstoffer og andre bioprodukter. Avancerede genomforskning og biokemiske tilgange har muliggjort en hurtig stigning i kendskabet til diterpenoid-metaboliske gener, enzymer, og veje. Men den strukturelle kompleksitet af diterpenoider og den snævre taksonomiske fordeling af individuelle forbindelser i ofte kun en enkelt art er fortsat begrænsende faktorer for deres effektive produktion. Tilgængeligheden af en bredere vifte af metaboliske enzymer giver nu ressourcer til at producere diterpenoider i tilstrækkelige titre og renhed for at lette en dybere undersøgelse af denne vigtige metabolit gruppe. Ved at trække på etablerede værktøjer til mikrobielt og plantebaseret enzym-Co-ekspression præsenterer vi en let betjent og tilpasselig protokol til enzymatisk produktion af diterpenoider i enten Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, og rensning af ønskede produkter via silica-kromatografi og semi-præparativ HPLC. Ved hjælp af gruppen af majs (Zea mays) dolabralexin diterpenoider som et eksempel, vi fremhæver, hvordan modulære kombinationer af diterpenforbindelser syntase (ditps) og cytochrom P450 oxygenase (P450) enzymer kan bruges til at generere forskellige isomere stilladser. Rensede forbindelser kan anvendes i forskellige downstream-applikationer, såsom metabolit strukturelle analyser, enzym struktur-funktion undersøgelser, og in vitro og i planta Bioaktivitet eksperimenter.

Introduction

Diterpenoider omfatter en kemisk forskelligartet gruppe på mere end 12.000 overvejende polycykliske 20-kulstof naturprodukter, der spiller en kritisk rolle i mange organismer1. Svampe og planter producerer den største mangfoldighed af diterpenoider, men bakterier har også vist sig at danne bioaktive diterpenoider (Se anmeldelser2,3,4,5). Diterpenoider har rødder i deres enorme strukturelle mangfoldighed og tjener et væld af biologiske funktioner. Et par diterpenoider, såsom Gibberellin væksthormoner, har væsentlige funktioner i udviklingsmæssige processer5. Men de fleste diterpenoider tjener som mæglere i kemisk forsvar og interorganismal interaktioner. Blandt disse er diterpenharpiks syrer i skadedyrs-og patogen forsvaret af nåletræer og artsspecifikke blandinger af antimikrobielle diterpenoider i større fødevareafgrøder såsom majs (Zea mays) og ris (Oryza sativa) i vid udstrækning blevet har studeret6,7. Disse bioaktiviteter giver en rig kemisk repository til kommercielle applikationer, og vælg diterpenoider anvendes som vigtige lægemidler, tilsætningsstoffer, klæbemidler, og andre bioprodukter i hverdagen moderne liv8,9 ,10. For at fremme forskningen i diterpenoider ' naturlige mangfoldighed og biologiske funktioner og i sidste ende promovere bredere kommercielle anvendelser er det nødvendigt med værktøjer til omkostningseffektiv tilberedning af rene forbindelser. Storstilet isolation fra plantemateriale er blevet etableret for nogle få isomere bioprodukter, såsom diterpenforbindelser harpikssyrer, der produceres som et biprodukt af papirmasse-og papirindustrien8. Akkumulering af diterpenoider i kun specifikke væv og under stram regulering af miljømæssige stimuli begrænser imidlertid ofte isolering af tilstrækkelige produktmængder fra den naturlige producent2. Desuden hæmmer den strukturelle kompleksitet af diterpenoider deres produktion gennem kemisk syntese, selv om sådanne tilgange har været vellykkede i flere tilfælde11,12. Med tilgængeligheden af avancerede genomiske og biokemiske teknologier har enzymatiske produktionsplatforme fået stigende opmærksomhed for at producere en række isomere forbindelser (Se anmeldelser13,14, 15,16,17,18).

Alle terpenoider, herunder diterpenoider, er afledt af to isomeriske isoprenoide prækursorer, isopentenyldiphosphat (IPP) og dimethylallyldiphosphat (DMAPP)19 , der til gengæld dannes gennem mevalonat (MVA) eller methylerythritol-5-fosfat (MEP) pathway. Terpenoid biosyntese fortsætter gennem MEP-stien i bakterier og MVA-vejen i svampe, hvorimod planterne besidder en cytosolisk MVA og en plastidial MEP-pathway, hvor sidstnævnte er den primære vej mod isomere dannelse20. Kondensation af IPP og DMAPP ved prenyl transferaser giver den centrale 20-Carbon forløber til alle diterpenoider, geranylgeranyl diphosphat (GGPP)20. Downstream af ggpp formation, to enzym familier, terpen synthaser (tpss) og cytochrom P450 monooxygenaser (P450s) stort set kontrollere dannelsen af den store kemiske mangfoldighed af terpenoid metabolisme21,22. Diterpenforbindelser synthases (ditpss) katalyserer den engagerede kulhydrat-drevne cyklisering og omorganisering af ggpp til dannelse af forskellige stereo specifikke bi-, poly-eller makrocykliske diterpenstilladser1,3,23, 24. Iltning og yderligere funktionel dekoration af disse stilladser er derefter lettet af P450 enzymer og vælge andre enzym familier22,25. TPSs og P450s findes almindeligvis som artsspecifikke, multi-gene familier, der kan danne modulære biosyntetiske netværk, hvor kombinationen af forskellige enzym moduler langs en fælles plan muliggør dannelsen af en bred vifte af forbindelser2, 26. den hurtige opdagelse af funktionelt adskilte enzymer, der opererer i modulære terpenoide veje i de seneste år, har givet udvidede muligheder for deres anvendelse som en alsidig Reservedelsliste til metabolisk manipulation af delvise eller komplette veje i både mikrobielle og plantebaserede produktionsplatforme. For eksempel, gær (Saccharomyces cerevisiae) er blevet anvendt med succes til at ingeniør multi-enzym veje til fremstilling af terpenoid bioprodukter, såsom malaria medicin artemisinin27, sesquiterpenoid biobrændstoffer bisabolene og farnesen28, men også vælge diterpenoider29,30,31. Ligeledes er der konstrueret Escherichia coli -platforme til industriel fremstilling for nogle få isomere-metabolitter, herunder taxolprækursor taxadien, der anvendes som et anti-cancer-lægemiddel, og diterpen-alkoholen, sclareol , der anvendes i duft industrien13,32,33,34. Fremskridt inden for genteknologi og Transformations teknologier har også gjort plante værtssystemer stadig mere levedygtige til produktion af plante naturprodukter9,14,35,36. Især den tætte tobak relative, Nicotiana benthamiana, er blevet et meget anvendt chassis til terpenoid pathway analyse og ingeniørarbejde, på grund af den lethed af Agrobacterium-medieret omdannelse af flere gene kombinationer , effektiv biosyntese af endogene prækursorer og høj biomasse14,35,36.

Tegning på disse etablerede platforme for terpenoid biosyntese, vi beskriver her let at bruge og omkostningseffektive metoder til enzymatisk produktion af diterpenoider og oprensning af enkelte forbindelser. De præsenterede protokoller illustrerer, hvordan E. coli og N. benthamiana platforme udviklet til forbedret isomere forløber biosyntese kan udnyttes til kombinatorisk ekspression af forskellige ditpss og P450 enzymer til at generere ønskede isomere-forbindelser. Anvendelsen af denne protokol til at fremstille og rense strukturelt forskellige diterpenoider er vist ved eksempel på specialiserede diterpenoider fra majs (Zea mays), kaldet dolabralexiner, endogene biosyntese, hvoraf rekrutter to ditps og en P450 Enzym. Rensning af forskellige dolabralexiner, der spænder fra olefiner til oxygenholdige derivater, opnås derefter ved at kombinere separatoriske tragt ekstraktion med stor skala silica-kolonne kromatografi og præparativ højtryksvæskekromatografi (HPLC). De beskrevne protokoller er optimeret til produktion af diterpenoider, men kan også let tilpasses til relaterede terpenoid klasser, samt andre naturlige produkter, for hvilke enzym ressourcer er til rådighed. Forbindelser fremstillet ved hjælp af denne metode er velegnede til forskellige downstream-anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, strukturel karakterisering via nuklear magnetisk resonans (NMR) analyse, anvendelse som substrater for enzym funktionelle undersøgelser og en række Bioaktivitet assays.

Protocol

Forsigtig: de her beskrevne protokoller omfatter brug af farlige kemikalier, skarpe genstande, elektriske apparater, varme genstande og andre farer, der kan medføre personskade. Der bør bæres passende personlige værnemidler, og de relevante sikkerhedsprocedurer, herunder sikkerhedskurser, bør følges.

1. fremstilling af materialer og opløsninger

  1. Forbered og autoklave lysogeny bouillon medium (LB) i 30 min: pr 1 L medium, Bland 10 g tryptone, 5 g bakteriel gær ekstrakt, og 10 g NaCl og opløses i 1 L deioniseret (DI) vand.
  2. For 1 L Co-Expression kulturer, forberede og autoklave fantastisk bouillon (TB) medium for 30 min: i en 2,8 L Erlenmeyer kolbe Bland 12 g tryptone, 24 g bakteriel gærekstrakt og 40 mL af 10% (v/v) glycerol og opløses i 860 mL DI vand. Forbered og autoklave 1,3 L af 10x fosfatbuffer [1,3 L af DI vand, 30,03 g mono kalium fosfat (KH2po4), og 163,02 g Dikaliumphosphat (K2HPO4)] og tilsæt til ovennævnte medium.
  3. Forbered super optimal bouillon med Katabolite undertrykkelse (SOC) medier.
    1. Forbered og autoklave til 30 min en opløsning, der indeholder 2% (w/v) tryptone, 0,5% (w/v) bakteriel gærekstrakt, 8,5 mM NaCl og 2,5 mM KCl.
    2. Tilsæt steril MgSO4 og glucose både med en endelig koncentration på 20 mm. Brug 1 M NaOH til at justere til pH 7,0. Opbevar SOC-mediet ved-20 °C.
  4. Forbered 1 L af 1 M natrium pyruvat. Autoklave i 15 min og opbevares ved 4 °C.
  5. 20 mL 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) forberedes i steril DI-vand. Opbevar 1 – 2 mL aliquoter ved-20 °C.
  6. Forbered infiltration buffer: 10 mM MES (1,952 g) og 10 mM MgCl2 (2,033 g) opløst i 1 L af di vand. Opbevares ved 4 °C.
  7. Lav og autoklave LB-agar i 30 min.: pr. 100 mL DI vand tilsættes 1 g trypton, 0,5 g bakteriel gærekstrakt, 1 g NaCl og 1,5 g agar. Når LB agar er cool nok til at håndtere flasken, tilsæt antibiotika som krævet for den ønskede plasmid kombinationer. Hæld agarplader med petriskåle, og opbevar dem ved 4 °C.
    1. Se tabel 1 for specifikationer vedrørende sammensat produktion i henholdsvis E. coli og N. benthamiana. Wrap plader, der indeholder rifampicin i folie for at forhindre nedbrydning ved opbevaring.
Arbejds koncentration (μg/mL)
Antibiotika Lager (mg/mL) Opløsningsmiddel 1 plasmid 2 plasmid'er 3 eller 4 plasmid'er
Carbenicillin 50 H2O 50 25 20
Chloramphenicol 30 EtOH 30 20 20
Kanamycin 50 H2O 50 25 20
Spectinomycin 30 H2O 30 25 20
Gentamycin 50 H2O 30
Rifampicin 10 MeOH 10

Tabel 1: antibiotika koncentrationer for plasmid-Co-ekspression i E. coli eller N. benthamiana.

2. produktion af diterpenoide metabolitter i E. coli

Bemærk: den protokol, der er beskrevet her til fremstilling af isomere metabolitter i E. coli er blevet tilpasset fra en tidligere rapporteret enzym Co-Expression platform udviklet af gruppen af Dr. Reuben J. Peters (Iowa State University, IA, USA)13 ,32.

  1. Omdannelse af kompetente celler med plasmid kombinationer.
    1. Tø kemisk kompetente E. coli -celler på is (BL21DE3-C41 celler blev anvendt i denne protokol).
    2. Der tilsættes 1 μL af en 100 ng/μL opløsning af hver konstruktion, som anvendes til co-ekspression til 25 μL af de kompetente celler i et 1,5 mL mikrorør. Må ikke vortex eller blandes ved pipettering.
      Bemærk: for optimal ekspression og aktivitet af TPS-og P450-enzymer skal der tages hensyn til flere sekvensændringer. For TPS er fjernelse af N-terminal plastidial transit peptid ofte afgørende. Specifikt, plastidial mono-og di-TPS typisk kræver fjernelse af den forventede transit peptid (ved hjælp af almindeligt forudsigelse algoritmer37), hvorimod cytosolisk sesqui-TPS normalt kan anvendes som fuld-længde gener. Med hensyn til P450s, codon optimering samt fjernelse eller udskiftning med Leader sekvens makktsskgk af N-terminal transmembran domæne har vist sig effektiv i mange tilfælde38,39. Hertil kommer, når Co-udtrykker P450 enzymer en cytochrom P450 reduktase (CPR) bør indgå for at sikre tilstrækkelig P450 aktivitet.
    3. Blandingen inkubere på is i 30 min. Bland hver 10 minutter ved forsigtigt at Skrable røret over en Micro tube rack.
    4. Præ-incubate SOC medier og LB agar plader ved 37 °C indeholdende antibiotika som krævet for den ønskede kombination af konstruktioner.
      Bemærk: hver konstruktion, der skal Co-transformeres, skal have en tydelig antibiotikaresistens samt distinkte oprindelser af replikation for at sikre optimalt protein udtryk.
    5. Varmechok celle blandingen ved 42 °C i 1 minut, og derefter inkubere på is i mindst 2 min.
    6. Tilsæt 200 μL varm SOC-medie.
    7. Celle blandingen rystes i 1 time ved 37 °C og 200 rpm.
    8. Tilsæt ca. 10 autoklaveres glasperler til den varmede lb agar plade. Tilsæt 100 μL af celle blandingen og Udskift låget. Ryst pladen vandret med låget på for at fordele cellerne jævnt. Fjern glasperler ved at tappe dem ud i en affaldsbeholder. Alternativt kan du bruge andre foretrukne plating metoder.
    9. LB-agarpladen inkubateres ved 37 °C natten over med den coatede overflade nedad. Pladen med transformerede E. coli -kolonier kan anvendes den følgende dag eller opbevares ved 4 °c forseglet i paraffin folie i op til 2 uger.
  2. Fremstilling af inokulations kulturer
    1. På den følgende dag skal der fremstilles en opløsning af LB-medium med antibiotika, der kræves til den transformerede plasmid-kombination ved hjælp af koncentrationerne i tabel 1.
    2. I en steril hætte overføres 5 mL LB medium til et 15 mL sterilt glas prøve slange med en åndbar plastik hætte. Forbered et lille kulturrør til hver ønsket stor (1 L) kultur.
    3. Vælg individuelle E. coli -KOLONIER fra lb-agar-pladen ved hjælp af en pipettespids. Hver tube af LB inokuleres med en E. coli -koloni ved at skubbe en pipettespids, der indeholder en udvalgt koloni, ud i hvert rør.
    4. Cap hvert inokulationskulturtestrør med en åndbar plastik hætte. Placer de udjævnede E. coli små kulturer i en 37 °c ryste inkubator for 12 – 24 timer.
  3. Forberedelse og induktion af co-Expression kulturer
    1. På den følgende dag tilsættes 100 mL forberedt 10x fosfatbuffer til 900 mL forberedt TB for en endelig fosfatbuffer koncentration på 1x. Tilsæt nødvendige antibiotika med koncentrationer i henhold til tabel 1.
    2. Ryst ved 140 rpm ved 37 °C, indtil den er varm (ca. 30 min).
    3. Hver kolbe af medier inokuleres i 1 L-kulturer med 5 mL inokulationskultur. Den pipettespids, der anvendes til inokulering af dyrknings kulturer, fastholdes i inokulationskulturrøret, således at der ved ekstraktion med organisk opløsningsmiddel i efterfølgende trin ikke er ekstraherede plast forureninger.
    4. Inkuber med omrystning ved 200 rpm, indtil den optiske densitet ved 600 nm (OD600) når 0,6, ca. 3 h. For at måle OD600 med et spektrofotometer, brug en blanding af steril TB med fosfatbuffer som en blank.
    5. Ved den ønskede OD600indstilles inkubator indstillingerne til 16 °c.
    6. Ved samtidig at udtrykke P450s, frisk tilberede riboflavin og aminolevulinsyre, som er afgørende for tilstrækkelig P450 co-faktor produktion. For hvert eksperiment skal du lave 4 g/l riboflavin og 150 g/l aminolevulinsyrehydrochlorid Acid. Opbevar opløsningen pakket i folie indtil brug, da riboflavin er let følsom.
    7. Efter inkubator har nået 16 °C (ca. 30 min), tilsættes 1 mL af 1 M IPTG, 1 mL 4 g/L riboflavin og 1 mL 150 g/L aminolevulinsyre til hver kultur. For isomere-produktion skal der tilsættes 25 ml 1 M natriumpyruvat til hver kultur for at sikre tilstrækkelig prækursor dannelse.
      Bemærk: alle konstruktioner, der anvendes i denne analyse, var under den samme IPTG-inducerbare promotor. Forskellige initiativtagere kan anvendes som ønsket.
    8. Inkuber ved 16 °C og 140 rpm for 72 h. Tilsæt 25 mL natriumpyruvat hver efterfølgende dag efter induktion, hvis de producerer diterpenoider. Straks bruge kulturer straks anvendes til separatoriske tragt ekstraktion af metabolitter; må ikke høste eller gemme kulturer.

3. adskillelse og rensning af metabolitter

  1. Separatoriske tragt ekstraktion af metabolitter
    Bemærk: det er vigtigt kun at anvende glas-og glas pipetter ved brug af organiske opløsningsmidler for at forhindre blødgørings sygdomme.
    1. Fastgør den separerende tragt på en ring holder i en stinkhætte. Anbring et affalds bæger under den separatoriske tragt.
    2. Hæld 500 mL af 50/50 (v/v) ethylacetat/hexaner i den separatoriske tragt.
      Bemærk: opløsningsmiddel blandingen bør justeres på basis af opløseligheden og polariteten af de målrettede metabolitter. Vand miscible opløsningsmidler bør undgås for at sikre en passende faseadskillelse.
    3. Tilsæt 500 mL E. coli -kulturen til skilletragten og anbring den på glas proppen.
    4. Ryst tragten for at blande kulturen med ekstraktionsopløsningsmidlet, ca. 5 – 10x. Ofte de-gas tragten ved at åbne studs, mens tragten holdes på hovedet og pegede ind i røg Hood at frigøre tryk. Gentag omrystning og de-gas procedure 2x.
    5. Placer tragten oprejst i ring standen, og vent, indtil opløsnings laget (øverst) er adskilt fra det vandige (kultur) lag (nederst), ca. 1 min.
      Bemærk: når der observeres en stor mængde bobler i interfasen, kan tilsætning af et lille volumen på 5 – 10 mL EtOH tilsættes for at forbedre fase adskillelsen.
    6. Tag proppen af. Dræne E. coli -laget i et affalds bæger, og opretholde opløsningsmiddel laget i tragten.
    7. Proceduren gentages med de resterende 500 mL E. coli -kultur og den samme 500 ml solvens, der anvendes til den første ekstraktion.
    8. Opløsningsmidlet, der indeholder de ekstraherede metabolitter, aflades i en ren kolbe. Undgå kontaminering med E. coli -kulturen.
  2. Roterende fordampning koncentration
    1. Forbered den roterende fordampning (rotovap) udstyr: fyld vandbadet og Indstil temperaturen til 25 °C. For varmefølsomme forbindelser, brug en lavere temperaturindstilling eller tilsæt is til vandbad. Fyld kondenserings kammeret med tøris og Indstil rotationshastigheden til 60 – 80 rpm.
    2. Der tilsættes ca. 700 mL ekstraherede metabolitter til en 1 L fordampende kolbe, fastgøres til rotovap og sænkes ned i vandbad. Drej vandbadet på og Indstil til 25 °C.
    3. Start rotation af fordampnings kolben, Tænd for vakuumsystemet, og øg gradvist opsugning for at undgå hurtig kogning af metabolitten opløsning i affalds kolben. Fordampet opløsningsmiddel bør begynde at kondensere og dryppe ind i kondensat-opsamlings-(affalds-) kolben.
    4. Når kun få mL af metabolitten opløsningen forbliver i fordampningskolben, skal du stoppe rotationerne og slukke for vakuumsystemet. Løft fordampningskolben, og tryk den ned ved at lukke vakuum ledningen. Den koncentrerede metabolits opløsning bevares i fordampning kolben. Bortskaf affaldet i affalds kolben.
    5. Fortsæt roterende fordampning ved at tilsætte op til 700 mL yderligere ekstraheret metabolit opløsning til fordampnings kolben. Gentag processen, indtil al den ekstraherede metabolit opløsning er koncentreret.
    6. De koncentrerede metabolitter fjernes fra fordampningen ved at overføre en glas pipette til et nyt prøveglas. Fordampningskolben skylles med 5 mL 50/50 (v/v) ethylacetat/hexaner eller ønsket opløsningsmiddel blanding to gange, hvorved skylle opløsningen overføres til prøverøret.
    7. Opbevar koncentrerede metabolitter ved-20 °C eller-80 °C (afhængigt af produktets stabilitet) indtil videre anvendelse.
  3. Rensning af silica-søjlen
    1. Tilbered glasvarer ved at skylle en 1 L bæger, en glas tragt, 50 mL reagensglas og en 3,2 L kromatografikolonne (udstyret med et glas-fret) én gang med hexan og en gang med ethylacetat. Etiketten 50 mL reagensglas, som vil blive brugt til at indsamle fraktioner.
    2. Tilsæt 2 L silica gel (230 – 400 mesh, grade 60) til en 3,2 L kromatografikolonne med en 2 L reservoir kapacitet og en fritted disk, derefter indlæse sand til at danne en 5 cm lag i toppen af søjlen.
    3. Kolonnen forberedes til kromatografi ved at skylle den grundigt med 2 L hexan. På alle tidspunkter, bør der være en tynd (~ 0,5 cm) lag af opløsningsmiddel væske over sand laget af søjlen for at sikre, at søjlen ikke tørrer ud eller erhverve luftlommer. En glas indløbs adapter, der er sluttet til en luftslange, kan bruges til forsigtigt at øge strømningshastigheden gennem søjlen i stedet for tyngdekraften alene.
    4. Læg det koncentrerede metabolits ekstrakt (se punkt 3,2) på søjlen. Skyl flasken, der indeholdt prøve 3x med hexan, og læg den i kolonnen for at sikre, at hele prøven er overført.
    5. Brug følgende gradient, Indlæs 100 mL ad gangen og saml 50 mL fraktioner i mærkede reagensglas: 100% hexanes 3x, 10% (v/v) ethylacetat i hexanes 3x, 12,5% (v/v) ethylacetat i hexanes 3x, 15% (v/v) ethylacetat i hexanes 3x , 20% (v/v) ethylacetat i hexanes 3x, 40% (v/v) ethylacetat i hexanes 3x, 60% (v/v) ethylacetat i hexanes 3x, og 100% ethylacetat 4X.
      Bemærk: gradient skal justeres baseret på sammensatte størrelse og polaritet og ønskede adskillelse.
    6. Brug en glas pipette til at overføre 1 mL fra hver fraktion til et mærket GC-hætteglas. Analysér hver prøve via GC-MS for at bestemme, hvilke fraktioner der indeholder de ønskede metabolitter og deres renhedsgrad.
      Bemærk: GC-MS-metoden, som egner sig til de metabolitter, der produceres i denne metode, er beskrevet i Mafu et al. 201839. Kort fortalt blev alle analyser udført på en GC med en XL MS-detektor ved hjælp af en HP-5MS-kolonne (Se tabel over materialer), et prøvevolumen på 1 μl og ovntemperatur rampe fra 50 °c til 300 °c ved 20 °c min-1.
    7. Når du har fastlægge, hvilke brøker der indeholder den eller de pågældende forbindelser, kombineres alle fraktioner, der indeholder den samme forbindelse. Korrekt bortskaffelse af fraktioner, der ikke indeholder nogen forbindelser til en affaldsbeholder. Gentag den roterende fordampnings procedure, hvis det er nødvendigt for at koncentrere de rensede metabolitter.
    8. Hvis yderligere rensning er nødvendig, skal du bruge (semi-) præparativ HPLC for at forbedre produktets renhed. HPLC-protokollerne bør tilpasses på grundlag af individuelle udstyrsspecifikationer og interesse forbindelser.
      1. Resuspendering af tørrede silica-kromatografi prøver i 1 mL hexan (diterpencarbonhydrider) eller acetonitril (oxygenerede diterpen oider), og Filtrer gennem en filter sprøjte for at forhindre kontaminering med små partikler.
      2. For ikke-polære diterpenoider anvendes en KN-kolonne (Se tabel over materialer) med en anbefalet strømningshastighed på 1 ml/min og en hexan: ethylacetat gradient, med fraktioner indsamlet hvert 1 minut.
      3. For Polar diterpenoider, brug en C18 kolonne (Se tabel over materialer) med en anbefalet strømningshastighed på 3 ml/min og en acetonitril: vand gradient, med fraktioner indsamlet hvert 1 minut.
      4. Alle HPLC-rensede fraktioner tørres under en nitrogenstrøm og resuspenderes i 1 mL hexan før GC-MS-analyse for at vurdere produktets tæthed og renhed.

4. produktion af isomere metabolitter med N. benthamiana

Bemærk: den protokol, der er beskrevet her til fremstilling af isomere-metabolitter i N. benthamiana , er blevet tilpasset fra tidligere rapporterede studier35,36,40,41. Nedenstående protokol er specifik for sprøjte infiltration af N. benthamiana blade. Andre infiltration metoder, såsom vakuum infiltration er lige velegnede. Binære T-DNA-vektorsystemer, såsom pCAMBIA130035Su (pLIFE33) eller peaq-HT40,41,42, der muliggør formering i E. coli og A. tumefaciens og genekspression i plante værter, er egnet til denne protokol.

  1. Beplantning af Nicotiana benthamiana
    1. Fyld 1 750 ml gryde med indstøbning jord og vand puljen. Tilsæt ~ 20 tobak frø og forsigtigt trykke med fingeren, så de er i jorden. Må ikke dækkes med jord.
      Bemærk: frø kan genereres gennem selvbestøvning for frøforme ring. Frø til dette eksperiment blev indhentet fra UC Davis Department of Plant Biology, og er offentligt tilgængelige via USDA kimplasma repository (https://npgsweb.Ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450).
    2. Lad pot i et vækstkammer med følgende betingelser, vanding hver anden dag for at sikre, at jorden ikke tørrer ud. Vokse planter ved 26 °C og 60% fugtighed med 16:8 h dag: nat cyklus for alle trin i denne protokol.
    3. Efter 1 uge fyldes ~ 20 Potter med indstøbning jord og vand Potter. Ved hjælp af pincet, forstå en tobak frøplante ved stammen og forsigtigt fjerne fra kilden pot, placere en frøning i hver ny gryde og forsigtigt gratdannelse rødderne. Må ikke beskadige bladene eller rødderne.
    4. Vand planterne hver anden dag ved at placere vand i bakken Potter er i (også kaldet "bund vanding"). Hver fjerde vanding, omfatter generisk gødning i vandet ifølge pakke instruktioner.
  2. Freeze-Thaw transformation af Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 kompetente celler
    1. Thaw Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 (eller andre foretrukne stamme) kompetente celler på is (~ 1 h). Pre-chill 0,2 mL mikrocentrifuge glas på is. Varme SOC-medier ved 28 °C.
    2. Bland forsigtigt cellerne med pipet spidsen (må ikke pipet op og ned) og alikvot celler for hver omdannelse til de kølede 1,5 mL mikrorør.
    3. Tilsæt 1-5 μL (~ 400 ng) DNA til hvert rør af kompetente celler og bland forsigtigt ved at skraber røret langs et rørstativ.
      Bemærk: ønskede konstruktioner behøver ikke at have forskellige antibiotika resistans, fordi de hver er omdannet separat og vil blive blandet før infiltration.
    4. Placer mikrorør i flydende nitrogen i 5 min.
    5. Fjern mikrorør fra flydende nitrogen og Placer rørene på værelset-Temp rack. Tø rør i 5 min i 37 °C inkubator.
    6. Tilsæt 250 μL af det forvarmede (28 °C) SOC til hvert mikrorør. Ryst ved 28 – 30 °C, 225 rpm, for 3 timer.
    7. Plade 50 μL af transformerede celler på LB-agarplader indeholdende de nødvendige antibiotika, der er beskrevet i tabel 1 , med sterile glasperler som beskrevet i trin 2.1.8.
    8. Incubate plader inverteret ved 28 – 30 °C for 48 h. vækst inden for den 1St dag i inkubationen kan være et tegn på kontaminering. Transformeret A. tumifaciens kan anvendes efter 2-dages inkubation eller opbevares ved 4 °c forseglet i paraffin film i op til 2 uger.
  3. Agrobacterium-medieret forbigående enzym-Co-ekspression i Nicotiana benthamiana
    1. Prune 4-ugers gamle Nicotiana benthamiana planter 2 dage før infiltration ved at fjerne nedre blade. Efterlad 4 øverste blade. Vand planterne. Må ikke vand planterne 24 h før infiltration for at give mulighed for åben spalteåbninger og lettere infiltration.
    2. Der tilsættes 10 mL LB med arbejds koncentrationer af de relevante antibiotika for udvalgte konstruktioner og Agrobacterium stamme (beskrevet i tabel 1) til et 50 ml sterilt glas prøverør med et folie låg.
    3. Inokulere ved hjælp af en pipettespids til at pode en enkelt koloni af omdannet Agrobacterium og skubbe spidsen ind i lb medier. Hver Agrobacterium transformant skal have mindst 2 små kulturer.
    4. Inkuber natten over ved 28 °C og 220 rpm.
    5. Måle optisk tæthed ved 600 nm (OD600) af overnight kulturer ved hjælp af et spektrofotometer. Fortynd de overnight kulturer til en OD600 af 1.
      Bemærk: optimale OD600 værdier kan variere, når du bruger andre Agrobacterium stammer.
    6. 10 mL fortyndet natkultur fordeles til 50 mL koniske rør.
    7. Høst bakterierne ved centrifugering ved 3500 rpm i 15 minutter ved stuetemperatur. Hæld og kassér supernatanten.
    8. Re-suspendere kulturer i 10 mL infiltration buffer ved forsigtigt at ryste røret og rullende på en tube rack. OD600 skal være lig 1 for hver konstruktion.
    9. Generer de ønskede kombinationer for infiltrationer ved at kombinere lige store mængder af hver transformerede cellelinje. OD600 skal være lig 1 for hver infiltration. Beregn 5 mL infiltrations opløsning pr. blad, 2 blade pr. plante.
    10. Fastgør rørene horisontalt til en rocker og klippe forsigtigt i 2 timer ved stuetemperatur.
    11. Infiltrere ~ 2 blade per N. benthamiana plante ved hjælp af ca 5 ml infiltration blanding per blad. Infiltrer sunde blade med en nådesløs sprøjte på undersiden af bladene, mens du udøver et modtryk med en finger på den øverste side af bladet for at sikre, at infiltrations opløsningen er til at kvæge blad vævet.
    12. Marker alle infiltrerede blade med en sort markør eller en anden indikator. Placer infiltrerede planter i vækst kammeret i 5 dage. Hold planterne godt vandede.
      Bemærk: en inkubationstid på fem dage har vist sig at være tilstrækkelig til at nå de diterpenoide niveauer, som er tilstrækkelige til de fleste downstream-analyser, og samtidig bevare tidseffektiviteten ved produkt dannelse. Længere inkubations perioder kan testes, hvor der kræves højere produktmængder.
  4. Metabolitten ekstraktion og rensning fra omdannet Nicotiana benthamiana
    1. Høst infiltrerede blade fra planter ved at klippe dem fra planten. Tilsæt ~ 100 mL flydende nitrogen og et enkelt blad til en mørtel, derefter Grind ved hjælp af en mørtel og Pestle eller vævs mølle indtil opnåelse af et fint pulver.
    2. Tilsæt pulveriseret væv til et GC-MS-hætteglas til 500 μL-afgrænsningen. Tilsæt 1,5 mL af 50/50 (v/v) ethylacetat/hexan eller ønsket opløsningsmiddel blanding til hætteglasset og hætten stramt.
      1. For udtryk, der er blevet testet til at levere de ønskede produkter, pulje jord væv i en større kolbe eller prøve rør, derefter tilsættes ~ 2x mængden af opløsningsmiddel end vævs volumen og ryste natten over. Fortsæt til trin 4.4.5 til rensning.
    3. Placer alle hætteglassene i et Micro tube rack og tape ned stramt for at sikre. Uddrag under kraftig omrystning natten over ved stuetemperatur.
    4. Overfør 400 μL ekstrakt og 600 μL hexan til et frisk GC-MS-hætteglas. Du må ikke alikvot blad vævet. Analyser prøver ved hjælp af GC-MS ved hjælp af den metode, der er beskrevet i trin 3.3.6.1.
    5. Efter analyse via GC-MS for tilstedeværelse af ønskede metabolitter, samler blad blade og fortsætter gennem roterende fordampning, silica kolonne kromatografi og HPLC for at opnå rene forbindelser som beskrevet i punkt 3,2 og 3,3.

Representative Results

Skematisk arbejdsgang for isomere-produktion med E. coli
Figur 1 illustrerer den beskrevne arbejdsgang for isomere produktion. Den protokol, der er skitseret her, er blevet tilpasset fra en tidligere beskrevet E. coli platform for isomere biosyntese13,32 for brug af større volumen kulturer og rensning af ønskede isomere produkter via silica Kromatografi. For at demonstrere brugen af denne protokol brugte vi en nyligt identificeret dolabralexin-vej fra majs, der består af to diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) og ZmKSL4 (Zm00001d032858), en multifunktionel P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) og en cytochrom P450 reduktase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (figur 2). Kort fortalt blev E. coli BL21DE3-C41 kompetente celler præ-omdannet med pcdfduet: IRS og pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 plasmider13,32. Pcdfduet: IRS plasmid indeholder nøgle enzymer til produktion af isomere prækursorer, herunder 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfat syntase (DXS), 1-deoxy-d-xylulose-5-fosfat reduktase (DXR) og isopentenyldiphosphat-isomeriase (Idi) og viste sig at øge isomere dannelse i E. coli13. PACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmid indeholder majs-copalyldifosfat syntase ZmAN2 og en ggpp-syntase fra Abies Grandis. Enzymer katalyserer de engagerede reaktioner i dolabralexin biosyntesen blev derefter Co-omdannet som plasmider pET28b: ZmKSL4 og petduet: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. For detaljer om sekvenser og plasmid konstruktioner Se Mafu et al. 201839.

Et GC-MS-kromatogram af de ekstraherede Enzymprodukter er vist i figur 3a, der illustrerer dannelsen af tre dolabralexin-forbindelser, nemlig dolabradien (1,2 ± 0,25 mg/l kultur), epoxydolabren (0,65 ± 0,2 mg/l kultur) og epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L kultur) som kvantificeret på basis af en standardkurve med isomere sclareol. Sclareol blev anvendt som referencestandard på grund af sin lignende struktur og kemiske egenskaber sammenlignet med dolabralexins. Typisk observerede mindre biprodukter omfatter chloramphenicol, indol derivater oxindol og indol-5-aldehyd, og prækursor geranylgeranyl diphosphat (GGPP) (figur 3). Indole repræsenterer almindeligvis det primære biprodukt, men vises ikke her, da opbevaringstiden er kortere end den indstillede solvens forsinkelse på 7 minutter for at bevare GC-MS-instrumentets integritet.

Skematisk arbejdsgang for isomere produktion med N. benthamiana
Figur 4 viser en oversigt over ekspression af dolabralexin-vejen i N. benthamiana. For de produkter, der er beskrevet her, blev følgende konstruktioner omdannet separat til A. tumefaciens Strain GV3101: pLife33: P19 (der udtrykker det P19 genhæmmende suppressor-protein), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Fuld længde indfødte sekvenser af majs dolabralexin pathway gener blev brugt i den binære T-DNA vektor pLife3341 med kanamycin resistens for formering i E. coli og A. tumefaciens. Co-ekspression af upstream terpenoid pathway gener er valgfri, da prækursor geranylgeranyl diphosphat er endogent dannet i N. benthamiana. Men, flere undersøgelser har med held ansat sådanne tilgange til at øge isomere dannelse i N. benthamiana14,36,41. Som illustreret i figur 3producerede Co-Expression med succes dolabradiene og 15, 16-epoxydolabrene. I modsætning til enzym-Co-ekspression i E. coliblev der ikke påvist 15, 16-epoxydolabranol i metabolitten ekstrakter.

Tilstedeværelse af 15, 16-epoxydolabrene i blad ekstrakter viste aktiviteten af CYP71Z18 i N. benthamiana. Da 15, 16-epoxydolabranol viste sig at være stabilt efter ekstraktion fra mikrobielle kulturer (figur 3) samt efter isolering fra majs rodvæv i tidligere undersøgelser39, forekommer det plausibelt, at det hydroxylerede produkt er glykosyleret af endogene glycosyltransferaser og efterfølgende afsondret i vakuole, hvilket gør det utilgængelige for ekstraktion med de organiske opløsningsmidler blandinger, der anvendes her til ekstraktion36,43,44,45 ,46. Lignende uønskede produktændringer i forbindelse med pathway Engineering i N. benthamiana er blevet rapporteret i tidligere undersøgelser47. Som vist for Co-ekspression i E. coliresulterer forbigående ekspression i N. benthamiana i udvinding af flere biprodukter, herunder lineære alkaner af forskellig kædelængde som baseret på sammenligning med reference massespektrdata baser. Sammensatte titre ekstraheret fra blad materiale fandtes at være i gennemsnit 2,4 +/-0,5 mg dolabradien og 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene pr g tørt blad væv. Disse titre kan ikke sammenlignes direkte med E. coli -co-Expression-systemet i betragtning af de forskellige eksperimentelle opsætninger.

Diterpenoid rensning
Diterpenoid oprensning blev opnået ved anvendelse af silica-kolonne kromatografi og efterfølgende semi-præparativ HPLC. Metabolit ekstrakter fra 12 L af poolede E. coli -kulturer blev renset ved hjælp af silica-kolonne kromatografi for at adskille de tre fokale dolabralexin-forbindelser (figur 3a). Silica kromatografi er ideel til opnåelse af høj renhed af målforbindelserne, da det muliggør enkel adskillelse af diterpenolefiner og oxygenerede derivater, og fjerner let det største forurenende stof, oxindol, som bevares på silicagmatricen ( Figur 3a).

Figure 1
Figur 1: workflow for isomere produktion i E. coli og metabolit rensning fra flydende bakterielle kulturer. Stiplede felter viser valgfrie trin, hvor yderligere rensning er påkrævet. A) repræsentativt billede af den ekstraherede E. coli -kultur ved hjælp af en skilletragt. (B) repræsentativt billede af metabolitten ekstrakt rensning ved hjælp af silica kromatografi.   Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dolabralexin biosyntetisk vej og genkonstruktioner, der anvendes i dette studie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: GC-MS-resultater. Er repræsentative GC-MS-kromatogrammer af rensede diterpenoide produkter, der er fremstillet ved hjælp af enzym Co-Expression assays i (A) E. coli og (B) N. benthamiana. Produkt identifikationer er baseret på sammenligninger med autentiske standarder og reference massespektre fra National Institute of Standards and Technology (NIST) Mass spektral Library. 1, oxindol; 2, indol-5-aldehyd; 3, pyrrolo [1, 2-a] pyrazine-1, 4-Dione, hexahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromophenyl] thio]-a-d-glucosid S, S-dioxid; 5, dolabradien; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] pyrazine-1, 4-Dione, hexahydro-3-(phenylmethyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 og 12, ukendt; 10, chloramphenicol; 11, 3, 7, 11, 15-tetramethyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkaner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Diterpenoid-produktion i N. benthamiana. (A) arbejdsgangen for isomere produktion i N. benthamiana og metabolit rensning fra blad materiale. B) repræsentativt billede af n. benthamiana -planter klar til infiltration eksperimenter, før beskæring. C) repræsentative billeder af planter af N. benthamiana efter beskæring. (D) billede af sprøjte infiltrerede blade. Mørkere områder er blevet infiltreret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Bredere undersøgelse og anvendelse af isomere naturlige produkter nødvendiggør enkle, billige protokoller til at syntetisere og rense tilstrækkelige mængder af ønskede forbindelser. Den hurtige stigning i antallet af tilgængelige diterpenoid-metaboliske enzymer fra en bred vifte af arter giver nu en ekspansiv opgørelse for den enzymatiske produktion af diterpenoider ved hjælp af mikrobielle og plantebaserede værtssystemer. Derudover gør den modulære arkitektur af mange diterpenoide veje det muligt at bruge enzymer fra samme eller forskellige arter i ' plug & play ' kombinatoriske ingeniør tilgange til at generere en række naturlige og nye naturlignende isomere natur produkter2,14,26,35.

E. coli er en foretrukken mikrobiel vært for naturligt produkt biosyntese på grund af sin robusthed, lethed af skalerbarhed, begrænset kemisk kompleksitet for reduceret biprodukt forurening, og den rigdom af tilgængelige værktøjer til DNA-samling og udtryk Optimering. Det er vores erfaring, at platformen beskrevet her er velegnet til fremstilling af produkt udbytter på op til flere hundrede mg diterpenforbindelser olefiner og alkoholer, som er egnet til mange downstream-anvendelser, herunder dem, der foreslås her. Selv om det ikke opfylder industriel skala, kan den produktionsplatform, der er beskrevet her, fungere som et fundament for yderligere pathway, Host og fermenterings optimering, som det med succes er påvist for beslægtede diterpenoider som taxadien og sclareol33 ,34. Over-ekspression af rate-begrænsende MVA eller MEP pathway gener er blevet etableret med succes for at overvinde udbytte-begrænsende faktorer for isomere biosyntese, såsom utilstrækkelig forløber levering og forløber flux i konkurrerende veje13, 32,33,39. Selvom bevist succes i flere undersøgelser, dårlig ekspression og katalytisk aktivitet af terpenoid-metaboliske eukaryote P450s og andre membran-bundne enzymer i E. coli er en sandsynlig begrænsende faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Brug af codon-optimerede sekvenser og protein modifikationer, såsom fjernelse af endoplasmatiske reticulum signal peptid eller indførelse af et plastidial signal peptid, har vist sig nyttigt at øge opløseligt P450-udtryk14,38 ,49,50,53. Sådanne ændringer var også anvendt til det mikrobielle Co-ekspression af majs CYP71Z1839 , der anvendes som et eksempel på en vej i denne undersøgelse. De beskrevne protokoller er baseret på anvendelse af plasmider, der transporterer et eller to gener pr. konstruktion, alt sammen under den samme inducerbare promotor. Hvor der ønskes større gene kombinationer, er det tilrådeligt at bruge forskellige tilgængelige multi-gen-kassetter eller genstablings systemer for at afbøde reduceret Transformations effektivitet og vækst i kulturen på grund af brugen af flere plasmider og antibiotika13 .

Med den bredere tilgængelighed af genetik og genomforskning ressourcer, anlæg værtssystemer også bliver stadig mere egnet til fremstilling af naturlige produkter. Fordele omfatter evnen af planter til at producere de nødvendige naturlige prækursorer drives af fotosyntese, dermed muliggør produkt dannelse uden behov for at supplere prækursorer molekyler54,55. N. benthamiana anvendes allerede i vid udstrækning til in vivo funktionel karakterisering og kombinatorisk ekspression af terpenoid og andre naturlige produkt veje14,35,36,40 . Bemærkelsesværdige fordele ved at bruge N. benthamiana som værtssystem omfatter den endogene produktion af diterpenoide prækursorer, brug af indfødte gensekvenser, forenklet ekspression af eukaryote P450s, let kombinatorisk gen-transformation (som separate antibiotika er ikke påkrævet for forbigående Co-transformation), og enkel ekstraktion af målprodukter fra blad materiale. Hvor det er nødvendigt, kan isomere produktion forbedres gennem Co-ekspression af centrale MEP-pathway gener for at øge prækursorer36,41. Begrænsninger for skalerbar isomere produktion i N. benthamiana er mere komplekse sammenlignet med flydende mikrobielle kulturer på grund af behovet for at generere tilstrækkelig plantebiomasse, mere arbejdskraftintensiv produkt rensning fra kemisk komplekse plante væv, og mulig uønsket metabolisering af målprodukter gennem, for eksempel, oxidation, glykosylering eller defosforylering af endogene enzymer36,43,44,45 ,46,47. Men, denne procedure kan skaleres op til mg produktmængder ved at øge antallet af planter, der anvendes til agroinfiltration56.

De produkt ekstraktions-og rensnings protokoller, der er beskrevet her, er kompatible med E. coli og N. benthamianasamt S. cerevisiae og andre plante-eller mikrobielle værtssystemer og giver en omkostningseffektiv tilgang, der er let at oprettet i både biologi og kemilaboratorier og kræver ikke dyre rensningsanlæg. Metabolitten ekstraktion ved hjælp af en skilletragt er velegnet til effektiv ekstraktion og faseadskillelse før kromatografisk rensning. Tragt størrelser kan let justeres for at give mulighed for større kultur mængder og reducere eksperimentel tid, der kræves for at udtrække fra store kulturer. Vi fandt brugen af en hexan/ethylacetat gradient til at være ideel til udvinding diterpenoider af forskellig polaritet som påvist her for gruppen af dolabralexiner, der omfatter både kulbrinte og oxygenerede forbindelser (figur 3). Afhængigt af egenskaberne for målprodukterne kan andre opløsnings blandinger være fordelagtige. Opløsningsmidler må dog ikke være blandbare med vand for at sikre en vellykket ekstraktion og faseadskillelse ved hjælp af den separatoriske tragt teknik. Desuden skal der tages hensyn til produkttab ved fordampning ved anvendelse af denne metode til fremstilling af flygtige organiske forbindelser (VOC), såsom lavmolekylære mono-og sesqui-terpenoider og andre VOC. Kromatografisk adskillelse af diterpenoider af forskellige niveauer af iltning ved hjælp af en større skala (~ 2 L) silica kolonne har været fordelagtigt i vores erfaring, da det giver forbedret produkt adskillelse og minimerer behovet for iterativ rensning trin, når du bruger mindre kolonne volumener. Kolonne volumener og matricer kan justeres efter behov for den ønskede kultur mængde og typen af naturprodukt. Renheden af målprodukter, der kan opnås ved hjælp af denne protokol, er velegnet til mange downstream-anvendelser, såsom bioaktivitets analyser eller til brug i enzym aktivitetsanalyse. Hvis der er behov for højere renhedsgrad, såsom strukturelle analyser via NMR, kan produktets renhed dog forbedres effektivt ved yderligere rensning ved hjælp af (semi) præparativ HPLC.

Denne protokol, der er beskrevet her, er blevet optimeret til produktion af isomere naturlige produkter, men kan også let tilpasses til beslægtede mono-, sesqui-og Tri-terpenoider, samt andre naturlige produktklasser blot ved at generere det ønskede enzym moduler til kombinatorisk udtryk14,57. Der skal dog tages hensyn til ændringer af procedurerne for produkt udvinding og-rensning for forbindelser med større volatilitet, såsom mono-og sesqui-terpenoider, eller højere polaritet og funktionel modifikation som eksemplificeret ved glykosylering af mange triterpenoider, phenylpropanoider og andre naturlige produktklasser.

Selv om industrielle platforme til fremstilling af naturlige produkter er tilgængelige, de protokoller, der er beskrevet her, tilbyder et billigt, tilpasselig værktøj, som let kan oprettes i de fleste laboratorier. Som det fremgår af produktionen af majs dolabralexiner her og andetsteds39, er de produktmængder og den renhed, der kan opnås ved hjælp af denne metode, typisk tilstrækkelige til at lette forskellige downstream-analyser og-anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, forskellige bioaktivitets undersøgelser, analyse af interaktioner mellem organismer, samt til anvendelse som enzym substrater eller som udgangsmateriale til semi-syntese tilgange.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) for at levere de pIRS og pGGxZmAN2 konstruktioner. Finansiel støtte til dette arbejde af NSF Plant-Biotic interaktioner program (Grant # 1758976 til P.Z.), DOE Early karriere Research program (Grant # DE-SC0019178 til P.Z.), DOE joint Genome Institute community Science program (Grant # CSP2568 til P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship Program (til K.M.M.), og en UC Davis Deans mentorordning Award Fellowship (til K.M.M.) er taknemmeligt anerkendt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent -
7890B GC Agilent -
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

Biokemi isomere biosyntese co-Expression diterpenforbindelser syntase cytochrom P450 monooxygenase Nicotiana benthamiana Zea mays plante specialiseret metabolisme
En tilpasselig tilgang til enzymatisk produktion og rensning af Diterpenoid naturprodukter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., … More

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter