Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/59997
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Surgery Branch, National Cancer Institute, NIH, 2Center for Cell-Based Therapy, National Cancer Institute, NIH, 3Laboratory of Immunology, Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel beskriver en metode til at generere funktionelle tumor antigen-specifikke induceret pluripotente stamcelle-afledte CD8αβ+ enkelt positive T-celler ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system.

Abstract

Generering og udvidelse af funktionelle T-celler in vitro kan føre til en bred vifte af kliniske anvendelser. En sådan anvendelse er til behandling af patienter med fremskreden kræft. Adoptiv T celle overførsel (ACT) af højt berigede tumor antigen-specifikke T-celler har vist sig at forårsage varige regression af metastatisk kræft hos nogle patienter. Men under ekspansion, disse celler kan blive udmattet eller senescent, begrænse deres Effector funktion og persistens in vivo. Induceret pluripotente stamcelle (iPSC) teknologi kan overvinde disse forhindringer ved at føre til in vitro-generation af et stort antal mindre differentierede tumor antigen-specifikke T-celler. Human iPSC (hiPSC) har kapacitet til at differentiere sig til enhver form for somatisk celle, herunder lymfocytter, som bevarer den oprindelige T-celle receptor (TCR) genomisk omorganisering, når en T-celle anvendes som en startcelle. Derfor omprogrammering af humane tumor antigen-specifikke T-celler til hiPSC efterfulgt af omdifferentiering til T Cell Lineage har potentiale til at producere forynget tumor antigen-specifikke T-celler. Beskrevet her er en metode til generering af tumor antigen-specifikke CD8αβ+ enkelt positive (SP) T celler fra hipsc ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system. Denne metode er et kraftfuldt værktøj til in vitro-celle Lineage generation og vil lette udviklingen af in vitro-afledte T-celler til brug i regenerativ medicin og celle-baserede terapier.

Introduction

Ud over fysiologiske fordele, T-celler har mange potentielle terapeutiske anvendelser. Generering og udvidelse af T-celler in vitro kan anvendes til sygdoms modellering og terapeutisk validering samt en kilde til behandling af arvelige og erhvervede immundefekt tilstande (dvs. virale immundefekter og lymfodepletering sekundært til kemoterapi eller transplantation) og til udryddelse af kræft. Sidstnævnte kvalitet har ført til udvikling af adoptivt Cell overførsel (ACT) til behandling af patienter med fremskreden kræft1.

ACT består af at resse en patients tumor, udtrække tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs), udvide TILs ex vivo, derefter reinfusing de udvidede celler i patienten2. Det har vist sig at være en effektiv behandlingsmodalitet for nogle patienter med Metastatisk Cancer.  Desværre, ikke alle patienter reagerer på denne behandling. Tidligere rapporter har vist, at differentierings tilstanden for overførte celler3,4,5,6,7,8,9, brug af store tal af stærkt berigede kræft antigen-specifikke t-celler10, og persistens af t-celler efter overførsel11,12 er alle korreleret med mere holdbare svar13,14. Derfor, når ACT undlader at fremkalde en anti-tumorrespons, det kan delvis skyldes et lavt udbytte af kræft antigen-specifikke T-celler, ineffektiv ex vivo ekspansion fører til konsumption og tab af reaktive kloner, eller manglende vedholdenhed efter overførsel4 . Det er blevet postuleret, at disse forhindringer kan overvindes ved generering af et stort antal mindre differentierede kræft antigen-specifikke T-celler in vitro15,16.

Hæmatopoietiske Stem/stamceller (Hspc'er) er en konventionel kilde til in vitro T celle generering, selv om denne metode er begrænset af det lille antal celler, der kan inddrives fra en enkelt donor1. Embryonale stamceller (ESCs) har også vist sig at producere T-celler, men med lavt udbytte17, hvilket gør det ineffektivt for kliniske anvendelser. Da T-stamceller Desuden oplever stokastiske genetiske rekombination af deres T-celle receptorer (TCRs) i tidlige udviklingsstadier, er det ikke muligt at anvende Hspc'er eller Esc'erne til at generere en ren population af antigen specifikke T-celler uden yderligere genomisk ændringer som TCR-gentransduktion.

En tilgang til at overvinde disse forbehold er at omprogrammere TILs til menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs), som kan give en grænseløs kilde til in vitro T celle generation. Det har vist sig, at kræft antigen-specifikke tils kan omprogrammeres til hipscs og re-differentieret til T Cell afstamning, som bevarer den samme t celle receptor (TCR) gen omlægning som den oprindelige t celle18,19.  Denne detalje er vigtig for Act, fordi individuelle patient tumorer har unikke Mutations profiler, og meget få kræft antigener har vist sig at være delt blandt patienter20. Derfor kan brug af Cancer antigen-specifikke TILs som en kilde til in vitro-produktion af hiPSC-afledte T-celler give en ny strategi for personlig behandling af patienter med metastatisk kræft.

Præsenteret her i detaljer er en protokol til differentiering af hiPSC-afledte T Lineage celler i funktionelle antigen-specifikke CD8αβ+ enkelt positive (SP) t-celler ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system. Denne metode er et kraftfuldt værktøj til in vitro T Celledifferentiering af hiPSCs, hæmatopoietiske stamceller, og embryonale stammer, samt deres yderligere anvendelser i regenerativ medicin og celle-baserede terapier.

Protocol

1. dyrkning af humane iPSCs (hiPSCs) på mus embryonale fibroblaster (MEF)

Bemærk: Alternative metoder til dyrkning af hiPSCs kan også anvendes, herunder, men ikke begrænset til: såning på en 6 brønd plade forbelagt med gelatine, en gelatinøs protein blanding, rekombinant Laminin 511 eller en anden ekstracellulær matrix, der anvendes i hiPSC-ekspansion, og dyrkes ved hjælp af definerede medier, der er specielt formuleret til menneskelig pluripotente stamcelle kultur.

  1. Culturing MEF
    1. Coat en 10 cm cellekultur Petri skål med 4 mL 0,1% gelatine og Inkuber i 30 min ved 37 °C.
    2. TØ et hætteglas med 4 x 106 bestrålede MEF hurtigt ind i 10 ml 37 °C MEF-medier (DMEM + 10% FBS + 1x penicillin-streptomycin + 1x L-Glutamin-supplement). Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Aspirér supernatanten, og resuspender celle pellet i 9 mL MEF-medier.
    3. Fjern den gelatine belagte skål fra inkubator. Aspirere gelatine og tilsæt 7 mL MEF-medier. Plade 3 mL MEF suspension (fra trin 1.1.2) på den gelatine belagte skål. Rock skålen side-til-side og front-to-back for at sikre jævn fordeling af MEF over skålen. Inkuber ved 37 °C i 8-36 h.
  2. Passaging hiPSC på MEF
    Bemærk:     dataene blev genereret ved hjælp af Mart-1 iPSC afledt af langsigtede kulturperler MELANOM til, som specifikt GENKENDER Mart-1 peptid i forbindelse med HLA-A * 02:01, som tidligere beskrevet18.
    1. Passage hiPSCs når kolonier er mellem 0,8-1,2 mm i diameter. Før passaging, check hiPSC kolonier i et stereomikroskop og fjerne eventuelle områder af differentiering fra kulturen ved hjælp af plastik kant af en 200 μL spids.
    2. Aspirere brugte medier og tilsæt 10 mL hiPSC-medier (Human ES Culture Media [tabel over materialer] + 10 ng/ml Human Basic fibroblast Growth Factor [hbFGF]) suppleret med 10 μM rock hæmmer.
    3. Hold cellen kultur skålen i den ene hånd og Rul en engangs celle passaging værktøj på tværs af hele skålen i en retning. Påfør nok tryk, så hele rulle bladet rører kultur skålen og opretholde et ensartet tryk under rullende handling.
    4. Drej kultur skålen 90 °, og Gentag trin 1.2.3. Se pladen i mikroskopet for visuelt at bekræfte korrekt skæring af kolonierne, som skal vises ternet. Frigør afskårne kolonier ved skånsom mekanisk skylning med en 200 μL pipette.
      Bemærk: Løsrivelse af afskårne kolonier ved mekanisk skylning skal ske umiddelbart efter opskæring af kolonier med rullen, fordi efter 3 min vil de afskårne kolonier begynde at sætte sig fast på skålen, og det vil blive vanskeligt at løsne kolonier af homogen størrelse ved at skylle.
    5. Overfør 350-600 klumper af afskårne kolonier på en ny 10 cm skål MEF (belagt 8-36 h før hiPSC-passaging) med 10 mL friske hiPSC-medier suppleret med 10 μM-klippe hæmmer. Inkubere ved 37 °C.
      Bemærk: 600 klumper repræsenterer ca. 1,0 x 106 Mart-1 IPSC og vil give 0,5-1,0 x 106 DP-celler på dag 35. Det forventede antal vil dog variere afhængigt af styrken af startcelle linjen og kultur forholdene.
    6. Den følgende dag, aspirere brugte medier og tilsæt 10 mL friske hiPSC medier. Skift hiPSC-medier hver 1-2 dage afhængigt af hiPSC-vækstraten.

2. forberedelse af OP9/filen DLL1 celler til co-kultur med hiPSCs

  1. Kultur OP9/filen DLL1 celler i OP9 medier [α-minimum essentiel medium (α-MEM) + 20% føtal bovint serum (FBS) + 1x penicillin-streptomycin] ved 37 °C. Når OP9/filen DLL1 celler når confluency, aspirere medier og vaske en gang med 5 mL 1x magnesium, calcium, og phenol rød-fri fosfat bufferet saltvand (PBS).
  2. Aspirere PBS og tilsæt 2 mL 0,05% trypsin-EDTA.  Inkuber i 5 min ved 37 °C. Derefter tilsættes 4 mL OP9 medier og mekanisk dissocierer cellelaget ved pipettering for at lave en enkelt cellesuspension.
  3. Cellesuspensionen overføres til et 50 mL konisk rør gennem en 100 μm celle-si for at undgå celle klumper. Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Aspirér supernatanten og resuspension i 12 mL OP9 medier.
  4. Tilsæt 8 mL OP9 medier til hver af seks nye 10 cm cellekultur Petri skåle. Plade 2 mL OP9/filen DLL1 cellesuspension fra trin 2,3 på hver ny 10 cm skål. Rock skålen side-til-side derefter front-to-back for at sikre jævn fordeling af OP9/filen DLL1 over skålen.
  5. Inkubere ved 37 °C. Gentag passagen hver 2-3 dage, når cellerne når frem til konfluency.
    Bemærk: Det er vigtigt at gøre nok frosne bestand af OP9/filen DLL1 celler og tø en ny bestand hver 4-6 uger.

3. in vitro-differentiering af hiPSCs i CD8αβ + enkelt positive (SP) T- celler

  1. Forbered prægelatineret OP9/filen dll1 retter en uge før Co-kultur med hipscs. For at forberede 0,1% gelatineopløsning tilsættes 5 mL rumtemperatur (RT) vævs-grade bestand gelatineopløsning til 500 mL PBS.
    1. Coat 3 nye 10 cm cellekultur Petri skåle ved at tilføje 4 mL per skål af 0,1% gelatine.  Inkuber 30 min ved 37 °C.
    2. Aspirere gelatine og tilsæt 8 mL OP9 medier til hver skål. Passage en flydende skål af OP9/filen dll1 (som gjort i punkt 2 ovenfor) til tre gelatine pre-coated retter.
  2. Efter 4 dage tilsættes 10 mL OP9 medier til hver 10 cm skål af OP9/filen DLL1 på gelatine, til i alt 20 mL medier pr. skål.
  3. Efter 7-8 dage, begynde hipsc Co-kultur på OP9/filen dll1 flydende retter (differentiering dag 0).
    1. Aspirere brugte medier fra flydende 10 cm parabol af hipscs på MEF. Tilsæt 10 mL OP9-medier. Skær og frigør hiPSC-kolonier ved hjælp af et værktøj til engangs celle passaging som udført i trin 1.2.3 og 1.2.4.
    2. Overfør 350-600 klumper af afskårne kolonier på en 10 cm præ-gelatiniseret OP9/filen DLL1 skål (trin 3,1) med 10 mL friske OP9 medier ved hjælp af en 200 μL pipette. Rock kulturen parabol side-til-side derefter front-to-back for at sikre jævn fordeling af kolonier.
      Bemærk: Alternativt kan præ-formede hipsc-embryoidlegemer (EBs) eller lille klump suspension anvendes.  Men, brugen af en engangs celle passaging værktøj eller EB formation system foretrækkes at producere hiPSC klumper af ensartet størrelse.
  4. På dag 1, aspirere brugte medier og erstatte med 20 mL friske OP9 medier. hipsc klumper Co-dyrkede på OP9/filen dll1 for 1 dag vil fremstå som små runde enkeltlags kolonier (figur 1).
  5. På dag 5, aspirere 10 mL brugte medier og tilsæt 10 mL friske OP9 medier. hiPSC kolonier vil begynde at differentiere sig til primitive mesoderm, som er karakteriseret ved en flerlags mørkt Center.
  6. På dag 9, aspirere 10 mL brugte medier og tilsæt 10 mL friske OP9 medier. På dette tidspunkt vil flerlaget Center strukturer udvikle sig til kuppel-lignende former, og et perifert netværk-lignende område vil begynde at blive tydelig.
  7. På dag 13, høst hæmatopoietiske stamceller (HPCs) (figur 1). hiPSC-afledte strukturer på dag 13 er karakteriseret ved en mørk central organoid omgivet af et netværk af kuppel-lignende områder, repræsentative for hæmatopoietiske zoner (HZs) tidligere rapporteret at vedlægge humane embryonale stamceller-afledte hæmatopoietiske progenitorer 21.
    Bemærk:     tilstedeværelsen af kuppel-lignende strukturer indikerer en vellykket proces, selv i fravær af mørke Centre. Den manglende evne til at producere HPCs kan skyldes dårlig kvalitet af OP9/filen DLL1, kvaliteten af FBS parti, sammenflughed af iPSC klumper seedet på OP9/filen DLL1 (350-600 klumper er optimal), og/eller variationer i styrken af iPSC linjer til at producere hæmatopoietiske prækursorer.
    1. Aspirer brugte medier og vask 1x med 5 mL 1x phenol rød-fri Hanks afbalanceret saltopløsning modificeret med calcium og magnesium (HBSS).
    2. Aspirer hbss og tilsæt 250 μl 5000 enheder/ml kollagenase IV i 10 ml hbss. Inkubér ved 37 °c i 45 min. aspirat hbss med kollagenase IV og vask en gang med 5 ml PBS.
    3. Aspirere PBS og tilsæt 5 mL 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter. Derefter tilsættes 4 mL OP9 medier og dissocierer cellelaget ved pipettering for at lave en enkelt cellesuspension.
    4. Cellesuspensionen overføres til et 50 mL konisk rør gennem et 100 μm cellefilter.  Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Aspirér supernatanten og resuspension i 10 mL OP9 medier.
    5. Plade cellesuspension på en ny gelatiniseret 10 cm celle-kultur Petri skål (Se trin 3.1.1 og 3.1.2). Inkuber ved 37 °C i 45 min. Indsaml derefter ikke-vedlige celler ved blid pipettering.
    6. Overfør den indsamlede cellesuspension til et 50 mL konisk rør gennem et 100 μm cellefilter.  Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Supernatanten aspireres og resuspenderes i 10 mL Differentialmedier [OP9 medier med 5 ng/mL Human stamcellefaktor (hSCF), 5 ng/mL humant Flt3 ligand (hFLT3L) og 5 ng/mL humant interleukin 7 (hIL-7)].
    7. Plade cellesuspensionen på en ny 10 cm OP9/filen dll1 flydende skål.
  8. På dag 16, passage cellerne.
    1. Mekanisk frakobling af ikke-klæber celler ved skånsom pipettering og Filtrer gennem en 100 μm-celle-Strainer. Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Aspirér supernatanten og resuspension i 10 mL differentierings medier.
    2. Plade cellesuspensionen på en ny 10 cm OP9/filen dll1 flydende skål.
  9. Fortsæt med at passaging ikke-klædige celler hver 5-7 dage derefter ved at gentage trin 3,8.
  10. På dag 35, berige CD4+CD8+ dobbelt positiv (DP) population og stimulere til at producere CD8αβ+ SP T celler (figur 2).
    1. Mekanisk løsrive ikke-vedliggende celler ved skånsom pipettering og Filtrer gennem en 100 μm celle-si for at fjerne celle klumper. Berige CD4+ celle befolkning ved CD4 magnetisk perle isolation i henhold til producentens protokol.
      Bemærk: rationalet for brug af CD4 magnetiske perler er at fjerne CD4-CD8- DN celler fra kulturen, da disse er blevet påvist at forårsage direkte drab af CD4+CD8+ DP celler efter stimulation22.
    2. Tæl levende CD4 beriget celler ved hjælp af en Neubauer hemocytometer og Trypan blå farvestof.  Suspension i OP9 medier i total koncentration 0,5 x 106 celler/ml. Aliquot 1 ml af cellesuspensionen (0,5 x 106 celler) i hver brønd af en vævskultur flad bund 24 brønd plade af flydende OP9/filen dll1.
    3. Tilsæt 100 IE humant interleukin 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anti-humant CD3 antistof, og 2 μg/mL anti-humant CD28 antistof, derefter kultur ved 37 °C.
    4. På dag 4-7 efter stimulation, indsamle celler til molekylær analyse (figur 3) eller co-kultur med peptid-pulsed antigen præsentere celler (APCS).

4. måling af antigen specificitet af hiPSC afledte CD8αβ + SP T- celler

Bemærk: Den type af Apc'er, der skal anvendes til denne oplevelse, er afhængig af MHC-begrænsningen af hiPSC-afledte T-celler. Her anvendes T2 cellelinje, som er en hybrid af T og B lymfoblastoid cellelinjer. T2-celler Express HLA-A * 02:0123, som er anerkendt af JKF6 celler, hvorfra MART1-IPSC blev afledt18. Denne T2-cellelinje kan udvides i rpmi 1640 + 20% FBS + 1x penicillin-streptomycin og er urerne, når cellerne når en densitet på 5 x 105 celler/ml.

  1. Count Live HLA-A * 02:01+ T-B hybrid lymfoblastoid T2-celler ved hjælp af en Neubauer hemocytometer og trypan blå farvestof. Incubate APCs i 24 brønd vævskultur plade med 1 μg/mL MART-1 peptid i 2 timer ved 37 °C.
    Bemærk: Optimal peptidkoncentration er variabel, afhængigt af cellelinje og antigen specificitet.
  2. Saml APCs og vask 2x med 10 mL PBS for at fjerne eventuelle ekstra peptid.
  3. Tæl APCs og suspendere ved 2 – 5 x 105 celler/ml i OP9 medier med 100 iu Il-2 og 5 ng/ml Il-7. Aliquot 100 μL cellesuspension (2-5 x 104 celler) i hver brønd af en ultra-lav fastgørelse U bund 96 brønd plade eller direkte ind i en præ-belagt elispot plade.
  4. Sorter hiPSC-afledte CD8αβ+ SP T celler (1 uge efter anti-Human CD3/CD28 antistof stimulation) ved hjælp af en celle sortering og suspendere ved 1 x 106 celler/ml i OP9 medier med 100 iu Il-2 og 5 ng/ml Il-7. Aliquot 100 μL cellesuspension (1 x 105 celler) i hver brønd af APCS og kultur for 16-20 h ved 37 °c.
  5. Efter 16-20 h, Analysér cytokinsekretions profilen ved ELISpot assay pr. producentens protokol (figur 4).

Representative Results

Efter 13 dages hiPSCs Co-culturing med OP9/filen DLL1, CD34+CD43+ hæmatopoietiske stamceller dukkede op (figur 1). Efter yderligere 22 dages kultur på ikke-gelatiniseret OP9/filen DLL1 i nærværelse af hSCF, hFLT3L, og hIL-7, hæmatopoietiske afkom differentieret i CD3+CD7+CD4+CD8+ dobbelt-positive (DP) T Lineage celler, hvoraf størstedelen udtrykte TCR specifikt for Mart-1 epitop (tetramer) (figur 2).

Det har tidligere vist sig, at CD8 + SP t- celler kan induceres fra CD4+CD8+ DP t-celler ved TCR-signalering via agonist peptid eller antistof-drevet TCR stimulation24,25. Derfor, på dag 35 af kultur, hiPSC-afledte CD4+CD8+ DP T celler blev stimuleret med anti-humane CD3 og anti-humane CD28 antistoffer i nærværelse af hIL-7 og Hil-2.  Fire dage efter stimulation steg antallet af CD3+CD8αβ+ SP-celler dramatisk og forblev specifikt for Mart-1 epitope, hvilket bekræfter bevarelsen af deres nedarvede antigen-specificitet (figur 3).

For at bestemme de funktionelle egenskaber af hiPSC-afledte CD8αβ+ SP T-celler, antigen-afhængige aktivering og sekretion af interferon gamma (IFN-γ) blev analyseret. Efter stimulation med anti-humane CD3 og anti-humane CD28 antistoffer i 1 uge, hiPSC-afledte CD8αβ+ SP T celler blev isoleret ved hjælp af en celle sortering og co-kultiveret med T2 cellelinje udtrykker HLA-a * 02:01 med eller uden cognate MART1 peptid for 16-20 h. ELISpot-analysen afslørede, at hiPSC-afledte CD8αβ+ SP t-celler udskiller højere mængder af IFN-γ sammenlignet med CD8αα+ SP t-celler, når de DYRKES i nærværelse af Mart-1 peptid. IFN-γ-ekspression var null for T-celler og Apc'er alene, hvilket viste, at humane T-iPSC-afledte T-celler er antigen specifikke og funktionelle (figur 4).

Figure 1
Figur 1: generering af hipsc-afledte hæmatopoietiske stamceller. (A) skematisk oversigt over differentieringen af hipscs til hæmatopoietisk afstamning ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur. (B) udseendet af hipsc-afledte strukturer på dag 1 (øverst til venstre), 3 (øverst til højre), 7 (nederst til venstre) og 13 (nederst til højre). Skala stænger = 100 μm. (C) flow cytometrisk analyse af hipsc afledte CD34+CD43+ hæmatopoietiske stamceller på dag 13. Data er repræsentative for seks uafhængige eksperimenter (n = 1 til 2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: hiPSC-differentiering i Mart1+ CD4+CD8αβ+ DP T-celler. (A) skematisk oversigt over differentieringen af hipsc-afledte hæmatopoietiske Lineage til umodne T-celler ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur. B) flow cytometrisk analyse af CD4 vs. CD8α, CD3 vs. CD8β og Mart-1 transthyretin ekspression i hipsc-afledte T-celler på dag 35. På lymfocytter, enkeltceller, PI negativ. Data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter (n = 3-8). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: induktion af CD8αβ + SP T- cellefænotype. Flow cytometrisk analyse af CD4- hipsc-afledte T-celler 4 dage efter human anti-CD3 og humant anti-CD28 antistof-drevet stimulation. Lymfocytter, enkeltceller, PI negativ (n = 4).   Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: antigen specificitet af hipsc-afledte CD8αβ+ SP T-celler. IFN-γ sekretion ved ELISpot assay af hiPSC-afledte CD8αβ+ SP, CD8αα+ SP, og bulk T celler efter 20 h Co-kultur med eller uden T2 celler pulserende (eller ikke) med Mart-1 peptid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Co-kulturen af OP9 murine stromale celler er et veletableret system til in vitro-generation af lymfocytter (dvs., NK, B, og T-celler) fra Hspc'er og pluripotente stamceller. Notch signalering er nødvendig for at inducere t Lineage engagement og kan opnås ved ektopisk ekspression af notch ligand filen dll1 eller DLL4, som har sammenlignelig effekt for t Cell generation1. Derfor er OP9/filen DLL1-samkultursystemet blevet en meget anvendt metode til fremstilling af T-celler in vitro.  Desuden er denne metode anvendes til brug sammen med flere typer og kilder af humane celler, herunder navlestrengsblod, knoglemarvs Hspc'er og ESCs.  Imidlertid er genereringen af T-celler fra disse kilder begrænset enten ved utilstrækkelig hentning af kilde celler eller ved ineffektiv differentiering til T-cellerne1. Desuden kan et T-celle produkt med en enkelt TCR rekombination ikke genereres fra disse åbne repertoire kilder. Ved hjælp af regenerativ medicin teknikker, nemlig induceret pluripotente stamcelle (IPSC) teknologi, kan det være muligt at producere massive antal antigen-specifikke T-celler til brug i celle-baserede Therapeutics15.

hiPSCs svarer til pluripotente Esc'er i deres kapacitet til selvfornyelse, grænseløs ekspansion og potentiale til at differentiere til enhver form for somatisk celle i kroppen; de mangler imidlertid de etiske betænkeligheder ved brugen af produkter af embryonal oprindelse til kliniske anvendelser. Desuden kan hiPSCs produceres fra enhver somatisk celle, der giver mulighed for udvikling af celleprodukter til personlig medicin. I tidligere rapporter er hipscs fremstillet af humane T-celler ved hjælp af hele perifere mononukleære celler, CD3 + celler eller isolerede cytotoksiske T- lymfocytter (CTL'er) som kilde18,19,22, 26. Når hiPSCs genereres fra en t-celle kilde (t-iPSCs), nedarves den oprindelige TCR-genordning. Derfor kan patient T-iPSC afledte T-celler give en model for personlig ACT-behandling ved at målrette mod en patients særskilte kræft antigener.

Differentieringen af humane pluripotente stamceller i T Lineage celler er opdelt i to trin: dannelsen af hæmatopoietiske stamceller (HPCs)27 og deres yderligere differentiering i t Lineage celler21. Begge trin kan udføres ved hjælp af OP9/filen DLL1 Co-Culture system. Vigtigere, kvaliteten af OP9/filen DLL1 feeder celler er afgørende for succesen af T Celledifferentiering. Da OP9/filen DLL1 celler ikke er en udødelig homogen cellelinje, er kvaliteten af FBS og kulturforhold afgørende for at opretholde deres ekspansion uden at miste evnen til at støtte hiPSC differentiering. Derfor anbefales det at pre-evaluere partiet af FBS og passage konsekvent, når celle-til-celle cytoplasmisk kontakt begynder at forekomme, for at forhindre Celledifferentiering og senescens. Et punkt at tage i betragtning er, at celle-til-celle kontakt kan vises skelnes fra baggrunden afhængigt af fasekontrast og forstørrelse af mikroskopet. I vores erfaring, de fleste OP9/filen DLL1 retter vil synes at være 80% flydende, når klar til passage.

Det har vist sig, at de redifferentierede t-Lineage celler genereret fra t-ipscs af OP9/filen dll1 Co-Culture kan producere CD8+ SP T-celler ved stimulering18,19. Men regenereret CD8+ SP T celler erhverve den iboende-lignende CD8αα homodimer22,28, som er en ineffektiv Co-receptor for TCR signalering29.  Derudover har disse regenererede CD8+ SP T-celler vist stærk TCR-uafhængig cytotoksicitet, hvilket gør disse celler ugunstige til klinisk brug30. Denne protokol beskriver en nylig metode, der involverer stimulering af rensede CD4+CD8+ DP-celler til at generere CD8αβ + SP T- celler med en mere konventionel fænotype og forbedret antigen-specifik cytotoksicitet22. Selv om tabet af antigen specificitet på grund af sekundær tcrα alleliske omlægning forekommer i DP fase efter langvarig kultur, dette kan overvindes ved genomredigering i T-ipscs31.  Det er vores erfaring, at hiPSC-afledte DP celler begynder at dukke op på dag 30-35 i kulturen, og disse nyligt genererede DP-celler har endnu ikke gennemgået sekundær TCRα-omlægning. Derfor bevarer de fleste DP-celler på dag 35 antigen specificitet og kan bruges til at generere antigen specifikke CD8αβ + SP T- celler.

Før Human anti-CD3 og anti-CD28 stimulation på dag 35 skal CD4-CD8-DN- cellerne fjernes fra kulturen, da disse er blevet påvist at forårsage direkte drab af CD4+CD8+ DP-celler efter stimulation22. Brug af CD4 magnetisk perle berigelse (trin 3,10) vil berige for både DP og CD4+CD8- INTERMEDIATE enkelt positive (ISP) celler1, som vi har vist sig at have nogen negative virkninger22. Alternativt kan fluorescens-aktiverede celle sortering ved flow cytometri udføres for at isolere DP-celler. Men magnetisk perle adskillelse foretrækkes, da det undgår mekanisk stress induceret af strømnings cytometri.

Generationen af CD8αβ+ SP T celler fra humane pluripotente stamceller uden aktivering-medieret agonist udvælgelse er efterfølgende blevet påvist ved brug af 3D murine stromale cellekultur32. Men, fysiologiske positive udvælgelse er afhængig af samspillet mellem TCR med Self-peptid-MHC komplekser, som er unikt behandlet og præsenteret af thymisk kortikale epitelceller33. Desuden har TCR affinitet for udvælgelse peptider vist sig at bestemme de efterfølgende funktionelle kapaciteter af modne CD8αβ+ SP T celler34.  I øjeblikket er der ingen beviser for, at en notch stromale celle-baserede Co-kultur system kan give den definerede udvælgelse peptid og MHC kompleks kræves for fysiologiske positive udvælgelse.

Det er tidligere blevet rapporteret i en murine model, at T Lineage celler genereret fra tumor antigen-specifikke T celle-afledte hiPSCs ved hjælp af OP9/filen DLL1 alene undlader at opleve konventionel modning. Men IPSC-afledte umodne t-celler genereret af OP9/filen dll1 system kan modnes i naive-lignende t-celler ved yderligere fysiologiske thyminsyre uddannelse i et 3D-kultur system 28,35. Derfor er den protokol, der præsenteres her for at producere iPSC-afledte umodne T-celler genereret af OP9/filen DLL1 system afgørende for yderligere forsøg på at generere reelle humane tumor antigen-specifikke post-thymic T-celler i stand til langvarig vedholdenhed in vivo med effektivitet til behandling af etablerede vaskulariserede tumorer.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Vi takker Alan B. Hoofring og Erina H. Han for grafisk assistance. Denne forskning blev støttet af Intramural Research program af National Cancer Institute (ZIA BC010763) og Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for celle-baserede kræft immunterapi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm dish Corning, Inc.  353003
Anti-CD3, human BD Biosciences Cat# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, human BD Biosciences Cat# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, human Biolegend Cat# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, human BD Biosciences Cat# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, human BD Biosciences Cat# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, human BD Biosciences Cat# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, human BD Biosciences Cat# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, human BD Biosciences Cat# 555548, RRID:AB_395932
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-375
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-387
CD4 Microbeads, human Miltenyl Biotec 130-045-101
Cell strainer 100 um Fisher Scientific 22-363-549
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini 100-500
Flt-3 ligand R&D Systems 427-FL
Gelatin Solution 2%  SIGMA-Aldritch G1393-100ML
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine supplement
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free Gibco 14025-092
Interleukin-2 R&D Systems 202-IL
Interleukin-7 R&D Systems 407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV MBL Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35) InnoPep 3146-0100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
αMEM powder Gibco 61100061
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Thermo Fisher Scientific C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962
OP9/N-DLL1 Riken Bioresource center Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 OP9/DLL1
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Primate ES Cell Medium Reprocell RCHEMD001 Human ESC Culture Media
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) Tocris 1254
RPMI 1640 Gibco 11875093
Stem Cell Factor (SCF) R&D Systems 455-MC
StemPro EZPassage 23181-010
T2-tumor ATCC T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) 
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25200-072
U Bottom 96 well plate Corning, Inc.  3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est. Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).
  2. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  3. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  4. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  5. Crompton, J. G., et al. Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape. Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).
  6. Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Silencing stemness in T cell differentiation. Science. 359 (6372), 163-164 (2018).
  7. Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation. Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).
  8. Vodnala, S. K., et al. T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism. Science. 363 (6434), (2019).
  9. Restifo, N. P., Gattinoni, L. Lineage relationship of effector and memory T cells. Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).
  10. Tran, E., et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 344 (6184), 641-645 (2014).
  11. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  12. Gautam, S., et al. The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity. Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).
  13. Klebanoff, C. A., et al. Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice. Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).
  14. Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
  15. Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
  16. Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. Memoirs of a reincarnated T cell. Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).
  17. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  18. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  19. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  20. Lo, W., et al. Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer. Cancer Immunology Research. , (2019).
  21. Timmermans, F., et al. Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).
  22. Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
  23. Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids. Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).
  24. Snauwaert, S., et al. In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection. Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).
  25. Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC. Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).
  26. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  27. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 23, Unit 23, 26 (2007).
  28. Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
  29. McNicol, A. M., et al. CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR. European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).
  30. Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy. Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).
  31. Minagawa, A., et al. Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy. Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).
  32. Montel-Hagen, A., et al. Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).
  33. Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
  34. Takada, K., et al. TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells. Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).
  35. Vizcardo, R., et al. A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants. JoVE. , https://www.jove.com/video/58672/a-three-dimensional-thymic-culture-system-to-generate-murine-induced e58672 (2019).

Tags

Kræftforskning pluripotente stamcelle induceret pluripotente stamcelle immunologi adoptiv celle overførsel T Celledifferentiering tumor antigen specificitet
Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Good, M. L., Vizcardo, R., Maeda,… More

Good, M. L., Vizcardo, R., Maeda, T., Tamaoki, N., Malekzadeh, P., Kawamoto, H., Restifo, N. P. Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells. J. Vis. Exp. (152), e59997, doi:10.3791/59997 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter