Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider til tidsforfald struktureret belysning mikroskopi

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/60003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

Summary

Protokollen beskriver specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider med en kommercielt tilgængelig DNA gel plet, erhvervelse af tid bortfalder serie af levende mærket celler ved super-opløsning struktureret belysning mikroskopi (SR-SIM), og automatisk sporing af nukleoid bevægelse.

Abstract

Mitokondrielle nukleoider er kompakte partikler dannet af mitokondrielle DNA-molekyler belagt med proteiner. Mitokondrielle DNA koder tRNAs, rRNAs, og flere væsentlige mitokondrielle polypeptider. Mitokondrielle nukleoider deler og distribuerer inden for det dynamiske mitokondrielle netværk, der gennemgår fission /fusion og andre morfologiske ændringer. Høj opløsning levende fluorescens mikroskopi er en enkel teknik til at karakterisere en nukleoid position og bevægelse. Til denne teknik er nukleoider almindeligt mærket gennem fluorescerende tags af deres proteinkomponenter, nemlig transskriptionsfaktor a (TFAM). Men denne strategi har brug for overekspression af en fluorescerende protein-mærket konstruktion, som kan forårsage artefakter (rapporteret for TFAM), og er ikke muligt i mange tilfælde. Organiske DNA-bindende farvestoffer har ikke disse ulemper. Men de viser altid farvning af både nukleare og mitokondrielle DNAs, og dermed mangler specificitet til mitokondrielle nukleoider. Ved at tage hensyn til sådanne farvestoffers fysisk-kemiske egenskaber valgte vi en nukleinsyregelplet (SYBR Gold) og opnåede præferencemærkning af mitokondrielle nukleoider i levende celler. Farvestoffets egenskaber, især dets høje lysstyrke ved binding til DNA, tillader efterfølgende kvantificering af mitokondriel nukleoid bevægelse ved hjælp af tidsserier af superopløsningsstrukturerede belysningsbilleder.

Introduction

Cirkulære 16,5 kbp DNA-molekyler udgør det genetiske materiale af mitokondrier, kodning 22 tRNAs, 2 rRNAs, og 13 polypeptider er nødvendige for mitokondrielle oxidative fosforylering komplekser. Mitokondrielt DNA bundet til mitokondriel transskriptionsfaktor a (TFAM) og flere andre proteiner danner mitokondrielle nukleoider1,2,3,4. Mitokondrielle nukleoider bevæger sig og omfordeler mellem komponenterne i mitokondrielle netværk5,6 under dets morfologiske ombygning, fission eller fusion afhængigt af cellecyklusfase, stress og andre faktorer (gennemgået i Pernas et al.7). Desuden er bevægelsen af mitokondrielle nukleoider, involveret i systemisk lupus erythematosus sygdom8 og kan spille en rolle i andre sygdomme. Fluorescensmikroskopi er en enkel teknik til live-celle undersøgelser af organeller, men teknikken har en opløsning på >200 nm, hvilket er større end størrelsen af mitokondrielle nukleoider (~ 100 nm9,10,11,12). Denne grænse er blevet omgået ved såkaldte "super-resolution"-teknikker, såsom stimuleret emissionsudtømning (STED) og enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM)13,14. Hidtil har mitokondrielle nukleoider og andre DNAs blev afbildet i levende celler ved direkte stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM)15. Fine submidelige strukturer med positioner korreleret med mtDNA blev observeret af STED i levende celler16. Disse superopløsningsteknikker kræver imidlertid høj belysningsintensitet, hvilket forårsager fototoksiske virkninger på levende celler17. Derfor er tid bortfalder billeddannelse af mitokondrielle nukleoider med opløsning ud over diffraktion grænse udfordrende. For at løse dette, brugte vi super-opløsning struktureret belysning mikroskopi (SR-SIM)18. SIM kræver en meget lavere belysningseffektdosis end STED og SMLM19. I modsætning til STED- og SMLM-teknikker tillader SIM desuden enkel flerfarvet tredimensional (3D) billeddannelse, og det kræver ikke særlige fotofysiske egenskaber af fluorophores eller billeddannelsesbuffersammensætning19.

Den konventionelle strategi for mærkning mitokondrielle nukleoider i levende celler er fluorescerende tagging af et mitokondrielt nukleoid protein, såsom TFAM20. I mange tilfælde er denne strategi imidlertid ikke egnet. Desuden, overekspression af fluorescerende protein-mærkede TFAM producerer en alvorlig artefakt21. Mærkning af DNA med organiske farvestoffer har fordele i forhold til en fluorescerende protein (FP)-baseret strategi. Organiske farvestoffer er fri for begrænsninger i forbindelse med FP-mærkning: de kan anvendes til enhver type celler eller væv og kan anvendes på ethvert tidspunkt af et eksperiment. Levende celle billeddannelse af mitokondrielle nukleoider er blevet rapporteret med flere DNA-bindende farvestoffer: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, og picoGreen15,25,26. En væsentlig ulempe ved de fleste DNA-bindende farvestoffer til nukleoid mærkning er, at de pletter alle DNA i cellen. Målretning et farvestof udelukkende til mitokondrie DNA er meget ønskeligt. For at opnå dette, omhyggelig udvælgelse af et farvestof besidder egnede fysisk-kemiske egenskaber er nødvendig. Lipofile farvestoffer besidder delocalized positiv ladning, såsom rhodamin 123, er kendt for at ophobe sig i levende mitokondrier, som bevarer deres negative membran potentiale. Desuden bør et ideelt farvestof til specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider binde DNA med høj affinitet og udsender lys fluorescens ved DNA-binding. I betragtning af disse krav, visse cyaniner er lovende (f.eks picoGreen), men nukleare DNA er rigeligt plettet af disse farvestoffer samtidig med mitokondriel DNA15,25,26. Denne protokol beskriver specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider i levende celler med en anden cyanin farvestof, SYBR Gold (SG), og sporing af nukleoider i time lapse super-opløsning SIM-videoer. Desuden kan SG-farvede levende celler afbildes ved enhver form for omvendt fluorescerende mikroskop (konfokal, spinning disk, epifluorescens, osv.) egnet til levende celler og udstyret med en 488 nm lyskilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle de cellelinjer, der er nævnt her, var dyrket i høj glukose Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvæg serum (FBS), glutamin, penicillin / streptomycin, og pyruvat. Ækvilibrer alle medier og kosttilskud, der skal anvendes på mærknings- og billedbilledets dag, ved at opvarme dem op til 37 °C i en inkubator, der er indstillet til 5% CO2. Alt cellekulturarbejde, herunder mærkning, foregår under sterile forhold under en laminar flowhætte.

1. Mobil mærkning

  1. En dag før mærkningsproceduren, kultur 4 x 105 HeLa celler i 2 ml medium i en 35 mm petriskål med #1,5 glas bund. Multi-well chambered dias kan bruges, men mængder bør justeres proportionalt med lydstyrken af brønden. Cellesuspensionen fortyndes til ca. 50.000 celler/ml og frø 2 ml af cellesuspensionen i en 35 mm petriskål.
  2. Forbered følgende fortyndinger af SYBR Gold (SG) kommerciel lageropløsning: 1:5.000. Forbered Mitotracker Deep Red (langt rød plet) eller Mitotracker CMXRos Red (rød plet) (Tabel over materialer, kommercielle lager fortyndet 1:2.000) i phenol rød-fri kultur medium. Forbered det samme sæt fortyndinger af picoGreen som for SG.
    BEMÆRK: De løsninger, der er beskrevet i trin 1.2, er 2x-mærkningsløsningerne. Beskyt så meget som muligt alle opløsninger, der indeholder fluorescerende farvestoffer, mod lys.
  3. De klæbende celler vaskes én gang med 2 ml PBS. Der tilsættes 1 ml rødfrit dyrkningsmedium til 35 mm petriskålen. For et 8-brønds-kammerslid skal du bruge et volumen svarende til 1/2 af den samlede brøndkapacitet (f.eks. tilsættes 125 μL, hvis den samlede brøndkapacitet er 250 μL).
  4. Der tilsættes 1 mM af den 2x-mærkningsopløsning, der er fremstillet i trin 1.2 til 35 mm Petriskål. For en 8-brønds chambered slide, bruge en volumen svarende til 1 / 2 af den samlede brønd kapacitet. Cellerne inkuberes i 30 min. ved 37 °C under 5 % CO2.
    BEMÆRK: Cellerne inkuberes ikke med SG-mærkningsopløsning i mere end 1 time, da længere inkubation vil forårsage mærkning af nukleart DNA.
  5. Sug forsigtigt mediet, der indeholder de fluorescerende farvestoffer, og vask cellerne én gang med PBS.
  6. Der tilsættes rødfrit foolcellekulturmedium, og2 cellerne holdes i mørke i en CO 2-inkubator ved 37 °C indtil billeddannelse.
  7. Billede levende celler på en SR-SIM mikroskop udstyret med en inkubationsenhed (se nedenfor).

2. SR-SIM-billedanskaffelse

  1. Installer en scene-top inkubator på mikroskopet fase. Indstil den ønskede temperatur og CO2-koncentration (f.eks. 37 °C og 5 % for pattedyrceller), og hold den varm i mindst 1 time, før billedet blev anskaffet.
  2. Tænd for alle komponenter i SR-SIM mikroskop, herunder lasere, og lad dem varme op i mindst 1 time.
  3. Vælg en høj forstørrelse, høj numerisk blænde (NA) nedsænkning mål (f.eks 100x 1,46 NA olie), der anbefales til SR-SIM af mikroskop producenten.
  4. Der monteres et chambered slide eller 35 mm skål med mærkede celler (fra trin 1.6) på det inkuberede mikroskoptrin.
  5. Lokalisering af det interesseområde, der er afhængigt af prøven, helst med okularer. For at opnå den bedste SR-SIM billedkvalitet, skal du vælge de celler, der er godt knyttet til glasset.
  6. Brug et back-dåse high-end elektron multiplicerende charge-koblet enhed (EM-CCD) kamera til at erhverve SR-SIM-billeder.
  7. Brug af billederhvervelsessoftwaren til at indstille en høj EM-forstærkning, der anbefales til det anvendte kamera (f.eks. 300).
  8. Før du erhverver den tid bortfalder serien for nukleoid sporing, erhverve en to-farve SR-SIM billede af det samme synsfelt: en kanal for mitokondriel farvning og en anden for SG. Indstil den første farvekanal, der passer til den anvendte mitokondrielle plet (f.eks. for en langt rød mitokondriel plet, indstille excitationen til 633 nm eller længere og et 650 nm longpass-emissionsfilter). For SG-signalet skal excitationen indstilles til 488 nm og et 500-550 nm bandpass-emissionsfilter.
  9. Ved hjælp af softwaren, indstille den laveste laser effekt muligt for både 488 nm og langt røde plet linjer.
    BEMÆRK: En typisk indstilling er 1% laser udgangseffekt justeret af en acousto-optisk tunable filter (AOTF).
  10. Hvis SIM-mikroskopet kun henter kanaler fortløbende (opsætning af enkelt kamera), skal du slukke for den langtrøde pletdetekteringskanal.
  11. Indstil erhvervelsen af et enkelt brændpunktsplan ved at slukke for Z-stakæsken ved at fjerne markeringen af Z-stakkassen i softwaren.
  12. Indstil den kortest mulige EM-CCD-kameraeksponeringstid.
  13. Angiv tre rotationer af gitteret i stedet for fem rotationer.
  14. For at øge billedhastigheden skal du i fanen Anskaffelse af softwaren indstille kameraet til kun at læse dataene fra det centrale område af kamerasensoren i stedet for "Full Chip".
    BEMÆRK: For eksempel giver skift fra at læse et område på 1.000 x 1.000 pixels fuld sensor til at læse kun 256 x 256 pixel en reduktion i kameraets eksponeringstid fra 50 ms til 13,4 ms og den samlede rammetid fra 1,8 s til 1,2 s. Hvis kun en central del af kamerasensoren læses, vil synsfeltet være meget lille for en 63x eller 100x målsætning, der typisk bruges til SR-SIM. En kortere eksponeringstid vil reducere signal-støj-forholdet mellem billederne.
  15. Optimer lasereffekt og kameraeksponeringstid: Antag SR-SIM todimensionelle (2D) billeder af mærkede celler ved flere lasereffektværdier (f.eks. 0,5 %, 1%, 1,5 %, 2 %) og flere eksponeringstider (f.eks. 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Behandl de rå SIM-datasæt (se trin 3.1).
  17. Vælg laserkraft og kameraeksponeringstider, der giver SIM-billeder med lyse pletter i mitokondrierne (dvs. nukleoiderne) med få eller ingen artefakter, der genereres af SIM-behandling. Undersøg områderne uden for mitokondrierne (f.eks. 1 % effekt af 488 nm solid state-laseren og 25 ms eksponering af EM-CCD-kamera).
  18. Start anskaffelsen af tidslapsserien ved hjælp af de indstillinger, der er optimeret i trin 2.15-2.17.

3. Databehandling og -analyse

  1. Behandl rå SIM-datasæt med det strukturerede belysningsmodul i en egnet software (Tabel over materialer): Vælg afkrydsningsfeltet Automatisk for SIM-behandlingsparametre. Hvis du vil have automatisk behandling af flere filer, skal du bruge batchbehandlingsværktøjet, fravælge Brug aktuel for batch, klikke på Kør batch og vælge flere filer til SIM-behandling.
  2. Konverter SIM-behandlede tidsseriedatasæt til ims-format med Imaris-filkonvertersoftware (dvs. den version, der svarer til den version af Imaris-softwaren).
  3. Åbn en konverteret fil i softwaren (version 8.4.1 eller nyere), der har licens til modulet Lineage (eller Spor).
  4. Start oprettelsen af oprettelsen "Pletter" ved at klikke på ikonet Tilføj nye pletter. Der startes en oprettet guide til oprettelse.
  5. Vælg fanen Opret i guiden.
  6. På det første trin i guiden skal du klikke på Spor pletter (over tid) og fortsætte til det andet trin i guiden.
  7. Indstil anslået XY-diameter til 0,1-0,15 μm, klik på Subtraktion af baggrund, og fortsæt til det tredje trin.
  8. Juster tærsklen i filteret "Kvalitet" ved at trække den lodrette linje i histogrammet, så størstedelen af nukleoiderne registreres som "pletter", mens artefakterne ikke registreres (dvs. de fundne pletter er markeret som kugler overlejret på billedet). Kontroller, om dette er tilfældet på hver ramme, og juster tærsklen, hvis det er nødvendigt. Fortsæt til det fjerde og derefter til det femte trin i guiden.
  9. Vælg algoritmen Autoregressiv bevægelse. Indstil max afstand til 0,5 μm. Indstil max mellemrumsstørrelse til 0.
  10. Kig på hver ramme i tidsserien og kontrollere, om nogen falske spor er tegnet, og hvis eventuelle huller mellem spor er indført (spor bygget af guiden med aktuelle indstillinger er straks markeret som linjer overlejret på billedet). Juster "Max Distance" hvis det er nødvendigt. Fortsæt til det sjette trin i guiden. Vælg filteret Sporvarsel, og angiv en grænse på 3-5 s.
  11. Hvis de aktuelt fundne pletter eller spor ikke er optimale, skal du gå tilbage til de foregående trin i guiden ved hjælp af navigationsknapper (nederst i guidevinduet), der er nødvendige for at finjustere en parameter for pletter eller sporoprettelse.
  12. Når de finjusterede parametre gør det muligt for softwaren at registrere alle pletter og bygge spor korrekt, skal du klikke på den grønne pilenavigationsknap i guiden for at bekræfte oprettelsen af sporene.
  13. Udtræk statistikken over sporene ved at klikke på ikonet Statistik. Vælg de nødvendige statistikparametre(fanen Detaljerede og gennemsnitlige værdier under Statistik), og eksporter værdierne som CSV-filer ved at klikke på ikonet Diskettedrev til kvantificering og visualisering.
    BEMÆRK: Maksimal sporhastighed, gennemsnitlig sporhastighed, sporlængde og sporforskydning er eksempler på parametre, der er vigtige.
  14. Hvis billeddatasættet skal præsenteres eller udgives, skal du oprette snapshots og/eller videofiler, der repræsenterer tidsforskydningsserien med valgfrit overlejrede spor ved hjælp af snapshot- eller animationsværktøjerne.

4. Konfokale Billede Erhvervelse

  1. Aninstaller en fasetop-inkubator på mikroskopstadiet, sæt den ønskede temperatur og CO2-koncentrationen (dvs. 37 °C og 5 % for pattedyrceller), og hold varmen i mindst 1 time, før billedanskaffelsen påbegyndes.
  2. Tænd for alle komponenter i en konfokal laser scanning mikroskop, herunder lasere, og lad dem varme op i mindst 1 time.
  3. Vælg en ønsket midt til høj forstørrelse mål og rumlig prøveudtagning i henhold til Nyquist kriterier.
  4. For SG-kanalen skal du indstille excitationen til 488 nm og et detektionsområde på 500-550 nm. For mitokondriel pletkanal, indstillet til 561 nm og 570-630 nm emission for et rødt farvestof, eller 633 nm excitation og >650 nm emission for en langt rød farvestof.
  5. Indstil den lavest mulige lasereffekt (typisk 1 % eller mindre), der tillader anskaffelse af signalerne med PMT-detektorgevinster på 700 mV.
  6. Erhverve to-farve konfokale billeder af cellerne, hvor mitokondrielle nukleoider er opdaget i "SG kanal" og mitokondrier detekteres i den "røde" eller "langt rød" kanal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering af levende celle mærkning med SG
For det første var fordelingen af SG i cellerne ved inkubation med farvestoffet ved forskellige fortyndinger karakteriseret ved konfokal mikroskopi. Efter inkubation med høje koncentrationer af SG eller picoGreen mærkede begge farvestoffer for det meste kernerne og viste en punktformig farvning i cytoplasmaet (Figur 1), på samme måde som offentliggjorte data for et andet positivt ladet cyaninfarvestof (dvs. picoGreen)15. Men ved inkubation med SG ved 1:10.000 fortynding, svag farvning dukkede op i kernerne, mens der i cytoplasmaet, vi observerede et mønster af lyse pletter (Figur 1). På den anden side, inkubation med picoGreen farvestof fortyndet 1:10,000 gav det meste nuklearfarvning. SG signal var meget lysere end picoGreen på samme koncentration. Dataene viste, at SG er mere egnet til billeddannelse mitokondrielle DNA end andre lignende DNA-bindende farvestoffer.

For at bekræfte, at de lyse prikker er lokaliseret i mitokondrier, vi farves levende celler samtidig med SG og langt røde mitokondrielle plet. Sidstnævnte er en positivt ladet celle gennemtrængelige organisk farvestof, der ophobes i mitokondrier af levende celler. Ved inkubation med SG på 1:10,000 og 1:50,000 fortyndinger, næsten alle SG farvning forekom i mitokondrier, mens der ved mærkning på 1:500 og 1:1,000 fortyndinger, betydelig farvning af kerner og cytoplasma opstod (Figur 2).

Endvidere karakteriserede vi tidsforløbet for farvning af levende celler med SG ved tidsforskydning mikroskopi (Figur 3). De parceller af SG fluorescens intensitet i mitokondrier vs tid (Figur 3B) foreslog, at efter 45 min, nukleoid farvning var tæt på mætning. Således anbefaler vi inkubationstider på ~ 30-60 min.

Vi testede, hvordan SG intracellulære fordeling ændringer ved fiksering og / eller permeabilisering af cellerne. Fiksering (2% paraformaldehyd [PFA]) af de levende farvede celler forårsagede en let omfordeling af farvestoffet til kernen (Figur 4A,B). Permeabilisering af de faste celler (0,1% Triton X100) eliminerede SG prikket mønster i mitokondrier, og farvning af kernerne var dominerende (Figur 4C). Hvis SG blev tilsat til cellerne efter fiksering og permeabilisering, fordeles den ensartet over cytoplasmaet og kernerne (Figur 4D). Således kan SG mærkede celler fastsættes, hvis det er nødvendigt, men farvestoffet er ikke egnet til protokoller, der kræver gennemtrængelighed.

Sporing af levende celle SR-SIM og mitokondrielle nukleoider
Levende celler costained med SG og en langt rød mitokondriel plet(Tabel af materialer) var 3D afbildet af en super-opløsning SIM-teknik. Som i de konfokale billeder (Figur 2) optrådte mitokondrielle nukleoider som lyspunkter i mitokondrierne (Figur 5A). Desuden har vi erhvervet en tidsserie af 2D SIM-billeder og sporede placeringen af nukleoiderne i en opløsning ud over diffraktionsgrænsen. Umiddelbart før vi startede tidsserien, købte vi SIM 3D-stakke i SG og mitokondrielle pletkanaler. Så vi erhvervede en tidsserie i SG kanal kun og spores mitokondrielle nukleoider for at kvantificere deres bevægelser. Sporets gennemsnitshastighed var 0,042 μm/s, og den maksimale øjeblikkelige hastighed for sporet var 0,078 ± 0,012 μm/s. De fleste nukleoider ikke fortrænge langt fra deres oprindelige positioner, men viste kort afstand tilfældige bevægelser, der sandsynligvis var begrænset til mitokondrielle netværk, som en overlay af spor på mitokondrielle billeder antyder (Figur 5B). Få hurtige retningsbestemte forskydninger opstod i løbet af en typisk tidsserie (Film 1).

Figure 1
Figur 1: Sammenligning af picoGreen og SG levende celle mærkning. A549-celler blev inkuberet med picoGreen eller SG ved angivne fortyndinger og afbildet. Repræsentative synsfelter for de mærkede celler i den grønne kanal. LSM880 Airyscan FAST, 20x/air mål, Scale bar = 50 μm. Enkelte optiske sektioner. Hvide firkanter markerer de områder, der vises ved en højere forstørrelse til højre for hele 423 x 423 μm synsfelter. For fortyndinger for 1:1.000 og 1:2.000 vises de samme billeder ved to lysstyrkeindstillinger: "standard"-lysstyrkeindstillingerne, der er optimeret til 1:10.000 fortynding, og indstillingerne for "reduceret lysstyrke" justeret for at undgå detektormætning. Dette tal er blevet ændret fra Jevtic et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: SG-lokalisering i levende celler ved mærkning ved forskellige koncentrationer. HeLa-celler blev inkuberet i 30 min. med en blanding af 0,25 μM Mitotracker CMXRos Red og den angivne SG-fortynding. Løsningen blev erstattet med DMEM, og billederne blev erhvervet på en LSM880 Airyscan mikroskop, 63x 1,4 olie mål, med en sekventiel erhvervelse af farvekanaler. Enkelte optiske skiver vises Vægtstang = 10 μm). Dette tal er blevet ændret fra Jevtic et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: HeLa-celler under mærkning med SYBR Gold (SG). Først blev levende HeLa-celler mærket med Mitotracker CMXRos Red og vasket. SG (endelig fortynding 1:10.000 i DMEM) blev tilføjet til cellerne og en tid bortfalder serie blev erhvervet. LSM880 mikroskop, 63x 1,4 Olie mål, sekventiel erhvervelse. Z-stakke blev erhvervet på hvert tidspunkt. De maksimale intensitetsfremskrivninger vises. (A) Gennemsnitlige intensiteter af SG fluorescens over tid i flere regioner af interesse. ( B) Repræsentative synsfelter, der viser de interesseområder, hvor SG-fluorescens blev målt (farvede rektangler). (C) Et synsfelt på flere tidspunkter under inkubation med SG. Et kvadratisk område markeret med hvid streg vises ved en højere forstørrelse i højre kolonne. Dette tal er blevet ændret fra Jevtic et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Effekt af fiksering og permeabilisering på SG-lokalisering i cellerne. HeLa celler blev plettet med SG (lager fortyndet 1:10,000) og Mitotracker CMXRos Red (0,25 μM) i 30 min. Enkelt optiske skiver blev erhvervet på en roterende disk mikroskop; sekventiel erhvervelse; skalabar = 10 μm. (A) Levende HeLa-celler farves med SG. (B) Levende HeLa celler farves med SG og derefter fastgjort med 2% PFA i PBS i 30 min. (C) Live HeLa celler farves med SG, derefter fastgjort med 2% PFA i PBS i 30 min og gennemsyret med 0,1% Triton X100 i 15 min. På det nederste panel vises det samme billede, men lysstyrken i den grønne kanal er indstillet højere. (D) HeLa celler fast med 2% PFA, gennemsyret med 0,1% Triton X100 i 15 min, og derefter farves med SG og Mitotracker CMXRos Red. For at erhverve de billeder, der er vist i (D),emccd gevinst af kameraet til den grønne kanal blev reduceret med en faktor på 12 i forhold til A-C for at undgå overeksponering. Dette tal er blevet ændret fra Jevtic et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Nukleoid sporing på live SIM-billeder. Repræsentative billeder af et synsfelt af SG farvede celler. Bund: SIM-billedet med to farver, der er taget før anskaffelsen af tidsforskydningsserien. Grøn = SG-kanal; magenta = mitotracker kanal. Top: nukleoid spor fra en 50-frame SIM tidsserie i SG kanal (Movie 1); frame tid = 1,8 s; sporing af Imaris 8.4.1 software. Spor er farvekodede ved maksimal sporhastighed (μm/s); Elyra PS.1, SIM-tilstand, 100x/1.46 Oliemål; Vægtstang = 10 μm. Dette tal er blevet ændret fra Jevtic et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Film 1: SIM-tidsforskydningsserie, der viser repræsentative SG-farvede celler. Skalabar = 5 μm. Detekterede mitokondrielle nukleoider er markeret som hvide kugler. Spor visualiseres som "Dragon tails" (8 rammer længde) og farvekodede i henhold til deres maksimale instant hastigheder (farve bar i nederste højre viser hastigheder i μm / s). Mitokondrielle nukleoider sporing og visualisering af Imaris 8.4.1 software. Denne video er blevet offentliggjort i Jevtic et al.27. Klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere kritiske komponenter i protokollen: For at opnå præferencemærkning af mitokondrielt DNA skal koncentrationen af DNA-bindende farvestof under inkubation holdes meget lav (f.eks. en 1:10.000 fortynding af et typisk kommercielt lager), og inkubationstiden skal være 30 min. Inkubationstiden må aldrig overstige 1 h. SYBR Gold-farvestoffet bør anvendes. andre DNA-bindende farvestoffer er ikke lyse nok til at generere et stærkt signal ved mærkning ved lav koncentration.

Begrænsningen af vores protokol er, at farvestoffet vaskes ud fra mitokondrielle nukleoider under et gennemtrængelsestrin. Derfor er den beskrevne procedure ikke egnet til konventionelle immunfluorescensprotokoller. I dette tilfælde kan nukleoider i faste celler effektivt mærkes med andre teknikker, såsom antistoffer mod DNA eller mitokondrielle transskriptionsfaktorer (TFAM).

Direkte mærkning af mitokondrielle nukleoider med DNA-bindende organisk farvestof har fordele i forhold til fluorescerende proteinmærkning: enhver type celle kan mærkes inden for <1 h, uden tidsmæssige eller andre begrænsninger af forbigående eller stabilt udtryk for fluorescerende proteinmærkede konstruktioner. Også i de nuværende protokoller, konventionelle fluorescerende protein-tagging af TFAM blev rapporteret at forårsage artefakter. Desuden pletter SG effektivt kun nukleoider, hvis mitokondrielt membranpotentiale er intakt. Dette forhindrer billede erhvervelse af biologisk irrelevante "syge" og døde celler, som ikke kan undgås med FP-baseret farvning. Endelig opnåede tidligere offentliggjorte protokoller baseret på DNA-bindende farvestoffer ikke præferentiel farvning af mitokondrielt DNA.

Den foreslåede protokol er hurtig og enkel, således antager vi, at det vil blive udbredt til levende billeddannelse af mitokondrielle nukleoider ved forskellige fluorescens teknikker, både diffraktion begrænset (f.eks laserscanning confocal, TIRF, osv.) samt super-opløsning SIM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Asifa Akhtar og Angelika Rambold (både Max Planck Institut for Immunobiology og Epigenetics) for at give HeLa celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elyra PS1 Carl Zeiss multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)
High glucose DMEM GIBCO/ThermoFisher 31966021
ibidi 35 mm dish, glass bottom Ibidi Gmbh 81158
ibidi 8-well microSlide, glass bottom Ibidi Gmbh 80827
Imaris 8.4.1 Bitplane/Oxford Instruments image porcessing and visualisation software package
iXon 885 Andor Technologies EMCCD camera with back-illuminated sensor
LSM880 Airyscan Carl Zeiss laser scanning confocal microscope with array detector
Mitotracker CMXRos Red ThermoFischer M7512 red live cell mitochondrial stain
Mitotracker Deep Red FM ThermoFischer M22426 far red live cell mitochondrial stain
picoGreen ThermoFischer P7581 cell permeant DNA stain
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective Carl Zeiss
SYBR Gold ThermoFischer S11494 cell permeant DNA stain
Zen Black 2012 software Carl Zeiss image acquisition and processing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).

Tags

Biologi mitokondriel nukleoid mitokondrielt DNA asymmetrisk cyanin DNA fluorescerende plet struktureret belysning mikroskopi levende celle mikroskopi
Specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider til tidsforfald struktureret belysning mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S.… More

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter