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Biology

समय-चूक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड्स की विशिष्ट लेबलिंग

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/60003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

Summary

प्रोटोकॉल में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए जेल दाग के साथ माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की विशिष्ट लेबलिंग, सुपर-रिज़ॉल्यूशन संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसआर-सिम) द्वारा लाइव लेबल कोशिकाओं की समय चूक श्रृंखला का अधिग्रहण, और न्यूक्लियोइड मोशन की स्वचालित ट्रैकिंग का वर्णन किया गया है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड प्रोटीन से लेपित माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अणुओं द्वारा गठित कॉम्पैक्ट कण हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए टीआरएनए, आरएनआरए और कई आवश्यक माइटोकॉन्ड्रियल पॉलीपेप्टाइड्स को एन्कोड करता है। माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड डायनेमिक माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के भीतर विभाजित और वितरित करते हैं जो विखंडन/संलयन और अन्य रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरता है । हाई रेजोल्यूशन लाइव फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एक न्यूक्लॉयड की स्थिति और गति की विशेषता के लिए एक सीधी तकनीक है। इस तकनीक के लिए, न्यूक्लियोइड को आमतौर पर उनके प्रोटीन घटकों के फ्लोरोसेंट टैग के माध्यम से लेबल किया जाता है, अर्थात् प्रतिलेखन कारक एक (TFAM)। हालांकि, इस रणनीति को फ्लोरोसेंट प्रोटीन-टैग किए गए निर्माण की अतिअभिव्यक्ति की आवश्यकता है, जो कलाकृतियों (टीएफएएम के लिए रिपोर्ट) का कारण बन सकता है, और कई मामलों में संभव नहीं है। ऑर्गेनिक डीएनए बाइंडिंग रंगों से ये नुकसान नहीं होते। हालांकि, वे हमेशा परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएना दोनों का धुंधला दिखाते हैं, इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ्स की विशिष्टता की कमी होती है। इस तरह के रंगों के भौतिक-रासायनिक गुणों को ध्यान में रखते हुए, हमने एक न्यूक्लिक एसिड जेल दाग (एसवाईबीआर गोल्ड) का चयन किया और लाइव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की तरजीही लेबलिंग हासिल की। रंग के गुण, विशेष रूप से डीएनए के लिए बाध्यकारी पर इसकी उच्च चमक, सुपर-रिज़ॉल्यूशन संरचित रोशनी छवियों की समय श्रृंखला का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड मोशन के बाद की मात्रा की अनुमति देते हैं।

Introduction

परिपत्र 16.5 केबीपी डीएनए अणु माइटोकॉन्ड्रिया की आनुवंशिक सामग्री, 22 टीआरएनए, 2 आरएनआरए और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन परिसरों के लिए आवश्यक 13 पॉलीपेप्टाइड का गठन करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए (टीएफएएम) और कई अन्य प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लॉइड1,,2,,3,,4बनाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ्स मूव और माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क5के घटकों के बीच पुनर्वितरितहोता है,6 इसके रूपात्मक रीमॉडलिंग, विखंडन या संलयन के दौरान सेल चक्र चरण, तनाव और अन्य कारकों के आधार पर (पर्नास एट अल7में समीक्षा की गई)। इसके अलावा माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड्स की गति को सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेटोस डिजीज8 में फंसाया जाता है और यह अन्य बीमारियों में भूमिका निभा सकता है । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ऑर्गेनेल्स के लाइव-सेल अध्ययन के लिए एक सीधी तकनीक है, लेकिन तकनीक में >200 एनएम का एक संकल्प है, जो माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लिकॉइड (~ 100 एनएम9,,10,,11,,12)के आकार से बड़ा है। इस सीमा को तथाकथित "सुपर-रिज़ॉल्यूशन" तकनीकों द्वारा दरकिनार किया गया है, जैसे उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) और एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम)13,,14। अब तक, माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ्स और अन्य डीएना को सीधे स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (DSTORM)15द्वारा लाइव कोशिकाओं में चित्रित किया गया था। एमटीडीएनए से संबंधित पदों के साथ ठीक उप-माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाएं लाइव कोशिकाओं16में एसटीईडी द्वारा देखी गईं। हालांकि, इन सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों को उच्च रोशनी तीव्रता की आवश्यकता होती है, जो जीवित कोशिकाओं17पर फोटोटॉक्सिक प्रभाव का कारण बनती है। इसलिए, विवर्तन सीमा से परे संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की समय चूक इमेजिंग चुनौतीपूर्ण है। इसके समाधान के लिए हमने सुपर-रेजोल्यूशन स्ट्रक्चर्ड रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसआर-सिम)18का इस्तेमाल किया । सिम एसटीईडी और एसएमएलएम19की तुलना में एक बहुत कम रोशनी पावर डोज की आवश्यकता है . इसके अलावा, एसटीईडी और एसएमएलएम तकनीकों के विपरीत, सिम सीधे बहुरंगी त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग की अनुमति देता है, और इसमें फ्लोरोफोरस या इमेजिंग बफर संरचना19के विशेष फोटोभौतिक गुणों की आवश्यकता नहीं होती है।

लाइव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड लेबलिंग के लिए पारंपरिक रणनीतिटीएफएमएएम 20जैसे माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोड प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग है। हालांकि, कई मामलों में, यह रणनीति उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग टीएफएएम की अतिअभिव्यक्ति एक गंभीर विरूपण साक्ष्य21पैदा करती है। कार्बनिक रंगों के साथ डीएनए की लेबलिंग एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) आधारित रणनीति पर फायदे हैं । कार्बनिक रंग एफपी टैगिंग से संबंधित विवशों से मुक्त हैं: उनका उपयोग किसी भी प्रकार की कोशिकाओं या ऊतकों के लिए किया जा सकता है और किसी प्रयोग के किसी भी समय बीपर किया जा सकता है। मिटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड्स की लाइव सेल इमेजिंग की रिपोर्ट कई डीएनए-बाध्यकारी रंगों के साथ दी गई है: DAPI22,SYBR ग्रीन23,Vybrant DyeCycle24,और picoGreen15,,25,,26। न्यूक्लियोइड लेबलिंग के लिए सबसे डीएनए बाध्यकारी रंगों की एक पर्याप्त खामी यह है कि वे सेल के भीतर सभी डीएनए दाग । पूरी तरह से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के लिए एक रंग को लक्षित करना अत्यधिक वांछनीय है। इसे प्राप्त करने के लिए, उपयुक्त भौतिक-रासायनिक गुणों वाले एक डाया का सावधानीपूर्वक चयन आवश्यक है। लिपोफिलिक रंगों में स्थानीयकृत सकारात्मक आवेश, जैसे रोडामिन 123, लाइव माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होने के लिए जाना जाता है, जो उनकी नकारात्मक झिल्ली क्षमता को संरक्षित करता है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की विशिष्ट लेबलिंग के लिए एक आदर्श रंग डीएनए को उच्च आत्मीयता के साथ बांधना चाहिए और डीएनए बाध्यकारी पर उज्ज्वल फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करना चाहिए। इन आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए, कुछ साइनिन आशाजनक हैं (उदाहरण के लिए, पिकोग्रीन), लेकिन परमाणु डीएनए इन रंगों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए15,,25,,26के साथ बहुतायत से दाग दिया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में एक और साइनिन डाये, एसवाईबीआर गोल्ड (एसजी) के साथ लाइव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की विशिष्ट लेबलिंग और समय चूक सुपर-रेजोल्यूशन सिम वीडियो में नाभिककी की ट्रैकिंग का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, एसजी-दाग लाइव कोशिकाओं को किसी भी प्रकार के उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (कॉन्फोकल, कताई डिस्क, एपिफ्लोरसेंस, आदि) द्वारा चित्रित किया जा सकता है जो जीवित कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है और 488 एनएम प्रकाश स्रोत से लैस है।

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Protocol

नोट: यहां उल्लिखित सभी सेल लाइनों को उच्च ग्लूकोज ड्यूल्बेकको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), ग्लूटामाइन, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और पायरुवेट के साथ पूरक किया गया था । लेबलिंग और इमेजिंग के दिन इस्तेमाल किए जाने वाले सभी मीडिया और सप्लीमेंट्स को इनक्यूबेटर सेट में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके 5% सीओ2तक पहुंचाएं । लेबलिंग सहित सभी सेल संस्कृति कार्य एक लैमिनार प्रवाह हुड के तहत बाँझ परिस्थितियों में होता है।

1. लाइव सेल लेबलिंग

  1. लेबलिंग प्रक्रिया से एक दिन पहले, संस्कृति 4 x 105 वाघेला कोशिकाओं में मध्यम के 2 मिलीएल में एक ३५ मिमी पेट्री डिश में #1.५ ग्लास नीचे के साथ । मल्टी-वेल चैम्बर स्लाइड का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन वॉल्यूम को अच्छी तरह से की मात्रा के अनुपात में समायोजित किया जाना चाहिए। सेल निलंबन को पतला करें लगभग ५०,००० कोशिकाओं/mL और बीज 2 mL सेल निलंबन के एक ३५ मिमी पेट्री डिश में है ।
  2. SYBR गोल्ड (एसजी) वाणिज्यिक स्टॉक समाधान के निम्नलिखित कमजोर: 1:5,000 तैयार करें। फिनॉल रेड-फ्री कल्चर मीडियम में माइटोट्रैकर डीप रेड (सुदूर लाल दाग) या माइटोट्रैकर सीएमएक्सरोस रेड (लाल दाग)(सामग्री की तालिका;वाणिज्यिक स्टॉक पतला 1:2,000) तैयार करें। एसजी के लिए पिकोग्रीन के समान सेट कमजोरिशों को तैयार करें।
    नोट: स्टेप 1.2 में वर्णित समाधान 2x लेबलिंग समाधान हैं। जितना संभव हो प्रकाश से फ्लोरोसेंट रंगों वाले सभी समाधानों की रक्षा करें।
  3. एक बार 2 एमएल पीबीएस के साथ अनुयायी कोशिकाओं को धो लें। 35 एमएम पेट्री डिश में 1 एमएल फिनॉल रेड-फ्री कल्चर मीडियम डालें। 8-अच्छी तरह से कक्षित स्लाइड के लिए, कुल अच्छी क्षमता के 1/2 के बराबर मात्रा का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, यदि कुल अच्छी क्षमता 250 माइक्रोन है तो 125 माइक्रोन जोड़ें)।
  4. स्टेप 1.2 से 35 एमएम पेट्री डिश में तैयार 2एक्स लेबलिंग सॉल्यूशन में 1 mL जोड़ें। एक 8 अच्छी तरह से कक्षित स्लाइड के लिए, कुल अच्छी क्षमता के 1/2 के बराबर एक मात्रा का उपयोग करें । 30 मिन के लिए कोशिकाओं को 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।
    नोट: एसजी लेबलिंग समाधान के साथ कोशिकाओं को 1 घंटे से अधिक समय तक इनक्यूबेट न करें, क्योंकि अब इनक्यूबेशन परमाणु डीएनए की लेबलिंग का कारण बनेगी।
  5. फ्लोरोसेंट रंगों वाले माध्यम को ध्यान से एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो एंटे करें।
  6. फिनॉल रेड-फ्री सेल कल्चर मीडियम डालें और इमेजिंग तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को अंधेरे में रखें।
  7. एक एसआर-सिम माइक्रोस्कोप पर छवि रहने वाली कोशिकाएं जो इनक्यूबेशन इकाई से लैस हैं (नीचे देखें)।

2. एसआर-सिम छवि अधिग्रहण

  1. माइक्रोस्कोप स्टेज पर स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर स्थापित करें। वांछित तापमान और सीओ2 एकाग्रता (जैसे, 37 डिग्री सेल्सियस और स्तनधारी कोशिकाओं के लिए 5%) सेट करें और छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए गर्म रखें।
  2. लेजर सहित एसआर-सिम माइक्रोस्कोप के सभी घटकों पर स्विच करें, और उन्हें कम से कम 1 घंटे के लिए गर्म करने के लिए छोड़ दें।
  3. माइक्रोस्कोप निर्माता द्वारा एसआर-सिम के लिए अनुशंसित एक उच्च आवर्धन, उच्च संख्यात्मक अपर्चर (एनए) विसर्जन उद्देश्य (जैसे, 100x 1.46 एनए तेल) चुनें।
  4. इनक्यूबेटेड माइक्रोस्कोप स्टेज पर लेबल वाली कोशिकाओं (चरण 1.6 से) के साथ एक चैम्बर स्लाइड या 35 मिमी पकवान स्थापित करें।
  5. नमूना पर ब्याज के क्षेत्र का पता लगाएं, अधिमानतः नेत्र के साथ। सर्वश्रेष्ठ एसआर-सिम इमेजिंग गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, उन कोशिकाओं को चुनें जो ग्लास से अच्छी तरह से जुड़ी हुई हैं।
  6. एसआर-सिम छवियों को प्राप्त करने के लिए बैक-टिन्ड हाई-एंड इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (ईएम-सीसीडी) कैमरे का उपयोग करें।
  7. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, उपयोग किए गए कैमरे (जैसे, 300) के लिए अनुशंसित एक उच्च ईएम लाभ सेट करें।
  8. न्यूक्लियोइड ट्रैकिंग के लिए समय चूक श्रृंखला प्राप्त करने से पहले, देखने के एक ही क्षेत्र की एक दो रंग एसआर-सिम छवि प्राप्त करें: माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला के लिए एक चैनल और एसजी के लिए एक और एक। इस्तेमाल किए जाने वाले माइटोकॉन्ड्रियल दाग के लिए उपयुक्त पहला रंग चैनल सेट करें (उदाहरण के लिए, दूर लाल माइटोकॉन्ड्रियल दाग के लिए, उत्तेजना को 633 एनएम या उससे अधिक और 650 एनएम लॉन्गपास उत्सर्जन फिल्टर पर सेट करें)। एसजी सिग्नल के लिए, 488 एनएम और 500-550 एनएम बैंडपास उत्सर्जन फिल्टर पर उत्तेजना सेट करें।
  9. सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, सबसे कम लेजर शक्ति दोनों ४८८ एनएम और दूर लाल दाग लाइनों के लिए संभव सेट ।
    नोट: एक विशिष्ट सेटिंग 1% लेजर आउटपुट पावर है जिसे एक एकोस्टो-ऑप्टिकल ट्राय फिल्टर (एओटीएफ) द्वारा समायोजित किया जाता है।
  10. यदि सिम माइक्रोस्कोप केवल क्रमिक रूप से (एकल कैमरा सेटअप) चैनल प्राप्त करता है, तो दूर-लाल दाग का पता लगाने वाले चैनल को बंद कर दें।
  11. सॉफ्टवेयर में जेड-स्टैक बॉक्स को अनटिक करके जेड-स्टैक अधिग्रहण को बंद करके एक ही फोकल प्लेन का अधिग्रहण सेट करें।
  12. सबसे कम संभव ईएम-सीसीडी कैमरा एक्सपोजर समय निर्धारित करें।
  13. पांच घूर्णन के बजाय ग्रिड के तीन घूर्णन सेट करें।
  14. फ्रेम रेट बढ़ाने के लिए सॉफ्टवेयर के एक्विजिशन टैब में कैमरा सेट करके सिर्फ'फुल चिप'के बजाय कैमरा सेंसर के सेंट्रल एरिया से ही डाटा पढ़ें।
    नोट: उदाहरण के लिए, 1,000 x 1,000 पिक्सल पूर्ण सेंसर के क्षेत्र को पढ़ने से स्विच करने से केवल 256 x 256 पिक्सल पढ़ने के लिए कैमरा एक्सपोजर समय में 50 एमएस से 13.4 एमएस तक कमी और 1.8 एस से 1.2 एस तक कुल फ्रेम समय की अनुमति देता है। यदि कैमरा सेंसर का केवल एक केंद्रीय हिस्सा पढ़ा जाता है, तो देखने का क्षेत्र आमतौर पर एसआर-सिम के लिए उपयोग किए जाने वाले 63x या 100x उद्देश्य के लिए बहुत छोटा होगा। एक छोटा एक्सपोजर समय छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम करेगा।
  15. लेजर पावर और कैमरा एक्सपोजर समय का अनुकूलन करें: कई लेजर पावर वैल्यूज (जैसे, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%) और कई एक्सपोजर बार (जैसे, 13.4 एमएस, 25 एमएस, 50 एमएस)।
  16. कच्चे सिम डेटासेट को प्रोसेस करें (चरण 3.1 देखें)।
  17. लेजर पावर और कैमरा एक्सपोजर समय चुनें जो सिम प्रसंस्करण द्वारा उत्पन्न कम या कोई कलाकृतियों के साथ माइटोकॉन्ड्रिया (यानी, नाभिक) में उज्ज्वल धब्बों के साथ सिम छवियों को उपज देते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया के बाहर के क्षेत्रों का निरीक्षण करें (उदाहरण के लिए, 488 एनएम ठोस-राज्य लेजर की 1% शक्ति और ईएम-सीसीडी कैमरे के 25 एमएस एक्सपोजर)।
  18. चरण 2.15-2.17 में अनुकूलित सेटिंग्स का उपयोग करके समय चूक श्रृंखला का अधिग्रहण शुरू करें।

3. डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)के संरचित रोशनी मॉड्यूल के साथ कच्चे सिम डेटासेट को संसाधित करें: सिम प्रसंस्करण मापदंडों के लिए ऑटो चेकबॉक्स चुनें। कई फाइलों की स्वचालित प्रसंस्करण के लिए, बैच प्रोसेसिंग टूल का उपयोग करें, बैच के लिए उपयोग वर्तमानका चयन करें, रन बैच पर क्लिक करें और सिम प्रसंस्करण के लिए कई फ़ाइलों का चयन करें।
  2. सिम-प्रोसेस्ड टाइम सीरीज डेटासेट को इमरिस फाइल कनवर्टर सॉफ्टवेयर (यानी, इमरिस सॉफ्टवेयर के वर्जन के अनुरूप वर्जन) के साथ आईएमएस फॉर्मेट में कन्वर्ट करें।
  3. सॉफ्टवेयर (संस्करण 8.4.1 या बाद में) में एक परिवर्तित फ़ाइल खोलें जिसमें वंश (या ट्रैक) मॉड्यूल के लिए लाइसेंस है।
  4. ऐड न्यू स्पॉट आइकन पर क्लिक करके'स्पॉट्स'क्रिएशन विजार्ड शुरू करें। सृजन के लिए एक जादूगर का शुभारंभ किया जाएगा।
  5. जादूगर का बनाएं टैब चुनें।
  6. जादूगर के पहले चरण पर, ट्रैक स्पॉट (समय के साथ) पर क्लिक करें और जादूगर के दूसरे चरण में आगे बढ़ें।
  7. अनुमानित XY व्यास 0.1-0.15 माइक्रोन के लिए सेट करें, पृष्ठभूमि घटाव पर क्लिक करें और तीसरे चरण के लिए आगे बढ़ें ।
  8. हिस्टोग्राम में ऊर्ध्वाधर रेखा को खींचकर फिल्टर"गुणवत्ता"में दहलीज को समायोजित करें ताकि अधिकांश नाभिक "धब्बे" के रूप में पता लगाया जा सके, जबकि कलाकृतियों का पता नहीं लगाया जाता है (यानी, पता लगाए गए स्थानों को छवि पर मढ़ा गेंदों के रूप में चिह्नित किया जाता है)। जांच करें कि क्या यह प्रत्येक फ्रेम पर मामला है और यदि आवश्यक हो तो दहलीज को समायोजित करें। चौथे और फिर जादूगर के पांचवें चरण के लिए आगे बढ़ें।
  9. ऑटोरेग्रेसिव मोशन एल्गोरिदम चुनें। अधिकतम दूरी 0.5 माइक्रोन के लिए सेट करें। 0 तक अधिकतम गैप साइज सेट करें।
  10. समय श्रृंखला में प्रत्येक फ्रेम को देखें और जांचें कि क्या कोई झूठी पटरियां तैयार की जाती हैं और यदि पटरियों के बीच कोई अंतराल पेश किया जाता है (वर्तमान सेटिंग्स के साथ जादूगर द्वारा निर्मित ट्रैक तुरंत छवि पर मढ़ा लाइनों के रूप में चिह्नित किए जाते हैं)। यदि आवश्यक हो तो"मैक्स डिस्टेंस"समायोजित करें। जादूगर के छठे चरण के लिए आगे बढ़ें। ट्रैक अवधि फ़िल्टर चुनें और 3-5 एस की सीमा निर्धारित करें।
  11. यदि वर्तमान में पाए गए धब्बे या ट्रैक इष्टतम नहीं हैं, तो स्पॉट या ट्रैक निर्माण के लिए किसी भी पैरामीटर को ठीक करने के लिए आवश्यक नेविगेशन बटन (जादूगर खिड़की के नीचे) का उपयोग करके जादूगर के पिछले चरणों में वापस जाएं।
  12. जब ठीक देखते मापदंडों सॉफ्टवेयर सभी स्थानों का पता लगाने और सही ढंग से पटरियों का निर्माण करने के लिए अनुमति देते हैं, पटरियों के निर्माण की पुष्टि करने के लिए जादूगर में हरे तीर नेविगेशन बटन पर क्लिक करें ।
  13. सांख्यिकी आइकन खिड़की पर क्लिक करके पटरियों के आंकड़े निकालें। आवश्यक सांख्यिकी मापदंडों (सांख्यिकीके तहतविस्तृत और औसत मूल्य टैब) चुनें और क्वांटिफिकेशन और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फ्लॉपी ड्राइव आइकन पर क्लिक करके मूल्यों को सीएसवी फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।
    नोट: अधिकतम ट्रैक गति, मतलब ट्रैक गति, ट्रैक लंबाई, और ट्रैक विस्थापन मापदंडों के उदाहरण हैं जो महत्वपूर्ण हैं।
  14. यदि छवि डेटासेट को प्रस्तुत या प्रकाशित करने की आवश्यकता है, तो स्नैपशॉट या एनीमेशन टूल का उपयोग करके वैकल्पिक रूप से मढ़ा पटरियों के साथ समय चूक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करने वाली स्नैपशॉट और/या वीडियो फ़ाइलें बनाएं।

4. कॉन्फोकल इमेज एक्विजिशन

  1. माइक्रोस्कोप चरण पर एक चरण-शीर्ष इनक्यूबेटर स्थापित करें, वांछित तापमान और सीओ2 एकाग्रता (यानी, 37 डिग्री सेल्सियस और स्तनधारी कोशिकाओं के लिए 5%) सेट करें और छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए गर्म रखें।
  2. लेजर सहित एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के सभी घटकों पर स्विच करें, और उन्हें कम से कम 1 घंटे के लिए गर्म करने के लिए छोड़ दें।
  3. Nyquist मानदंडों के अनुसार उच्च आवर्धन उद्देश्य और स्थानिक नमूना के लिए एक वांछित मध्य चुनें।
  4. एसजी चैनल के लिए, 488 एनएम पर उत्तेजना और 500-550 एनएम की एक डिटेक्शन रेंज सेट करें। माइटोकॉन्ड्रियल दाग चैनल के लिए, एक लाल रंग के लिए 561 एनएम और 570-630 एनएम उत्सर्जन के लिए सेट, या 633 एनएम उत्तेजना और 650 एनएम उत्सर्जन के लिए एक दूर लाल रंग के लिए।
  5. सबसे कम संभव लेजर पावर (आमतौर पर 1% या उससे कम) निर्धारित करें जो 700 एमवी के पीएमटी डिटेक्टर लाभ के साथ संकेतों के अधिग्रहण की अनुमति देता है।
  6. कोशिकाओं की दो रंग की कॉन्फोकल छवियां प्राप्त करें, जहां "एसजी चैनल" में माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड का पता लगाया जाता है और माइटोकॉन्ड्रिया का पता "लाल" या "सुदूर लाल" चैनल में लगाया जाता है।

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Representative Results

एसजी के साथ लाइव सेल लेबलिंग का लक्षण वर्णन
सबसे पहले, विभिन्न कमजोरियों पर डाइके के साथ इनक्यूबेशन पर कोशिकाओं में एसजी का वितरण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषता थी। एसजी या पिकोग्रीन की उच्च सांद्रता के साथ इनक्यूबेशन के बाद, दोनों रंगों ज्यादातर नाभिक लेबल और साइटोप्लाज्म में एक पकता धुंधला दिखाया(चित्रा 1),इसी तरह एक और सकारात्मक आरोप लगाया cyanine रंग (यानी, picoGreen)15के लिए प्रकाशित डेटा के लिए प्रकाशित करने के लिए । हालांकि, 1:10,000 कमजोर पड़ने पर एसजी के साथ इनक्यूबेशन पर, नाभिक में बेहोश धुंधला दिखाई दिया, जबकि साइटोप्लाज्म में, हमने उज्ज्वल धब्बे(चित्र 1)का एक पैटर्न देखा। दूसरी ओर, पिकोग्रीन रंग पतला 1:10,000 के साथ इनक्यूबेशन ज्यादातर परमाणु धुंधला मिले । एसजी सिग्नल एक ही एकाग्रता पर पिकोग्रीन की तुलना में बहुत उज्जवल था। आंकड़ों से पता चला है कि एसजी अन्य समान डीएनए बाध्यकारी रंगों की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए इमेजिंग के लिए अधिक उपयुक्त है ।

इस बात की पुष्टि करने के लिए कि माइटोकॉन्ड्रिया में उज्ज्वल बिंदुओं का स्थानीयकरण किया गया है, हमने एसजी और सुदूर लाल माइटोकॉन्ड्रियल दाग के साथ जीवित कोशिकाओं को एक साथ दाग दिया। उत्तरार्द्ध एक सकारात्मक आवेशित कोशिका परगने योग्य कार्बनिक रंग है जो जीवित कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है। 1:10,000 और 1:50,000 कमजोरी पर एसजी के साथ इनक्यूबेशन पर, लगभग सभी एसजी धुंधला माइटोकॉन्ड्रिया में हुई, जबकि 1:500 और 1:1,000 कमजोरकरने पर लेबलिंग पर, नाभिक और साइटोप्लाज्म के महत्वपूर्ण धुंधला(चित्रा 2)हुआ ।

इसके अलावा, हमने समय चूक माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3)द्वारा एसजी के साथ लाइव कोशिकाओं को धुंधला करने के समय पाठ्यक्रम की विशेषता दी। माइटोकॉन्ड्रिया बनाम टाइम(चित्रा 3बी)में एसजी फ्लोरेसेंस तीव्रता के भूखंडों ने सुझाव दिया कि 45 मिन के बाद, नाभिक धुंधला संतृप्ति के करीब था। इस प्रकार, हम ~ 30-60 0 0 0 के इनक्यूबेशन बार की सलाह देते हैं।

हमने परीक्षण किया कि कैसे एसजी इंट्रासेलुलर वितरण कोशिकाओं के निर्धारण और/या permeabilization पर बदलता है । लाइव-दाग कोशिकाओं के निर्धारण (2% पैराफॉर्मलडिहाइड [पीएफए]) ने नाभिक(चित्र4ए, बी)को रंगे के मामूली पुनर्वितरण का कारण बना। निश्चित कोशिकाओं (0.1% ट्राइटन X100) के पार्मेबिलाइजेशन ने माइटोकॉन्ड्रिया में एसजी बिंदीदार पैटर्न को समाप्त कर दिया, और नाभिक का धुंधला प्रमुख था(चित्र4सी)। यदि एसजी को निर्धारण और पार्मेबिलाइजेशन के बाद कोशिकाओं में जोड़ा गया था, तो यह साइटोप्लाज्म और नाभिक(चित्रा 4डी)में समान रूप से वितरित किया गया था। इस प्रकार, एसजी लेबल कोशिकाओं को यदि आवश्यक हो तो तय किया जा सकता है, लेकिन डाया प्रोटोकॉल है कि permeabilization की आवश्यकता के लिए उपयुक्त नहीं है ।

लाइव सेल एसआर-सिम और माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइडट्रैकिंग
एसजी और एक दूर लाल माइटोकॉन्ड्रियल दाग(सामग्री की तालिका)के साथ कोस्टाइन की गई लाइव कोशिकाओं को सुपर-रेजोल्यूशन सिम तकनीक द्वारा 3डी इमेज्ड किया गया था। कॉन्फोकल छवियों(चित्र ा 2)के रूप में, माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड माइटोकॉन्ड्रिया(चित्र 5ए)के भीतर उज्ज्वल धब्बे के रूप में दिखाई दिए। इसके अलावा, हमने 2डी सिम छवियों की एक समय श्रृंखला हासिल की और विवर्तन सीमा से परे एक संकल्प पर नाभिक की स्थिति को ट्रैक किया। समय श्रृंखला शुरू करने से तुरंत पहले हमने एसजी और माइटोकॉन्ड्रियल दाग चैनलों में सिम 3डी स्टैक का अधिग्रहण किया। फिर हमने केवल एसजी चैनल में एक समय श्रृंखला हासिल की और उनकी गति की मात्रा निर्धारित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड को ट्रैक किया। ट्रैक का मतलब गति 0.042 माइक्रोन/एस था, और ट्रैक की अधिकतम तत्काल गति 0.078 ± 0.012 माइक्रोन/एस थी। अधिकांश नाभिक ने अपने मूल पदों से दूर नहीं किया लेकिन कम दूरी की यादृच्छिक गति दिखाई जो शायद माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क तक ही सीमित थी, माइटोकॉन्ड्रियल छवियों पर पटरियों के ओवरले के रूप में पता चलता है(चित्रा 5बी)। कुछ तेजी से दिशात्मक विस्थापन एक ठेठ समय श्रृंखला(फिल्म 1)के दौरान हुई ।

Figure 1
चित्रा 1: पिकोग्रीन और एसजी लाइव सेल लेबलिंग की तुलना। A549 कोशिकाओं को पिकोग्रीन या एसजी के साथ संकेतित कमजोर होने और छवि पर इनक्यूबेटेड किया गया था। हरे चैनल में लेबल कोशिकाओं के दृश्य के प्रतिनिधि क्षेत्र। LSM880 Airyscan फास्ट, 20x/एयर ऑब्जेक्टिव, स्केल बार = 50 माइक्रोन सिंगल ऑप्टिकल सेक्शन। सफेद वर्ग पूरे 423 x 423 माइक्रोन क्षेत्रों के दाईं ओर उच्च आवर्धन पर दिखाए गए क्षेत्रों को चिह्नित करते हैं। 1:1,000 और 1:2,000 कमजोर पड़ने के लिए, एक ही छवियों को दो चमक सेटिंग्स में दिखाया गया है: "डिफ़ॉल्ट" चमक सेटिंग्स 1:10,000 कमजोर पड़ने के लिए अनुकूलित, और "कम चमक" सेटिंग्स डिटेक्टर संतृप्ति से बचने के लिए समायोजित । इस आंकड़े को जेवटिक एट अल27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न सांद्रता पर लेबलिंग पर लाइव कोशिकाओं में एसजी स्थानीयकरण। वाला कोशिकाओं को 0.25 माइक्रोन मिटोट्रैकर सीएमएक्सआरओ रेड और संकेतित एसजी कमजोर पड़ने के मिश्रण के साथ 30 मिन के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था। समाधान को डीएमईएम के साथ बदल दिया गया था, और छवियों को रंग चैनलों के अनुक्रमिक अधिग्रहण के साथ एक LSM880 Airyscan माइक्रोस्कोप, 63x 1.4 तेल उद्देश्य पर अधिग्रहीत किया गया था। एकल ऑप्टिकल स्लाइस स्केल बार = 10 माइक्रोन दिखाया गया है) । इस आंकड़े को जेवटिक एट अल27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: SYBR गोल्ड (एसजी) के साथ लेबलिंग के दौरान हेला कोशिकाओं । सबसे पहले, लाइव वाघेला कोशिकाओं को Mitotracker CMXRos लाल और धोया के साथ लेबल किया गया । एसजी (DMEM में अंतिम कमजोर पड़ने 1:10,000) कोशिकाओं में जोड़ा गया था और एक समय चूक श्रृंखला का अधिग्रहण किया गया था । LSM880 माइक्रोस्कोप, 63x 1.4 तेल उद्देश्य, अनुक्रमिक अधिग्रहण। जेड-स्टैक हर समय बिंदु पर अधिग्रहीत किए गए थे। अधिकतम तीव्रता के अनुमान ों को दर्शाया गया है। (क)ब्याज के कई क्षेत्रों में समय के साथ एसजी फ्लोरेसेंस की औसत तीव्रता । (ख)ब्याज के क्षेत्रों को दिखाने के प्रतिनिधि क्षेत्र जहां एसजी फ्लोरेसेंस मापा गया था (रंगीन आयत) । (ग)एसजी के साथ इनक्यूबेशन के दौरान कई समय बिंदुओं पर देखने का क्षेत्र । सफेद रेखा के साथ चिह्नित एक वर्ग क्षेत्र सही कॉलम में एक उच्च आवर्धन पर दिखाया गया है। इस आंकड़े को जेवटिक एट अल27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कोशिकाओं में एसजी स्थानीयकरण पर निर्धारण और परमीबिलाइजेशन का प्रभाव। वाघेला कोशिकाओं को एसजी (स्टॉक पतला 1:10,000) और Mitotracker CMXRos लाल (0.25 μM) के साथ 30 मिन के लिए दाग थे । एकल ऑप्टिकल स्लाइस एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत किए गए थे; अनुक्रमिक अधिग्रहण; स्केल बार = 10 μm.(ए)लाइव वाघेला कोशिकाओं एसजी के साथ दाग। (ख)लाइव वाघेला कोशिकाओं एसजी के साथ दाग और फिर 30 मिन के लिए PBS में 2% पीएफए के साथ तय की ।(सी)लाइव वाघेला कोशिकाओं एसजी के साथ दाग, तो 30 मिन के लिए PBS में 2% पीएफए के साथ तय की और 15 मिन के लिए ०.१% Triton X100 के साथ permeabilized । निचले पैनल पर, एक ही छवि दिखाई गई है, लेकिन हरे रंग के चैनल में चमक अधिक सेट है। (घ)2% पीएफए के साथ तय की गई वाला कोशिकाएं, 15 मिन के लिए 0.1% ट्राइटन X100 के साथ पार्मीकृत, और फिर एसजी और माइटोट्रैकर सीएमएक्सरोस रेड के साथ दाग दिया। (डी)में दिखाई गई छवियों को प्राप्त करने के लिए, ग्रीन चैनल के लिए कैमरे के EMCCD लाभ ओवरएक्सपोजर से बचने के लिए ए-सी की तुलना में 12 के कारक से कम हो गया था। इस आंकड़े को जेवटिक एट अल27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लाइव सिम छवियों पर न्यूक्लॉयड ट्रैकिंग। एसजी दाग कोशिकाओं के दृश्य के एक क्षेत्र के प्रतिनिधि छवियां। नीचे: समय चूक श्रृंखला के अधिग्रहण से पहले लिया दो रंग सिम छवि। ग्रीन = एसजी चैनल; मजेंटा = माइटोट्रैकर चैनल। शीर्ष: एसजी चैनल(मूवी 1)में 50-फ्रेम सिम समय श्रृंखला से न्यूक्लियोइड ट्रैक; फ्रेम समय = 1.8 एस; इमरिस 8.4.1 सॉफ्टवेयर द्वारा ट्रैकिंग। ट्रैक अधिकतम ट्रैक गति (μm/s) द्वारा रंग-कोडित होते हैं; Elyra PS.1, सिम मोड, 100x/1.46 तेल उद्देश्य; स्केल बार = 10 माइक्रोन। इस आंकड़े को जेवटिक एट अल27से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
मूवी 1: सिम समय चूक श्रृंखला प्रतिनिधि एसजी दाग कोशिकाओं दिखा । स्केल बार = 5 μm. पता चला माइटोकॉन्ड्रियल नाभिक नाभिक सफेद क्षेत्रों के रूप में चिह्नित कर रहे हैं। पटरियों को "ड्रैगन पूंछ" (8 फ्रेम लंबाई) और रंग-कोडित के रूप में उनकी अधिकतम तत्काल गति के अनुसार कल्पना की जाती है (नीचे दाईं ओर रंग बार μm/s में गति दिखाता है)। मिमारिस 8.4.1 सॉफ्टवेयर द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ट्रैकिंग और विजुअलाइजेशन। यह वीडियो जेवटिक एट अल27में प्रकाशित हुआ है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण घटक हैं: माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की तरजीही लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, इनक्यूबेशन के दौरान डीएनए बाध्यकारी रंगे की एकाग्रता को बहुत कम रखा जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, एक ठेठ वाणिज्यिक स्टॉक का 1:10,000 कमजोर पड़ना), और इनक्यूबेशन समय 30 min होना चाहिए। इनक्यूबेशन समय 1 घंटे से अधिक कभी नहीं होना चाहिए SYBR गोल्ड रंग का इस्तेमाल किया जाना चाहिए; अन्य डीएनए-बाध्यकारी रंग कम एकाग्रता पर लेबलिंग पर एक मजबूत संकेत उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त उज्ज्वल नहीं हैं।

हमारे प्रोटोकॉल की सीमा यह है कि एक परमीबिलाइजेशन चरण के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड से डाया धोया जाता है। इसलिए, वर्णित प्रक्रिया पारंपरिक प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त नहीं है। इस मामले में, निश्चित कोशिकाओं में नाभिक को अन्य तकनीकों के साथ कुशलतापूर्वक लेबल किया जा सकता है, जैसे डीएनए या माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन कारकों (TFAM) के खिलाफ एंटीबॉडी।

डीएनए बाध्यकारी कार्बनिक रंग के साथ माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की प्रत्यक्ष लेबलिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग पर फायदे हैं: फ्लोरोसेंट प्रोटीन-टैग किए गए निर्माणों की क्षणिक या स्थिर अभिव्यक्ति के लौकिक या अन्य विवशों के बिना किसी भी प्रकार की कोशिका को <1 एच के भीतर लेबल किया जा सकता है। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में, TFAM के पारंपरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैगिंग कलाकृतियों का कारण बताया गया था । इसके अलावा, एसजी कुशलतापूर्वक नाभिक को दाग देता है तभी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की क्षमता बरकरार हो। यह जैविक रूप से अप्रासंगिक "बीमार" और मृत कोशिकाओं के छवि अधिग्रहण को रोकता है, जिसे एफपी-आधारित धुंधला से बचा नहीं जा सकता है। अंत में, डीएनए बाध्यकारी रंगों के आधार पर पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के तरजीही धुंधला हासिल नहीं किया ।

प्रस्तावित प्रोटोकॉल तेज और सरल है, इस प्रकार हम मानते हैं कि इसका व्यापक रूप से विभिन्न फ्लोरेसेंस तकनीकों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ्स की लाइव इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाएगा, दोनों विवर्तन सीमित (जैसे, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल, टीआईआरएफ, टीआरएफ, आदि) के साथ-साथ सुपर-रिज़ॉल्यूशन सिम।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक वाघेला कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए आसिफा अख्तर और एंजेलिका रामबोल्ड (मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर इम्यूनोबायोलॉजी एंड एपिजेनेटिक्स) को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elyra PS1 Carl Zeiss multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)
High glucose DMEM GIBCO/ThermoFisher 31966021
ibidi 35 mm dish, glass bottom Ibidi Gmbh 81158
ibidi 8-well microSlide, glass bottom Ibidi Gmbh 80827
Imaris 8.4.1 Bitplane/Oxford Instruments image porcessing and visualisation software package
iXon 885 Andor Technologies EMCCD camera with back-illuminated sensor
LSM880 Airyscan Carl Zeiss laser scanning confocal microscope with array detector
Mitotracker CMXRos Red ThermoFischer M7512 red live cell mitochondrial stain
Mitotracker Deep Red FM ThermoFischer M22426 far red live cell mitochondrial stain
picoGreen ThermoFischer P7581 cell permeant DNA stain
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective Carl Zeiss
SYBR Gold ThermoFischer S11494 cell permeant DNA stain
Zen Black 2012 software Carl Zeiss image acquisition and processing software

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References

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जीव विज्ञान अंक 160 माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लॉइड माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए असममित साइनिन डीएनए फ्लोरोसेंट दाग संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी लाइव सेल माइक्रोस्कोपी
समय-चूक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड्स की विशिष्ट लेबलिंग
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Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).

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