Summary
Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.
Abstract
Durotaxis ist der Prozess, durch den Zellen Spannungsverspannungen erkennen und darauf reagieren. Um diesen Prozess in vitro zu untersuchen, muss die Steifigkeit des einer Zelle zugrunde liegenden Substrats manipuliert werden. Während sich Hydrogele mit abgestufter Steifigkeit und Langzeit-Migrationstests in Durotaxis-Studien als nützlich erwiesen haben, ermöglichen sofortige, akute Reaktionen auf lokale Veränderungen der Substratspannung eine gezielte Untersuchung einzelner Zellbewegungen und subzellulärer Signalereignisse. Um die Fähigkeit der Zellen, die zugrunde liegende Substratsteifigkeit zu erkennen und darauf zu reagieren, zu testen, wird eine modifizierte Methode zur Anwendung akuter Verspannungen erhöhter Spannung auf einzelne Zellen verwendet, die auf verformbaren Hydrogelen kultiviert werden und echtzeitfähig sind. Manipulation der Festigkeit und Richtung der SteifigkeitGradienten, die den betreffenden Zellen vermittelt werden. Durch feinabstimmung der Details und Parameter des Assays, wie Form und Abmessungen der Mikropipette oder der relativen Position, Platzierung und Richtung des angewendeten Gradienten, kann der Assay für die Untersuchung jeder mechanisch empfindlichen Zelltyp und -system. Diese Parameter können geändert werden, um den angewendeten Stimulus zuverlässig zu verändern und die Funktionalität und Vielseitigkeit des Assays zu erweitern. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung sowohl der langfristigen durotaktischen Bewegung als auch unmittelbarerer Veränderungen der zellulären Signalisierung und morphologischen Dynamik als Reaktion auf sich ändernde Steifigkeit.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten hat die Bedeutung der mechanischen Eigenschaften der Umgebung einer Zelle in der Zellbiologie zunehmend Anerkenntnis gefunden. Verschiedene Gewebe und extrazelluläre Matrizen haben unterschiedliche relative Steifigkeiten und, wie Zellen im ganzen Körper wandern, navigieren sie diese Veränderungen, mit diesen mechanischen Eigenschaften, um sie zu führen1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Zellen verwenden die Steifigkeit eines gegebenen Gewebes, um ihr motileverhalten während Vonprozessen wie Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung zu informieren. Die molekularen Mechanismen, die das Aufsehen und die Reaktion auf diese mechanischen Eingänge ermöglichen, bleiben jedoch weitgehend unbekannt1,2,3,4,5, 6 , 7.
Um die Mechanismen zu untersuchen, durch die Zellen auf physikalische Umwelthinweise reagieren, muss die Steifigkeit oder Steifigkeit des Substrats, das den anhaftenden Zellen zugrunde liegt, manipuliert werden. Im Jahr 2000 entwickelten Chun-Min Lo, Yu-Li Wang und Kollegen einen Assay 8, bei dem die motile Reaktion einer einzelnen Zelle auf wechselnde mechanische Hinweise direkt durch Dehnen verformbarer extrazellulärer Matrix (ECM)-beschichteter Polyacrylamid getestet werden konnte. Hydrogele, auf denen die Zellen plattiert wurden. Zellen weisen eine signifikante Präferenz für die Migration zu steiferen Substraten auf, ein Phänomen, das sie als "Durotaxis" bezeichneten.
Seit dem ursprünglichen Bericht im Jahr 2000 wurden viele andere Techniken für die Untersuchung von Durotaxis eingesetzt. Steile Steifigkeitsgradienten wurden hergestellt, indem Gele über starre Merkmale wie Polystyrolperlen9 oder steife Polymerpfosten10 gegossen wurden oder indem das Substrat um die Ränder eines Glasdeckels11 polymerisiert wurde, um mechanische ' Schrittgrenzen". Alternativ wurden Hydrogele mit flacheren, aber festen Steifigkeitsgradienten durch eine Vielzahl von Methoden hergestellt, wie z. B. Gradienten von Vernetzern, die durch mikrofluidische Vorrichtungen12,13 oder nebeneinander gebaute Hydrogellösungströpfchen erzeugt werden. mit unterschiedlicher Steifigkeit8oder Hydrogele mit photoreaktivem Vernetzen, die mit abgestufter UV-Lichtbelichtung behandelt werden, um einen linearen Steifigkeitsgradienten14,15zu erzeugen. Diese Techniken wurden mit großer Wirkung verwendet, um durotaktische zelluläre Bewegung en masse im Laufe der Zeit zu untersuchen. In der Regel werden diese Features jedoch im Vorfeld der Zellbeschichtung hergestellt, und ihre Eigenschaften bleiben im Laufe des Experiments konsistent und stützen sich auf zufällige Zellbewegungen für die Probenahme mechanischer Gradienten. Keine dieser Techniken ist für die Beobachtung schneller Veränderungen des zellulären Verhaltens als Reaktion auf akute mechanische Reize geeignet.
Um zelluläre Reaktionen auf akute Veränderungen in der mechanischen Umgebung zu beobachten, bieten Einzelzelldurotaxis-Assays mehrere Vorteile. In diesen Assays erhalten einzelne Zellen einen akuten, mechanischen Stimulus, indem sie das darunter liegende Substrat mit einer Glasmikropipette aus der Zelle herausziehen und so einen Richtungsgradienten der Zellmatrixspannung einführen. Veränderungen des motilen Verhaltens, wie Geschwindigkeit oder Migrationsrichtung, werden dann durch die Live-Zell-Phasenkontrastmikroskopie beobachtet. Dieser Ansatz erleichtert die direkte Beobachtung von Ursache-Wirkungs-Beziehungen zwischen mechanischen Reizen und Zellmigration, da er eine schnelle, iterative Manipulation der Richtung und Größe des Spannungsgradienten und die Bewertung der daraus resultierenden zelluläre Reaktionen in Echtzeit. Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um Zellen, die fluoreszierende Fusionsproteine oder Biosensoren exezieren, mechanisch zu stimulieren, um Veränderungen in Menge, Aktivität oder subzellulärer Lokalisierung von Proteinen zu visualisieren, die im Verdacht stehen, an mechanosensing und durotaxis.
Diese Technik wurde von Gruppen eingesetzt, die Durotaxis8,16 studieren und wird hier beschrieben, da sie vom Howe Laboratory angepasst wurde, um das durotaktische Verhalten von SKOV-3 Eierstockkrebszellen und die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die unter ly durotaxis17. Zusätzlich wird ein modifiziertes Verfahren für die Herstellung von Hydrogelen mit einer einzigen, gleichmäßigen Schicht fluoreszierender Mikrosphären in der Nähe der Zellkulturoberfläche beschrieben; Dies erleichtert die Visualisierung und Optimierung von mikropipettegenerierten Dehnungsgradienten und kann die Beurteilung der Zellkontraktilität durch Traktionskraftmikroskopie ermöglichen.
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Protocol
1. Herstellung von verformbaren Polyacrylamid-Hydrogelen mit eingebetteten fluoreszierenden Mikrosphären
HINWEIS: Anfahrt s. Beschreibung der Polymerisation eines 25 kPa Hydrogels mit einem Durchmesser von 22 m und einer Dicke von ca. 66 m. Jeder oder alle dieser Parameter können geändert werden, und die Anweisungen hierzu finden Sie in Tabelle 1 und in den Anmerkungen17.
- Aktivierung von Glasbodenschalen oder Deckellipsen
- Bereiten Sie die Bindesilan-Arbeitslösung für die Aktivierung einer Glasboden-Bildform oder eines Deckslips vor, der in eine Live-Zell-Bildgebungskammer passt. Mischen Sie 950 l 95% Ethanol, 50 l Eisessigsäure und 5 l Bindetesylan (y-Methacryloxypropyltrimethoxysilan).
HINWEIS: Die Verwendung eines größeren unteren Deckelslips im Vergleich zum oberen Deckelschlupf gibt zusätzlichem Arbeitsraum bei der Zubereitung des Gels und erleichtert die Positionierung der Glasmikropipette in späteren Schritten. Wenn Sie einen Coverslip anstelle einer Glasboden-Bildform verwenden, reinigen Sie den Coverslip, wie im folgenden Abschnitt beschrieben. - Aktivieren Sie die Oberfläche des Glases für 20 s mit einem Koronastab und überlagern Sie sofort 50 l der Bindesilanarbeitslösung. Lassen Sie die Lösung 10 min trocknen.
- Zweimal mit 95% Ethanol abspülen, dann zweimal mit Isopropanol und dann die Deckellipsen ca. 20 min lüften lassen.
HINWEIS: Aktiviertes Glas kann bis zu einer Woche in einem Trockenhaus aufbewahrt werden.
- Bereiten Sie die Bindesilan-Arbeitslösung für die Aktivierung einer Glasboden-Bildform oder eines Deckslips vor, der in eine Live-Zell-Bildgebungskammer passt. Mischen Sie 950 l 95% Ethanol, 50 l Eisessigsäure und 5 l Bindetesylan (y-Methacryloxypropyltrimethoxysilan).
- Reinigung Top Abdeckungenlipsen
- 22 mm Obere Abdeckungen durch Inkubation in 2% HCl bei 70 °C für 30 min reinigen und dann zweimal in ddH2O für 10 min waschen.
- Die Deckellipsen in einer Lösung von 2% Küvettenreinigungskonzentrat in ddH2O bei 50 °C für 30 min inkubieren, dann zweimal in ddH2O für 10 min waschen.
- Die Deckelin ddH2O bei 90 °C für 30 min inkubieren, dann in 70% Ethanol bei 70 °C für 10 min und dann bei 60 °C für mindestens 2 h an der Luft trocknen.
HINWEIS: Gereinigte Abdeckungen können unbegrenzt in einem sauberen Trockenhaus aufbewahrt werden.
- Fluoreszierende Mikrosphäre/Perlenabscheidung auf Top-Coverlips
- Sonicate die Stammlösung von fluoreszierenden Mikrosphären für 1 h in einem Ultraschall-Wasserbad. Machen Sie eine funktionierende Perlenlösung, indem Sie den Perlenbestand 1:200 in 100% Ethanol verdünnen und 1 h wieder beschallen.
- 15 min, bevor die Perlenlösung die Beschallung beendet hat, reinigen Sie die Abdeckungen gründlich, indem Sie sie vertikal in einen keramischen Deckeldeckelhalter legen und mit Raum-Luft-Plasma für 3 min in einem Tischplasmareiniger behandeln.
- Um die Handhabung zu erleichtern und das Gleiten des Deckels während der nachfolgenden Schritte zu verhindern, legen Sie ein Stück Parafilm in einen 60 mm Petrischalendeckel oder einen ähnlichen Behälter. Legen Sie den Deckelinin in den Stabilisator und tippen Sie leicht nach unten, um einen guten Kontakt zwischen dem Parafilm und dem Coverslip zu gewährleisten.
- Für einen 22-mm-Abdeckungsslip 150 l der Arbeitsperlenlösung an die Oberseite des Deckslips geben. Sofortiges Absaugen der Ethanollösung von der Seite des Deckels, so dass die Perlen auf dem Deckelschlupf. Lassen Sie den Deckelrutschen lufttrocknen.
ANMERKUNG: Die Menge der hinzugefügten Arbeitsperlenlösung sollte 4 l/cm2 betragen und kann skaliert werden, um jede Größe zu bedecken.
- Gießhydrogele mit eingebetteten fluoreszierenden Perlen
- Bereiten Sie die Hydrogellösung von Acrylamid und Bisacrylamid vor. Mischen Sie die Lösung gemäß Tabelle 1, und fügen Sie dann 2,5 l 10 % APS und 0,5 l TEMED hinzu. Gut mischen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt.
ANMERKUNG: Das Hydrogel-Lösungsgemisch kann verändert werden, um den Young-Modul oder die Steifigkeit des Hydrogels zu variieren, indem das Verhältnis von Acrylamid zu Bis-Acrylamid gemäß Tabelle 1geändert wird. Diese Werte wurden für den Einsatz im Howe-Labor mittels Atomkraftmikroskopie überprüft, sollten aber innerhalb der eigenen Institution bestätigt werden. - Unmittelbar nach der Herstellung der Hydrogel-Lösung einen 25-L-Tropfen auf die aktivierte Seite der Glasbodenschale oder den unteren Deckelschlupf geben, dann sofort den perlenbeschichteten Deckelaufschub auf die Lösung legen, Perlenseite nach unten. Die Berührung des Tropfens mit der Rückseite des Deckels gefolgt von langsamem Absenken hilft, Luftblasen im Hydrogel zu vermeiden.
ANMERKUNG: Die Höhe des Hydrogels sollte sich im Arbeitsabstand der Objektivlinse befinden, die im späteren Experiment verwendet werden soll. Eine Hydrogelhöhe von 66 m eignet sich gut für die meisten Systeme. Die Größe des Hydrogels kann durch Zugabe von mehr oder weniger Hydrogellösung je nach Größe des Deckels skaliert werden. Um das entsprechende Volumen der Hydrogellösung zu berechnen, verwenden Sie die Gleichung für das Volumen eines Zylinders, V = 2h, wobei r der Deckslipradius und h die gewünschte Hydrogelhöhe ist. Typischerweise sagt diese Berechnung mit fairer Genauigkeit die tatsächliche Höhe des Hydrogels voraus, gemessen durch die Vorbereitung eines Gels mit perlenbeschichteten Abdeckungen sowohl auf der Ober- als auch auf der Unterseite und mit einem konfokalen Mikroskop, um den Abstand zwischen den beiden Perlenebenen zu messen. Es wurde jedoch festgestellt, dass die tatsächliche Höhe des Hydrogels von dieser Berechnung um 20 m abweichen kann(z. B. abhängig von der Dicke und dem Hersteller des oberen Glasdeckels). Es wird empfohlen, die Gelhöhe mit der oben beschriebenen Methode direkt zu messen. - Lassen Sie das Gel 30 min polymerisieren, dann entfernen Sie den oberen Deckelrutsch sanft mit Zangen. Das Hinzufügen von 50 mM HEPES pH 8.5 zur Schale kann die Entfernung erleichtern. Waschen Sie für 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 dreimal.
- Bereiten Sie die Hydrogellösung von Acrylamid und Bisacrylamid vor. Mischen Sie die Lösung gemäß Tabelle 1, und fügen Sie dann 2,5 l 10 % APS und 0,5 l TEMED hinzu. Gut mischen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt.
- Hydrogel-Aktivierung und extrazelluläre Matrixbeschichtung
- Aktivieren Sie die Hydrogeloberfläche durch Inkubation in 0,4 mM Sulfo-SANPAH (Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) Hexanoat) in 50 mM HEPES pH 8.5. Sofortige Belichtung einer UV-Lichtbogenlampe in einem geschlossenen Bereich.
HINWEIS: Schützen Sie Sulfo-SANPAH vor der Aktivierung vor Licht. Für eine 400 W Lampe, positionieren Sie das Gel 10 cm von der Glühbirne innerhalb des Leuchtkastens und leuchten für 100 s. Die Sulfo-SANPAH-Lösung wechselt von leuchtend orange zu dunkelbraun. - Waschen Sie für 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 dreimal.
HINWEIS: Hydratisierte Gele können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. - Inkubieren Sie das aktivierte Hydrogel in 20 g/ml Fibronectin in 50 mM HEPES pH 8,5 für 1 h bei 37 °C.
- Die Fibronectin-Lösung ansaugen und dreimal 5 min in phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen. Sterilisieren Sie das Hydrogel und den Deckel der Schale für 15 min unter UV-Licht in einer Gewebekulturhaube mit einem geringen PBS-Volumen. Einmal in sterilem PBS waschen.
HINWEIS: Andere Arten von ECM-Protein können verwendet werden, um das Hydrogel einschließlich Kollagen und Laminin zu beschichten.
- Aktivieren Sie die Hydrogeloberfläche durch Inkubation in 0,4 mM Sulfo-SANPAH (Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) Hexanoat) in 50 mM HEPES pH 8.5. Sofortige Belichtung einer UV-Lichtbogenlampe in einem geschlossenen Bereich.
2. Beschichtungszellen
- Fügen Sie 3 ml Medien mit 21.000 Zellen hinzu, um eine 60-mm-Schale für eine endgültige Zelldichte von 1000 Zellen/cm2zu füllen. Passen Sie die Sädichte nach Bedarf an, um Dasvervölkern zu verhindern und die freie Bewegung einzelner Zellen zu ermöglichen.
- Lassen Sie die Zellen bei 37 °C für mindestens 4 h und für bis zu 18 h vor der Bildgebung erholen. Bereiten Sie sich auf die Bildgebung vor, indem Sie zwei Mal mit Bildmedien spülen, bevor Sie Bildmedien hinzufügen. Lassen Sie die Zellen mindestens 30 min vor der Bildgebung ausdemieren.
HINWEIS: Bildschirmmedienbedingungen im Voraus, um Bedingungen zu bestimmen, die die Migration in der verwendeten Zelllinie optimieren. Bei SKOV-3-Zellen stimuliert DMEM ohne Phenolrot, das 20 mM HEPES und 12,5 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor enthält, die meiste Migration. Optimale Bedingungen für Ref52-Zellen sind Ringer-Puffer mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 25 ng/mL Thrombozyten-abgeleitetem Wachstumsfaktor.
3. Herstellung der Glasmikropipette: Pipette ziehen und schmieden
- Ziehen Sie 100 mm lange Borosilikatglas-Mikropipetten mit einem Außen- und 0,58 mm Innendurchmesser von 1,0 mm in einem zweistufigen Verfahren, um eine Verjüngung über 2 mm zu erhalten, die im ersten Millimeter auf 50 m reduziert wird und sich im letzten Millimeter auf ein langes, paralleles Rohr mit einem Durchmesser von 10 m erstreckt.
- Ziehen Sie die Pipette in eine Mikroschmiede. Gestalten Sie die Pipette so, dass sie eine 15 m stumpfe Spitze hat, die ganz am Ende eines 250-mm-Abschnitts eingeschlossen ist, der in einem Winkel von 35° vom Rest der Pipette gebogen ist. Der ungefähre Durchmesser an der Biegung sollte etwa 30 m betragen, um der Spitze Festigkeit zu verleihen.
HINWEIS: Die Bemaßungen der Taper und Spitze können so eingestellt werden, dass sie die gewünschte Kraft richtig anwenden (siehe Schritt 5). Das Ziehen von Mikropipetten bei 65 °C für den ersten Schritt für 3 mm und 60 °C für den zweiten Schritt erzeugt die in Schritt 3.1 beschriebenen Abmessungen. Die Ergebnisse mit verschiedenen Pipettenabzügen können variieren. - Sterilisieren Sie die Mikropipette vor Gebrauch in 70% Ethanol.
4. Positionierung des Mikromanipulators und der Mikropipette
- Entfernen Sie den Tellerdeckel und laden Sie die Schale auf die Mikroskopbühne und -mitte. Verwenden Sie ein 10-faches oder ähnlich niedriges Vergrößerungsziel. Bedecken Sie die Medien mit Mineralöl, um eine Verdunstung der Medien zu verhindern.
-
Einfügen gezogener Pipetten
- Setzen Sie die gezogene Pipette in den Mikropipettemantel ein und zeigen Sie den Haken nach unten in Richtung der Schale. Die Spitze des Hakens wird der niedrigste Punkt sein, wenn er auf das Gel abgesenkt wird.
- Legen Sie den Mantel in den Mikromanipulator ein und stellen Sie ihn ein, bis die Spitze der Pipetten spitze über der Objektivlinse in X- und Y-Richtung zentriert ist.
- Senken Sie die Pipette mit grobem Manipulator, bis sie nur die Oberfläche der Flüssigkeit berührt.
- Mit Phasenkontrast oder Hellfeld, fokussieren Sie das Mikroskop auf die Perlenschicht an der Oberseite des Gels. Dies wird die Referenzebene sein.
- Um sicherzustellen, dass das Ziel nicht gefahr ist, die Probe oder Die Stufe zu treffen, bringen Sie den Fokus über das Gel, um die Spitze der Mikropipette zu finden, indem Sie kleine Anpassungen des groben Manipulators in x und Y Richtungen verwenden, um Schatten auf die Brennebene zu werfen. Senken Sie die Mikropipette nur, wenn sie sicher ist, dass sich die Spitze der Pipette im Sichtfeld befindet.
- Stellen Sie sicher, dass die abgestumpfte Spitze der Mikropipette nach unten zeigt, indem Sie die Pipetette im Mantel drehen oder den Mantel im Mikromanipulator drehen, bis die Spitze senkrecht zur Brennebene ist. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5 nach Bedarf. Konzentrieren Sie sich auf die Spitze der Pipette.
- Konzentrieren Sie sich zurück zur oberen Perlenschicht des Gels, um zu messen, wie weit die Pipette von der Geloberfläche entfernt ist. Konzentrieren Sie sich wieder auf eine Ebene, die teilweise zwischen dem Gel und der Spitze der Pipette liegt. Senken Sie die Pipette langsam, um die mittlere Fokalebene zu erreichen.
- Wiederholen Sie Schritt 4.6, bis sehr schwache Schatten von der Spitze der Mikropipette geschätzt werden können, wenn Sie sich auf das Hydrogel konzentrieren. Erhöhen Sie auf die nächsthöhere Vergrößerung.
- Senken Sie den Mikromanipulator, bis Schatten und Brechungen der Spitze der Mikropipette innerhalb der Perlenschicht-Fokalebene geschätzt werden können.
- Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das, was im Experiment verwendet wird. Senken Sie die Pipetten, bis sie knapp über der Oberfläche des Hydrogels schwebt.
5. Kalibrieren der Mikromanipulator- und Krafterzeugung
- In Phase oder Hellfeld, senken Sie die schwebende Mikropipette, um die Oberfläche des Hydrogels zu berühren. Beobachten Sie, wie die Pipte bei Kontakt mit dem Hydrogel aussieht. Fahren Sie mit der Niedrigeren Mikropipette in Z fort, bis Anpassungen in X und Y das Ziehen und Ablenkführen des Hydrogels in diese Richtungen verursachen. Verwenden Sie die Mikrosphären oder zellennahe als Treuhandzeichen.
ANMERKUNG: Wenn der Mikromanipulator am Phasenkondensatorarm oder an der Bank befestigt ist und nicht die Probenstufe selbst, ziehen Sie das Gel immer aus, bevor Sie die Stufe bewegen, um ein Bruch der Pipette oder störende Zellen zu vermeiden. Wenn die Pipetten bricht, gehen Sie zurück zu Schritt 3 und Schritt 4. - Finden Sie einen Bereich ohne Zellen, um das Gel zu engagieren. Ziehen Sie es in alle Richtungen und machen Sie es sich mit der Art und Weise wohl, wie Mikromanipulation zu Verformung des Gels führt.
- Nehmen Sie fluoreszierende Bilder des Perlenfeldes ohne Manipulation, mit der Pipette, die das Gel einschaltet, und mit der engagierten Pipette, die das Gel zieht. Wiederholen Sie dies mehrmals mit guten Notizen in Bezug auf die Teilstriche auf dem Mikromanipulator, die Art und Weise, wie die Pipettenspitze in Phase oder Hellfeld in jeder Phase des Ziehens aussieht, und den Abstand, den sich die Spitze mit dieser Manipulation bewegt.
- Verwenden Sie ImageJ wie zuvor beschrieben16,17, um relative Perlenverschiebungen und Kraft, die auf die Perlen angewendet werden, zu berechnen, indem Sie das Null-Perlen-Feld mit dem Perlenfeld ohne Pipetteneingriff, dem Perlenfeld mit dem eingelegten Gel und dem gezogenes Gel.
- Um den Spannungsreiz zu optimieren, vergleichen Sie die Kraftanwendung mit unterschiedlichen Mikropipette-Spitzenmaßen, Entfernungen von der Zelle oder dem Abstand, den der Mikromanipulator vom Anfangspunkt des Touchdowns auszieht. Die Wirkung der Mikropipette-Spitzendimension auf die Kraftanwendung bietet dem Anwender große Flexibilität, zeigt aber auch die Notwendigkeit, Kraftkarten für neue Mikropipetten zu generieren, auch wenn die Abmessungen und die Form den zuvor kalibrierten Spitzen sehr ähnlich sind.
6. Durchführung des Durotaxis-Assays
- Bevor Sie das Experiment durchführen, üben Sie, das Gel in der Nähe einer Zelle einzubinden, und beobachten Sie die Verformung der Zelle, wenn der Mikromanipulator neu positioniert wird.
- Überwachen Sie eine Gruppe von Zellen, die eine klare Polarität haben und sich 30 min lang zu bewegen scheinen, um Zellen zu identifizieren, die sich gerichtet bewegen.
- Wählen Sie eine Zelle, die sich in eine einzelne, klare Richtung bewegt, und überwachen Sie sie mit der gewünschten Bildrate für weitere 30 min.
- Wenn die Bestimmung der auf die Zelle ausgeübten Kräfte oder die von der Zelle ausgeübte Spannung gewünscht wird, erfassen Sie bei jeder Erfassung Perlenfeldbilder. Wenn die Zelle während der Überwachung ihren Richtungsverlauf ändert, wählen Sie eine andere Zelle aus, die überwacht werden soll, da dies die Bestimmung der Wirkung der Stimulation erschwert.
- Betreiben Sie das Hydrogel ca. 50 m von der Zelle entfernt. Positionieren Sie die Pipette vor der nahen Seite der Vorderkante und bewegen Sie den Mikromanipulator so, dass das Gel orthogonal in die Bewegungsrichtung der Zelle verformt ist. Beobachten Sie die Zelle im Laufe der Zeit, während sie auf den akuten, lokalen Gradienten der Steifigkeit reagiert.
ANMERKUNG: Das hier vorgesehene Timing ist wirksam bei der Überwachung von SKOV3- oder Ref52-Fibroblasten, jedoch sollten das Intervall und der Gesamtzeitverlauf an den beobachteten Zelltyp und das biologische Ereignis angepasst werden. Wenn Sie mit der Fluoreszenzmikroskopie koppeln, halten Sie die fluoreszierende Erfassung unmittelbar vor Schritt 6.5. an, verwenden Sie Phasenkontrast oder Hellfeld, um Mikropipette und Pull zu positionieren, und starten Sie die fluoreszierende Erfassung unmittelbar danach neu. - Wenn die Pipetten verrutscht oder der Farbverlauf anderweitig gelockert oder freigegeben wird, suchen Sie eine neue Zelle, indem Sie die Schritte 6.2 und 6.3 wiederholen.
7. Ermittlung der durotaktischen Migrationsreaktion
- Berechnen Sie mit ImageJ19 oder einem anderen Bildanalyseprogramm den Drehwinkel, indem Sie eine Linie zwischen der Mitte der Vorderkante der Zelle bei 0 min und 30 min Post-Monitor (die die ursprüngliche Flugbahn der Zelle widerspiegelt) und einer anderen Linie zwischen der Mitte die Vorderkante kurz vor und 80 min nach Stimulation und Messung des Winkels zwischen diesen beiden Linien.
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Representative Results
Durch die Vorbereitung von Mikropipetten (Abbildung 1) und die Normalisierung der Krafterzeugung der Züge (Abbildung 2 und Abbildung 3), wie oben beschrieben, wurden optimale durotaktische Bedingungen für mehrere Zelllinien identifiziert. Mit dieser Technik, wie in Abbildung 4beschrieben, bewegen sich sowohl die SKOV-3-Ovarialkrebszellen17 als auch die embryonalen Fibroblasten der Ratte Ref52 (Abbildung 5) in Richtung erhöhter Steifigkeit in Gradienten, die von einer Glasmikropipette aufgetragen werden. Neben Durotaxis kann diese Methode verwendet werden, um dynamische Signalereignisse mit fluoreszierenden Biosensoren und Markern zu untersuchen. Beispielsweise kann die Struktur und Signalisierung innerhalb der fokalen Adhäsionsstrukturen bei durotaktischer Stimulation beobachtet werden. Vinculin-Spannungssensor (VinTS) ist ein FRET-basierter Biosensor, der auf fokale Verklebungen lokalisiert, was eine fluoreszierende Beobachtung der fokalen Haftdynamik und die Messung von Spannungsänderungen innerhalb dieser Strukturen ermöglicht19. Ref52-Zellen, die VinTS vorübergehend auf 125 kPa Polyacrylamidgelen exprimieren, zeigen die Bildung von Fokaladesionen in Dehnungsrichtung über einen Zeitraum von 40 min (Abbildung6A). DIE FRET-Analyse20 zeigt, dass Vinkulin lokalisierte fokale Adhäsionen eine unmittelbare Spannungsänderung erfahren, wenn sie mit akuter durotaktischer Stimulation (Abbildung 6B) präsentiert wird, die den Nutzen dieses Assays auf die Beobachtung subzellulärer Signalisierungvon Ereignissen als Reaktion auf durotaktische Stimulation.
Abbildung 1. Diagramme von typischgezogenen (A) und geschmiedeten (B) Mikropipetten. (A) Mikropipetten werden mit einem zweistufigen Protokoll gezogen, um eine Verjüngung von 1 mm bis 10 m über 2 mm zu erreichen. (B) Mikropipetten werden dann in die Mikroschmiede geladen und ihre Spitzen werden gebogen, eingeschlossen und verkürzt, so dass die letzten 250 m der Micropipette wird in einem Winkel von 35° gebogen und verjüngen sich von 30 m auf eine abgerundete Spitze, die 15 m misst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Verbessertes Perlenfeld nach der Ethanolbeschichtung im Vergleich zur herkömmlichen Methode mit Poly-L-Lysin. Repräsentative Hydrogel-Perlenfelder aus Poly-L-Lysin und Ethanol (EtOH) Verdampfungsabdeckungsbeschichtungsverfahren mit gelb-grünen, roten und dunkelroten Fluoreszenzperlen. Maßstabsleiste: 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Generation der Kraftkarte für eine Beispiel-durotaktische Dehnung. (A) Position der fluoreszierenden Mikrosphären vor und nach (pseudofarbengrün bzw. rot) verformt das Hydrogel mit einer Mikropipette (über den rechten Rand der Platte). Maßstabsleiste: 25 m. Verschiebungsvektoren (B) und Verschiebungs-Wärmekarte (C) zwischen null und gezogenen Perlenfeldern, die von Traction Force Microscopy-Plugins in ImageJ generiert werden, heben den Gradienten von Perlenablenkung und Hydrogeldehnung hervor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Schematische durotaxis Assay und Bestimmung des Ablenkwinkels. (A) Eine Zelle wird mindestens 30 min lang beobachtet, um ihre ursprüngliche Flugbahn zu bestimmen. (B) Die Mikropipette wird orthogonal zur Flugbahn der Zelle positioniert, 50 m von der Zellkante entfernt. Das Hydrogel wird von der Mikropipette so eingesetzt, dass das Bewegen der Mikropipette Kraft auf die Oberfläche des Hydrogels ausübt. (C) Die Mikropipette wird zusätzlich 20 m von der Zelle entfernt, orthogonal zur Zellbahn, was einen akuten, lokalen Spannungsverlauf (blau bezeichnet) erzeugt, der sich in Richtung der Mikropipette erhöht. (D) Die Zelle wird im Laufe der Zeit beobachtet, während sie durch den angewendeten Farbverlauf navigiert. (E) In ImageJ oder einem Bildanalyseprogramm wird die ursprüngliche Flugbahn (gestrichelte Linie) durch eine Linie markiert, die von der Mitte der Zelle durch die Mitte der Vorderkante im ersten Frame gezeichnet wird. Die letzte Flugbahn (volumenfeste Linie) wird durch eine Linie markiert, die gezeichnet wird, nachdem die Zelle durch den angewendeten Spannungsverlauf navigieren darf. Der Winkel zwischen diesen beiden Linien in Richtung des Stimulus wird als "Drehwinkel" bezeichnet, hier durch , markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Ratatische Embryonale Fibroblasten bewegen sich in Richtung Regionen mit erhöhter Substratsteifigkeit in Durotaxis. Zeitverlauf mit durotaktischem Satz einer Ref52-Zelle 10 min vor dem Zug (Panel 1), 1 min vor dem Zug (Panel 2), zum Zeitpunkt des Ziehens (Panel 3) und 1 h nach Ziehen (Panel 4). Pfeil zeigt die Richtung der Dehnung an. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Proteinlokalisierung und Aktivität während der durotaktischen Stimulation mit fluoreszierenden Markern oder Biosensoren. Ref52-Zellen, die vinculin Tension Sensor (VinTS)19, die auf 125 kPa Polyacrylamidgelen migrieren, vorübergehend exprimieren, werden mit akuter durotaktischer Stimulation dargestellt. (A) Nach der Stimulation bilden sich neue Fokaladesionen in Streckenrichtung, wenn sich die Zellen entlang des Steifigkeitsgradienten neu orientieren. Für zwei 10 min Perioden, beginnend 20 min vor mechanischer Stimulation und 21 min nach Stimulation, wurden die Zellmorphologie (oben) und die Fokaladsionsbildung (unten) überwacht. Rote Farbe gibt den ersten Zeitpunkt innerhalb des Zeitraums und grüne Farbe den Zeitpunkt 10 min später an. Neue Fokaladesionen, die innerhalb der 10 min Periode gebildet werden, werden grün dargestellt. Vor der Stimulation bilden sich neue Fokaladesionen in Fahrtrichtung. Nach der Stimulation bilden sich neue Fokaladesionen in Richtung Dehnung. Pfeil zeigt die Richtung der Dehnung an. Pfeilspitzen zeigen Bereiche mit Fokaladesionen an, die über diesen 10 min Zeitraum gebildet wurden. Maßstabsleiste: 25 m. (B) DIE FRET-Analyse der VinTS-Fluoreszenz zeigt eine Spannungsänderung innerhalb der fokalen Adhäsionen proximal bis durotaktische Dehnung. Gliederung der Zellmembran vor und nach der Dehnung markieren Verformung der Zelle bei Stimulation. Pfeilspitzen zeigen Beispiele für Fokaladesionen, die Veränderungen des FRET-Verhältnisses auf Dehnung erfahren. Maßstabsleiste: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gewünschte Hydrogelsteifigkeit | 3 kPa | 25 kPa | 125 kPa |
| 7,5% Acrylamid | 100 l | 100 l | 160 l |
| 0,5% Bis-Acrylamid | 10 l | 100 l | 100 l |
| ddH2O | 287 l | 197 l | 137 l |
Tabelle 1. Acrylamid-Gel-Lösungen.
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Discussion
Hier wird ein wiederholbarer, einzelliger Durotaxis-Assay gezeigt, der die Beurteilung der Fähigkeit einer Zelle ermöglicht, ihr Migrationsverhalten als Reaktion auf akute mechanische Hinweise zu ändern. Diese Technik kann auch in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie und geeigneten Fusionsproteinen oder Biosensoren eingesetzt werden, um subzelluläre Signalisierung und zytoskelettale Ereignisse innerhalb von Sekunden nach mechanischer Stimulation oder über einen längeren Zeitraum während der durotaktische Bewegung. Das Verständnis der Beziehung einer Zelle zu ihrer Umgebung beinhaltet die Untersuchung der Auswirkungen sowohl der chemischen als auch der mechanischen Aspekte dieser Umgebung. Obwohl potenziell schwer zu meistern, kann dieser Durotaxis-Assay weit verbreitet sein, um die zelluläre Reaktion auf Veränderungen in seiner mechanischen Mikroumgebung zu verstehen.
Bedeutung für bestehende Methoden
Wie bereits erwähnt, ist diese Mikropipetten-basierte Methode der durotaktischen Stimulation hoch gradipulierbar, was ein hohes Maß an raumzeitlicher Kontrolle über mechanische Reize ermöglicht, ein großer Vorteil gegenüber anderen Techniken, wie vorgeformten linearen oder Schrittgradienten der Steifigkeit. Die Größe und Richtung der vermittelten Dehnungsgradienten kann visualisiert werden, indem die Verschiebung von fluoreszierenden Perlen, die in das Hydrogel eingebettet sind, in der Nähe der Zellkulturoberfläche verfolgt wird.
Das Beschränken dieser Treuhandmarkierungen auf eine einzelne Ebene unterhalb der Kulturoberfläche erhöht die Genauigkeit dieser Nachverfolgung. Mikrosphären unterhalb der Verformungsebene (entweder durch die Mikropipette oder, für die Traktionskraftmikroskopie, durch zelluläre Kontraktilität), wie es bei der gleichmäßigen Vermischung der Mikrosphären im Hydrogel der Fall wäre, bewegen sich weniger als in der Ebene. Mikrosphären, die zu einer Unterschätzung der angewandten Kräfte führen können. Außerdem ist diese Modifikation einfacher durchzuführen und zuverlässiger als Methoden, bei denen Perlen in einer extrem dünnen Schicht aus Polyacrylamid überlagert werden, die auf einem vorgeformten Gel21 gegossen oder durch schwerkraftunterstütztes Absetzen auf die Hydrogeloberfläche gebracht wird22 und produziert eine gleichmäßigere Verteilung von Perlen über das Hydrogel als zuvor beschriebene Methoden17,23.
Modifikation und zukünftige Anwendungen
Die Besonderheiten dieses Assays können so geändert werden, dass er am besten der Zelllinie des Interesses entspricht. Zum Beispiel können eine Vielzahl von extrazellulären Matrixmolekülen(z.B. Kollagen I, Kollagen IV, Laminin) oder andere Klebenliganden verwendet werden, um das Hydrogel zu funktionalisieren. Auch die Startsteifigkeit des Hydrogels kann leicht angehoben oder gesenkt werden, indem das Verhältnis von Acrylamid zu Bis-Acrylamid abgestimmt wird (siehe Tabelle 1). Durch die Änderung der Abmessungen der Mikropipettespitze und der Größe des Zuges kann dieser Assay optimiert werden, um einen wiederholbaren und effektiven durotaktischen Stimulus für den betreffenden Zelltyp zu vermitteln.
Kritische Schritte und Fehlerbehebung
Nur Zellen, die einer stetigen, linearen Migrationsbahn vor hydrogel-Manipulation folgen, sollten stimuliert werden, um sicherzustellen, dass Veränderungen der Flugbahn auf den mechanischen Reiz und nicht auf zufällige Schwankungen zurückzuführen sind. Es muss darauf geachtet werden, eine Glasmikropipette herzustellen, die die Hydrogeloberfläche ohne Verrutschen eingreift, aber das Gel beim Ziehen nicht reißt. Es ist wichtig, im Laufe des Experiments eine stetige, konstante Dehnung auf das Hydrogel anzuwenden, um saubere Ergebnisse zu erzielen, was bedeutet, dass der Benutzer beim Platzieren und Bewegen der Mikropipette geübt werden sollte, bevor er auf eine Zelle trifft. Jede unbeabsichtigte Bewegung der Mikropipette, die zu Veränderungen im Spannungsverlauf führt, könnte die Durotax-Fähigkeit der Zelle beeinträchtigen. In ähnlicher Weise sollte die Manipulation des Gels mit jeder neuen Mikropipette geübt werden, die geschmiedet wird, da leichte Änderungen in der Pipettenform dazu führen können, dass die Pipetten-Gel-Interaktion variiert.
Wenn die Mikropipette nicht im mikroskopischen Sichtfeld positioniert wird, bevor die Vergrößerung erhöht wird, kann dies zum versehentlichen Bruch der zerbrechlichen Glasspitze führen. Stellen Sie sicher, dass die Höhe und X-Y-Position der Spitze bekannt ist, bevor Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator senken. Überwachen Sie immer die Position der Mikropipette, um das Bruchrisiko zu reduzieren. Es wird empfohlen, die Vergrößerung für jede neue Mikropipette, die in den Mikromanipulator geladen wird, wieder auf 10-fache zu verkleinern, da leichte Bewegungen des Mikromanipulators und der Pipettenhülle zu großen sichtbaren Veränderungen in der Position der neu belasteten Mikropipette.
Bevor Sie zellenzubeobachten, ist es wichtig, zuerst die Mikropipette zu testen, um zu bestätigen, dass sie das Hydrogel wie erwartet eingreift und dass es für die Anwendung der gewünschten Dehnung geeignet ist. Die Suche nach Spitzenabmessungen, die zum Experiment und Zelltyp passen, ist entscheidend für den Erfolg bei der Anwendung durotaktischer Stimulation. Das Ende der Mikropipette sollte so gerundet sein, dass sie das Gel nicht durchbricht, aber nicht so abgerundet, dass sie es nicht packt. Wenn die Pipte das Gel nicht effektiv zieht, kann sie entlang der Oberfläche gleiten. Die Form der Mikropipettespitze kann zu abgerundet sein, um richtig mit der Geloberfläche zu interagieren. Die Abmessungen an der Spitze der Mikropipette sollten so lange eingestellt werden, bis ein fester, stetiger Kontakt konstant erreicht werden kann. In einigen Fällen, in denen die Mikropipette über die Geloberfläche rutscht, kann es notwendig sein, die Mikropipette weiter in das Hydrogel zu senken, um mehr Traktion zu gewinnen. Wenn die Mikropipette durch Gel reißt, kann die Spitze zu fein oder zu scharf sein. Gelreißen kann auch darauf hinweisen, dass beim Ziehen zu viel Kraft angewendet wird. Die Mikropipette sollte leicht angehoben werden, um die Verformung des Gels zu reduzieren und kürzere Abstände zu ziehen.
Wenn die Zelle oder der Rand der Zelle durch die Mikropipette aus dem Fokus gezogen wird, ist die Spitze der Mikropipette oft zu nah an der Zelle oder die Dehnung ist zu stark. Bewegen Sie die Mikropipette weiter von der Zelle entfernt und verformen Sie die Zelle in den X-Y-Ebenen nur geringfügig. Das Herausnehmen der Zelle aus dem Fokus macht nicht nur zelluläre Ereignisse unmöglich zu überwachen und optische Aberrationen zu verursachen, sondern es wird auch dazu führen, dass die Zelle mehr Stimulation erfahren, als der vorgesehene 2-dimensionale Spannungsgradient.
Am wichtigsten ist, dass es wichtig ist, nur Antworten aufzuzeichnen und zu analysieren, die konsistente durotaktische Manipulation mit minimalem menschlichen Fehler aufweisen. Wenn das Absenken der Spitze ungenau ist oder wenn die Mikropipette neu positioniert wird, werden die Ergebnisse des Experiments getrübt. Da dieser Test komplex ist und viele Schritte fehleranfällig sind, muss bei jedem Schritt darauf geachtet werden, unbeabsichtigte Veränderungen in der Stimulation der Zellen zu vermeiden. Ein Ausfall bei einem Schritt kann zu einer inkonsistenten Stretchanwendung und unzuverlässigen Ergebnissen führen.
Einschränkungen
Es gibt Einschränkungen für diese Technik, die in Betracht gezogen werden sollten. Vor allem das präzise Schmieden und Manipulieren der Glasmikropipetten kann eine steile Lernkurve für neue Anwender darstellen. Zusätzlich müssen die Position und Größe des Hydrogelzuges für unterschiedliche Zelllinien optimiert werden. Die Untersuchung von fluoreszierenden Perlenverschiebungen vor und nach hydrogel-Manipulation kann bei diesem Aspekt der Technik helfen. Auch, während die Technik eine hohe raumzeitliche Beobachtung des durotaktischen Verhaltens in einzelnen Zellen ermöglicht, macht dies es zu einem Test mit niedrigem Durchsatz. Es ist daher wichtig, darauf hinzuweisen, dass dieser Assay auch durch andere Techniken mit geringerer Manipulabilität, aber höherem Durchsatz ergänzt werden kann, wie z. B. die Verwendung von Hydrogelen mit vorgeformten Steifigkeitsgradienten, um das durotaktische Verhalten größerer Populationen von Zellen auf einmal. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hohe Grad der raumzeitlichen Kontrolle mechanischer Hinweise, die der einzellige durotaktische Assay bietet, es sehr nützlich macht, die molekularen Mechanismen zu analysieren, die zum durotaktischen Verhalten vieler verschiedener Zelltypen unter vielen Bedingungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
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