Summary
В этой статье описывается метод генерации функциональных опухолевых антигенов-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных CD8 "- один положительных Т-клеток с помощью OP9/DLL1 совместной культуры системы.
Abstract
Генерация и расширение функциональных Т-клеток in vitro может привести к широкому спектру клинических применений. Одним из таких применений является лечение пациентов с запущенным раком. Было показано, что приемная передача Т-клеток (ACT) высокообогащенных опухолевых антиген-специфических Т-клеток вызывает прочную регрессию метастатического рака у некоторых пациентов. Однако, во время расширения, эти клетки могут стать исчерпаны или старческие, ограничивая их функции эффектора и настойчивость в vivo. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) технология может преодолеть эти препятствия, что приводит к в пробирке поколения большого количества менее дифференцированных опухолевых антиген-специфических Т-клеток. Человеческий iPSC (hiPSC) имеет способность дифференцироваться в любой тип соматических клеток, включая лимфоциты, которые сохраняют исходный рецептор Т-клеток (TCR) геномные перестановки, когда Т-клетка используется в качестве стартовой клетки. Таким образом, перепрограммирование человеческих опухолевых антиген-специфических Т-клеток в hiPSC с последующим повторением к линии Т-клеток имеет потенциал для производства помолодевших опухолевых антигенов конкретных Т-клеток. Описанный здесь метод для генерации опухолевых антиген-специфических CD8"- одиночные положительные (SP) Т-клетки от hiPSC с помощью OP9/DLL1 системы совместной культуры. Этот метод является мощным инструментом для генерации линии линии in vitro T и будет способствовать развитию in vitro полученных Т-клеток для использования в регенеративной медицине и клеточной терапии.
Introduction
В дополнение к физиологическим преимуществам, Т-клетки имеют много потенциальных терапевтических применений. Генерация и расширение Т-клеток in vitro может быть использовано для моделирования заболеваний и терапевтической проверки, а также источником лечения наследственных и приобретенных состояний иммунодефицита (т.е. вирусных иммунодефицитов и лимфодепляции вторичных к химиотерапии или трансплантации) и для искоренения рака. Это последнее качество привело к развитию приемной передачи Т-клеток (ACT) для лечения пациентов с запущенным раком1.
ACT состоит из резекции опухоли пациента, извлечения опухолевых лимфоцитов (TILs), расширение TILs ex vivo, а затем reinfusing расширенные клетки в пациента2. Было показано, что эффективная методика лечения для некоторых пациентов с метастатическим раком. К сожалению, не все пациенты реагируют на эту терапию. Предыдущие отчеты показали, что дифференциация состояния переданных ячеек3,4,5,6,7,8,9, использование больших чисел высокообогащенного рака антиген-специфических Т-клеток10, и сохранение Т-клеток после передачи11,12 все коррелируют с более прочными ответами13,14. Поэтому, когда ACT не в состоянии вызвать противоопухолевую реакцию, это может отчасти из-за низкой урожайности рака антиген-специфических Т-клеток, неэффективное расширение ex vivo, приводящее к истощению и потере реактивных клонов, или отсутствие настойчивости после передачи4 . Было постулировано, что эти препятствия могут быть преодолены путем генерации большого числа менее дифференцированных антигена рака конкретных Т-клеток в пробирке15,16.
Гематопоиэтисические стволовые/прародители клетки (HSPCs) являются обычным источником для генерации клеток in vitro T, хотя этот метод ограничен небольшим количеством клеток, которые могут быть извлечены из одного донора1. Эмбриональные стволовые клетки (ESC) также были показаны для производства Т-клеток, но с низкой урожайностью17, что делает его неэффективным для клинического применения. Кроме того, поскольку T линейные клетки испытывают стохастические генетические рекомбинации своих Т-клеточных рецепторов (TCRs) на ранних стадиях развития, невозможно использовать HSPCs или ESCs для создания чистой популяции антиген-специфических Т-клеток без дальнейших геномных модификации, такие как трансдукция генов TCR.
Один из подходов к преодолению этих оговорок заключается в перепрограммировании TILs для индуцированных человека плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые могут обеспечить безграничный источник для генерации т-клеток in vitro. Было показано, что рак антиген-специфических TILs могут быть перепрограммированы в hiPSCs и вновь дифференцированы к линии Т-клеток, которая сохраняет тот же Рецептор Т-клеток (TCR) гена перестановки, как оригинальный Т-клеток18,19. Эта деталь важна для ACT, потому что отдельные опухоли пациента имеют уникальные мутационные профили, и очень немногие антигены рака были показаны, чтобы быть общим среди пациентов20. Таким образом, использование рака антигена конкретных TILs в качестве источника для в ипроцпредства поколения hiPSC полученных Т-клеток может обеспечить новую стратегию для персонализированного лечения пациентов с метастатическим раком.
Представлено здесь подробно протокол для дифференциации hiPSC полученных T линейных клеток в функциональных антиген-специфических CD8 "- один положительный (SP) Т-клеток с использованием OP9/DLL1 совместной культуры системы. Этот метод является мощным инструментом для дифференциации клеток in vitro T hiPSCs, гематопоиетических прародителей и эмбриональных стволовых клеток, а также их дальнейшего применения в регенеративной медицине и клеточной терапии.
Protocol
1. Культивирование iPSCs человека (hiPSCs) на мыши эмбриональных фибробластов (MEF)
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные методы культивирования hiPSCs также могут быть использованы, в том числе, но не ограничиваясь: посев на 6 хорошо пластины предварительно покрыты желатина, желатиновой белковой смеси, рекомбинантный ламинин 511, или любой другой внеклеточной матрицы, используемой в расширении hiPSC, и культивируется с использованием определенных средств массовой информации, специально разработанных для человеческой плюрипотентной культуры стволовых клеток.
-
Культирование MEF
- Пальто 10 см клеточной культуры Петри блюдо с 4 мл 0,1% желатина и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию.
- Оттепель флакон 4 х 106 облученных MEF быстро в 10 мл 37 КС MEF средств массовой информации (DMEM 10% FBS 1x пенициллин-стрептомицин 1x L-глутамамин дополнения). Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Приготовьте супернатант и отдохните клеточные гранулы в 9 мл средств массовой информации MEF.
- Удалите блюдо с желатином из инкубатора. Аспирировать желатин и добавить 7 мл MEF средств массовой информации. Плита 3 мл подвески MEF (от шага 1.1.2) на блюдо с покрытием с желатином. Рок блюдо из стороны в сторону и спереди к спине, чтобы обеспечить равномерное распределение MEF над блюдом. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию 8-36 ч.
-
Passaging hiPSC на MEF
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были получены с помощью MART-1 iPSC, полученных из долгосрочной культивированной меланомы TIL, которые конкретно признают пептид MART-1 в контексте HLA-A-02:01, как ранее описано18.- Проходные HIPSCs, когда колонии между 0,8 - 1,2 мм в диаметре. Перед прохождением, проверить hiPSC колоний в стерео-микроскоп и удалить любые области дифференциации от культуры, используя пластиковый край 200 л наконечника.
- Аспират провел средства массовой информации и добавить 10 мл hiPSC средств массовой информации (человеческие ES культуры средств массовой информации -Таблица материалов- 10 нг /мЛ человека основной фактор роста фибробластов »hbFGF» дополняется 10 мкм ROCK ингибитор.
- Держите блюдо культуры клеток в одной руке и рулон одноразовые ячейки проходной инструмент через все блюдо в одном направлении. Примените достаточное давление, чтобы весь роликовое лезвие касался блюда культуры и поддерживалединое давление во время подвижного действия.
- Поверните блюдо культуры 90 "и повторите шаг 1.2.3. Просмотр пластины в микроскоп, чтобы визуально подтвердить правильную резку колоний, которые должны появиться клетчатые. Отсоединить колонии нежной механической промывкой с помощью пипетки 200 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсоединение разрезающих колоний механической промывкой должно быть сделано сразу после разрезания колоний роликом, так как через 3 мин разрезанные колонии начнут прикрепляться к блюду, и затрудниться отсоединение колоний однородного размера путем промывки. - Передача 350 - 600 скоплений разрезанных колоний на новое 10-сантиметровое блюдо MEF (поплавок 8 - 36 ч до прохождения hiPSC) с 10 мл свежих средств hiPSC дополнены 10 мкм ингибитором ROCK. Инкубировать при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: 600 сгустков представляет собой приблизительно 1,0 х 106 MART-1 iPSC и даст 0,5-1,0 х 106 DP-клеток на 35-й день. Тем не менее, ожидаемые цифры будут варьироваться в зависимости от потенции стартовой линии ячейки и условий культуры. - На следующий день, аспират провел сми и добавить 10 мл свежих средств hiPSC. Изменение HIPSC сми каждые 1-2 дней в зависимости от скорости роста hiPSC.
2. Подготовка клеток OP9/DLL1 для совместной культуры с hiPSCs
- Культурные клетки OP9/DLL1 в медиа-предплечьях OP9 ( минимальная необходимая среда (з-МЭМ) - 20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) - 1x пенициллин-стрептомицин при 37 градусах Цельсия. Когда op9/DLL1 клетки достигают выпуклости, аспирируют носители и моют один раз с 5 мл 1x магния, кальция и фенола, свободного от фосфата буферного солильного (PBS).
- Аспирировать PBS и добавить 2 мл 0,05% Трипсин-EDTA. Инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах По Цельсию. Затем добавьте 4 мл носителя OP9 и механически разъединяйте клеточный слой, прокладывая трубку, чтобы сделать одноклеточную подвеску.
- Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 50 мл через ситечко 100 мкм, чтобы избежать клеточных сгустков. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Приготовьте супернатант и отдохните в 12 мл средств массовой информации OP9.
- Добавьте 8 мл средств массовой информации OP9 к каждому из шести новых 10 см клеточной культуры Петри блюд. Плита 2 мл op9/DLL1 клеточная подвеска от шага 2.3 на каждой новой тарелке 10 см. Рок блюдо из стороны в сторону, то спереди к спине, чтобы обеспечить равномерное распределение OP9/DLL1 над блюдом.
- Инкубировать при 37 градусах Цельсия. Повторяйте проход каждые 2 - 3 дня, когда клетки достигают выпуклости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно делать достаточно замороженных запасов клеток OP9/DLL1 и размораживать новый запас каждые 4-6 недель.
3. В Vitro Дифференциация hiPSCs в CD8 "- Одиночный положительный (SP) T-клетки
- Приготовьте желатинированные блюда OP9/DLL1 за неделю до совместной культуры с hiPSCs. Для приготовления 0,1% желатина раствора добавьте 5 мл комнатного раствора (RT) тканевого запаса до 500 мл PBS.
- Пальто 3 новых 10 см клеточной культуры Петри блюда, добавив 4 мл на блюдо 0,1% желатина. Инкубировать 30 мин при 37 градусах По Цельсию.
- Аспирировать желатин и добавить 8 мл OP9 средств массовой информации к каждому блюду. Прохождение одного сольнца блюдо OP9/DLL1 (как это делается в разделе 2 выше) до трех желатин предварительно покрытием блюд.
- После 4 дней, добавить 10 мл OP9 средств массовой информации на каждый 10 см блюдо OP9/DLL1 на желатин, в общей сложности 20 мл средств массовой информации на блюдо.
- После 7 - 8 дней, начать hiPSC совместной культуры на OP9/DLL1 конфлюентные блюда (дифференциация день 0).
- Аспират провел средства массовой информации из слияния 10 см блюдо hiPSCs на MEF. Добавьте 10 мл носителей OP9. Вырезать и отделить hiPSC колоний с помощью одноразового инструмента пропуска ячеек, как это делается в шагах 1.2.3 и 1.2.4.
- Передача 350 - 600 скоплений срезанных колоний на 10 см предварительно желатинизированной антенны OP9/DLL1 (шаг 3.1) с 10 мл свежих носителей OP9 с использованием пипетки 200 л. Рок культуры блюдо из стороны в сторону, то спереди к спине, чтобы обеспечить равномерное распределение колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, предварительно сформированные hiPSC эмбриональных органов (EBs) или небольшой суспензии может быть использован. Тем не менее, использование одноразового инструмента пропуска ячеек или системы формирования EB предпочтительнее производить сгустки hiPSC равномерного размера.
- На 1 день, аспират провел сми и заменить 20 мл свежих средств OP9. hiPSC скопления совместно культурные на OP9/DLL1 в течение 1 дня появится как небольшие круглые монослойные колонии(рисунок 1).
- На 5-й день, аспир 10 мл отработанных средств массовой информации и добавить 10 мл свежих средств массовой информации OP9. колонии hiPSC начнут дифференцироваться в примитивный мезодерм, который характеризуется многослойным темным центром.
- На 9-й день, аспир 10 мл отработанных средств массовой информации и добавить 10 мл свежих средств массовой информации OP9. В этот момент многослойные центральные структуры превратятся в куполообразные формы, и периферийная сетевая область начнет проявляться.
- На 13-й день собирают гематопоиетические клетки-прародители (ГЭС) (рисунок 1). hiPSC-производные структуры на день 13 характеризуются темным центральным органоидомом, окруженным сетью куполообразных областей, представительница гематопоиетических зон (ГЗ), ранее сообщалось, чтобы приложить человеческие эмбриональные стволовые клетки полученных гематопоитических протеже 21.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие куполообразных структур указывает на успешный процесс даже при отсутствии темных центров. Неспособность производить HPCs может быть связано с низким качеством OP9/DLL1, качество множества FBS, выпуклость iPSC сгустки посеяны на OP9/DLL1 (350-600 сгустков является оптимальным), и / или изменения в потенции линий iPSC для производства гематопоитических прекурсоров.- Аспират провел средства массовой информации и мыть 1x с 5 мл 1x фенол без красного цвета Хэнкс 'сбалансированный солевой раствор изменен с кальцием и магнием (HBSS).
- Аспирировать HBSS и добавить 250 л 5000 единиц / мл коллагеназы IV в 10 мл HBSS. Инкубировать при 37 градусах По области в течение 45 мин. Аспир HBSS с коллагеназой IV и мыть один раз с 5 мл PBS.
- Аспирировать PBS и добавить 5 мл 0,25% Трипсин-EDTA. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 мин. Затем добавьте 4 мл носителей OP9 и разъедините клеточный слой, протянив трубку, чтобы сделать одноклеточную подвеску.
- Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 50 мл через 100 мкм-ситечко. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Приготовьте супернатант и отдохните в 10 мл средств массовой информации OP9.
- Суспензия клеток плиты на новую желатинизированную 10-сантиметровую клеточную культуру петри блюдо (см. шаги 3.1.1 и 3.1.2). Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 45 мин. Затем соберите неприсоединения клеток нежным пипеттингом.
- Передача собранной подвески клеток в коническую трубку 50 мл через 100 мкм-ситечко. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Аспирация супернатанта и resuspend в 10 мл дифференциации средств массовой информации (OP9 СМИ с 5 нг /мл человека фактор стволовых клеток (hSCF), 5 нг/мл человека Flt3 лиганд (hFLT3L), и 5 нг/мл человека интерлейкин 7 (hIL-7)».
- Плита клеточной подвески на новый 10 см OP9/DLL1 конфлюента блюдо.
- На 16-й день проходите камеры.
- Механически отсоединить неприсоединения клеток нежным pipetting и фильтр через 100 мкм ячейки ситечко. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Призадыхать супернатант и resuspend в 10 мл дифференциации средств массовой информации.
- Плита клеточной подвески на новый 10 см OP9/DLL1 конфлюента блюдо.
- Продолжайте пропускать неприсоединения клетки каждые 5-7 дней после этого, повторяя шаг 3.8.
- На 35-й день обогащайте CD4иCD8- двойное положительное (DP) популяцию и стимулируйте производить CD8"
- Механически отсоединить неприсоединения клеток нежным pipetting и фильтр через 100 мкм ячейки ситечко для удаления клеточных сгустков. Обогащать CD4- популяцию клеток CD4 магнитной бисоизоляцией в соответствии с протоколом производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обоснование использования CD4 магнитных бусин оков заключается в удалении CD4-CD8- DN-клеток из культуры, так как они были продемонстрированы, чтобы вызвать прямое убийство CD4иCD8dP клеток после стимуляции22. - Подсчитайте живые обогащенные клетки CD4 с помощью гемоситометра Нойбауэра и синего красителя Трипан. Приостановка в OP9 сми при общей концентрации 0,5 х 106 ячеек/мл. Aliquot 1 мл клеточной подвески (0,5 х 106 клеток) в каждый колодец культуры ткани плоский нижний 24 хорошо пластины сливаopных OP9/DLL1.
- Добавьте 100 МЕ человеческого интерлейкина 2 (hIL-2), 5 нг/мЛ hIL-7, 500 нг/мл антитела CD3, и 2 мкг/мл антитела CD28, затем культура при 37 градусах Цельсия.
- На 4 - 7 день после стимуляции, собирать клетки для молекулярного анализа(Рисунок 3) или совместной культуры с пептид-пульсированный антиген представляя клетки (APCs).
- Механически отсоединить неприсоединения клеток нежным pipetting и фильтр через 100 мкм ячейки ситечко для удаления клеточных сгустков. Обогащать CD4- популяцию клеток CD4 магнитной бисоизоляцией в соответствии с протоколом производителя.
4. Измерение антигена Специфика hiPSC Производные CD8"
ПРИМЕЧАНИЕ: Тип БТР, которые будут использоваться для этого experiement зависит от ограничения MHC hiPSC полученных Т-клеток. Здесь используется линия клеток Т2, которая представляет собой гибрид лимфобластоидных линий Т и В. T2 клетки выражают HLA-A'02:0123, который распознается JKF6 ячеек, из которых MART1-iPSC был получен18. Эта линия клеток T2 может быть расширена в RPMI 1640 и 20% FBS и 1x пенициллин-стрептомицин и проходит, когда клетки достигают плотности 5 х 105 клеток / мл.
- Подсчитайте живые HLA-A-02:01- T-B гибридные лимфобластоиды T2 клетки с помощью гемоситометра Нойбауэра и трипан овского синего красителя. Инкубировать БТР в 24 хорошо ткани культуры пластины с 1 мкг /мл МАРТ-1 пептид для 2 ч при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация пептида является переменной, в зависимости от клеточной линии и антигена специфичности. - Соберите БТР и мыть 2x с 10 мл PBS, чтобы удалить любой дополнительный пептид.
- Подсчитайте БТР и приостановить на 2 - 5 х 105 ячеек / мл в OP9 СМИ с 100 МЕ Ил-2 и 5 нг / мл Ил-7. Aliquot 100 л клеточной подвески (2-5 х 104 ячейки) в каждый колодец ультра-низкой крепления U нижней пластины 96 хорошо или непосредственно в предварительно покрытой пластины ELISpot.
- Сортировать hiPSC полученных CD8"- SP Т-клеток (1 неделя после анти-человеческой стимуляции CD3/CD28 антитела) с помощью сортировки клеток и приостановить на 1 х 106 ячеек/ мл в OP9 средств массовой информации с 100 МЕ IL-2 и 5 нг /мл IL-7. Aliquot 100 л клеточной суспензии (1 х 105 ячеек) в каждую скважину БТР и культуры для 16 - 20 ч при 37 градусах Цельсия.
- После 16 - 20 ч, проанализировать профиль секреции цитокинов по АНАЛИЗу ELISpot в протоколе производителя(рисунок 4).
Representative Results
После 13 дней hiPSCs со-культивирования с OP9/DLL1, CD34cd43й гематопоитетические клетки-предродителя появились (Рисунок 1). После дополнительных 22 дней культуры на не-желатинизированных OP9/DLL1 в присутствии hSCF, hFLT3L, и hIL-7, гематопоиетическиепрародители дифференцированы вCD3 большинство из которых выразили TCR специфичны для ЭПитопа MART-1 (тетрамер)(рисунок 2).
Ранее было показано, что CD8и SP Т-клетки могут быть индуцированы из CD4иCD8DP T-клеток TCR сигнализации через агонист пептид или антитела инициативе TCR стимуляции24,25. Таким образом, на 35-й день культуры, hiPSC-производные CD4иD8DP T-клетки были стимулированы с анти-человеческих CD3 и антител CD28 в присутствии hIL-7 и hIL-2. Через четыре дня после стимуляции, количество CD3иCD8 "SP-клеток резко увеличилось и оставалось специфическим для ЭПитопа MART-1, подтверждая сохранение их унаследованной антиген-специфическости (Рисунок 3).
Для определения функциональных свойств хиПС-производных CD8 'SP T-клеток, антиген-зависимой активации и секреции интерферона гамма (IFN-я) был проанализирован. После стимуляции античеловеческими CD3 и антителами CD28 в течение 1 недели, HIPSC-производные CD8» - SP T-клетки были выделены с помощью сортировки клеток и совместно культивированы с линией т2 клеток, выражающей HLA-A:01 с или без cognate MART1 пептид для 16 - 20 h. Проверка ELISpot показала, что hiPSC-производные CD8 »- SP T-клетки выделяют более высокое количество IFN-я по сравнению с CD8 »и SP T-клеток, когда культивируется в присутствии ПЕПтида MART-1. Выражение IFN-я было недействительным для Т-клеток и АПК в одиночку, демонстрируя, что человеческие Т-iPSC полученных Т-клеток антиген-специфических и функциональных (Рисунок 4).
Рисунок 1: Поколение клеток гематопоитического прародителя, полученных из hiPSC. (A) Схематический обзор дифференциации hiPSCs к гематопоитической линии с использованием OP9/DLL1 совместной культуры. (B) Появление hiPSC-производных структур на днях 1 (вверху слева), 3 (вверху справа), 7 (внизу слева) и 13 (внизу справа). Шкала баров 100 мкм. (C) Поток цитометрического анализа hiPSC полученных CD34cd43й гематопоитетические клетки-прародители на день 13. Данные представляют шесть независимых экспериментов (n no 1 к 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: дифференциация hiPSC в Mart1 и CD4,CD8 " (A) Схематический обзор дифференциации hiPSC полученных гематопоитической линии на незрелые Т-клетки с использованием OP9/DLL1 совместной культуры. (B) Поток цитометрического анализа CD4 против CD8 ", CD3 против CD8" и MART-1 тетрамер выражение в hiPSC полученных Т-клеток на 35-й день. Закрытые на лимфоциты, одиночные клетки, PI отрицательный. Данные являются репрезентативными из трех независимых экспериментов (n No 3 - 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Индукция CD8 "- ФЕнотип Т-клеток SP. Поток цитометрического анализа CD4- HiPSC полученных Т-клеток через 4 дня после человека анти-CD3 и человека анти-CD28 антитела инициативе стимуляции. Закрытые на лимфоциты, одиночные клетки, ИП отрицательные (n No 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Антигенная специфичность hiPSC-производных CD8 »- SP Т-клеток. IFN-я секреция ELISpot ассси hiPSC-производных CD8" SP, CD8" SP, и объемНые Т-клетки после 20 ч совместной культуры с или без T2 клеток импульсных (или нет) с MART-1 пептид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Сокультура стромальных клеток OP9 murine является хорошо отлаженной системой для производства лимфоцитов in vitro (т.е., НК, В и Т)) из HSPCs и плюрипотентных стволовых клеток. Notch сигнализации требуется, чтобы вызвать T линии обязательств и может быть достигнуто эктопическим выражением Notch ligand DLL1 или DLL4, которые имеют сопоставимую эффективность для Т-клеток поколения1. Таким образом, система сокультуры OP9/DLL1 стала широко используемым методом производства Т-клеток in vitro. Кроме того, этот метод применим для использования с несколькими типами и источниками человеческих клеток, включая пуповинную кровь, ГСКИ костного мозга и ESCs. Однако генерация Т-клеток из этих источников ограничена либо недостаточным извлечением исходных клеток, либо неэффективной дифференциацией на Т-клетки1. Кроме того, продукт Т-клеток с одной рекомбинацией TCR не может быть создан из этих открытых источников репертуара. С помощью методов регенеративной медицины, а именно индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) технологии, это может быть возможно производить огромное количество антиген-специфических Т-клеток для использования в клеточной основе терапии15.
hiPSCs похожи на плюрипотентных ESCs в их способности к самообновлению, безграничное расширение, и потенциал, чтобы дифференцировать к любому типу соматических клеток в организме; однако, они не имеют этических проблем, связанных с использованием продуктов эмбрионального происхождения для клинического применения. Кроме того, HIPSCs может быть произведенизна из любой соматической клетки, что позволяет развитие клеточных продуктов для персонализированной медицины. В предыдущих докладах, HIPSCs были произведены из человеческих Т-клеток с использованием целых периферических моноядерных клеток, CD3и клеток, или изолированных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLs) в качестве источника18,19,22, 26. Когда hiPSCs генерируются из источника Т-клеток (T-iPSCs), первоначальная перестановка гена TCR наследуется. Таким образом, пациент T-iPSC полученных Т-клеток может обеспечить модель для персонализированного лечения ACT, ориентируясь на пациента различных антигенов рака.
Дифференциация человеческих плюрипотентных стволовых клеток в Т-линии клеток делится на два этапа: генерация гематопоиетических клеток-прародителей (HPCs)27 и их дальнейшая дифференциация на Т линейные клетки21. Оба шага могут быть выполнены с помощью системы совместной культуры OP9/DLL1. Важно отметить, что качество клеток-кормушек OP9/DLL1 имеет решающее значение для успеха дифференциации Т-клеток. Поскольку клетки OP9/DLL1 не являются увековеченной однородной клеточной линией, качество FBS и культурных условий имеют решающее значение для поддержания их расширения, не теряя при этом возможности поддерживать дифференциацию hiPSC. Поэтому рекомендуется предварительно оценить много FBS и проход последовательно, когда клетка к клетке цитоплазматический контакт начинает происходить, в целях предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Один момент, чтобы принять во внимание то, что контакт между клетками может показаться неотличимым от фона в зависимости от фазы контраста и увеличения микроскопа. По нашему опыту, большинство блюд OP9/DLL1 будет казаться 80% сливовыми, когда они готовы к прохождению.
Было показано, что редифференцированные T линейные клетки, генерируемые из T-iPSCs OP9/DLL1 совместной культуры может производить CD8и SP Т-клеток при стимуляции18,19. Тем не менее, регенерированные CD8и SP Т-клетки приобретают врожденный, как CD8 "гомодимер22,28, который является неэффективным со-рецептором для TCR сигнализации29. Кроме того, эти регенерированные CD8и SP Т-клетки показали сильную TCR-независимую цитотоксичность, что делает эти клетки неблагоприятными для клинического использования30. Этот протокол описывает недавний метод, включающий стимуляцию очищенного CD4иCD8- DP-клеток для генерации CD8 "- SP T-клеток с более обычным фенотипом и улучшенной антиген-специфической цитотоксичность22. Несмотря на то, что потеря специфичности антигена из-за вторичной tCR' аллеличная перестановка происходит на стадии DP после длительной долгосрочной культуры, это может быть преодолено путем редактирования генома в T-iPSCs31. По нашему опыту, hiPSC-полученных DP-клеток начинают появляться на 30 - 35 день культуры, и эти вновь созданные dP-клетки еще не претерпели вторичной перестановки TCR. Таким образом, большинство клеток ДП на 35-й день сохраняют специфичность антигена и могут быть использованы для генерации антигена-специфических CD8 '- SP T-клеток.
До человека анти-CD3 и анти-CD28 стимуляции на 35 день, CD4-CD8- DN клетки должны быть удалены из культуры, так как они были продемонстрированы, чтобы вызвать прямое убийство CD4CD8и DP клеток после стимуляции22. Использование CD4 магнитного обогащения бисера (шаг 3.10) обогатит как для DP и CD4CD8- промежуточные одноположительные (ISP) клетки1, которые мы, как было показано, не имеют негативных последствий22. Кроме того, флуоресцентная сортировка клеток по цитометрии потока может быть выполнена для изоляции клеток ДП. Тем не менее, магнитное разделение биса является предпочтительным, как это позволяет избежать механического стресса, вызванного цитометрии потока.
Поколение CD8'- SP Т-клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток без активации опосредования агонист выбор впоследствии было продемонстрировано с помощью 3D мурина стромальной культуры32. Однако физиологический положительный отбор зависит от взаимодействия TCR с комплексами самопептид-МХК, которые однозначно обрабатываются и представлены тимическими корковых эпителиальных клетками33. Кроме того, было показано, что сродство TCR к отбору пептидов определяет последующие функциональные возможности зрелых CD8 »- SP T-клеток34. В настоящее время нет никаких доказательств того, что Notch stromal клеточной системы со-культуры может обеспечить определенный отбор пептид и MHC комплекс, необходимый для физиологического положительного отбора.
Ранее сообщалось в модели murine, что T линии клеток, генерируемых из опухолевых антигенов конкретных Т-клеток полученных hiPSCs с использованием OP9/DLL1 только не испытывают обычного созревания. Тем не менее, iPSC-полученных незрелых Т-клеток, генерируемых системой OP9/DLL1 может созреть в наивные Т-клетки путем дальнейшего физиологического тимического образования в системе 3D культуры 28,35. Таким образом, протокол, представленный здесь для производства iPSC полученных незрелых Т-клеток, генерируемых системой OP9/DLL1 имеет жизненно важное значение для дальнейших попыток создания реальных человеческих опухолевых антигенов конкретных пост-тимических Т-клеток, способных долгосрочной настойчивости в vivo с эффективность лечения устоявшихся васкуляризированных опухолей.
Disclosures
Авторы не раскрытии информации.
Acknowledgments
Мы благодарим Алана Б. Хуфринга и Эрину Х. Он за графическую помощь. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы Национального института рака (ЗИА BC010763) и интрамуральной NCI рака Moonshot инициативы для клеточной иммунотерапии рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
| Anti-CD3, human | BD Biosciences | Cat# 561812, RRID:AB_1089628 | |
| Anti-CD34, human | BD Biosciences | Cat# 348791, RRID:AB_400381 | |
| Anti-CD4, human | Biolegend | Cat# 344612, RRID:AB_2028479 | |
| Anti-CD43, human | BD Biosciences | Cat# 560198, RRID:AB_1645460 | |
| Anti-CD7, human | BD Biosciences | Cat# 555361, RRID:AB_395764 | |
| Anti-CD8a, human | BD Biosciences | Cat# 555369, RRID:AB_398595 | |
| Anti-CD8b, human | BD Biosciences | Cat# 641057, RRID:AB_1645747 | |
| Anti-TCRb, human | BD Biosciences | Cat# 555548, RRID:AB_395932 | |
| CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-375 | |
| CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-387 | |
| CD4 Microbeads, human | Miltenyl Biotec | 130-045-101 | |
| Cell strainer 100 um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
| Gelatin Solution 2% | SIGMA-Aldritch | G1393-100ML | |
| GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine supplement |
| HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free | Gibco | 14025-092 | |
| Interleukin-2 | R&D Systems | 202-IL | |
| Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV | MBL | Cat#TB-0009-2 | |
| Mart1-hiPSC | Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 | RIKEN-IMS | |
| Melan-A, MART 1 (26-35) | InnoPep | 3146-0100 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| αMEM powder | Gibco | 61100061 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Thermo Fisher Scientific | C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | OP9/DLL1 |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | Human ESC Culture Media |
| Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) | Tocris | 1254 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
| StemPro | EZPassage | 23181-010 | |
| T2-tumor | ATCC | T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| U Bottom 96 well plate | Corning, Inc. | 3799 |
References
- Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est. Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).
- Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
- Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Crompton, J. G., et al. Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape. Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).
- Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Silencing stemness in T cell differentiation. Science. 359 (6372), 163-164 (2018).
- Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation. Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).
- Vodnala, S. K., et al. T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism. Science. 363 (6434), (2019).
- Restifo, N. P., Gattinoni, L. Lineage relationship of effector and memory T cells. Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).
- Tran, E., et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 344 (6184), 641-645 (2014).
- Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
- Gautam, S., et al. The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity. Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).
- Klebanoff, C. A., et al. Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice. Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).
- Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
- Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
- Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. Memoirs of a reincarnated T cell. Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lo, W., et al. Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer. Cancer Immunology Research. , (2019).
- Timmermans, F., et al. Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).
- Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
- Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids. Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).
- Snauwaert, S., et al. In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection. Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).
- Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC. Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 23, Unit 23, 26 (2007).
- Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
- McNicol, A. M., et al. CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR. European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).
- Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy. Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).
- Minagawa, A., et al. Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy. Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).
- Montel-Hagen, A., et al. Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).
- Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
- Takada, K., et al. TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells. Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).
- Vizcardo, R., et al. A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants. JoVE. , https://www.jove.com/video/58672/a-three-dimensional-thymic-culture-system-to-generate-murine-induced e58672 (2019).
