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Biochemistry

एंजाइमी उत्पादन और Diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के शोधन के लिए एक अनुकूलन दृष्टिकोण

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/59992
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Plant Biology, University of California Davis

Summary

यहाँ हम Escherichia कोलाई या Nicotiana benthamianaमें जैव संश्लेषी एंजाइमों के combinatorial अभिव्यक्ति के माध्यम से diterpenoid चयापचयों के उत्पादन और शुद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान मौजूद है , क्रोमैटोग्राफी उत्पाद के बाद शोधन. जिसके परिणामस्वरूप चयापचयों आणविक संरचना विशेषता सहित विभिन्न अध्ययनों के लिए उपयुक्त हैं, एंजाइम कार्यात्मक अध्ययन, और bioactivity assays.

Abstract

Diterpenoids छोटे अणु प्राकृतिक उत्पादों है कि व्यापक रूप से जीवन के राज्यों में वितरित कर रहे हैं और विकास की प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण जैविक कार्य किया है की एक विविध वर्ग के रूप में, interorganismal बातचीत, और पर्यावरण अनुकूलन. इन विभिन्न bioactivities के कारण, कई diterpenoids फार्मास्यूटिकल्स, खाद्य additives, जैव ईंधन, और अन्य जैव उत्पादों के रूप में आर्थिक महत्व के भी हैं. उन्नत जीनोमिक्स और जैव रासायनिक दृष्टिकोण diterpenoid-मेटाबोलिक जीन, एंजाइमों, और रास्ते के ज्ञान में तेजी से वृद्धि सक्षम है. हालांकि, अक्सर केवल एक ही प्रजाति में diterpenoids की संरचनात्मक जटिलता और अलग-अलग यौगिकों के संकीर्ण वर्गीकरण वितरण उनके कुशल उत्पादन के लिए बाधा कारक रहते हैं। चयापचय एंजाइमों की एक व्यापक रेंज की उपलब्धता अब पर्याप्त titers और शुद्धता में diterpenoids के उत्पादन के लिए संसाधन प्रदान करने के लिए इस महत्वपूर्ण चयापचय समूह की गहरी जांच की सुविधा. माइक्रोबियल और संयंत्र आधारित एंजाइम सह-अभिव्यक्ति के लिए स्थापित उपकरणों पर ड्राइंग, हम या तो Escherichia कोलाई या Nicotiana benthamianaमें diterpenoids के एंजाइमी उत्पादन के लिए एक आसानी से संचालित और अनुकूलन प्रोटोकॉल पेश करते हैं, और सिलिका क्रोमैटोग्राफी और अर्द्ध-पूर्वार्ध HPLC के माध्यम से वांछित उत्पादों की शुद्धि। मक्का के समूह का उपयोग करना (जीए मई) एक उदाहरण के रूप में dolabralexin diterpenoids, हम प्रकाश डाला कैसे diterpene synthase के मॉड्यूलर संयोजन (diTPS) और साइटोक्रोम P450 monooxygenase (P450) एंजाइमों विभिन्न diterpenoid पाड़ उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शुद्ध यौगिकों विभिन्न बहाव अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के चयापचय संरचनात्मक विश्लेषण के रूप में, एंजाइम संरचना समारोह अध्ययन, और इन विट्रो में और planta bioactivity प्रयोगों में.

Introduction

डाइटरपेनॉइडमें 12,000 से अधिक मुख्य रूप से बहुचक्रीय 20-कार्बन प्राकृतिक उत्पादों का रासायनिक विविध समूह होता है जो कई जीवों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1. कवक और पौधे डाइटरपेनॉइड की सबसे बड़ी विविधता का उत्पादन करते हैं, लेकिन बैक्टीरिया को बायोएक्टिव डाइटरपेनोइड बनाने के लिए भी दिखाया गया है (समीक्षा2,3,4,5देखें)। उनके विशाल संरचनात्मक विविधता में निहित, diterpenoids जैविक कार्यों की एक भीड़ की सेवा. कुछ डाइटरपेनॉइड, जैसे जिबरेलिन वृद्धि हार्मोन, विकासात्मक प्रक्रियाओं में आवश्यक कार्यकरते हैं 5। हालांकि, diterpenoids के बहुमत रासायनिक रक्षा और interorganismal बातचीत के मध्यस्थों के रूप में सेवा करते हैं. इनमें से, कोनिफेरस पेड़ों और प्रजातियों के रोगजनक बचाव में डाइटरपेन राल एसिड प्रमुख खाद्य फसलों जैसे मक्का (जीए मई) और चावल (ओरीजा सैटाइवा) में एंटीमाइक्रोबियल डाइटरपेनॉइड के मिश्रण सबसे बड़े पैमाने पर रहे हैं । अध्ययनकिया 6,7. इन bioactivities वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के लिए एक अमीर रासायनिक भंडार प्रदान करते हैं, और चुनिंदा diterpenoids महत्वपूर्ण फार्मास्यूटिकल्स, खाद्य additives, चिपकने वाला, और रोजमर्रा की आधुनिक जीवन8,9 के अन्य bioproducts के रूप में उपयोग किया जाता है ,10. प्राकृतिक विविधता और diterpenoids के जैविक कार्यों पर अनुसंधान अग्रिम और अंततः व्यापक वाणिज्यिक अनुप्रयोगों को बढ़ावा देने के लिए, शुद्ध यौगिकों की लागत कुशल तैयारी के लिए उपकरण की आवश्यकता है. संयंत्र सामग्री से बड़े पैमाने पर अलगाव कुछ diterpenoid जैव उत्पादों के लिए स्थापित किया गया है, जैसे diterpene राल एसिड है कि लुगदी और कागज उद्योग8के प्रतिफल के रूप में उत्पादित कर रहे हैं. तथापि, केवल विशिष्ट ऊतकों में और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं द्वारा तंग विनियमन के अंतर्गत डाइटरपेनॉइडकाज का संचय प्रायः प्राकृतिक उत्पादक2से पर्याप्त उत्पाद मात्रा के पृथक्करण को सीमित करता है। इसके अतिरिक्त, डाइटरपेनॉइड्स की संरचनात्मक जटिलता रासायनिक संश्लेषण के माध्यम से उनके उत्पादन में बाधा डालती है, यद्यपि ऐसे दृष्टिकोण अनेक मामलों में11,12में सफल रहे हैं । उन्नत जीनोमिक और जैव रासायनिक प्रौद्योगिकियों की उपलब्धता के साथ, एंजाइमी उत्पादन प्लेटफार्मों diterpenoid यौगिकों की एक श्रृंखला के उत्पादन के लिए बढ़ती ध्यान प्राप्त की है (देखें समीक्षा13,14, 15,16,17,18)

सभी terpenoids, diterpenoids सहित, दो आइसोरेनॉइड अग्रदूतों से प्राप्त कर रहे हैं, आइसोपेनिल डाइफॉस्फेट (आईपीपी) और dimethylallyl diphosphate (DMAPP)19 कि, बारी में, mevalonate (MVA) या के माध्यम से गठित कर रहे हैं मेथिलएरिथ्रिटॉल-5-फॉस्फेट (एमईपी) पथ। टेर्पेनॉइड बायोसिंथेसिस बैक्टीरिया में एमईपी मार्ग और कवक में एमवीए मार्ग के माध्यम से बढ़ता है, जबकि पौधों में साइटोसोलिक एमवीए और एक प्लास्टिडायल एमईपी मार्ग होता है, जिसके बाद डाइटरपेनॉइड गठन20की ओर प्राथमिक मार्ग होता है। प्रीनिल ट्रांसफरेस द्वारा आईपीपी और डीएपीएपी का संघनन सभी डाइटरपेनोइड्स के लिए केंद्रीय 20 कार्बन अग्रदूत पैदावार, geranylgeranyl diphosphate (GGPP)20. GGPP गठन के बहाव, दो एंजाइम परिवारों, terpene synthases (TPS) और साइटोक्रोम P450 monooxygenases (P450s) काफी हद तक terpenoid चयापचय21,22के विशाल रासायनिक विविधता के गठन को नियंत्रित . Diterpene synthases (diTPS) प्रतिबद्ध कार्बोकेशन संचालित cyclization और GGPP के पुनर्व्यवस्थित करने के लिए विभिन्न स्टीरियो विशिष्ट द्वि,, पाली, या मैक्रो-साइक्लिक diterpene पाड़1,3,23,बनाने के लिए उत्प्रेरित 24. ऑक्सीजन और इन पाड़ों के आगे कार्यात्मक सजावट तो P450 एंजाइमों द्वारा सुविधा और अन्य एंजाइम परिवारों का चयन22,25. TPSs और P450s आमतौर पर प्रजातियों के रूप में मौजूद हैं-विशिष्ट, बहु जीन परिवारों कि मॉड्यूलर biosynthetic नेटवर्क फार्म कर सकते हैं, जहां एक आम खाका के साथ विभिन्न एंजाइम मॉड्यूल के संयोजन यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के गठन में सक्षम बनाता है2, 26.हाल के वर्षों में मॉड्यूलर टेरपेनॉइड पथों में सक्रिय कार्यात्मक रूप से विशिष्ट एंजाइमों की तेजी से खोज ने आंशिक या पूर्ण पथों की चयापचय इंजीनियरिंग के लिए बहुमुखी भागों की सूची के रूप में उनके उपयोग के लिए विस्तार के अवसर प्रदान किए हैं दोनों माइक्रोबियल और संयंत्र आधारित उत्पादन प्लेटफार्मों. उदाहरण के लिए, खमीर(Saccharomyces cerevisiae) को सफलतापूर्वक terpenoid bioproducts के निर्माण के लिए बहु एंजाइम रास्ते इंजीनियर करने के लिए लागू किया गया है, जैसे antimalarial दवा artemisinin27, सेस्क्वेट्रेपेनॉइड जैव ईंधन बिसाबोलेन और फरनेसने28, लेकिन यह भी diterpenoids29,30,31का चयन करें . इसी तरह, औद्योगिक पैमाने पर निर्माण के लिए इंजीनियर Escherichia कोलाई प्लेटफार्मों कुछ diterpenoid चयापचयों के लिए स्थापित किया गया है, Taxol अग्रदूत taxadiene एक विरोधी कैंसर दवा और diterpene शराब के रूप में इस्तेमाल सहित, sclareol , खुशबू उद्योग में इस्तेमाल किया13,32,33,34. जेनेटिक इंजीनियरिंग और परिवर्तन प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने संयंत्र मेजबान प्रणालियों को भी संयंत्र प्राकृतिक उत्पादों के उत्पादन के लिए तेजी से व्यवहार्य बना दियाहै 9,14,35,36. विशेष रूप से, करीब तंबाकू रिश्तेदार, Nicotiana benthamiana,terpenoid मार्ग विश्लेषण और इंजीनियरिंग के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया चेसिस बन गया है, कई जीन संयोजन के एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थ परिवर्तन की आसानी के कारण , अंतर्जात अग्रदूतों के कुशल जैव संश्लेषण , और उच्च बायोमास14,35,36.

terpenoid biosynthesis के लिए इन स्थापित प्लेटफार्मों पर ड्राइंग, हम यहाँ का वर्णन करने के लिए आसान करने के लिए उपयोग और लागत कुशल तरीकों diterpenoids के एंजाइमी उत्पादन और एकल यौगिकों की शुद्धि के लिए. प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन कैसे ई. कोलाई और एन benthamiana प्लेटफार्मों बढ़ाया diterpenoid अग्रदूत ों के लिए इंजीनियर विभिन्न diTPSs और P450 एंजाइमों के combinatorial अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जा सकता उत्पन्न करने के लिए वांछित डाइटरपेनॉइड यौगिक। संरचनात्मक रूप से अलग अलग diterpenoids का उत्पादन और शुद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन मक्का से विशेष diterpenoids के उदाहरण के द्वारा दिखाया गया है (जीए mays), कहा जाता है dolabralexins, अंतर्जात biosynthesis जिनमें से दो diTPS और एक P450 भर्ती एंजाइम. olefins से oxygenated डेरिवेटिव को लेकर विभिन्न dolabralexins की शुद्धि तो बड़े पैमाने पर सिलिका स्तंभ क्रोमैटोग्राफी और तैयारी उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के साथ पृथकरी कीप निष्कर्षण के संयोजन के द्वारा हासिल की है। वर्णित प्रोटोकॉल diterpenoids के उत्पादन के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन यह भी आसानी से संबंधित terpenoid वर्गों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही अन्य प्राकृतिक उत्पादों के लिए जो एंजाइम संसाधन उपलब्ध हैं. इस दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्पादित यौगिकों विभिन्न बहाव अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, सहित, लेकिन सीमित नहीं, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) विश्लेषण के माध्यम से संरचनात्मक लक्षण, एंजाइम कार्यात्मक अध्ययन के लिए substrates के रूप में उपयोग, और की एक श्रृंखला bioactivity परख.

Protocol

चेतावनी: यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल खतरनाक रसायनों, तेज वस्तुओं, बिजली के उपकरणों, गर्म वस्तुओं, और अन्य खतरों है कि चोट में परिणाम हो सकता है का उपयोग शामिल हैं. उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहना जाना चाहिए, और सुरक्षा प्रशिक्षण सहित उपयुक्त सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन किया जाना चाहिए।

1. सामग्री और समाधान की तैयारी

  1. 30 मिनट के लिए लाइसोजेनी शोरबा मीडियम (एलबी) तैयार करें और ऑटोक्लेव लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) को 30 मिनट के लिए तैयार करें: मध्यम के 1 एल प्रति 1 एल, 10 ग्राम ट्रिप्टोन, 5 ग्राम बैक्टीरियल खमीर निकालने, और 10 ग्राम NaCl को मिलाकर 1 एल deionized (DI) पानी में घोल लें।
  2. 1 एल सह-अभिव्यक्ति संस्कृतियों के लिए, तैयार करें और 30 मिनट के लिए ऑटोक्लेव भयानक ब्रोथ (टीबी) माध्यम: एक 2.8 एल Erlenmeyer फ्लास्क मिश्रण में 12 ग्राम tryptone, 24 ग्राम बैक्टीरियल खमीर निकालने, और 10% के 40 एमएल (v/v) ग्लिस्टरॉल और DI पानी के 860 एमएल में भंग. 10x फॉस्फेट बफर के 1.3 एल, 30.03 ग्राम मोनोपोटेशियम फॉस्फेट (KH2PO4) और 163.02 ग्राम डाइपोटेशियम फॉस्फेट (K2HPO4) की तैयारी और ऑटोक्लेव 1.3 एल।
  3. Catabolite दमन (SOC) मीडिया के साथ सुपर इष्टतम शोरबा तैयार करें.
    1. तैयार करें और 30 मिनट के लिए एक समाधान युक्त 2% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) जीवाणु खमीर निकालने, 8.5 m NaCl, और 2.5 m KCl युक्त autoclave.
    2. बाँझ MgSO4 और ग्लूकोज दोनों 20 mM के एक अंतिम एकाग्रता के साथ जोड़ें. पीएच 7.0 को समायोजित करने के लिए 1 M NaOH का उपयोग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर SOC मीडिया स्टोर करें।
  4. 1 एम सोडियम पाइरुटेट का 1 ल तैयार की। 15 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. बाँझ DI पानी में 1 M isopropyl के 20 एमएल तैयार करें-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 एमएल एलिकोट्स स्टोर करें।
  6. अंत:स्यंदन बफर तैयार की: 10 एम एम एम एम एम (1ण्952 ह) तथा 10 उम्बक्क्22 (2ण्033 ह) 1 ल् के डी आई जल में भंग। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. 30 मिनट के लिए एलबी एगर तैयार करें और ऑटोक्लेव एलबी एगर करें: प्रति 100 एमएल डीआई पानी, 1 ग्राम ट्रिप्टोन, 0.5 ग्राम बैक्टीरियल खमीर एक्सट्रेक्ट, 1 ग्राम नैक्ल, और 1.5 ग्राम एगार डालें। एक बार एलबी आगर बोतल को संभालने के लिए काफी ठंडा है, वांछित प्लाज्मिड संयोजन के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ें। पेट्री व्यंजन का उपयोग कर के गार प्लेटें डालो और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
    1. ई. कोलाई और एन तुलामथानामें यौगिक उत्पादन के संबंध में विनिर्देशों के लिए सारणी 1 देखें। भंडारण पर गिरावट को रोकने के लिए पन्नी में rifampicin युक्त प्लेटें लपेटें.
कार्य एकाग्रता (जेडजी/
एंटीबायोटिक स्टॉक (एमजी/एमएल) विलायक 1 प्लाज़्मिड 2 प्लाज़्मिड 3 या 4 प्लाज्मिड
कार्बेनिसिलिन 50 एच2हे 50 25 20
क्लोरैम्फीनिकोल 30 एटओएच 30 20 20
कानामाइसिन 50 एच2हे 50 25 20
स्पेक्टिनोमाइसिन 30 एच2हे 30 25 20
Gentamycin 50 एच2हे 30
रिफाम्पिकिन 10 MeOH 10

तालिका 1: ई. कोलाई या एन तुलामियानमें प्लाज्मिड सह-अभिव्यक्ति के लिए एंटीबायोटिक सांद्रता।

2. ई. कोलाई में diterpenoid चयापचयों का उत्पादन

नोट: ई. कोलाई में diterpenoid चयापचयों के उत्पादन के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक पहले से सूचित एंजाइम सह अभिव्यक्ति डॉ Reuben जे पीटर्स (Iowa राज्य विश्वविद्यालय, IA, संयुक्त राज्य अमेरिका)13 के समूह द्वारा विकसित मंच से अनुकूलित किया गया है ,32.

  1. प्लाज्मिड संयोजनों के साथ सक्षम कोशिकाओं का परिवर्तन।
    1. बर्फ पर thaw रासायनिक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं (BL21DE3-C41 कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया).
    2. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में सक्षम कोशिकाओं के 25 डिग्री सेल्सियस में सह-अभिव्यक्ति के लिए प्रयुक्त प्रत्येक निर्माण के 100 एनजी/जेडएल समाधान का 1 $ल जोड़ें। पाइपिंग द्वारा भंवर या मिश्रण न करें।
      नोट: इष्टतम अभिव्यक्ति और टीपीएस और P450 एंजाइमों की गतिविधि के लिए, कई अनुक्रम संशोधनों पर विचार किया जाना चाहिए. टीपीएस के लिए, एन-टर्मिनल प्लास्टिडायल पारगमन पेप्टाइड को हटाने अक्सर आवश्यक है। विशेष रूप से, प्लास्टिडायल मोनो- और डी-टीपीएस आम तौर पर भविष्यवाणी पारगमन पेप्टाइड को हटाने की आवश्यकता होती है (आम भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग करके37),जबकि साइटोसोलिक सेस्क्वी-टीपीएस आमतौर पर पूर्ण लंबाई जीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। P450s के संबंध में, कोडन अनुकूलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हटाने या नेता अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापन के संबंध में MAKKTSSKGK एन-टर्मिनल transmembrane डोमेन के कई मामलों में प्रभावी साबित हो गया है38,39. इसके अलावा, जब सह-व्यक्त P450 एंजाइमों एक साइटोक्रोम P450 रिडक्टेस (सीपीआर) पर्याप्त P450 गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए.
    3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण इनक्यूबेट करें। हर 10 मिनट में एक माइक्रोट्यूब रैक के पार ट्यूब को स्क्रैप करके मिलाएं।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-इनक्यूबेट एसओसी मीडिया और एलबी आगर प्लेटें जिनमें एंटीबायोटिक दवाएं होती हैं, जो निर्माण के वांछित संयोजन के लिए आवश्यक होती हैं।
      नोट: प्रत्येक निर्माण सह रूपांतरित होने के लिए एक अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध, साथ ही प्रतिकृति के अलग मूल इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए होना चाहिए।
    5. गर्मी 1 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर सेल मिश्रण झटका, और फिर कम से कम 2 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    6. गर्म समाज मीडिया के 200 $L जोड़ें.
    7. 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 1 एच के लिए सेल मिश्रण हिलाओ।
    8. गर्म LB agar प्लेट में लगभग 10 ऑटोक्लेव्ड ग्लास मोती जोड़ें। सेल मिश्रण के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और ढक्कन की जगह. कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए पर ढक्कन के साथ क्षैतिज रूप से प्लेट हिलाएं। उन्हें एक अपशिष्ट कंटेनर में बंद दोहन से कांच मोती निकालें. वैकल्पिक रूप से, अन्य पसंदीदा चढ़ाना तरीकों का उपयोग करें।
    9. लेपित सतह चेहरे के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी आगर प्लेट को इनक्यूबेट करें। परिवर्तित ई. कोलाई कालोनियों के साथ प्लेट अगले दिन इस्तेमाल किया जा सकता है या अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए पैराफिन फिल्म में सील 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. टीका संस्कृतियों की तैयारी
    1. अगले दिन, सारणी 1में प्रदत्त सांद्रता का उपयोग करते हुए रूपांतरित प्लाज्मिड संयोजन के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी माध्यम का समाधान तैयार की।
    2. एक बाँझ हुड में, एक प्लास्टिक सांस टोपी के साथ एक 15 एमएल बाँझ ग्लास परीक्षण ट्यूब के लिए एलबी मध्यम के 5 एमएल हस्तांतरण। प्रत्येक वांछित बड़े (1 एल) संस्कृति के लिए एक छोटी सी संस्कृति ट्यूब तैयार करें।
    3. एक पिपेट टिप का उपयोग कर एलबी आगर प्लेट से व्यक्तिगत ई. कोलाई कालोनियों का चयन करें। एक ई. कोलाई कॉलोनी के साथ LB के प्रत्येक ट्यूब टीका प्रत्येक ट्यूब में एक चयनित कॉलोनी युक्त एक पिपेट टिप बाहर निकाल कर.
    4. एक सांस प्लास्टिक टोपी के साथ प्रत्येक टीका संस्कृति परीक्षण ट्यूब कैप. 12-24 ज के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में छाया हुआ ई. कोलाई छोटी संस्कृतियों रखें।
  3. सह-अभिव्यक्ति संस्कृतियों की तैयारी और प्रेरण
    1. अगले दिन, 1x के अंतिम फॉस्फेट बफर के लिए तैयार टीबी के 900 एमएल के लिए तैयार 10x फॉस्फेट बफर के 100 एमएल जोड़ें। सारणी 1के अनुसार सांद्रता के साथ आवश्यक एंटीबायोटिक्स जोड़ें।
    2. गर्म (लगभग 30 मिनट) तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 140 आरपीएम पर हिला।
    3. टीका संस्कृति के 5 एमएल के साथ 1 एल संस्कृतियों के लिए मीडिया के प्रत्येक फ्लास्क टीका। टीका संस्कृति ट्यूब में टीका संस्कृति टीका के लिए इस्तेमाल किया पाइपेट टिप बनाए रखें ताकि, बाद के चरणों में कार्बनिक विलायक के साथ निष्कर्षण पर, कोई निकाले प्लास्टिक contaminants हैं।
    4. 200 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट जब तक 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व 0.6 तक पहुँचता है, लगभग 3 एच. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ OD600 को मापने के लिए, एक खाली के रूप में फॉस्फेट बफर के साथ बाँझ टीबी का एक मिश्रण का उपयोग करें.
    5. वांछित OD600पर, 16 डिग्री सेल्सियस के लिए इनक्यूबेटर सेटिंग्स सेट करें।
    6. जब सह-व्यक्त P450s, ताजा riboflavin और aminolevulinic एसिड तैयार है, जो पर्याप्त P450 सह कारक उत्पादन के लिए आवश्यक हैं. प्रत्येक प्रयोग के लिए 4 ग्राम/एल राइबोफ्लेविन तथा 150 ग्राम/एल एमिनोलेवुलिनिक अम्ल बनाइये। उपयोग होने तक पन्नी में समाधान लपेटा रखें, क्योंकि राइबोफ्लेविन हल्के संवेदनशील है।
    7. इनक्यूबेटर 16 डिग्री सेल्सियस (लगभग 30 मिनट) तक पहुंच ने, 1 एमएल 1 एम आई पी टी जी, 4 ग्राम/एल राइबोफ्लेविन का 1 एमएल और प्रत्येक संस्कृति में 150 ग्राम/एल एमिनोलेवुलिनिक एसिड का 1 एमएल जोड़ें। डाइटरपेनॉइड उत्पादन के लिए, प्रत्येक संस्कृति में 1 एम सोडियम पाइरुटेट का 25 एमएल जोड़ा जाना चाहिए ताकि पर्याप्त अग्रदूत गठन को आश्वस्त किया जा सके।
      नोट: इस परख में इस्तेमाल सभी निर्माण एक ही IPTG-आकर्षक प्रमोटर के तहत थे. विभिन्न प्रमोटरों को वांछित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    8. 72 ज के लिए 16 डिग्री सेल्सियस और 140 आरपीएम पर इनक्यूबेट यदि डाइटरपेनोइड का उत्पादन होता है तो प्रत्येक आने वाले दिनों में 25 एमएल सोडियम पाइरुटेट जोड़ें। तुरंत उपयोग संस्कृतियों तुरंत चयापचयों के विभाजक कीप निष्कर्षण के लिए उपयोग किया जाता है; फसल या संस्कृतियों की दुकान नहीं है.

3. चयापचयों का पृथक्करण और शुद्धि

  1. चयापचयों के पृथक्कारी कीप निष्कर्षण
    नोट: यह केवल कांच के बर्तन और कांच pippettes का उपयोग करने के लिए जब कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करने के लिए plasticizer संदूषण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.
    1. धूआं के हुड में, एक रिंग स्टैंड पर सेविकोटरी कीप को सुरक्षित करें। पृथकता कीप के नीचे एक अपशिष्ट बीकर रखें।
    2. 50/50 (v/v) एथिल ऐसीटेट/हेक्सेन को अलग-अलग कीप में 500 एमएल डालें।
      नोट: विलायक मिश्रण विलेयता और लक्षित चयापचयों की polarity के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए. उपयुक्त चरण पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए जल-विक्रेय विलायकों से बचा जाना चाहिए।
    3. पृथक्कारी कीप में ई कोलाई संस्कृति के 500 एमएल जोड़ें और कांच डाट पर रखें।
    4. कीप हिला निष्कर्षण विलायक, लगभग 5-10x के साथ संस्कृति मिश्रण करने के लिए। अक्सर डी-गैस कीप को स्पिगट खोलकर, जबकि कीप को उल्टा रखा जाता है और दबाव जारी करने के लिए धूआं हुड में इंगित किया जाता है। मिलाते हुए और डी-गैस प्रक्रिया 2x दोहराएँ।
    5. कीप को रिंग स्टैंड में सीधा रखें और विलायक परत (ऊपर) जलीय (संस्कृति) परत (नीचे), लगभग 1 मिनट से अलग होने तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: जब एक बड़ी मात्रा में बुलबुले interphase में मनाया जाता है, 5-10 एमएल EtOH की एक छोटी मात्रा के अलावा चरण जुदाई में सुधार करने के लिए जोड़ा जा सकता है.
    6. डाट निकालें. ई. कोलाई परत को अपशिष्ट बीकर में छान लें, कीप में विलायक परत को बनाए रखें।
    7. ई. कोलाई संस्कृति के शेष 500 एमएल और पहले निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया एक ही 500 एमएल विलायक का उपयोग कर प्रक्रिया को दोहराएँ।
    8. निकाले गए चयापचयों वाले विलायक को एक साफ फ्लास्क में छान लें। ई. कोलाई संस्कृति के साथ संदूषण से बचें।
  2. रोटरी वाष्पीकरण एकाग्रता
    1. रोटरी वाष्पीकरण (रोटोvap) उपकरण तैयार करें: पानी के स्नान को भरने और तापमान 25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट। गर्मी संवेदनशील यौगिकों के लिए, एक कम तापमान सेटिंग का उपयोग करें या पानी के स्नान के लिए बर्फ जोड़ें. सूखी बर्फ के साथ संघनन कक्ष भरें और घूर्णन गति को 60-80 आरपीएम पर सेट करें।
    2. एक 1 एल वाष्पित फ्लास्क के लिए निकाले चयापचयों के लगभग 700 एमएल जोड़ें, rotovap करने के लिए देते हैं, और पानी के स्नान में कम. पर पानी स्नान हीटर बारी और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट.
    3. वाष्पित फ्लास्क का रोटेशन शुरू करें, वैक्यूम सिस्टम को चालू करें, और धीरे-धीरे अपशिष्ट फ्लास्क में मेटाबोलाइट समाधान के तेजी से उबलते से बचने के लिए चूषण में वृद्धि करें। विवेचित विलायक को संघनन करना शुरू करना चाहिए और संघनित-संग्रह (अपशिष्ट) फ्लास्क में टपकना चाहिए।
    4. जब मेटाबोलाइट विलयन का केवल कुछ एमएल वाष्पित फ्लास्क में रहता है, तो घूर्णन बंद कर दें और निर्वात प्रणाली को बंद कर दें। वाष्पीकरण फ्लास्क उठाएँ और वैक्यूम लाइन को बंद करके निराशाजनक हो। वाष्पित फ्लास्क में शेष संकेंद्रित मेटाबोलाइट विलयन को बनाए रखें। अपशिष्ट फ्लास्क में अपशिष्ट का निपटान।
    5. वाष्पीकरण फ्लास्क के लिए अतिरिक्त निकाले चयापचय समाधान के 700 एमएल तक जोड़कर रोटरी वाष्पीकरण जारी रखें। दोहराएँ प्रक्रिया जब तक निकाले मेटाबोलाइट समाधान के सभी ध्यान केंद्रित किया गया है.
    6. नए परीक्षण ट्यूब के लिए एक गिलास पिपेट के साथ स्थानांतरित करके वाष्पीकरण फ्लास्क से केंद्रित चयापचयों निकालें। 50/50 (v/v) एथिल ऐसीटेट/हेक्सेन या वांछित विलायक मिश्रण के 5 एमएल के साथ वाष्पित फ्लास्क को दो बार कुल्ला करें, परखनली में निराला विलयन को स्थानांतरित करें।
    7. -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित चयापचयों को स्टोर करें (उत्पाद स्थिरता पर निर्भर करता है) जब तक कि आगे का उपयोग न हो जाए।
  3. सिलिका स्तंभ शुद्धि
    1. एक 1 एल बीकर, कांच कीप, 50 एमएल टेस्ट ट्यूब, और 3.2 एल क्रोमैटोग्राफी कॉलम (एक गिलास झल्लाहट के साथ सुसज्जित) एक बार हेक्सेन के साथ और एक बार एथिल एसीटेट के साथ संचन द्वारा कांच के बर्तन तैयार करें। 50 एमएल टेस्ट ट्यूबों को लेबल करें, जिनका उपयोग भिन्नों को एकत्र करने के लिए किया जाएगा।
    2. एक 2 एल जलाशय क्षमता और एक fritted डिस्क के साथ एक 3.2 एल क्रोमैटोग्राफी कॉलम के लिए सिलिका जेल (230-400 जाल, ग्रेड 60) के 2 एल जोड़ें, तो स्तंभ के शीर्ष पर एक 5 सेमी परत बनाने के लिए रेत लोड।
    3. इसे 2 एल हेक्सेन के साथ अच्छी तरह से फ्लश करके क्रोमैटोग्राफी के लिए कॉलम तैयार करें। हर समय, स्तंभ की रेत परत के ऊपर विलायक तरल की एक पतली ($0.5 सेमी) परत होनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कॉलम सूख न जाए या हवा की जेब प्राप्त न करे। एक हवा नली से जुड़ा एक ग्लास इनलेट एडेप्टर धीरे अकेले गुरुत्वाकर्षण के बजाय स्तंभ के माध्यम से प्रवाह दर बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. केंद्रित मेटाबोलाइट निकालने को लोड करें (अनुभाग 3.2 देखें) स्तंभ पर. बोतल है कि हेक्सेन के साथ नमूना 3x निहित कुल्ला और स्तंभ में जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना के सभी स्थानांतरित किया गया है.
    5. निम्नलिखित ग्रेडिएंट का उपयोग करके, एक समय में 100 एमएल लोड करें और लेबल किए गए टेस्ट ट्यूबों में 50 एमएल अंश एकत्र करें: 100% हेक्सानेस 3x, 10% (v/v) हेक्सामें 3xanes में एथिल एसीटेट, 12.5% (v/v) हेक्सेन 3xanes में एथिल एसीटेट , हेक्सानेस 3x में एथिल ऐसीटेट, हेक्सेन 3एक्समें 40% (v/v) एथिल ऐसीटेट, हेक्सेन3 एक्स में 60% (v/v) एथिल ऐसीटेट, और 100% एथिल ऐसीटेट 4x।
      नोट: ग्रेडिएंट यौगिक आकार और polarities और वांछित जुदाई के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए.
    6. एक गिलास पिपेट का उपयोग करना, एक लेबल जीसी शीशी में प्रत्येक अंश से 1 एमएल हस्तांतरण। GC-MS के माध्यम से प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करने के लिए निर्धारित करने के लिए जो भिन्न वांछित चयापचयों और शुद्धता के अपने स्तर होते हैं.
      नोट: इस विधि में उत्पादित चयापचयों के लिए उपयुक्त GC-MS विधि Mafu एट अल में वर्णित किया गया है 201839. संक्षेप में, सभी विश्लेषण एक एक्स्ट्रा लार्ज एमएस डिटेक्टर के साथ एक जीसी पर एक HP-5MS कॉलम का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया (सामग्री की तालिकादेखें), 1 $L का एक नमूना मात्रा, और ओवन तापमान रैंप 50 डिग्री सेल्सियस से 300 डिग्री सेल्सियस पर 20 डिग्री मिनट-1.
    7. निर्धारित करने के बाद जो भिन्न ब्याज की यौगिक (ओं) होते हैं, सभी भागों है कि एक ही यौगिक होते गठबंधन. एक अपशिष्ट कंटेनर में किसी भी यौगिकों शामिल नहीं है कि भागों के ठीक से निपटान. शुद्ध चयापचयों ध्यान केंद्रित करने के लिए यदि आवश्यक हो तो रोटरी वाष्पीकरण प्रक्रिया को दोहराएँ।
    8. यदि अतिरिक्त शुद्धि आवश्यक है, तो उत्पाद शुद्धता में सुधार करने के लिए (अर्द्ध-) तैयारी एचपीएलसी का उपयोग करें। HPLC प्रोटोकॉल व्यक्तिगत उपकरण विनिर्देशों और ब्याज के यौगिकों के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए.
      1. 1 एमएल हेक्सेन (डाइटरपेन हाइड्रोकार्बन) या एसीटोनिट्रिल (ऑक्सीजनयुक्त डाइटरपेनॉइड) में सूखे सिलिका क्रोमैटोग्राफी नमूनों को फिर से भेजें, और छोटे कणों के साथ संदूषण को रोकने के लिए एक फिल्टर सिरिंज के माध्यम से फ़िल्टर करें।
      2. गैर-ध्रुवीय डाइटरपेनॉइड्स के लिए, 1 एमएल/मिनट और हेक्सेन की अनुशंसित प्रवाह दर के साथ सीएन कॉलम (सामग्री की सारणीदेखें) का उपयोग करें: एथिल एसीटेट ग्रेडिएंट, प्रत्येक 1 मिनट में एकत्र किए गए अंशों के साथ।
      3. ध्रुवीय डाइटरपेनॉइड्स के लिए, 3 एमएल/मिनट की अनुशंसित प्रवाह दर और एक एसीटोनिट्रिल:जल प्रवणता के साथ, प्रत्येक 1 मिनट में एकत्रित भिन्नों के साथ, एक C18 स्तंभ (सामग्री की सारणीदेखें) का उपयोग करें।
      4. सूखी सभी HPLC शुद्ध भिन्न एक नाइट्रोजन धारा के तहत और उत्पाद बहुतायत और शुद्धता का आकलन करने के लिए जीसी-एमएस विश्लेषण से पहले 1 एमएल हेक्सेन में फिर से निलंबित।

4. एन benthamiana का उपयोग कर diterpenoid चयापचयों का उत्पादन

नोट: एन बेंटहामिएना में डाइटरपेनॉइड मेटाबोलाइट्स के उत्पादन के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल को पहले से सूचितअध्ययनोंसे अनुकूलित किया गया है 35 ,36,40,41. नीचे प्रोटोकॉल एन benthamiana पत्तियों के सिरिंज घुसपैठ के लिए विशिष्ट है. अन्य घुसपैठ के तरीके, जैसे निर्वात घुसपैठ समान रूप से उपयुक्त हैं। द्विआधारी टी-डीएनए वेक्टर सिस्टम, जैसे pCAMBIA130035Su (pLIFE33) या PEAQ-HT40,41,42, जो ई. कोलाई और ए tumefaciens और संयंत्र मेजबानों में जीन अभिव्यक्ति में प्रचार सक्षम कर रहे हैं इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त है.

  1. रोपण निकोटियाना बेंटहमिना
    1. मिट्टी के बर्तन के साथ एक 750 एमएल बर्तन भरें और बर्तन पानी. 20 तंबाकू बीज जोड़ें और धीरे उंगली से नल इतना है कि वे मिट्टी में हैं. मिट्टी के साथ कवर मत करो.
      नोट: बीज संचरण के लिए आत्म परागण के माध्यम से बीज उत्पन्न किया जा सकता है. इस प्रयोग के लिए बीज संयंत्र जीव विज्ञान के यूसी डेविस विभाग से प्राप्त किए गए थे, और USDA gerplasm भंडार (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450) के माध्यम से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं.
    2. निम्नलिखित शर्तों के साथ एक विकास कक्ष में बर्तन छोड़ दो, हर दूसरे दिन पानी सुनिश्चित करने के लिए मिट्टी बाहर सूखी नहीं है. 26 डिग्री सेल्सियस पर पौधों को उगाएं और 16:8 एच दिन के साथ 60% आर्द्रता: इस प्रोटोकॉल में सभी चरणों के लिए रात चक्र।
    3. 1 सप्ताह के बाद, मिट्टी potting और बर्तन पानी के साथ $ 20 बर्तन भरें. संदंश का उपयोग करके, तने से तंबाकू के अंकुर को समझें और स्रोत के बर्तन से धीरे-धीरे निकाल दें, प्रत्येक नए बर्तन में एक अंकुर रखकर और ध्यान से जड़ों को दफन करें। पत्तियों या जड़ों को नुकसान न पहुंचाएं।
    4. हर दूसरे दिन पौधों को ट्रे में पानी रखकर पानी डालकर बर्तन में हैं (जिसे "नीचे पानी" भी कहा जाता है)। हर चौथे पानी, पैकेज निर्देशों के अनुसार पानी में जेनेरिक उर्वरक शामिल हैं.
  2. एग्रोबैक्टीरियम tumefaciens तनाव GV3101 सक्षम कोशिकाओं के फ्रीज-थॉ परिवर्तन
    1. Thaw Agrobacterium tumefaciens तनाव GV3101 (या अन्य पसंदीदा तनाव) बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं ($1 ज). बर्फ पर पूर्व ठंड 0.2 एमएल microcentrifuge ट्यूब. 28 डिग्री सेल्सियस पर गर्म समाज मीडिया।
    2. धीरे से पाइप टिप के साथ कोशिकाओं को मिश्रण (ऊपर और नीचे पाइप नहीं है) और ठंडा 1.5 एमएल microtubes में प्रत्येक परिवर्तन के लिए कोशिकाओं के alicot 15 डिग्री सेल्सियस.
    3. सक्षम कोशिकाओं के प्रत्येक ट्यूब के लिए डीएनए के 1-5 डिग्री एल ($ 400 एनजी) जोड़ें और एक ट्यूब रैक के साथ ट्यूब scraping द्वारा धीरे मिश्रण।
      नोट: वांछित निर्माण अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध की जरूरत नहीं है क्योंकि वे प्रत्येक अलग से बदल रहे हैं और घुसपैठ से पहले मिलाया जाएगा.
    4. 5 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में microtubes रखें.
    5. तरल नाइट्रोजन से microtubes निकालें और कमरे-टेम्प रैक पर ट्यूब जगह है. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए थाव ट्यूब।
    6. प्रत्येक माइक्रोट्यूब में प्री-वार्म्ड (28 डिग्री सेल्सियस) एसओसी का 250 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 28-30 डिग्री सेल्सियस, 225 आरपीएम, 3 ज के लिए हिलाओ।
    7. प्लेट 50 डिग्री एल LB agar प्लेटों पर परिवर्तित कोशिकाओं की आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं युक्त तालिका 1 में वर्णित बाँझ कांच मोती का उपयोग कर, के रूप में चरण 2.1.8 में वर्णित है.
    8. 48 ज के लिए 28-30 डिग्री सेल्सियस पर अंतर्लोधित इनक्यूबेट प्लेटें ऊष्मायन के 1st दिन के भीतर वृद्धि संदूषण का संकेत हो सकता है। परिवर्तित ए tumifaciens 2 दिन ऊष्मायन के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है या अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए पैराफिन फिल्म में सील 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
  3. एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थ क्षणिक एंजाइम निकोशियाना बेंटहामिएना में सह-अभिव्यक्ति
    1. Prune 4 सप्ताह पुराने Nicotiana benthamiana पौधों 2 दिन पहले कम पत्तियों को हटाने के द्वारा घुसपैठ. 4 ऊपरी पत्तियों को छोड़ दें। पौधों को पानी दें। घुसपैठ से 24 एच पहले पौधों को पानी न दें ताकि खुले रंधे और आसान घुसपैठ की अनुमति मिल सके।
    2. चुने गए निर्माणों और एग्रोबैक्टीरियम तनाव के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के काम सांद्रता के साथ एलबी के 10 एमएल जोड़ें (तालिका 1में वर्णित ) एक पन्नी ढक्कन के साथ एक 50 एमएल बाँझ ग्लास टेस्ट ट्यूब में।
    3. एक पिपेट टिप का उपयोग कर टीका बदल Agrobacterium की एक एकल कॉलोनी झाड़ू और LB मीडिया में टिप बाहर निकालना. प्रत्येक एग्रोबैक्टीरियम रूपांतरक में कम से कम 2 छोटी संस्कृतियां होनी चाहिए।
    4. 28 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर रात भर इनक्यूबेट।
    5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर रात भर संस्कृतियों के 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने। 1 के एक ओडी600 के लिए रात भर संस्कृतियों को पतला.
      नोट: इष्टतम OD600 मान अन्य एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों का उपयोग करते समय भिन्न हो सकते हैं।
    6. 50 एमएल शंकु ट्यूबों में पतला रात भर संस्कृति के 10 एमएल वितरित करें।
    7. कमरे के अस्थायी समय में 15 मिनट के लिए 3500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा बैक्टीरिया को फसल। डालो और supernatant त्याग दें.
    8. ट्यूब को धीरे से हिलाकर ट्यूब रैक पर रोलिंग द्वारा 10 एमएल घुसपैठ बफर में संस्कृतियों को फिर से निलंबित करें। OD600 प्रत्येक निर्माण के लिए 1 बराबर होना चाहिए.
    9. प्रत्येक रूपांतरित सेल लाइन के बराबर संस्करणों के संयोजन के द्वारा घुसपैठ के लिए वांछित संयोजन उत्पन्न करें। OD600 प्रत्येक घुसपैठ के लिए 1 के बराबर होना चाहिए. प्रति पत्ती घुसपैठ विलयन का 5 एमएल अनुमान लगाकर, प्रति पादप 2 पत्तियों का अनुमान लगाएं।
    10. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए धीरे से एक रॉकर और रॉक करने के लिए क्षैतिज ट्यूब संलग्न करें।
    11. प्रति पत्ती लगभग 5 एमएल घुसपैठ मिश्रण का उपयोग करते हुए एन तुलामैयाना संयंत्र में 2 पत्तियों को घुसपैठ करें। पत्तियों के नीचे एक सुई रहित सिरिंज के साथ स्वस्थ पत्तियों को घुसपैठ करने के लिए पत्ती के शीर्ष पक्ष पर एक उंगली के साथ एक काउंटर दबाव डालते हुए घुसपैठ समाधान पत्तियों के ऊतकों को दबाता है सुनिश्चित करने के लिए।
    12. मार्क सभी एक काले मार्कर या अन्य सूचक के साथ घुसपैठ पत्तियों. 5 दिनों के लिए विकास कक्ष में घुसपैठ पौधों प्लेस. पौधों को अच्छी तरह से पानी रखें।
      नोट: उत्पाद गठन के समय-दक्षता को बनाए रखते हुए, अधिकांश डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त diterpenoid स्तर तक पहुंचने के लिए पांच दिनों का एक ऊष्मायन समय पर्याप्त साबित हुआ है। लंबे समय तक ऊष्मायन अवधि का परीक्षण किया जा सकता है, जहां उच्च उत्पाद मात्रा की आवश्यकता होती है।
  4. रूपांतरित निकोतियाना तुलामियांना से मेटाबोलाइट निष्कर्षण और शुद्धि
    1. फसल ने पौधों से पत्तियों को काटकर उनकी घुसपैठ की। तरल नाइट्रोजन और एक मोर्टार के लिए एक पत्ती के 100 एमएल जोड़ें, तो एक मोर्टार और मूसल या ऊतक मिल का उपयोग कर पीस जब तक एक ठीक पाउडर प्राप्त करने.
    2. 500 डिग्री एल सीमांकन करने के लिए एक जीसी-एमएस शीशी में पाउडर ऊतक जोड़ें। 50/50 (v/v) एथिल ऐसीटेट/हेक्सेन या वांछित विलायक मिश्रण के 1.5 एमएल को शीशी और टोपी कसकर जोड़ें।
      1. अभिव्यक्ति है कि वांछित उत्पादों, पूल जमीन ऊतक एक बड़ा फ्लास्क या परीक्षण ट्यूब में प्रदान करने के लिए परीक्षण किया गया है के लिए, तो ऊतक की मात्रा से विलायक की मात्रा $ 2x जोड़ें और रात भर हिला. शुद्धि के लिए 4.4.5 कदम आगे बढ़ें.
    3. एक microtube रैक में सभी शीशियों प्लेस और सुरक्षित करने के लिए कसकर नीचे टेप. कमरे के तापमान पर रात भर जोरदार मिलाते हुए निकालें।
    4. एक ताजा जीसी-एमएस शीशी में निकालने के 400 जेडएल और हेक्सेन के 600 जेडएल स्थानांतरण। किसी भी पत्ती के ऊतकों को एलिकोट न करें। चरण 3.3.6.1 में वर्णित विधि का उपयोग कर GC-MS का उपयोग कर नमूने का विश्लेषण करें।
    5. वांछित चयापचयों की उपस्थिति के लिए जीसी-एमएस के माध्यम से विश्लेषण के बाद, पूल पत्ती के अर्क एक साथ और रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से आगे बढ़ना, सिलिका स्तंभ क्रोमैटोग्राफी, और HPLC के रूप में वर्गों में वर्णित शुद्ध यौगिकों प्राप्त करने के लिए 3.2 और 3.3.

Representative Results

ई. कोलाई का उपयोग कर के diterpenoid उत्पादन के लिए Schematic कार्यप्रवाह
चित्र 1 डाइटरपेनॉइड उत्पादन के लिए वर्णित कार्यप्रवाह को दर्शाता है। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल एक पहले से वर्णित ई. कोलाई मंच से diterpenoid biosynthesis13के लिए अनुकूलित किया गया है,32 बड़े मात्रा संस्कृतियों के उपयोग और सिलिका के माध्यम से वांछित diterpenoid उत्पादों की शुद्धि के लिए क्रोमैटोग्राफी. इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हम मक्का से हाल ही में पहचान की एक dolabralexin मार्ग का इस्तेमाल किया है कि दो diTPSs, $mAN2 ($m00001d029648) और $mKSL4 ($m00001d032858), एक बहु कार्यात्मक P450 (CYP71$18, ]m00001d014444, एक cyrom4, रिडक्टेज ($mCPR2, $m00001d026483) (चित्र 2) संक्षेप में, ई. कोलाई BL21DE3-C41 सक्षम कोशिकाओं pCDFDuet के साथ पूर्व बदल रहे थे: आईआरएस और PACYC-Duet:GGPPS/ pCDFDuet: आईआरएस प्लाज्मिड में डाइटरपेनॉइड अग्रदूत उत्पादन के लिए प्रमुखएंजाइम होते हैं, जिनमें 1-डिऑक्सी-डी-xylulose-5-फॉस्फेट सिन्थेज(dxs), 1-deoxy-D-xylulose-5-फॉस्फेट रिडक्टेस(dxr), और आइओपेनिल डाइफॉस्फेट आइसोमरेस (आइडी) और ई कोलाई13में डाइटरपेनॉइड गठन को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था . PACYC-Duet:GGPPS/$mAN2 प्लाज्मिड में मक्का एन्ट-कोपैरिल डाइफॉस्फेट सिन्थेज ]mAN2 और Abies grandisसे एक GGPP synthase होता है। एंजाइम ों dolabralexin biosynthesis में प्रतिबद्ध प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित तो plasmids pET28b के रूप में सह-रूपांतरण किया गया: [mKSL4 और PETDUET:]mCPR2/ दृश्यों और प्लाज्मिड निर्माणों पर विवरण के लिए Mafu एट अल 201839देखें .

निकाले गए एंजाइम उत्पादों का एक जीसी-एमएस क्रोमैटोग्राम चित्रा 3कमें दिखाया गया है, जिसमें तीन डोलब्रेब्राक्सिन यौगिकों के गठन का चित्रण किया गया है, अर्थात् डोलाब्रैडीन (1.2 ] 0.25 मिलीग्राम/एल संस्कृति), एपॉक्क्क्सिडोलैबरीन (0.65 ] 0.2 मिलीग्राम/एल संस्कृति), और इपॉक्क्डोलाब्रानोल (11.4) श् 1.1 मिलीग्राम/एल संस्कृति) एक मानक वक्र के आधार पर मात्रा निर्धारित के रूप में diterpenoid sclareol का उपयोग कर. Sclareol एक संदर्भ मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था, इसकी इसी तरह की संरचना और रासायनिक गुणों के कारण के रूप में dolabralexins की तुलना में. आमतौर पर देखा लघु उपोत्पादों में क्लोरएम्फीकॉल, इन्डोल डेरिवेटिव ऑक्सिडोल और इन्डोल-5-एल्डिहाइड, और पूर्ववर्ती जेरनिल्गेरेनिल डाइफॉस्फेट (जीजीपीपी)(चित्र 3)शामिल हैं। Indole आमतौर पर प्राथमिक प्रतिफल का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यहाँ नहीं दिखाया गया है, इसके प्रतिधारण समय के कारण 7 मिनट के सेट विलायक देरी से कम करने के लिए जीसी-एमएस साधन की अखंडता की रक्षा.

डाइटरपेनॉइड उत्पादन का स्नेमैटिक कार्यप्रवाह एन.
चित्र 4 में डॉलैब्रेक्सिन मार्ग की अभिव्यक्ति का अवलोकन कियागया है . यहाँ वर्णित उत्पादों के लिए, निम्नलिखित constructs अलग से A tumefaciens तनाव GV3101 में तब्दील हो गए: pLife33:p19 (p19 जीन silencing suppressor प्रोटीन को समाप्त), pLife33:[mCYP71]18, pLife33:$mAN2, pLife33:$mKSL4. ई. कोलाई और ए tumefaciens में प्रचार के लिए kanamycin प्रतिरोध के साथ द्विआधारी टी-डीएनए वेक्टर pLife3341 में मक्का dolabralexin मार्ग जीन की पूर्ण लंबाई देशी दृश्यों का इस्तेमाल किया गया। अपस्ट्रीम टेरपेनॉइड पथ जीनों का सह-अभिव्यक्ति वैकल्पिक है, क्योंकि पूर्ववर्ती geranylgeranyl diफॉस्फेट अंतर्जात रूप से एन बेंटामाना में बनता है। तथापि, कई अध्ययनों ने एन बेंटहमियाना14,36,41में डाइटरपेनॉइड गठन को बढ़ाने के लिए ऐसे दृष्टिकोणों को सफलतापूर्वक नियोजित किया है . जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, सह-अभिव्यक्ति ने डोलाब्रेडीन और 15,16-एपॉक्सीडोलब्रेन सफलतापूर्वक उत्पादन किया। ई. कोलाईमें एंजाइम सह-अभिव्यक्ति के विपरीत, मेटाबोलाइट निष्कर्षों में 15,16-एपॉक्सीडोलाब्रानोल का पता नहीं चला।

पत्ती के अर्क में 15,16-epoxydolabrene की उपस्थिति एन benthamianaमें CYP71 की गतिविधि का प्रदर्शन किया. के रूप में 15,16-epoxydolabranol माइक्रोबियल संस्कृतियों से निष्कर्षण के बाद स्थिर होना दिखाया गया था (चित्र 3) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पिछले अध्ययन39में मक्का की जड़ ऊतकों से अलगाव के बाद , यह विश्वसनीय प्रतीत होता है कि hydroxylated उत्पाद ग्लाइकोसिलेटाहुआ है अंतर्जात ग्लाइकोसिलट्रांसफरेस द्वारा और बाद में धानी में अलग कर दिया जाता है, जिससे यह निष्कर्षण के लिए यहां इस्तेमाल किए जाने वाले कार्बनिक विलायक मिश्रण के साथ निष्कर्षण के लिए दुर्गम हो जाता है36,43,44,45 ,46. एन तुलाहामिना में पथ इंजीनियरिंग के संदर्भ में इसी प्रकार के अवांछित उत्पाद संशोधनों की रिपोर्ट पिछले अध्ययनों में47में दी गई है . ई. कोलाईमें सह-अभिव्यक्ति के लिए दिखाया गया है के रूप में, एन benthamiana में क्षणिक अभिव्यक्ति कई byproducts की निकासी में परिणाम, विभिन्न श्रृंखला लंबाई के रैखिक alkanes सहित के रूप में संदर्भ जन स्पेक्ट्रम डेटाबेस की तुलना के आधार पर. पत्ती सामग्री से निकाले गए यौगिक titers औसत पर पाया गया 2.4 +/- 0.5 मिलीग्राम dolabradiene और 0.9 +/- 0.3 मिलीग्राम 15,16-epoxydolabrene प्रति ग्राम सूखी पत्ती ऊतक. इन titers की तुलना विभिन्न प्रयोगात्मक सेट अप को देखते हुए ई. कोलाई सह-अभिव्यक्ति प्रणाली से सीधे नहीं की जा सकती है।

डाइटरपेनॉइड शोधन
डाइटरपेनॉइड शुद्धि सिलिका कॉलम क्रोमैटोग्राफी और बाद में अर्द्ध-पूर्वानुमेय एचपीएलसी का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। तीन फोकल डोलाब्रेक्सिन यौगिकों को अलग करने के लिए सिलिका कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके पूल्ड ई. कोलाई संस्कृतियों के 12 एल से मेटाबोलाइट अर्क शुद्ध किए गए थे (चित्र 3क)। सिलिका क्रोमैटोग्राफी लक्ष्य यौगिकों की उच्च शुद्धता को प्राप्त करने के लिए आदर्श है, क्योंकि यह diterpene olefins और oxygenated डेरिवेटिव के सरल जुदाई सक्षम बनाता है, और आसानी से प्रमुख संदूषक, oxindole, जो सिलिका मैट्रिक्स पर बनाए रखा है हटा ( चित्र 3A).

Figure 1
चित्र 1: ई. कोलाई में diterpenoid उत्पादन के लिए कार्यप्रवाह और तरल जीवाणु संस्कृतियों से मेटाबोलाइट शुद्धि. डैश्ड बक्से वैकल्पिक चरणों को चित्रित करते हैं जहां अतिरिक्त शुद्धि की आवश्यकता होती है। (ए)एक पृथक्कारी कीप का उपयोग करके निकाले गए ई. कोलाई संस्कृति की प्रतिनिधि छवि। (बी)सिलिका क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करमेटाबोलाइट निकालने शुद्धि के प्रतिनिधि छवि।   कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: डोलब्रालेक्सिन जैव संश् लेषी मार्ग और जीन निर्माण इस अध्ययन में प्रयुक्त होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: GC-MS परिणाम. दिखाया गया है कि शुद्ध डाइटरपेनॉइड उत्पादों के प्रतिनिधि जीसी-एमएस क्रोमैटोग्राम हैं जो एंजाइम सह-अभिव्यक्ति परख का उपयोग करके प्राप्त किए जाते हैं (ए) ई . कोलाई और(बी) एन बेंटामेना. उत्पाद पहचान राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान (NIST) बड़े पैमाने पर वर्णक्रमीय पुस्तकालय के प्रामाणिक मानकों और संदर्भ मास स्पेक्ट्रम की तुलना पर आधारित हैं. 1, ऑक्सिडॉल; 2, इन्डोल-5-ऐल्डिहाइड; 3, Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, हेक्साहाइड्रो-3-(2-मेथिलप्रोपिल)-; 4, 6-O-Acetyl-1-[4-ब्रोमोफेनिल]-ए-डी-ग्लूकोसाइड एस,एस-डाइऑक्साइड; 5, डोलाब्राडीन; 6, 15,16-एपॉक्सीडोलब्रेन; 7, Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, हेक्साहाइड्रो-3-(फेनिलमेथिल)-; 8, 15,16-एपॉक्सीडोलाब्रानोल; 9 और 12, अज्ञात; 10, क्लोरैम्फीनिकॉल; 11, 3,7,11,15-टेट्रामेथिल-2-हेक्साडेसेन-1-ol; 13-16, alkanes. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एन बेंटहमिना में डाइटरपेनॉइड उत्पादन। ((A) छ तुलामनिया में डाइटरपेनॉइड उत्पादन का कार्यप्रवाह और पत्ती सामग्री से मेटाबोलाइट शुद्धि. (बी) एन बेंटहमियाना पौधों की प्रतिनिधि छवि, जो pruning से पहले घुसपैठ प्रयोगों के लिए तैयार है . (ग)pruning के बाद एन benthamiana पौधों के प्रतिनिधि छवियों. (डी)सिरिंज से घुसपैठ की पत्तियों की छवि। गहरे इलाकों में घुसपैठ की गई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

व्यापक जांच और diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के आवेदन सरल, सस्ती प्रोटोकॉल सिंथेसाइज़ और वांछित यौगिकों की पर्याप्त मात्रा में शुद्ध करने के लिए आवश्यक है। प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला से उपलब्ध diterpenoid-मेटाबोलिक एंजाइमों की संख्या में तेजी से वृद्धि अब माइक्रोबियल और संयंत्र आधारित मेजबान प्रणालियों का उपयोग diterpenoids के एंजाइमी उत्पादन के लिए एक विशाल सूची प्रदान करता है. इसके अलावा, कई diterpenoid रास्ते की मॉड्यूलर वास्तुकला 'प्लग एंड प्ले' combinatorial इंजीनियरिंग दृष्टिकोण में एक ही या विभिन्न प्रजातियों से एंजाइमों के उपयोग के लिए प्राकृतिक और नए प्रकृति की तरह diterpenoid प्राकृतिक की एक सरणी उत्पन्न करने के लिए सक्षम बनाता है उत्पादों2,14,26,35.

ई. कोलाई अपनी मजबूती, scalability की आसानी, कम उपोत्पाद संदूषण के लिए सीमित रासायनिक जटिलता, और डीएनए विधानसभा और अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध उपकरणों की संपत्ति के कारण प्राकृतिक उत्पाद biosynthesis के लिए एक पसंदीदा माइक्रोबियल मेजबान है अनुकूलन. हमारे अनुभव में, यहाँ वर्णित मंच यहाँ प्रस्तावित उन सहित कई downstream अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है जो diterpene olefins और alcohols के कई सौ मिलीग्राम तक के उत्पाद पैदावार के उत्पादन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. औद्योगिक पैमाने पर बैठक नहीं करते हुए, यहाँ वर्णित उत्पादन मंच आगे मार्ग, मेजबान, और किण्वन अनुकूलन के लिए एक नींव के रूप में सेवा कर सकते हैं के रूप में सफलतापूर्वक ऐसे taxadiene और sclareol 33 के रूप में संबंधित diterpenoids के लिए प्रदर्शन किया गया है ,34. दर-सीमित एमवीए या एमईपी पथ जीनों का अधिक-अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक डाइटरपेनॉइड जैव संश्लेषण के लिए उपज-सीमित कारकों को दूर करने के लिए स्थापित किया गया है, जैसे अपर्याप्त अग्रदूत आपूर्ति और प्रतिस्पर्धी रास्ते में अग्रदूत प्रवाह13, 32,33,39. हालांकि कई अध्ययनों में सफल साबित, गरीब अभिव्यक्ति और terpenoid-मेटाबोलिक यूकैरियोटिक P450s और ई. कोलाई में अन्य झिल्ली बाध्य एंजाइमों की उत्प्रेरक गतिविधि एक संभावित सीमित कारकहै 33,39 48,49,50,51,52. कोडोन-अनुकूलित दृश्यों और प्रोटीन संशोधनों का उपयोग, जैसे एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम सिग्नल पेप्टाइड को हटाने या प्लास्टिडायल सिग्नल पेप्टाइड की शुरूआत, घुलनशील P450 अभिव्यक्ति14को बढ़ाने के लिए उपयोगी साबित हुआ है14 ,38 ,49,50,53. इस तरह के संशोधनों को भी इस अध्ययन में एक उदाहरण मार्ग के रूप मेंइस्तेमाल मक्का CYP71 के माइक्रोबियल सह-अभिव्यक्ति के लिए नियोजित किया गया. वर्णित प्रोटोकॉल प्लाज्मिड के उपयोग पर आधारित हैं जो एक या दो जीन प्रति निर्माण ले जाते हैं, सभी एक ही प्रेरक प्रमोटर के तहत। जहां बड़े पैमाने पर जीन संयोजन वांछित हैं, यह कई प्लाज्मिड और एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग के कारण कम परिवर्तन दक्षता और संस्कृति विकास को कम करने के लिए विभिन्न उपलब्ध बहु जीन कैसेट या जीन स्टैकिंग प्रणालियों का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है13 .

आनुवंशिकी और जीनोमिक्स संसाधनों की व्यापक उपलब्धता के साथ, संयंत्र मेजबान प्रणाली भी प्राकृतिक उत्पादों के निर्माण के लिए तेजी से उपयुक्त हो जाते हैं. लाभ में प्रकाश संश्लेषण द्वारा संचालित आवश्यक प्राकृतिक अग्रदूतों का उत्पादन करने के लिए पौधों की क्षमता शामिल है , इस प्रकार पूर्ववर्ती अणुओं के पूरक की आवश्यकता के बिना उत्पाद के गठन को सक्षम करने54,55. एन benthamiana पहले से ही व्यापक रूप से vivo कार्यात्मक लक्षण और terpenoid और अन्य प्राकृतिक उत्पाद रास्ते14,35,36,40 के संयोजन अभिव्यक्ति में के लिए प्रयोग किया जाता है . एक मेजबान प्रणाली के रूप में एन benthamiana का उपयोग करने के उल्लेखनीय लाभ diterpenoid अग्रदूतों के अंतर्जात उत्पादन शामिल हैं, देशी जीन दृश्यों का उपयोग, यूकैरियोटिक P450s की सरलीकृत अभिव्यक्ति, combinatorial जीन परिवर्तन की आसानी (के रूप में अलग एंटीबायोटिक दवाओं क्षणिक सह परिवर्तन के लिए आवश्यक नहीं हैं), और पत्ती सामग्री से लक्ष्य उत्पादों की सरल निष्कर्षण. जहां जरूरत हो, डिटेरपेनॉइड उत्पादन को प्रमुख एमईपी मार्ग जीनों के सह-अभिव्यक्ति के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है ताकि पूर्ववर्ती आपूर्ति36,41में वृद्धि हो सके। एन benthamiana में स्केलेबल diterpenoid उत्पादन के लिए प्रतिबंध पर्याप्त संयंत्र बायोमास पैदा करने के लिए की आवश्यकता के कारण तरल माइक्रोबियल संस्कृतियों की तुलना में अधिक जटिल हैं, रासायनिक जटिल से अधिक श्रम गहन उत्पाद शुद्धि संयंत्र ऊतक, और लक्ष्य उत्पादों के संभावित अवांछित चयापचय के माध्यम से, उदाहरण के लिए, ऑक्सीकरण, ग्लाइकोसिलेशन या अंतर्जात एंजाइमों द्वारा dephosphorlation36,43,44,45 ,46,47. तथापि, इस प्रक्रिया को एग्रोघुसपैठ56के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधों की संख्या में वृद्धि करके उत्पाद की मात्रा तक बढ़ाया जा सकता है।

यहाँ वर्णित उत्पाद निष्कर्षण और शुद्धि प्रोटोकॉल ई. कोलाई और एन benthamianaके साथ संगत कर रहे हैं, साथ ही एस cerevisiae और अन्य संयंत्र या माइक्रोबियल मेजबान प्रणाली, और एक लागत कुशल दृष्टिकोण है कि आसान है प्रदान दोनों जीव विज्ञान और रसायन विज्ञान प्रयोगशालाओं में स्थापित करने और महंगा शुद्धि उपकरण की आवश्यकता नहीं है. एक विभाजक कीप का उपयोग चयापचय निष्कर्षण क्रोमैटोग्राफी शुद्धि करने से पहले कुशल निष्कर्षण और चरण जुदाई के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। फ़नल आकार आसानी से बड़े संस्कृति संस्करणों के लिए अनुमति देते हैं और बड़ी संस्कृतियों से निकालने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक समय को कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। हमने पाया कि हेक्सान/एथिल ऐसीटेट ग्रेडिएंट का उपयोग विभिन्न ध्रुवता के डाइटरपेनोइडों को निकालने के लिए आदर्श है जैसा कि यहाँ हाइड्रोकार्बन और ऑक्सीजनित यौगिकों दोनों को शामिल करने वाले डोलेब्रालेक्सिन के समूह के लिए दिखाया गया है(चित्र 3)। लक्ष्य उत्पादों के गुणों पर निर्भर करता है, अन्य विलायक मिश्रण फायदेमंद हो सकता है. हालांकि, सॉल्वैंट्स को अलग-अलग कीप तकनीक का उपयोग करके सफल निष्कर्षण और चरण जुदाई सुनिश्चित करने के लिए पानी के साथ मिश्रित नहीं होना चाहिए। इसके अलावा, वाष्पीकरण के माध्यम से उत्पाद हानि को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब अस्थिर कार्बनिक यौगिकों के उत्पादन के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग कर (VOCs), इस तरह के कम आणविक वजन मोनो के रूप में- और सेस्क्वी-terpenoids और अन्य VOCs. यह बेहतर उत्पाद जुदाई प्रदान करता है और पुनरावर्ती शुद्धिकरण के लिए की जरूरत को कम करता है, क्योंकि यह हमारे अनुभव में फायदेमंद रहा है एक बड़े पैमाने पर ($ 2 एल) सिलिका स्तंभ का उपयोग कर ऑक्सीजन के विभिन्न स्तरों के diterpenoids के Chromatographic जुदाई, हमारे अनुभव में फायदेमंद रहा है छोटे स्तंभ वॉल्यूम का उपयोग करते समय चरण. स्तंभ मात्रा और matrices वांछित संस्कृति की मात्रा और प्राकृतिक उत्पाद के प्रकार के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित किया जा सकता है. लक्ष्य उत्पादों है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता की शुद्धता कई downstream अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, जैसे bioactivity assays या एंजाइम गतिविधि विश्लेषण में उपयोग के लिए. हालांकि, जहां उच्च शुद्धता के स्तर की आवश्यकता होती है, जैसे एनएमआर के माध्यम से संरचनात्मक विश्लेषण, उत्पाद शुद्धता को अतिरिक्त शुद्धिकरण द्वारा कुशलतापूर्वक बढ़ाया जा सकता है (अर्द्ध)-पूर्वानुमेय एचपीएलसी का उपयोग करके।

इस प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन यह भी आसानी से संबंधित मोनो के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-, सेस्क्वी- और त्रि-terpenoids, साथ ही अन्य प्राकृतिक उत्पाद वर्गों बस वांछित एंजाइम पैदा करके संयोजी अभिव्यक्ति14,57के लिए मॉड्यूल . हालांकि, उत्पाद निष्कर्षण और शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं के संशोधनों को उच्च अस्थिरता वाले यौगिकों के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे मोनो- और सेस्क्वी-टेरपेनोइड, या उच्च ध्रुवता और कार्यात्मक संशोधन द्वारा उदाहरण के रूप में कई triterpenoids, फ़ेनिलप्रोपेनोइड, और अन्य प्राकृतिक उत्पाद वर्गों के ग्लिकोसिलेशन।

हालांकि प्राकृतिक उत्पादों के निर्माण के लिए औद्योगिक पैमाने पर प्लेटफार्मों उपलब्ध हैं, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक सस्ती, अनुकूलन उपकरण है कि आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं में स्थापित किया जा सकता है प्रदान करते हैं. के रूप में मक्का dolabralexins के उत्पादन द्वारा प्रदर्शन यहाँ और कहीं और39, उत्पाद मात्रा और शुद्धता है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है आम तौर पर विभिन्न बहाव विश्लेषण और उपयोग करता है, सहित की सुविधा के लिए पर्याप्त हैं, लेकिन नहीं तक सीमित, विभिन्न bioactivity अध्ययन, जीवों के बीच बातचीत का विश्लेषण, साथ ही एंजाइम substrates के रूप में उपयोग के लिए या अर्द्ध संश्लेषण दृष्टिकोण के लिए सामग्री शुरू के रूप में.

Disclosures

लेखक ों की घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

हम आभारी डॉ Reuben पीटर्स (Iowa राज्य विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका) pIRS और pGGx-mAN2 निर्माण प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं. एनएसएफ संयंत्र-बायोटिक इंटरेक्शन्स प्रोग्राम द्वारा इस कार्य के लिए वित्तीय सहायता (पी.जेड.) के लिए अनुदान 1758976, डीईओ अर्ली कैरियर रिसर्च प्रोग्राम (अनुदान] डे-एससी0019178 से पी.जेड.), डीईओ संयुक्त जीनोम संस्थान सामुदायिक विज्ञान कार्यक्रम (अनुदान ] सीएसपी 2568 को पी.जेड.), एनएसएफ स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम (के.एम.एम.) के लिए, और एक यूसी डेविस डीन मेंटरशिप पुरस्कार फैलोशिप (के.एम.एम.) आभार स्वीकार कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent -
7890B GC Agilent -
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column

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जैव रसायन अंक 152 diterpenoid biosynthesis सह-अभिव्यक्ति diterpene synthase साइटोक्रोम P450 मोनोऑक्सीजन Nicotiana benthamiana, जीए मई,संयंत्र विशेष चयापचय
एंजाइमी उत्पादन और Diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के शोधन के लिए एक अनुकूलन दृष्टिकोण
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Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., … More

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).

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