Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En tilpasningsvennlig tilnærming for enzymatisk produksjon og rensing av Diterpenoid naturlige produkter

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/59992

Summary

Her presenterer vi lett å bruke protokoller for å produsere og rense diterpenoid metabolitter gjennom Kombinatorisk uttrykk for biosyntetiske enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, etterfulgt av kromatografiske produkt Rensing. De resulterende metabolitter er egnet for ulike studier inkludert molekylær struktur karakterisering, enzym funksjonelle studier, og bioactivity analyser.

Abstract

Diterpenoids danner en mangfoldig klasse av små molekyl naturlige produkter som er vidt distribuert over livets riker og har kritiske biologiske funksjoner i utviklingsmessige prosesser, interorganismal interaksjoner, og miljømessige tilpasning. På grunn av disse ulike bioactivities er mange diterpenoids også av økonomisk betydning som farmasøytiske produkter, tilsetningsstoffer, biodrivstoff og andre bioprodukt. Avanserte Genomics og biokjemiske tilnærminger har aktivert en rask økning i kunnskap om diterpenoid-metabolske gener, enzymer og trasé. Imidlertid forblir den strukturelle kompleksiteten i diterpenoids og den smale taksonomisk fordelingen av individuelle forbindelser i ofte bare en enkelt Art Begrensende faktorer for effektiv produksjon. Tilgjengeligheten av et bredere spekter av metabolske enzymer gir nå ressurser for å produsere diterpenoids i tilstrekkelig titers og renhet for å lette en dypere undersøkelse av denne viktige metabolitten gruppen. Tegning på etablerte verktøy for mikrobiell og plante-baserte enzym co-Expression, presenterer vi en lett operert og passelig protokoll for enzymatisk produksjon av diterpenoids i enten Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, og rensing av ønskede produkter via silika kromatografi og semi-preparativ HPLC. Ved hjelp av gruppen av mais (Zea Mays) dolabralexin diterpenoids som et eksempel, understreker vi hvordan modulære kombinasjoner av diterpene syntase (diTPS) og cytokrom P450 monooxygenase (P450) enzymer kan brukes til å generere ulike diterpenoid stillaser. Renset forbindelser kan brukes i ulike nedstrøms applikasjoner, slik som metabolitten strukturelle analyser, enzym struktur-funksjon studier, og in vitro og i planta bioactivity eksperimenter.

Introduction

Diterpenoids utgjør en kjemisk mangfoldig gruppe på mer enn 12 000 hovedsakelig polysykliske 20-karbon naturprodukter som spiller kritiske roller i mange organismer1. Sopp og planter produserer det største mangfoldet av diterpenoids, men bakterier har også vist å danne bioaktive diterpenoids (se anmeldelser2,3,4,5). Forankret i sitt store strukturelle mangfold, diterpenoids tjene en rekke biologiske funksjoner. Noen få diterpenoids, slik som gibberellin veksthormoner, har viktige funksjoner i utviklingsprosesser5. Men flertallet av diterpenoids tjene som meglere av kjemiske forsvar og interorganismal interaksjoner. Blant disse, diterpene harpiks syrer i pest og patogen forsvar av bartrær og arter-spesifikke blandinger av antimikrobielle diterpenoids i store mat avlinger som mais (Zea Mays) og ris (oryza sativa) har vært mest omfattende studerte6,7. Disse bioactivities gir en rik kjemisk oppbevaringssted for kommersielle applikasjoner, og velg diterpenoids brukes som viktige legemidler, tilsetningsstoffer, lim, og andre bioprodukt av hverdagen moderne liv8,9 ,10. For å fremme forskning på naturlige mangfoldet og biologiske funksjoner av diterpenoids og til slutt fremme bredere kommersielle applikasjoner, er verktøy for kostnadseffektiv utarbeidelse av rene forbindelser nødvendig. Stor skala isolasjon fra plantemateriale har blitt etablert for et par diterpenoid bioprodukt, slik som diterpene harpiks syrer som produseres som et biprodukt av cellulose-og papirindustrien8. Men akkumulering av diterpenoids i bare spesifikke vev og under tett regulering av miljømessige stimuli ofte begrenser isolering av tilstrekkelige produkt mengder fra den naturlige produsent2. I tillegg hemmer den strukturelle kompleksiteten i diterpenoids sin produksjon gjennom kjemisk syntese, selv om slike tilnærminger har vært vellykket i flere tilfeller11,12. Med tilgjengeligheten av avanserte genomisk og biokjemiske teknologier, har enzymatisk produksjonsplattformer fått økende oppmerksomhet for å produsere en rekke diterpenoid forbindelser (se anmeldelser13,14, 15,16,17,18).

Alle terpenoider, inkludert diterpenoids, er avledet fra to isomere isoprenoid forløpere, isopentenyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (IPP) og dimethylallyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (DMAPP)19 som i sin tur dannes gjennom MEVALONAT (mva) eller methylerythritol-5-fosfat (MEP) veien. Terpenoid biosyntesen provenyet gjennom MEP veien i bakterier og MVA-veien i sopp, mens plantene har en cytosolic MVA og en plastidial MEP veien, med sistnevnte er den primære ruten mot diterpenoid formasjon20. Kondens av IPP og DMAPP ved prenyl transferases gir den sentrale 20-karbon forløperen til alle diterpenoids, geranylgeranyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (GGPP)20. Nedstrøms av GGPP formasjon, to enzym familier, terpen synthases (TPSs) og cytokrom P450 monooxygenases (P450s) i stor grad kontroll dannelsen av det store kjemiske mangfoldet av terpenoid metabolisme21,22. Diterpene synthases (diTPSs) katalysere begått carbocation-drevet syklisering og omorganisering av GGPP å danne ulike stereospecific bi-, Poly-, eller makro-syklisk Diterpene stillaser1,3,23, 24. Oksygenering og videre funksjonell dekorasjon av disse stillaser er så tilrettelagt av P450 enzymer og velg andre enzym familier22,25. TPSs og P450s vanligvis eksisterer som arter-spesifikke, multi-genet familier som kan danne modulære biosyntetiske nettverk, der kombinere ulike enzym moduler langs en felles blåkopi gjør dannelsen av et bredt spekter av forbindelser2, 26. den raske oppdagelsen av funksjonelt distinkte enzymer som opererer i modulære terpenoid trasé de siste årene har gitt ekspanderende muligheter for deres bruk som en allsidig deler liste for metabolske engineering av delvis eller fullstendig trasé i både mikrobielle og plante-baserte produksjonsplattformer. For eksempel, gjær (Saccharomyces cerevisiae) har vært brukt med hell til ingeniør multi-enzym trasé for fremstilling av terpenoid bioprodukt, slik som antimalariamidler stoffet Artemisinin27, sesquiterpenoid biodrivstoff bisabolene og far nesene28, men også velge diterpenoids29,30,31. På samme måte er det etablert Escherichia coli -plattformer for industriell skala produksjon for et par diterpenoid metabolitter, inkludert Taxol-forløperen taxadiene brukt som anti-kreft-stoff og diterpene alkohol, sclareol , brukt i duftbransjen13,32,33,34. Fremskritt innen genteknologi og transformasjon teknologier har også gjort anlegget vertssystemer stadig mer levedyktig for produksjon av plante naturprodukter9,14,35,36. Spesielt den nære tobakk slektning, Nicotiana benthamiana, har blitt en mye brukt chassis for terpenoid veien analyse og engineering, på grunn av den enkle Agrobacterium-mediert transformasjon av flere gen kombinasjoner , effektiv biosyntesen av endogene forløpere, og høy biomasse14,35,36.

Tegning på disse etablerte plattformene for terpenoid biosyntesen, beskriver vi her lett-å-bruke og kostnadseffektive metoder for enzymatisk produksjon av diterpenoids og rensing av enkelt forbindelser. De presenterte protokollene illustrerer hvordan E. coli og N. benthamiana plattformer konstruert for forbedret diterpenoid forløper biosyntesen kan utnyttes for Kombinatorisk uttrykk for ulike diTPSs og P450 enzymer for å generere ønskede diterpenoid forbindelser. Anvendelse av denne protokollen til å produsere og rense strukturelt forskjellige diterpenoids vises ved eksempel på spesialiserte diterpenoids fra mais (Zea Mays), kalt dolabralexins, endogene biosyntesen som rekrutterer to diTPS og en P450 Enzym. Rensing av ulike dolabralexins fra olefins til oksygenrikt derivater oppnås deretter ved å kombinere separatory trakt ekstraksjon med stor skala silika kolonne kromatografi og preparativ høytrykks væske kromatografi (HPLC). De beskrevne protokollene er optimalisert for produksjon av diterpenoids, men kan også lett tilpasses for relaterte terpenoid klasser, så vel som andre naturlige produkter som enzym ressurser er tilgjengelige. Forbindelser som produseres ved hjelp av denne tilnærmingen er egnet for ulike nedstrøms applikasjoner, inkludert men ikke begrenset til, strukturelle karakterisering via kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) analyse, bruk som underlag for enzym funksjonelle studier, og en rekke bioactivity analyser.

Protocol

FORSIKTIG: protokollene som beskrives her, omfatter bruk av farlige kjemikalier, skarpe gjenstander, elektriske enheter, varme gjenstander og andre farer som kan føre til personskade. Egnet personlig verneutstyr skal brukes, og de nødvendige sikkerhetsprosedyrene, inkludert sikkerhetsopplæring, bør følges.

1. utarbeidelse av materialer og løsninger

  1. Forbered og autoklav lysogeny buljong medium (LB) i 30 min: per 1 L medium, bland 10 g av tryptone, 5 g av bakteriell gjærekstrakt, og 10 g NaCl og oppløses i 1 L av deionisert (DI) vann.
  2. For 1 L co-uttrykk kulturer, forberede og autoklav fantastisk buljong (TB) medium for 30 min: i en 2,8 L Erlenmeyer kolbe bland 12 g tryptone, 24 g av bakteriell gjærekstrakt, og 40 mL på 10% (v/v) glyserol og oppløses i 860 mL av DI vann. Forbered og autoklav 1,3 L av 10x fosfat buffer [1,3 L av DI vann, 30,03 g monokalium fosfat (KH2PO4), og 163,02 g av inosinsyre fosfat (K2HPO4)] og legge til ovenfor medium.
  3. Forbered super optimal buljong med Catabolite undertrykkelse (SOC) Media.
    1. Forbered og autoklav i 30 min en løsning som inneholder 2% (w/v) tryptone, 0,5% (w/v) bakteriell gjærekstrakt, 8,5 mM NaCl, og 2,5 mM KCl.
    2. Tilsett sterile MgSO4 og glukose begge med en endelig konsentrasjon på 20 mm. Bruk 1 M NaOH for å justere til pH 7,0. Lagre SOC-mediet ved-20 ° c.
  4. Forbered 1 L av 1 M natrium pyruvat. Autoklav i 15 min og oppbevares ved 4 ° c.
  5. Forbered 20 mL 1 M isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTH) i sterilt vann. Oppbevares 1 – 2 mL alikvoter ved-20 ° c.
  6. Klargjør buffer for infiltrasjon: 10 mM MES (1,952 g) og 10 mM MgCl2 (2,033 g) oppløst i 1 L av di vann. Oppbevares ved 4 ° c.
  7. Forbered og autoklav LB agar for 30 min: per 100 mL av DI vann, tilsett 1 g tryptone, 0,5 g av bakteriell gjærekstrakt, 1 g NaCl, og 1,5 g av agar. En gang LB agar er avkjøle nok å hånd flasken, sammenlegge antibiotika idet krevde for det ønsket plasmider kombinasjonene. Pour agar plater ved hjelp av Petri retter og lagre ved 4 ° c.
    1. Se tabell 1 for spesifikasjoner angående sammensatt produksjon i E. coli og N. benthamiana, henholdsvis. Wrap plater inneholder Rifampicin i folie for å hindre degradering ved lagring.
Arbeids konsentrasjon (μg/mL)
Antibiotika Lager (mg/mL) Løsemiddel 1 plasmider 2 plasmider 3 eller 4 plasmider
Carbenicillin 50 H2O 50 25 20
Kloramfenikol 30 EtOH 30 20 20
Kanamycin 50 H2O 50 25 20
Spectinomycin 30 H2O 30 25 20
Gentamycin 50 H2O 30
Rifampicin 10 MeOH 10

Tabell 1: antibiotika konsentrasjoner for plasmider co-uttrykk i E. coli eller N. benthamiana.

2. produksjon av diterpenoid metabolitter i E. coli

Merk: protokollen som er beskrevet her for å produsere diterpenoid metabolitter i E. coli er tilpasset fra en tidligere rapportert enzym co-Expression plattform utviklet av gruppen av Dr. Reuben J. Peters (Iowa State University, IA, USA)13 ,32.

  1. Transformasjon av kompetente celler med plasmider kombinasjoner.
    1. Tin kjemisk kompetente E. coli celler på isen (BL21DE3-C41 celler ble brukt i denne protokollen).
    2. Tilsett 1 μL av en 100 ng/μL-løsning for hver konstruksjon som brukes til co-Expression til 25 μL av kompetente celler i en 1,5 mL microtube. Ikke Vortex eller bland med pipettering.
      Merk: for optimal uttrykk og aktivitet av TPS og P450 enzymer, flere sekvens modifikasjoner må vurderes. For TPS, fjerning av N-Terminal plastidial transitt peptid er ofte viktig. Nærmere bestemt, plastidial mono-og di-TPS vanligvis krever fjerning av spådd transitt peptid (ved hjelp av felles prediksjon algoritmer37), mens cytosolic SESQUI-TPS kan vanligvis brukes som full-lengde gener. Med hensyn til P450s, Codon optimalisering samt fjerning eller utskifting med leder sekvensen MAKKTSSKGK av N-Terminal transmembrane domenet har vist seg effektiv i mange tilfeller38,39. I tillegg, når co-uttrykker P450 enzymer en cytokrom P450 reduktase (HLR) bør inkluderes for å sikre tilstrekkelig P450 aktivitet.
    3. Ruge blandingen på isen i 30 min. Bland hver 10 minutter ved å forsiktig skrape røret over en microtube rack.
    4. Pre-ruge SOC Media og LB agar plater ved 37 ° c som inneholder antibiotika som kreves for den ønskede kombinasjon av konstruksjoner.
      Merk: hver konstruere skal co-transformert må ha en distinkt antibiotikaresistens, samt distinkte opprinnelsen til replikering for å sikre optimal protein uttrykk.
    5. Heat sjokk cellen blandingen ved 42 ° c i 1 minutt, og deretter ruge på isen i minst 2 min.
    6. Tilsett 200 μL av varme SOC-medier.
    7. Rist celle blandingen i 1 time ved 37 ° c og 200 rpm.
    8. Tilsett ca 10 autoklaveres glassperler til varmet LB agar plate. Tilsett 100 μL av celle blandingen og sett på lokket igjen. Rist platen horisontalt med lokket på for å fordele cellene jevnt. Fjern glass perlene ved å trykke dem av i en avfallsbeholder. Alternativt kan du bruke andre foretrukne plating metoder.
    9. Ruge LB agar plate ved 37 ° c over natten med belagt overflate med billedsiden ned. Platen med forvandlet E. coli koloniene kan brukes neste dag eller oppbevares ved 4 ° c forseglet i para fin film i opptil 2 uker.
  2. Utarbeidelse av inoculation kulturer
    1. På neste dag, utarbeide en løsning av LB medium med antibiotika som kreves for transformert plasmider kombinasjon ved hjelp av konsentrasjonene gitt i tabell 1.
    2. I en steril hette, overføre 5 mL LB medium til en 15 mL sterilt glass test rør med en plast pustende cap. Forbered en liten kultur rør for hver ønsket stor (1 L) kultur.
    3. Velg individuelle E. coli KOLONIER fra lb agar plate ved hjelp av en pipette spissen. Vaksinere hver tube med LB med en E. coli -koloni ved å mate ut en pipette som inneholder en utvalgt koloni i hvert rør.
    4. Cap hver inoculation kultur test tube med en pustende plast cap. Plasser den avkortet E. coli små kulturer i en 37 ° c risting inkubator for 12 – 24 h.
  3. Utarbeidelse og induksjon av co-uttrykk kulturer
    1. Neste dag, tilsett 100 mL forberedt 10x fosfat buffer til 900 mL forberedt TB for en endelig fosfat buffer konsentrasjon på 1x. Tilsett nødvendig antibiotika med konsentrasjoner i henhold til tabell 1.
    2. Rist ved 140 RPM ved 37 ° c til varme (ca. 30 min).
    3. Vaksinere hver kolbe av media for 1 L kulturer med 5 mL av inoculation kulturen. Behold pipette spissen som brukes til inoculation kultur inoculation i inoculation kultur rør slik at, ved ekstraksjon med organisk løsemiddel i påfølgende trinn, er det ingen utvunnet plast forurensninger.
    4. Ruge med risting på 200 RPM til den optiske tettheten på 600 NM (OD600) når 0,6, ca 3 t. For å måle OD600 med en spektrofotometer, bruk en blanding av steril TB med fosfat buffer som en blank.
    5. Still inn inkubator innstillingene til 16 ° c ved ønsket OD600.
    6. Når co-uttrykker P450s, fersk forberede riboflavin og aminolevulinic syre, som er avgjørende for tilstrekkelig P450 co-faktor produksjon. For hvert eksperiment, gjør 4 g/L riboflavin og 150 g/L aminolevulinic syre. Hold løsningen innpakket i folie til bruk, som riboflavin er lysfølsom.
    7. Etter at inkubator har nådd 16 ° c (ca. 30 min), tilsett 1 mL av 1 M IPTH, 1 mL 4 g/L riboflavin, og 1 mL 150 g/L aminolevulinic syre til hver kultur. For diterpenoid produksjon bør 25 mL av 1 M natrium pyruvat tilsettes til hver kultur for å sikre tilstrekkelig forløper formasjon.
      Merk: alle konstruksjoner som brukes i denne analysen var under samme IPTH-induserbart promoter. Ulike arrangører kan brukes som ønsket.
    8. Ruge ved 16 ° c og 140 RPM for 72 h. Tilsett 25 mL natrium pyruvat hver påfølgende dag etter induksjon ved fremstilling av diterpenoids. Umiddelbart bruke kulturer blir umiddelbart brukt til separatory trakt utvinning av metabolitter; ikke høste eller lagre kulturer.

3. separasjon og rensing av metabolitter

  1. Separatory trakt utvinning av metabolitter
    Merk: det er viktig at du bare bruker glass-og glas Pipetter når du bruker organiske løsemidler for å forhindre mykner forurensninger.
    1. Fest separatory trakten i en avtrekksvifte på et ringstativ. Plasser et avfalls beger under separatory trakt.
    2. Hell 500 mL av 50/50 (v/v) etanol acetate/hexaner inn i separatory trakten.
      Merk: løsemiddel blandingen bør justeres basert på løselighet og polaritet til de målrettede metabolitter. Vann blandbar løsemidler bør unngås for å sikre egnet fase separasjon.
    3. Tilsett 500 mL av E. coli -kulturen til separatory trakt og plasser på glass proppen.
    4. Rist trakten for å blande kulturen med utvinnings MIDlet, ca. 5 – 10x. Ofte de-gass trakten ved å åpne spigot mens trakten holdes opp ned og pekte inn i avtrekks panseret for å løsne trykket. Gjenta risting og de-gass prosedyren 2x.
    5. Plasser trakten oppreist i ring stativet, og vent til løsningsmidlet laget (øverst) har skilt fra det vandige (kultur) laget (nederst), ca 1 min.
      Merk: Når en stor mengde bobler observeres i Interphase, kan tilsetning av et lite volum på 5 – 10 mL EtOH tilsettes for å forbedre fase separasjon.
    6. Fjern proppen. Tøm E. coli -laget i et avfalls beger, og beholde løsningsmiddel laget i trakten.
    7. Gjenta fremgangsmåten ved hjelp av de resterende 500 mL av E. coli -kulturen og det samme 500 ml oppløsningsmidlet som brukes til første ekstraksjon.
    8. Tøm væsken som inneholder den utpakkede metabolitter inn i en ren kolbe. Unngå forurensning med E. coli kultur.
  2. Roterende fordampning konsentrasjon
    1. Klargjør roterende fordampning (rotovap) utstyr: Fyll vannbadet og Still temperaturen til 25 ° c. For varmefølsomme forbindelser, bruk en lavere temperaturinnstilling eller legge is til vannbad. Fyll det kondenserende kammeret med tørr is og sett rotasjonshastigheten til 60 – 80 RPM.
    2. Tilsett ca 700 mL av utpakkede metabolitter til en 1 L fordamper kolbe, fest til rotovap, og senk ned i vannbad. Slå varmtvannsberederen på og satt til 25 ° c.
    3. Start rotasjon av fordamper kolbe, slå på vakuumsystemet, og gradvis øke sug for å unngå rask koking av metabolitten løsningen i avfallsflasken. Fordampet løsemiddel bør begynne å kondenserende og drypper inn i kondensat samle (avfall) kolbe.
    4. Når bare noen få mL av metabolitten løsningen forblir i fordamper kolbe, stoppe rotasjoner og slå av vakuumsystemet. Hev fordamper kolbe og depressurize ved å lukke vakuum linjen. Behold konsentrert metabolitten løsning igjen i fordamper kolbe. Kast avfallet i avfallsflasken.
    5. Fortsett roterende fordampning ved å legge opp til 700 mL ekstra utvunnet metabolitten løsning til fordamper kolbe. Gjenta prosessen til alle de utpakkede metabolitten løsningen er konsentrert.
    6. Fjern de konsentrerte metabolitter fra fordamper kolbe ved å overføre med en glass pipette til nye reagensrør. Skyll fordamper kolbe med 5 mL 50/50 (v/v) etanol/hexaner eller ønsket løsningsmiddel blanding to ganger, og overfører skylle løsningen til reagensglasset.
    7. Oppbevar konsentrerte metabolitter ved-20 ° c eller-80 ° c (avhengig av produktets stabilitet) inntil videre bruk.
  3. Silica kolonne rensing
    1. Forbered glass ved å skylle et 1 liter beger, glass trakt, 50 mL test rør, og 3,2 L kromatografi søyle (utstyrt med et glass bånd) en gang med Heksan og en gang med etanol. Merk 50 mL test rør, som vil bli brukt til å samle fraksjoner.
    2. Tilsett 2 L av silika gel (230 – 400 mesh, grade 60) til en 3,2 L kromatografi kolonne med en 2 L reservoar kapasitet og en fritted disk, deretter laste sand for å danne et 5 cm lag på toppen av kolonnen.
    3. Klargjør kolonnen for kromatografi ved å skylle den grundig med 2 liter Heksan. Til enhver tid bør det være en tynn (~ 0,5 cm) lag av løsemiddel væsken over sand laget i kolonnen for å sikre at kolonnen ikke tørker ut eller erverve luftlommer. Et glass innløps adapter koblet til en luft slange kan brukes til å forsiktig øke strømningshastigheten gjennom kolonnen i stedet for tyngdekraften alene.
    4. Legg det konsentrerte metabolitten ekstrakt (se avsnitt 3,2) på søylen. Skyll flasken som inneholdt prøven 3x med Heksan og legge til kolonnen for å sikre at alle prøven er overført.
    5. Ved hjelp av følgende gradering, Last 100 mL om gangen og samle 50 mL fraksjoner i merket test rør: 100% hexaner 3x, 10% (v/v) etanol acetate i hexaner 3x, 12,5% (v/v) etanol acetate i hexaner 3x, 15% (v/v) etanol acetate i hexaner 3x , 20% (v/v) etanol acetate i hexaner 3x, 40% (v/v) etanol acetate i hexaner 3x, 60% (v/v) etanol acetate i hexaner 3x, og 100% etanol acetate 4X.
      Merk: gradering bør justeres basert på sammensatte størrelse og polariteter og ønsket separasjon.
    6. Bruk en glass pipette og Overfør 1 mL fra hver brøk til et merket GC-hetteglass. Analyser hvert eksempel via GC-MS for å finne ut hvilke brøker som inneholder de ønskede metabolitter og deres nivå av renhet.
      Merk: GC-MS-metoden som er egnet for metabolitter som produseres i denne metoden, er beskrevet i MAFU et al. 201839. Kort sagt, alle analysene ble utført på en GC med en XL MS detektor med en HP-5MS kolonne (se tabell over materialer), et prøvevolum på 1 μL, og ovns temperatur rampe fra 50 ° c til 300 ° c ved 20 ° c min-1.
    7. Når du har bestemt hvilke brøker som inneholder de sammensatte (e) av interesse, kombinerer du alle brøker som inneholder det samme sammensatte. Riktig kast fraksjoner som ikke inneholder noen forbindelser inn i en avfallscontainer. Gjenta den roterende fordampning prosedyren om nødvendig for å konsentrere renset metabolitter.
    8. Hvis ytterligere rensing er nødvendig, bruk (semi-) preparativ HPLC å forbedre produktets renhet. HPLC protokoller bør tilpasses basert på individuelle utstyrs spesifikasjoner og forbindelser av interesse.
      1. Resuspend tørket silica kromatografi prøver i 1 mL heksan (diterpene hydrokarboner) eller acetonitril (oksygenrikt diterpenoids), og Filtrer gjennom en filter sprøyte for å hindre forurensning med små partikler.
      2. For ikke-polare diterpenoids, bruk en CN-kolonne (se tabell over materialer) med en anbefalt strømningshastighet på 1 ml/min og en Heksan: etanol acetate gradient, med fraksjoner samlet hvert 1 minutt.
      3. For Polar diterpenoids bruker du en C18-kolonne (se tabell over materialer) med en anbefalt strømningshastighet på 3 ml/min og en acetonitril: vann gradering, med brøker samlet hvert 1 minutt.
      4. Tørk alle HPLC-renset fraksjoner under en nitrogen strøm og resuspend i 1 mL Heksan før GC-MS-analyse for å vurdere produkt overflod og renhet.

4. produksjon av diterpenoid metabolitter ved hjelp av N. benthamiana

Merk: protokollen som er beskrevet her for å produsere diterpenoid metabolitter i N. benthamiana har blitt tilpasset fra tidligere rapporterte studier35,36,40,41. Protokollen nedenfor er spesifikk for sprøyte infiltrasjon av N. benthamiana blader. Andre infiltrasjon metoder, slik som vakuum infiltrasjon er like egnet. Binære T-DNA vektor systemer, slik som pCAMBIA130035Su (pLIFE33) eller pEAQ-HT40,41,42, som muliggjør forplantning i E. coli og A. tumefaciens og genuttrykk i anlegget verter er egnet for denne protokollen.

  1. Planting Nicotiana benthamiana
    1. Fyll 1 750 mL gryte med potting jord og vann i potten. Tilsett ~ 20 tobakk frø og trykk forsiktig med fingeren slik at de er i jorda. Ikke dekk med jord.
      Merk: frø kan genereres gjennom selv-pollinering for frø forplantning. Frø for dette eksperimentet ble innhentet fra UC Davis Department of Plant Biology, og er offentlig tilgjengelig gjennom USDA germplasm repository (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450).
    2. La potten i en vekst kammer med følgende betingelser, vanning annenhver dag for å sikre at jorda ikke tørker ut. Dyrke planter ved 26 ° c og 60% fuktighet med 16:8 h dag: natt syklus for alle trinn i denne protokollen.
    3. Etter 1 uke, fyll ~ 20 potter med potting jord og vann pottene. Bruke tang, ta tak i en tobakk frøplante av stammen og forsiktig fjerne fra kilden potten, plassere en frøplante i hver ny pott og nøye Hi røttene. Ikke skade bladene eller røttene.
    4. Vann plantene annenhver dag ved å plassere vann i skuffen pottene er i (også kalt "Bottom vanning"). Hver fjerde vanning, inkluderer generisk gjødsel i vannet i henhold til pakken instruksjoner.
  2. Frys-Tin transformasjon av Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 kompetente celler
    1. Tin Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 (eller annen foretrukket belastning) kompetente celler på is (~ 1 h). Pre-chill 0,2 mL mikrosentrifugen rør på is. Varme SOC-medier ved 28 ° c.
    2. Bland celler forsiktig med Pipet spissen (ikke Pipet opp og ned) og alikvot 15 μL av celler for hver transformasjon til kjølt 1,5 mL mikrorør.
    3. Tilsett 1-5 μL (~ 400 ng) av DNA til hvert rør av kompetente celler og bland forsiktig ved å skrape rør langs en tube rack.
      Merk: ønsket konstruerer trenger ikke ha ulike antibiotika motstander fordi de er hver blir forvandlet separat og vil bli blandet før infiltrasjon.
    4. Plasser mikrorør i flytende nitrogen i 5 min.
    5. Fjern mikrorør fra flytende nitrogen og plassere rørene på rommet-temp rack. Tin rør i 5 minutter i 37 ° c inkubator.
    6. Tilsett 250 μL av den forvarmet (28 ° c) SOC til hver microtube. Rist ved 28 – 30 ° c, 225 RPM, for 3 timer.
    7. Plate 50 μL av transformert celler til LB agar plater som inneholder de nødvendige antibiotika beskrevet i tabell 1 ved hjelp av sterile glassperler, som beskrevet i trinn 2.1.8.
    8. Ruge plater invertert ved 28-30 ° c for 48 h. vekst innen inkubasjons på 1St kan være et tegn på forurensning. Transformert A. tumifaciens kan brukes etter 2-dagers inkubasjons eller lagres ved 4 ° c forseglet i para fin film i opptil 2 uker.
  3. Agrobacterium-mediert forbigående enzym co-uttrykk i Nicotiana benthamiana
    1. Beskjær 4-ukers-gamle Nicotiana benthamiana planter 2 dager før infiltrasjon ved å fjerne lavere blader. La 4 øverste bladene. Vann plantene. Ikke vann plantene 24 h før infiltrasjon for å tillate åpen stomata og enklere infiltrasjon.
    2. Tilsett 10 mL LB med arbeids konsentrasjoner av riktig antibiotika for utvalgte konstruksjoner og Agrobacterium stamme (beskrevet i tabell 1) til et 50 ml sterilt glass reagensrør med folie lokk.
    3. Vaksinere bruker en pipette tips for å serviett en enkelt koloni av forvandlet Agrobacterium og kaste spissen inn i lb Media. Hver Agrobacterium transformant bør ha minst 2 små kulturer.
    4. Ruge over natten ved 28 ° c og 220 RPM.
    5. Mål optisk tetthet ved 600 NM (OD600) av over natten kulturer ved hjelp av en spektrofotometer. Fortynne over natten kulturer til en OD600 av 1.
      Merk: optimale OD600 -verdier kan variere ved bruk av andre Agrobacterium stammer.
    6. Distribuer 10 mL fortynnet natt kultur til 50 mL koniske rør.
    7. Harvest bakteriene ved sentrifugering ved 3500 RPM for 15 min ved rom temp. Hell av og kast supernatanten.
    8. Re-suspendere kulturer i 10 mL infiltrasjon buffer ved forsiktig risting røret og ruller på et rør rack. OD600 skal være lik 1 for hver konstruksjon.
    9. Generer kombinasjonene ønsket for infiltrasjon ved å kombinere like volumer av hver transformert cellelinje. OD600 skal være lik 1 for hver infiltrasjon. Beregn 5 mL av infiltrasjon løsning per blad, 2 blader per plante.
    10. Fest rørene horisontalt til en rocker og stein forsiktig i 2 timer ved romtemperatur.
    11. Infiltrere ~ 2 blader per N. benthamiana plante bruker ca 5 ml av infiltrasjon blanding per blad. Infiltrere sunne blader med en nålløs sprøyte på undersiden av bladene mens øve et mot trykk med en finger på oversiden av bladet for å sikre infiltrasjon løsning suffuses bladet vev.
    12. Merk alle infiltrere blader med en svart markør eller annen indikator. Plasser infiltrere planter i vekst kammeret for 5 dager. Hold planter godt Vannes.
      Merk: en inkubasjonstid på fem dager har vist seg å være tilstrekkelig for å nå diterpenoid nivåer tilstrekkelig for de fleste nedstrøms analyser, og samtidig opprettholde tids effektiviteten til produkt formasjonen. Lengre inkubasjons perioder kan testes, der høyere produkt beløp er nødvendig.
  4. Metabolitten ekstraksjon og rensing fra forvandlet Nicotiana benthamiana
    1. Harvest infiltrere blader fra planter ved klipping dem fra anlegget. Tilsett ~ 100 mL flytende nitrogen og en enkelt blad til en mørtel, deretter grind ved hjelp av en mørtel og morter eller vev Mill til å få et fint pulver.
    2. Legg pulverisert vev til en GC-MS hetteglass til 500 μL avgrensning. Tilsett 1,5 mL 50/50 (v/v) etanol acetate/Heksan eller ønsket løsemiddel blanding til hetteglasset og lokket tett.
      1. For uttrykk som har blitt testet for å gi de ønskede produkter, Pool bakken vev i en større kolbe eller reagensglasset, legg deretter til ~ 2x mengden av løsemiddel enn vev volum og riste over natten. Fortsett til trinn 4.4.5 for rensing.
    3. Plasser alle hetteglassene i et microtube stativ og tape hardt for å sikre. Pakk under kraftig risting over natten ved romtemperatur.
    4. Overfør 400 μL av ekstrakt og 600 μL av Heksan inn i et ferskt hetteglass i GC-MS. Ikke alikvot noe blad vev. Analyser eksempler ved hjelp av GC-MS ved hjelp av metoden beskrevet i trinn 3.3.6.1.
    5. Etter analyse via GC-MS for tilstedeværelsen av ønsket metabolitter, ekstrakter bassenget blad sammen og fortsette gjennom roterende fordampning, silica kolonne kromatografi, og HPLC å få rene forbindelser som beskrevet i seksjoner 3,2 og 3,3.

Representative Results

Skjematisk arbeidsflyt for diterpenoid produksjon ved hjelp av E. coli
Figur 1 illustrerer den beskrevne arbeidsflyten for diterpenoid produksjon. Protokollen skissert her er tilpasset fra en tidligere beskrevet E. coli plattform for diterpenoid biosyntesen13,32 for bruk av større volum kulturer og rensing av ønskede diterpenoid produkter via silika kromatografi. For å demonstrere bruken av denne protokollen, brukte vi en nylig identifisert dolabralexin sti fra mais som består av to diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) og ZmKSL4 (Zm00001d032858), en multi-funksjonell P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), og en cytokrom P450 reduktase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (figur 2). I korte trekk var E. coli BL21DE3-C41 kompetente celler pre-transformert med pCDFDuet: IRS og pACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmider13,32. Den pCDFDuet: IRS plasmider inneholder nøkkel enzymer for diterpenoid forløper produksjon, inkludert 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfat syntase (dxs), 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfat reduktase (DXR), og isopentenyl uridindifosfatglukuronosyltransferase isomerase (Idi), og ble vist å øke diterpenoid formasjon i E. coli13. Den pACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmider inneholder mais ENT-copalyl uridindifosfatglukuronosyltransferase syntase ZmAN2 og en GGPP syntase fra abies grandis. Enzymer katalyserende de engasjerte reaksjonene i dolabralexin biosyntesen ble deretter co-transformert som plasmider pET28b: ZmKSL4 og pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. For detaljer om sekvenser og plasmider konstruksjoner se MAFU et al. 201839.

En GC-MS kromatogram av de utpakkede enzymet produktene er vist i figur 3a, illustrerer dannelsen av tre dolabralexin forbindelser, nemlig dolabradiene (1,2 ± 0,25 mg/l kultur), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l kultur), og epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L-kulturen) som kvantifisert basert på en standard kurve ved hjelp av diterpenoid sclareol. Sclareol ble brukt som referanse standard, på grunn av dens liknende struktur og kjemiske egenskaper sammenlignet med dolabralexins. Vanligvis observert mindre biprodukter inkluderer kloramfenikol, den indol derivater oxindol og indol-5-aldehyd, og forløperen geranylgeranyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (GGPP) (Figur 3). Indol representerer vanligvis den primære biprodukt, men er ikke vist her, på grunn av sin oppbevaring tid kortere enn den innstilte løsemiddel forsinkelse på 7 min for å bevare integriteten til GC-MS instrument.

Skjematisk arbeidsflyt av diterpenoid produksjon ved hjelp av N. benthamiana
Figur 4 viser en oversikt over uttrykket for dolabralexin Tien i N. benthamiana. For produktene som beskrives her, ble følgende konstruksjoner forvandlet separat til A. tumefaciens stamme GV3101: pLife33: P19 (uttrykker P19-genet som demper-protein), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Full-lengde native sekvenser av mais dolabralexin Pathway gener ble brukt i den binære T-DNA vektor pLife3341 med kanamycin motstand for forplantning i E. coli og A. tumefaciens. Co-uttrykk for oppstrøms terpenoid Pathway gener er valgfritt, siden forløperen geranylgeranyl uridindifosfatglukuronosyltransferase er endogenously dannet i N. benthamiana. Imidlertid har flere studier med hell ansatt slike tilnærminger for å øke diterpenoid formasjon i N. benthamiana14,36,41. Som illustrert i Figur 3, co-uttrykk vellykket produsert dolabradiene og 15, 16-epoxydolabrene. I motsetning til enzym co-uttrykk i E. coli, 15, 16-epoxydolabranol ble ikke oppdaget i metabolitten ekstrakter.

Tilstedeværelsen av 15, 16-epoxydolabrene i blad ekstrakter demonstrerte aktiviteten til CYP71Z18 i N. benthamiana. Som 15, 16-epoxydolabranol ble vist å være stabil etter ekstraksjon fra mikrobielle kulturer (Figur 3) samt etter isolering fra mais rot vev i tidligere studier39, synes det sannsynlig at det hydroksylerte produktet er glykosylert av endogene glycosyltransferases og senere sequestered i vacuole, rendering den utilgjengelige for ekstraksjon med organiske løsemiddel blandinger brukes her for ekstraksjon36,43,44,45 ,46. Lignende uønskede produkt modifikasjoner i forbindelse med Pathway Engineering i N. benthamiana har vært rapportert i tidligere studier47. Som vist for co-uttrykk i E. coli, forbigående uttrykk i N. benthamiana resulterer i ekstraksjon av flere biprodukter, inkludert lineær alkaner av ulik kjedelengde som basert på sammenligning til referanse massen Spectra databaser. Sammensatte titers Hentet fra blad materiale ble funnet å være i gjennomsnitt 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene og 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene per g tørt blad vev. Disse titers kan ikke sammenlignes direkte til E. coli co-Expression system gitt de forskjellige eksperimentelle satt ups.

Diterpenoid rensing
Diterpenoid rensing ble oppnådd ved hjelp av silika kolonne kromatografi og påfølgende semi-preparativ HPLC. Metabolitten ekstrakter fra 12 L av grupperte E. coli kulturer ble renset ved hjelp av silica kolonne kromatografi å skille de tre fokal dolabralexin forbindelser (figur 3a). Silica kromatografi er ideell for å oppnå høy renhet av målet forbindelser, siden det gir enkel separasjon av diterpene olefins og oksygenrikt derivater, og lett fjerner de store miljøgifter, oxindol, som er beholdt på silica matrise ( Figur 3a).

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyt for diterpenoid produksjon i E. coli og metabolitten rensing fra flytende bakterielle kulturer. Stiplede bokser viser valgfrie trinn der ekstra rensing er nødvendig. (A) representative bilde av utpakkede E. coli kultur ved hjelp av en separatory trakt. (B) representative bilde av metabolitten ekstrakt rensing ved hjelp av silica kromatografi.   Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Dolabralexin biosyntetiske vei og gen konstruksjoner brukt i denne studien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: GC-MS-resultater. Vist er representative GC-MS kromatogrammene av renset diterpenoid produkter innhentet ved hjelp av enzym co-Expression analyser i (A) E. coli og (B) N. benthamiana. Produkt-IDer er basert på sammenligninger til autentiske standarder og referanse massen Spectra av National Institute of Standards and Technology (NIST) masse Spectral bibliotek. 1, oxindol; 2, indol-5-aldehyd; 3, Pyrrolo [1, 2-a] pyrazine-1, 4-Dione, heksahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromophenyl] alkyltiokarbamid]-a-d-glucoside S, S-karbondioksid; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, Pyrrolo [1, 2-a] pyrazine-1, 4-Dione, heksahydro-3-(phenylmethyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 og 12, ukjent; 10, kloramfenikol; 11, 3, 7, 11, 15-tetramethyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkaner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Diterpenoid produksjon i N. benthamiana. (A) arbeidsflyt av diterpenoid produksjon i N. benthamiana og metabolitten rensing fra blad materiale. (B) representative bilde av N. benthamiana planter klar for infiltrasjon eksperimenter, før beskjæring. (C) representative bilder av N. benthamiana planter etter beskjæring. (D) bilde av sprøyte-infiltrere blader. Mørkere områder har blitt infiltrere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bredere undersøkelse og anvendelse av diterpenoid naturlige produkter nødvendiggjør enkle, rimelige protokoller for å syntetisere og rense tilstrekkelige mengder ønskede forbindelser. Den raske økningen i antall tilgjengelige diterpenoid-metabolske enzymer fra et bredt spekter av arter gir nå en ekspansiv inventar for enzymatisk produksjon av diterpenoids ved hjelp av mikrobielle og plante-baserte vertssystemer. I tillegg gjør den modulære arkitekturen til mange diterpenoid trasé bruk av enzymer fra samme eller forskjellige arter i plug & Play ' Kombinatorisk engineering tilnærminger til å generere en rekke naturlige og nye natur-lignende diterpenoid naturlig produkter2,14,26,35.

E. coli er en foretrukket mikrobiell vert for naturlig produkt biosyntesen på grunn av sin robusthet, enkel skalerbarhet, begrenset kjemisk kompleksitet for redusert biprodukt forurensning, og vell av tilgjengelige verktøy for DNA-montering og uttrykk Optimalisering. I vår erfaring, plattformen er beskrevet her er godt egnet for produksjon av produktet gir av opptil flere hundre mg diterpene olefins og alkoholer, som er egnet for mange nedstrøms applikasjoner, inkludert de som foreslås her. Selv om det ikke møter industriell skala, kan produksjonsplattformen som beskrives her, tjene som grunnlag for videre vei, vert og gjæring optimalisering som har blitt demonstrert for relaterte diterpenoids som taxadiene og sclareol33 ,34. Over-uttrykk for rate-begrensende MVA eller MEP veien gener har blitt etablert for å overvinne yield-Begrensende faktorer for diterpenoid biosyntesen, slik som utilstrekkelig forløper forsyning og forløper Flux i konkurrerende trasé13, 32,33,39. Selv vist seg vellykket i flere studier, dårlig uttrykk og katalysator aktivitet av terpenoid-metabolsk eukaryote P450s og andre membran-bundet enzymer i E. coli er en sannsynlig begrensende faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Bruk av Codon-optimalisert sekvenser og protein modifikasjoner, slik som fjerning av endoplasmatiske retikulum signal peptid eller innføring av et plastidial signal peptid, har vist seg nyttig å øke løselig P450 uttrykk14,38 ,49,50,53. Slike modifikasjoner ble også brukt for mikrobiell co-uttrykk for mais CYP71Z1839 brukes som et eksempel vei i denne studien. Protokollene beskrevet er basert på bruk av plasmider bærer en eller to gener per konstruere, alle under samme induserbart promoter. Der større-skala gen kombinasjoner er ønskelig, er det tilrådelig å bruke ulike tilgjengelige multi-genet kassetter eller gen stabling systemer for å redusere redusert transformasjon effektivitet og kultur vekst på grunn av bruk av flere plasmider og antibiotika13 .

Med den bredere tilgjengeligheten av genetikk og Genomics ressurser, anlegg vertssystemer også blitt stadig mer egnet for fremstilling av naturlige produkter. Fordelene inkluderer evne til planter for å produsere de nødvendige naturlige forløpere drevet av fotosyntese, og dermed muliggjør produkt dannelse uten behov for å supplere forløper molekyler54,55. N. benthamiana er allerede mye brukt for in vivo funksjonell karakterisering og Kombinatorisk uttrykk for terpenoid og andre naturlige produkt veier14,35,36,40 . Bemerkelsesverdige fordelene ved å bruke N. benthamiana som et vertssystem inkluderer den endogene produksjonen av diterpenoid forløpere, bruk av innfødte gen sekvenser, forenklet uttrykk for eukaryote P450s, enkel Kombinatorisk gen transformasjon (som separate antibiotika er ikke nødvendig for forbigående co-transformasjon), og enkel ekstraksjon av mål produkter fra blad materiale. Der det er nødvendig, kan diterpenoid produksjon forsterkes gjennom co-uttrykk for viktige MEP Pathway gener å øke forløperen Supply36,41. Begrensninger for skalerbar diterpenoid produksjon i N. benthamiana er mer komplekse i forhold til flytende mikrobielle kulturer på grunn av behovet for å generere tilstrekkelig plante biomasse, mer arbeidsintensiv produkt rensing fra kjemisk kompleks plante vev, og mulige uønskede metabolization av mål produkter gjennom, for eksempel, oksidasjon, glykosylering eller defosforylering av endogene enzymer36,43,44,45 ,46,47. Imidlertid kan denne fremgangsmåten skaleres opp til mg produkt mengder ved å øke antall planter som brukes for agroinfiltration56.

Produktet utvinning og rensing protokoller beskrevet her er kompatible med E. coli og N. Benthamiana, samt S. cerevisiae og andre plante-eller mikrobielle vertssystemer, og gir en kostnadseffektiv tilnærming som er lett å satt opp i både biologi og kjemi laboratorier og krever ikke dyrt renseutstyr. Metabolitten ekstraksjon ved hjelp av en separatory trakt er velegnet for effektiv ekstraksjon og fase separasjon før kromatografiske rensing. Trakt størrelser kan lett justeres for å muliggjøre større kultur volumer og redusere eksperimentell tid som trengs for å trekke ut fra store kulturer. Vi fant bruk av en Heksan/etanol acetate gradient å være ideell for utpakking diterpenoids av ulike polaritet som demonstrert her for gruppen av dolabralexins som utgjør både hydrokarboner og oksygenert forbindelser (Figur 3). Avhengig av egenskapene til mål produkter, kan andre løsemiddel blandinger være fordelaktig. Løsemidler må imidlertid ikke blandbar med vann for å sikre vellykket ekstraksjon og fase separasjon ved hjelp av separatory trakt teknikk. I tillegg må produkttap gjennom fordampning tas hensyn til ved bruk av denne tilnærmingen for å produsere flyktige organiske forbindelser (VOC), for eksempel lavere molekylvekt mono-og sesqui-terpenoider og andre VOC. Kromatografiske separasjon av diterpenoids av ulike nivåer av oksygenering bruke en større skala (~ 2 L) silica kolonne har vært fordelaktig i vår erfaring, siden det gir forbedret produkt separasjon og minimerer behovet for gjentakende rensing trinn ved bruk av mindre Kol onne volumer. Kolonne volumer og matriser kan justeres etter behov for ønsket kultur volum og type naturlig produkt. Renheten av mål produkter som kan oppnås ved hjelp av denne protokollen er egnet for mange nedstrøms programmer, for eksempel bioactivity analyser eller for bruk i enzym aktivitet analyser. Men hvor høyere renhet nivåer er nødvendig, for eksempel strukturelle analyser via NMR, produktrenhet kan effektivt forsterkes av ytterligere rensing bruker (semi)-preparativ HPLC.

Denne protokollen er beskrevet her er optimalisert for produksjon av diterpenoid naturlige produkter, men kan også lett tilpasses til beslektede mono-, sesqui-og Tri-terpenoider, samt andre naturlige produkt klasser bare ved å generere ønsket enzymet moduler for Kombinatorisk Expression14,57. Endringer i prosedyrene for uttrekking og rensing av produkter må imidlertid tas i betraktning for forbindelser med høyere volatilitet, for eksempel mono-og sesqui-terpenoider, eller høyere polaritet og funksjonell modifikasjon som et eksempel på glykosylering av mange triterpenoids, phenylpropanoids og andre naturlige produkt klasser.

Selv om industrielle plattformer for produksjon av naturlige produkter er tilgjengelige, protokollene beskrevet her tilbyr en billig, passelig verktøy som lett kan settes opp i de fleste laboratorier. Som demonstrert av produksjon av mais dolabralexins her og andre steder39, produktet mengder og renhet som kan oppnås ved hjelp av denne tilnærmingen er vanligvis tilstrekkelig til å lette ulike nedstrøms analyse og bruk, inkludert, men ikke begrenset til, ulike bioactivity studier, analyse av interaksjoner mellom organismer, så vel som for bruk som enzym underlag eller som start materiale for semi-syntese tilnærminger.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takknemlig erkjenner Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) for å gi pIRS og pGGxZmAN2 konstruksjoner. Finansiell oppbacking for denne arbeide av det NSF plante-biotiske vekselsvirkningene program (støtte # 1758976 å P.Z.), det DOE tidlig karrieren forskning program (støtte # DE-SC0019178 å P.Z.), det DOE skjøt Genova off fellesskapet vitenskap program (støtte # CSP2568 å P.Z.), det NSF Graduate Research Fellowship Program (til K.M.M.), og en UC Davis Dean ' s mentorer Award Fellowship (til K.M.M.) er takknemlig erkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent -
7890B GC Agilent -
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

Biokjemi diterpenoid biosyntesen co-uttrykk diterpene syntase cytokrom P450 monooxygenase Nicotiana benthamiana Zea Mays plante spesialisert metabolisme
En tilpasningsvennlig tilnærming for enzymatisk produksjon og rensing av Diterpenoid naturlige produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., More

Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter