Summary
Protokollet beskriver specifika märkning av mitokondriell nukleoider med en kommersiellt tillgängliga DNA gel fläck, förvärv av time lapse serie levande märkta celler av super-upplösning strukturerad belysning mikroskopi (SR-SIM), och automatisk spårning av nukleoid rörelse.
Abstract
Mitokondriella nukleoider är kompakta partiklar som bildas av mitokondriella DNA-molekyler belagda med proteiner. Mitokondriellt DNA kodar tRNAs, rRNAs och flera viktiga mitokondriella polypeptider. Mitokondriella nukleoider dela upp och distribuera inom den dynamiska mitokondriellt nätverk som genomgår fission / fusion och andra morfologiska förändringar. Högupplöst levande fluorescensmikroskopi är en enkel teknik för att karakterisera en nukleoid position och rörelse. För denna teknik, nukleoider är vanligen märkta genom fluorescerande taggar av deras proteinkomponenter, nämligen transkriptionsfaktor a (TFAM). Emellertid, denna strategi behöver överuttryck av en fluorescerande protein-taggade konstruktion, som kan orsaka artefakter (rapporteras för TFAM), och är inte möjligt i många fall. Organiska DNA-bindande färgämnen har inte dessa nackdelar. Men de visar alltid färgning av både nukleära och mitokondriella DNAs, vilket saknar specificitet till mitokondriella nukleoider. Genom att ta hänsyn till de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos sådana färgämnen, valde vi en nukleinsyra gel fläck (SYBR Gold) och uppnått förmånlig märkning av mitokondriella nukleoider i levande celler. Egenskaper hos färgen, särskilt dess höga ljusstyrka vid bindning till DNA, tillåter efterföljande kvantifiering av mitokondriell nukleoid rörelse med hjälp av tidsserier av super-upplösning strukturerad belysning bilder.
Introduction
Cirkulär 16,5 kbp DNA-molekyler utgör det genetiska materialet i mitokondrierna, kodning 22 tRNAs, 2 rRNAs och 13 polypeptider som behövs för mitokondriellt oxidativa fosforylering komplex. Mitokondriellt DNA bundet till mitokondriell transkriptionsfaktor a (TFAM) och flera andra proteiner bildar mitokondriella nukleoider1,2,3,4. Mitokondriella nukleoider flyttar och omfördelar mellan komponenterna i mitokondriellt nätverk5,,6 under sin morfologiska ombyggnad, fission eller fusion beroende på cellcykelfas, stress och andra faktorer (ses över i Pernas et al.7). Dessutom är rörelsen av mitokondriella nukleoider, inblandad i systemisk lupus erythematosus sjukdom8 och kan spela en roll i andra sjukdomar. Fluorescensmikroskopi är en enkel teknik för levande cellstudier av organeller, men tekniken har en upplösning på >200 nm, vilket är större än storleken på mitokondriella nukleoider (~100 nm9,10,11,12). Denna gräns har kringgåtts av så kallade "super-resolution" tekniker, såsom stimulerad utsläpp utarmning (STED) och enda molekyllokalisering mikroskopi (SMLM)13,14. Hittills har mitokondriella nukleoider och andra DNA avbildas i levande celler av direkt stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM)15. Fina submitokondriella strukturer med positioner som korrelerar med mtDNA observerades av STED i levande celler16. Dessa superupplösningstekniker kräver dock hög belysningsintensitet, vilket orsakar fototoxiska effekter på levande celler17. Därför är time lapse imaging av mitokondriella nukleoider med upplösning bortom diffraktion gränsen utmanande. För att åtgärda detta använde vi superupplösningsstrukturerad belysningsmikroskopi (SR-SIM)18. SIM kräver en mycket lägre belysning effekt dos än STED och SMLM19. Dessutom tillåter SIM, i motsats till STED- och SMLM-tekniker, enkel tredimensionell (3D) bildbehandling med flera färger, och det kräver inte särskilda fotofysiska egenskaper hos fluoroforeerna eller bildbuffertkompositionen19.
Den konventionella strategin för märkning mitokondriell nukleoider i levande celler är fluorescerande märkning av ett mitokondriellt nukleoidprotein, såsom TFAM20. I många fall är dock denna strategi inte lämplig. Dessutom ger överuttryck av fluorescerande protein-märktA TFAM en allvarlig artefakt21. Märkning av DNA med organiska färgämnen har fördelar jämfört med en fluorescerande protein (FP)-baserad strategi. Organiska färgämnen är fria från begränsningar relaterade till FP-märkning: de kan användas för alla typer av celler eller vävnader och kan tillämpas när som helst i ett experiment. Live cell imaging av mitokondriellt nukleoider har rapporterats med flera DNA-bindande färgämnen: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, och picoGreen15,25,26. En betydande nackdel med de flesta DNA-bindande färgämnen för nukleoid märkning är att de färga alla DNA i cellen. Inriktning ett färgämne enbart till mitokondriellt DNA är mycket önskvärt. För att uppnå detta är noggrant urval av ett färgämne som har lämpliga fysikalisk-kemiska egenskaper nödvändigt. Lipofila färgämnen som har delocalized positiv laddning, såsom rhodamin 123, är kända för att ackumuleras i levande mitokondrierna, som bevarar deras negativa membran potential. Dessutom bör ett idealiskt färgämne för specifik märkning av mitokondriella nukleoider binda DNA med hög affinitet och avge ljus fluorescens på DNA-bindning. Med tanke på dessa krav är vissa cyaniner lovande (t.ex. picoGreen), men kärn-DNA färgas rikligt av dessa färgämnen samtidigt med mitokondriellt DNA15,25,26. Det nuvarande protokollet beskriver specifika märkning av mitokondriella nukleoider i levande celler med en annan cyanin färgämne, SYBR Gold (SG), och spårning av nukleoider i tid förfaller super-upplösning SIM videor. Dessutom kan SG-färgade levande celler avbildas av alla typer av inverterad fluorescerande mikroskop (konfokal, snurrande skiva, epifluorescens, etc.) lämplig för levande celler och utrustade med en 488 nm ljuskälla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla cellinjer som nämns här var odlade i hög glukos Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), glutamin, penicillin/streptomycin och pyruvat. Jämvikt alla medier och kosttillskott som ska användas på dagen för märkning och bildbehandling genom uppvärmning av dem upp till 37 °C i en inkubator inställd på 5% CO2. Alla cellodlingsarbeten inklusive märkning sker under sterila förhållanden under en laminär flödeshuva.
1. Levande cell märkning
- En dag före märkningsproceduren, odling 4 x 105 HeLa celler i 2 ml medium i en 35 mm petriskål med #1,5 glasbotten. Flerbrunnskammare kan användas, men volymerna bör justeras proportionellt till brunnens volym. Späd cellfjädringen för att ha cirka 50 000 celler/ml och utsäde 2 ml av cellfjädringen i en 35 mm petriskål.
- Bered följande utspädningar av SYBR Gold (SG) kommersiella lager lösning: 1:5.000. Förbered Mitotracker Deep Red (långt röd fläck) eller Mitotracker CMXRos Röd (röd fläck) (Tabell över material;kommersiella lager utspädd 1:2000) i fenol röd-fri odling medium. Förbered samma uppsättning utspädningar av picoGreen som för SG.
OBS: De lösningar som beskrivs i steg 1.2 är 2x märkningslösningar. Skydda alla lösningar som innehåller fluorescerande färgämnen från ljus så mycket som möjligt. - Tvätta de vidhäftande cellerna med 2 ml PBS en gång. Tillsätt 1 ml fenol rödfri odlingsmedium till 35 mm petriskål. För en 8-vält kammarens bild, använd en volym som motsvarar 1/2 av den totala brunnskapaciteten (t.ex. tillsätt 125 μL om den totala brunnskapaciteten är 250 μL).
- Tillsätt 1 mLof den 2x märkningslösning som bereds i steg 1,2 till 35 mm Petriskål. För en 8-väl kamrad bild, använd en volym som motsvarar 1/2 av den totala brunnskapaciteten. Inkubera cellerna i 30 min vid 37 °C under 5 % CO2.
OBS: Inkubera inte cellerna med SG-märkningslösning längre än 1 h, eftersom längre inkubation kommer att orsaka märkning av kärn-DNA. - Sug försiktigt på mediet som innehåller fluorescerande färgämnen och tvätta cellerna en gång med PBS.
- Tillsätt fenol rödfri cell odling medium och hålla cellerna i mörkret i en CO2 inkubator vid 37 °C tills bildbehandling.
- Bildlevande celler på ett SR-SIM-mikroskop utrustat med en inkubationsenhet (se nedan).
2. SR-SIM-bildförvärv
- Installera en scen-top inkubator på mikroskop scenen. Ställ in önskad temperatur och CO2-koncentration (t.ex. 37 °C och 5 % för däggdjursceller) och håll dig varm i minst 1 h innan bildinsamling påbörjas.
- Slå på alla komponenter i SR-SIM-mikroskopet, inklusive lasrarna, och låt dem värmas upp i minst 1 h.
- Välj ett högt förstoringsmål med hög nedsänkning (NA) (t.ex. 100x 1,46 NA-olja) som rekommenderas för SR-SIM av mikroskoptillverkaren.
- Montera en kamrad rutschkana eller 35 mm skål med märkta celler (från steg 1.6) på det ruvade mikroskopstadiet.
- Leta upp det intressanta området på provet, helst med okulär. För att uppnå bästa SR-SIM-bildkvalitet, välj de celler som är väl fästa vid glaset.
- Använd en back-konserverad high-end elektron multiplicera laddningskopplad enhet (EM-CCD) kamera för att förvärva SR-SIM-bilder.
- Med hjälp av programvaran för bildinsamling ställer du in en hög EM-förstärkning som rekommenderas för den kamera som används (t.ex. 300).
- Innan du förvärvar time lapse-serien för nukleoid spårning, förvärva en tvåfärgad SR-SIM-bild av samma synfält: en kanal för mitokondriell färgning och en annan för SG. Ställ in den första färgkanalen som är lämplig för den mitokondriella fläck som används (t.ex. för en mycket röd mitokondriell fläck, ställ in excitationen på 633 nm eller längre och ett utsläppsfilter på 650 nm. För SG-signalen ställer du in excitationen på 488 nm och ett 500–550 nm bandpassutsläppsfilter.
- Med hjälp av programvaran, ställ in lägsta lasereffekt möjligt för både 488 nm och långt röda färglinjer.
OBS: En typisk inställning är 1% laseruteffekt justeras av en acousto-optisk tunable filter (AOTF). - Om SIM-mikroskopet endast förvärvar kanaler sekventiellt (installation av en kamera) stänger du av den långröda fläckdetekteringskanalen.
- Ställ in förvärvet av ett enda fokalplan genom att stänga av Z-stackens förvärv genom att avmarkera Z-stackboxen i programvaran.
- Ställ in så kortaste möjliga exponeringstiden för EM-CCD-kameran.
- Ange tre rotationer i rutnätet i stället för fem rotationer.
- För att öka bildhastigheten, i fliken Förvärv av programvaran, ställa in kameran att läsa data endast från det centrala området av kamerasensorn i stället för "Full Chip".
OBS: Om du till exempel växlar från att läsa ett område på 1 000 x 1 000 pixlar full sensor till att bara läsa 256 x 256 pixlar kan kameraexponeringstiden minskas från 50 ms till 13,4 ms och den totala bildrutetiden från 1,8 s till 1,2 s. Om bara en central del av kamerasensorn läss, då synfältet kommer att vara mycket liten för en 63x eller 100x mål som vanligtvis används för SR-SIM. En kortare exponeringstid minskar signal-brus-förhållandet mellan bilderna. - Optimera lasereffekt och kameraexponeringstid: skaffa SR-SIM tvådimensionella (2D) bilder av märkta celler vid flera lasereffektvärden (t.ex. 0,5 %, 1%, 1,5 %, 2%) och flera exponeringstider (t.ex. 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
- Bearbeta de rådatasuppsättningar (se steg 3.1).
- Välj laserkraft och kameraexponeringstider som ger SIM-bilder med ljusa fläckar i mitokondrierna (dvs. nukleoiderna) med små eller inga artefakter som genereras av SIM-bearbetning. Inspektera områdena utanför mitokondrierna (t.ex. 1 % effekt av 488 nm solid state laser och 25 ms exponering av EM-CCD-kamera).
- Starta förvärvet av time lapse-serien med hjälp av inställningarna optimerade i steg 2.15–2.17.
3. Databehandling och analys
- Bearbeta råa SIM-datauppsättningar med den strukturerade belysningsmodulen i en lämplig programvara (Tabell över material): välj kryssrutan Auto för SIM-bearbetningsparametrar. För automatisk bearbetning av flera filer använder du batchbearbetningsverktyget, avmarkerar Använd aktuell för batch, klickar på Kör batch och väljer flera filer för SIM-bearbetning.
- Konvertera SIM-bearbetade tidsseriedatauppsättningar till ims-format med Imaris filkonverterprogramvara (dvs. den version som motsvarar den version av Imaris-programvaran).
- Öppna en konverterad fil i programvaran (version 8.4.1 eller senare) som har en licens för modulen Härstamning (eller Spår).
- Starta skaparguiden "Spots" genom att klicka på Ikonen Lägg till nya platser. En guide för att skapa kommer att startas.
- Välj fliken Skapa i guiden.
- Klicka på Spåra fläckar (över tid) i det första steget i guiden och gå vidare till det andra steget i guiden.
- Ställ in uppskattad XY Diameter till 0,1-0,15 μm, klicka på Bakgrund subtraktion och gå vidare till det tredje steget.
- Justera tröskeln i filtret "Kvalitet" genom att dra den vertikala linjen i histogrammet så att majoriteten av nukleoiderna detekteras som "fläckar", medan artefakterna inte upptäcks (dvs. de upptäckta fläckarna markeras som bollar överlagrad på bilden). Kontrollera om så är fallet på varje ram och justera tröskelvärdet om det behövs. Fortsätt till det fjärde och sedan till det femte steget i guiden.
- Välj algoritmen För automatisk rörelse. Ställ in maxavståndet på 0,5 μm. Ställ in Max gapstorlek på 0.
- Titta på varje bildruta i tidsserien och kontrollera om några falska spår ritas och om några luckor mellan spåren introduceras (spår som skapats av guiden med aktuella inställningar markeras omedelbart som linjer som läggs över på bilden). Justera "Max avstånd" om det behövs. Fortsätt till det sjätte steget i guiden. Välj filtret Spårvaraktighet och ange ett tröskelvärde på 3–5 s.
- Om de platser eller spår som för närvarande identifieras inte är optimala går du tillbaka till de föregående stegen i guiden med hjälp av navigeringsknappar (längst ned i guidefönstret) som behövs för att finjustera alla parametrar för att skapa fläckar eller spår.
- När de finjusterade parametrarna tillåter programvaran att upptäcka alla fläckar och bygga spår korrekt, klicka på den gröna pilen navigeringsknappen i guiden för att bekräfta skapandet av spåren.
- Extrahera spårens statistik genom att klicka på ikonfönstret Statistik. Välj de nödvändiga statistikparametrarna (flikarna Detaljerade värden och Medelvärden under Statistik) och exportera värdena som csv-filer genom att klicka på diskettenhetsikonen för kvantifiering och visualisering.
OBS: Maximal spårhastighet, genomsnittlig spårhastighet, spårlängd och spårförskjutning är exempel på parametrar som är viktiga. - Om bilddatauppsättningen behöver visas eller publiceras skapar du ögonblicksbilder och/eller videofiler som representerar time lapse-serien med valfrit överlagrade spår med verktygen Ögonblicksbild eller Animering.
4. Confocal Bild Förvärv
- Installera en steg-top inkubator på mikroskopstadiet, ställ in önskad temperatur och CO2-koncentration (dvs. 37 °C och 5% för däggdjursceller) och håll dig varm i minst 1 h innan bildinsamling påbörjas.
- Slå på alla komponenter i ett konfokal laserscanningsmikroskop, inklusive lasrarna, och låt dem värmas upp i minst 1 h.
- Välj ett önskat medel till högförstoringsmål och rumslig provtagning enligt Nyquists kriterier.
- För SG-kanalen ställer du in magnetiseringen på 488 nm och ett detektionsområde på 500–550 nm. För mitokondriell fläckkanal, inställd på 561 nm och 570–630 nm utsläpp för ett rött färgämne, eller 633 nm excitation och >650 nm utsläpp för en långt röd färgämne.
- Ställ in lägsta möjliga lasereffekt (vanligtvis 1% eller mindre) som tillåter förvärv av signaler med PMT detektor vinster på 700 mV.
- Förvärva tvåfärgskonfokala bilder av cellerna, där mitokondriella nukleoider detekteras i "SG-kanalen" och mitokondrierna detekteras i den "röda" eller "långt röda" kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av levande cellmärkning med SG
För det första kännetecknades fördelningen av SG i cellerna vid inkubation med färgämnet vid olika utspädningar av konfokalmikroskopi. Efter inkubation med höga koncentrationer av SG eller picoGreen, båda färgämnen mestadels märkt atomkärnor och visade en punktat färgning i cytoplasman (figur 1), på samma sätt som publicerade data för en annan positivt laddad cyanin färgämne (dvs. picoGreen)15. Vid inkubation med SG vid 1:10 000 spädning uppträdde dock svag färgning i atomkärnorna, medan vi i cytoplasman observerade ett mönster av ljusa fläckar (figur 1). Å andra sidan gav inkubation med picoGreen färgämne utspädd 1:10.000 mestadels nukleär färgning. SG-signalen var mycket ljusare än picoGreen vid samma koncentration. Data visade att SG är mer lämplig för bildbehandling mitokondriellt DNA än andra liknande DNA-bindande färgämnen.
För att bekräfta att de ljusa prickarna är lokaliserade i mitokondrierna, färgade vi levande celler samtidigt med SG och långt röd mitokondriell fläck. Det senare är en positivt laddad cell genomsläpplig organiskt färgämne som ackumuleras i mitokondrierna av levande celler. Vid inkubation med SG vid 1:10.000 och 1:50.000 utspädningar, nästan alla SG färgning inträffade i mitokondrierna, medan vid märkning på 1:500 och 1:1,000 utspädningar, betydande färgning av kärnor och cytoplasman inträffade (Figur 2).
Vidare karakteriserade vi tidsförloppet för färgning levande celler med SG genom tid förfaller mikroskopi (Figur 3). Tomterna av SG fluorescens intensitet i mitokondrierna vs tid (figur 3B) föreslog att efter 45 min, nukleoid färgning var nära mättnad. Därför rekommenderar vi inkubationstider på ~30–60 min.
Vi testade hur SG intracellulära fördelningen förändringar vid fixering och / eller permeabilization av cellerna. Fixering (2% paraformaldehyd [PFA]) av de levande färgade cellerna orsakade en liten omfördelning av färgämnet till kärnan (figur 4A,B). Permeabilization av de fasta cellerna (0,1% Triton X100) elimineras SG prickade mönster i mitokondrierna, och färgning av atomkärnor var dominerande (Figur 4C). Om SG lades till cellerna efter fixering och permeabilisering, fördelas den jämnt över cytoplasman och atomkärnorna (figur 4D). Således kan SG märkta celler fastställas vid behov, men färgen är inte lämplig för protokoll som kräver permeabilisering.
Live cell SR-SIM och mitokondriell nukleoider spårning
Levande celler costained med SG och en långt röd mitokondriell fläck (Tabell av material) var 3D avbildas av en super-upplösning SIM-teknik. Liksom i de konfokala bilderna (figur 2) föreföll mitokondriella nukleoider som ljusa fläckar inom mitokondrierna (figur 5A). Vidare fick vi en tidsserie med 2D SIM-bilder och spårade nukleoidernas positioner med en upplösning som överskrider diffraktionsgränsen. Omedelbart innan tidsserien vi förvärvade SIM 3D stackar i SG och mitokondriellt fläck kanaler. Sedan fick vi en tidsserie i SG-kanalen bara och spårade mitokondriella nukleoider för att kvantifiera deras rörelser. Spårmedelhastigheten var 0,042 μm/s och den maximala omedelbara hastigheten på spåret var 0,078 ± 0,012 μm/s. Majoriteten av nukleoider inte tränga långt från sina ursprungliga positioner men visade kort avstånd slumpmässiga rörelser som förmodligen var begränsade till mitokondriellt nätverk, som en överlagring av spår på mitokondriellt bilder antyder (Figur 5B). Få snabba riktningsförskjutningar inträffade under en typisk tidsserie (Film 1).
Figur 1: Jämförelse av picoGreen och SG levande cell märkning. A549 celler inkuberades med picoGreen eller SG vid angivna utspädningar och avbildas. Representativa bildfält för de märkta cellerna i den gröna kanalen. LSM880 Airyscan FAST, 20x/luftmål, Skala bar = 50 μm. Enda optiska sektioner. Vita rutor markerar de områden som visas vid en högre förstoring till höger om hela 423 x 423 μm synfält. För utspädningar av 1:1 000 och 1:2 000 visas samma bilder med två ljusstyrkraftsinställningar: "standardinställningarna" för ljusstyrka optimerade för 1:10 000 utspädning och inställningarna för "minskad ljusstyrka" justeras för att undvika detektormättnad. Denna siffra har ändrats från Jevtic et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: SG-lokalisering i levande celler vid märkning vid olika koncentrationer. HeLa celler inkuberades i 30 min med en blandning av 0,25 μM Mitotracker CMXRos Red och den angivna SG utspädning. Lösningen ersattes med DMEM, och bilderna förvärvades på en LSM880 Airyscan mikroskop, 63x 1,4 olja mål, med en sekventiell förvärv av färgkanaler. Enstaka optiska skivor visas Skala bar = 10 μm). Denna siffra har ändrats från Jevtic et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: HeLa-celler under märkning med SYBR Gold (SG). Först, levande HeLa celler var märkta med Mitotracker CMXRos Röd och tvättas. SG (slutlig utspädning 1:10,000 i DMEM) lades till cellerna och en time lapse-serie förvärvades. LSM880 mikroskop, 63x 1.4 Oljemål, sekventiellt förvärv. Z-stackar förvärvades vid varje tidpunkt. De högsta intensitetsprognoserna visas. a)Medelmåttigheter av fluorescens av sg över tiden i flera regioner av intresse. b)Representativa synfält som visar de regioner av intresse där fluorescens av sg mättes (färgade rektanglar). C)Ett synfält vid flera tidpunkter under inkubation med SG. Ett fyrkantigt område som är markerat med vit linje visas vid en högre förstoring i den högra kolumnen. Denna siffra har ändrats från Jevtic et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekten av fixering och permeabilisering på SG-lokalisering i cellerna. HeLa celler var färgas med SG (lager utspädd 1:10.000) och Mitotracker CMXRos Red (0,25 μM) för 30 min. Enda optiska skivor förvärvades på en spinning skivmikroskop; Sekventiellt förvärv. skalstång = 10 μm.(A) Levande HeLa-celler färgade med SG. (B)Levande HeLa-celler färgade med SG och sedan fast med 2% PFA i PBS i 30 min.(C)Live HeLa celler färgas med SG, sedan fast med 2% PFA i PBS för 30 min och permeabilized med 0,1% Triton X100 för 15 min. På den nedre panelen visas samma bild, men ljusstyrkan i den gröna kanalen är högre. (D)HeLa celler fast med 2% PFA, permeabilized med 0,1% Triton X100 för 15 min, och sedan färgas med SG och Mitotracker CMXRos Red. För att hämta bilderna som visas i (D) minskade EMCCD-förstärkningen av kameran för den gröna kanalen med en faktor på 12 i jämförelse med A-C för att undvika överexponering. Denna siffra har ändrats från Jevtic et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Nukleoid spårning på live SIM-bilder. Representativa bilder av ett synfält av SG-färgade celler. Nederkant: den SIM-bild med två färger som tagits före förvärvet av time lapse-serien. Grön = SG-kanal; magenta = mitotracker kanal. Överst: nukleoidspår från en 50-frame SIM-tidsserie i SG-kanalen (Film 1); tid för inramning = 1,8 s; spårning av Imaris 8.4.1 programvara. Spåren färgkodas med maximal spårhastighet (μm/s). Elyra PS.1, SIM-läge, 100x/1.46 Oljemål; Skalstång = 10 μm. Denna siffra har ändrats från Jevtic et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: SIM time lapse-serien som visar representativa SG-färgade celler. Skala bar = 5 μm. Detekterade mitokondriella nukleoider är markerade som vita sfärer. Spår visualiseras som "Dragon tails" (8 bildrutor längd) och färgkodade enligt deras maximala omedelbara hastigheter (färgfältet längst ner till höger visar hastigheter i μm / s). Mitokondriell nukleoider spårning och visualisering av Imaris 8.4.1 programvara. Denna video har publicerats i Jevtic et al.27. Klicka här för att se den här videon (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera kritiska komponenter till protokollet: För att uppnå förmånlig märkning av mitokondriellt DNA bör koncentrationen av DNA-bindningsfärgen under inkubationen hållas mycket låg (t.ex. en 1:10 000 utspädning av ett typiskt kommersiellt lager) och inkubationstiden bör vara 30 min. Inkubationstiden får aldrig överstiga 1 h. SYBR Guldfärgämne bör användas. andra DNA-bindande färgämnen är inte tillräckligt ljusa för att generera en stark signal vid märkning vid låg koncentration.
Begränsningen av vårt protokoll är att färgen tvättas ut från mitokondriella nukleoider under en permeabilization steg. Därför är det beskrivna förfarandet inte lämpligt för konventionella immunofluorescensprotokoll. I detta fall kan nukleoider i fasta celler effektivt märkas med andra tekniker, såsom antikroppar mot DNA eller mitokondriell transkription faktorer (TFAM).
Direkt märkning av mitokondriella nukleoider med DNA-bindning organiskt färgämne har fördelar jämfört med fluorescerande proteinmärkning: alla typer av celler kan märkas inom <1 h, utan tidsmässiga eller andra begränsningar av övergående eller stabila uttryck för fluorescerande protein-märkta konstruktioner. Också, i nuvarande protokoll, konventionella fluorescerande protein-märkning av TFAM rapporterades orsaka artefakter. Dessutom fläckar SG effektivt nukleoider endast om mitokondriellt membran potential är intakt. Detta förhindrar bildinsamling av biologiskt irrelevanta "sjuka" och döda celler, som inte kan undvikas med FP-baserad färgning. Slutligen, tidigare publicerade protokoll baserade på DNA bindande färgämnen inte uppnå förmånsfärgning av mitokondriellt DNA.
Det föreslagna protokollet är snabbt och enkelt, så vi antar att det kommer att användas i stor utsträckning för levande avbildning av mitokondriella nukleoider av olika fluorescenstekniker, både diffraktion begränsad (t.ex. laserscanning confocal, TIRF, etc.) samt super-upplösning SIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Asifa Akhtar och Angelika Rambold (både Max Planck Institute for Immunobiology och Epigenetics) för att tillhandahålla HeLa celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| High glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35 mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
References
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
