Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/60003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

Summary

Het protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden met een commercieel verkrijgbare DNA-gel vlek, verwerving van time lapse-serie van live gelabelde cellen door super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM), en automatische tracking van nucleoïde beweging.

Abstract

Mitochondriale nucleoïden zijn compacte deeltjes gevormd door mitochondriale DNA-moleculen bedekt met eiwitten. Mitochondriaal DNA codeert tRNAs, rRNAs en verschillende essentiële mitochondriale polypeptiden. Mitochondriale nucleoïden verdelen en verspreiden binnen het dynamische mitochondriale netwerk dat splijting/fusie en andere morfologische veranderingen ondergaat. Hoge resolutie levende fluorescentie microscopie is een eenvoudige techniek om de positie en beweging van een nucleoïde te karakteriseren. Voor deze techniek worden nucleoïden vaak gelabeld door fluorescerende tags van hun eiwitcomponenten, namelijk transcriptiefactor a (TFAM). Echter, deze strategie moet overexpressie van een fluorescerende eiwit-tagged constructie, die artefacten kan veroorzaken (gemeld voor TFAM), en is niet haalbaar in veel gevallen. Organische DNA-bindende kleurstoffen hebben deze nadelen niet. Echter, ze tonen altijd vlekken van zowel nucleaire als mitochondriale AS, dus ontbreekt specificiteit voor mitochondriale nucleoids. Door rekening te houden met de fysisch-chemische eigenschappen van dergelijke kleurstoffen, hebben we een nucleïnezuurgelvlek (SYBR Gold) geselecteerd en een voorkeurslabel van mitochondriale nucleoïden in levende cellen bereikt. Eigenschappen van de kleurstof, met name de hoge helderheid bij binding aan DNA, maken latere kwantificering van mitochondriale nucleoïde beweging met behulp van tijdreeksen van super-resolutie gestructureerde verlichting beelden.

Introduction

Circulaire 16,5 kbp DNA-moleculen vormen het genetisch materiaal van mitochondriën, codering 22 tRNAs, 2 rRNAs, en 13 polypeptiden die nodig zijn voor mitochondriale oxidatieve fosforylation complexen. Mitochondriaal DNA gebonden aan mitochondriale transcriptie factor a (TFAM) en verschillende andere eiwitten vormen de mitochondriale nucleoïden1,2,,3,4. Mitochondriale nucleoïden bewegen en herverdelen tussen de componenten van het mitochondriale netwerk5,6 tijdens de morfologische remodellering, splijting of fusie, afhankelijk van de celcyclusfase, stress en andere factoren (beoordeeld in Pernas et al.7). Bovendien is de beweging van mitochondriale nucleoïden betrokken bij systemische lupus erythematosusziekte8 en kan een rol spelen bij andere ziekten. Fluorescentie microscopie is een eenvoudige techniek voor live-cel studies van organellen, maar de techniek heeft een resolutie van >200 nm, die groter is dan de grootte van mitochondriale nucleoïden (~ 100 nm9,10,11,12). Deze limiet is omzeild door zogenaamde "super-resolutie" technieken, zoals gestimuleerde emissie uitputting (STED) en single molecule lokalisatie microscopie (SMLM)13,14. Tot nu toe, mitochondriale nucleoïden en andere ED's werden afgebeeld in levende cellen door directe stochastische optische reconstructie microscopie (dSTORM)15. Fijne sub-mitochondriale structuren met posities die correleren met mtDNA werden waargenomen door STED in levende cellen16. Deze superresolutietechnieken vereisen echter een hoge verlichtingsintensiteit, die fototoxische effecten op levende cellen17veroorzaakt. Daarom is time lapse imaging van mitochondriale nucleoïden met resolutie voorbij diffractielimiet een uitdaging. Om dit aan te pakken, gebruikten we super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM)18. SIM vereist een veel lagere dosis verlichtingsvermogen dan STED en SMLM19. Bovendien, in tegenstelling tot STED en SMLM technieken, SIM maakt eenvoudige multicolor driedimensionale (3D) imaging, en het vereist geen bijzondere fotofysische eigenschappen van de fluorofoforen of imaging buffer samenstelling19.

De conventionele strategie voor het labelen van mitochondriale nucleoïden in levende cellen is fluorescerende tagging van een mitochondriaal nucleoïde eiwit, zoals TFAM20. In veel gevallen is deze strategie echter niet geschikt. Bovendien, overexpressie van fluorescerende eiwit-tagged TFAM produceert een ernstige artefact21. Etikettering van DNA met organische kleurstoffen heeft voordelen ten opzichte van een fluorescerende eiwit (FP)-gebaseerde strategie. Organische kleurstoffen zijn vrij van beperkingen in verband met FP tagging: ze kunnen worden gebruikt voor elk type cellen of weefsels en kan worden toegepast op elk moment van een experiment. Live cel beeldvorming van mitochondriale nucleoïden is gemeld met verschillende DNA-bindende kleurstoffen: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, en picoGreen15,25,26. Een wezenlijk nadeel van de meeste DNA-bindende kleurstoffen voor nucleoïde etikettering is dat ze alle DNA in de cel bevlekken. Het richten van een kleurstof uitsluitend op mitochondriaal DNA is zeer wenselijk. Om dat te bereiken, is een zorgvuldige selectie van een kleurstof die geschikte fysisch-chemische eigenschappen bezit noodzakelijk. Lipofiele kleurstoffen die gedelokaliseerde positieve lading bezitten, zoals rhodamine 123, zijn bekend om zich te accumuleren in levende mitochondriën, die hun negatieve membraan potentieel behouden. Bovendien moet een ideale kleurstof voor specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden DNA met hoge affiniteit binden en heldere fluorescentie uitzenden op DNA-binding. Gezien deze eisen zijn bepaalde cyanines veelbelovend (bijvoorbeeld picoGreen), maar nucleair DNA wordt overvloedig gekleurd door deze kleurstoffen gelijktijdig met mitochondriaal DNA15,25,26. Het huidige protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden in levende cellen met een andere cyanine kleurstof, SYBR Gold (SG), en het bijhouden van de nucleoïden in time lapse super-resolutie SIM-video's. Bovendien kunnen SG-gekleurde levende cellen worden afgebeeld door elk type omgekeerde fluorescerende microscoop (confocale, draaiende schijf, epifluorescentie, enz.) geschikt voor levende cellen en uitgerust met een 488 nm lichtbron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Alle hier genoemde cellijnen werden gekweekt in het medium (DMEM) van Dulbecco's Modified Eagle (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), glutamine, penicilline/strepputycine en pyruvate. Equilibrate alle media en supplementen te gebruiken op de dag van etikettering en beeldvorming door het opwarmen van hen tot 37 °C in een incubator ingesteld op 5% CO2. Alle celcultuurwerk inclusief etikettering vindt plaats in steriele omstandigheden onder een laminaire stroomkap.

1. Live Cell Labeling

  1. Een dag voor de etiketteringsprocedure, cultuur 4 x 105 HeLa cellen in 2 mL van medium in een 35 mm petrischaal met #1,5 glazen bodem. Meer goed chambered dia's kunnen worden gebruikt, maar volumes moeten proportioneel worden aangepast aan het volume van de put. Verdun de celsuspensie tot ongeveer 50.000 cellen/mL en zaad 2 mL van de celsuspensie in een petrischaal van 35 mm.
  2. Bereid de volgende verdunningen van SYBR Gold (SG) commerciële voorraad oplossing: 1:5,000. Bereid Mitotracker Deep Red (verre rode vlek) of Mitotracker CMXRos Red (rode vlek)(Tabel van materialen; commerciële voorraad verdund 1:2.000) in fenol rood-vrije cultuur medium. Bereid dezelfde set verdunningen van picoGreen als voor SG.
    LET OP: De oplossingen beschreven in stap 1.2 zijn de 2x labeling oplossingen. Bescherm alle oplossingen die fluorescerende kleurstoffen zoveel mogelijk tegen licht bevatten.
  3. Was de aanhangende cellen één keer met 2 mL PBS. Voeg 1 ml fenol roodvrij kweekmedium toe aan de petrischaal van 35 mm. Voor een dia met 8 goed kamers gebruikt u een volume dat gelijk is aan 1/2 van de totale putcapaciteit (voeg bijvoorbeeld 125 μL toe als de totale putcapaciteit 250 μL bedraagt).
  4. Voeg 1 mLof de 2x labeloplossing toe die in stap 1,2 tot 35 mm petrischaaltje wordt bereid. Voor een dia met 8 goed kamers gebruikt u een volume dat gelijk is aan 1/2 van de totale putcapaciteit. De cellen gedurende 30 minuten incubeer maken bij 37 °C onder 5% CO2.
    LET OP: Broed de cellen niet langer dan 1 uur met SG-etiketteringsoplossing uit, omdat een langere incubatie zal leiden tot etikettering van nucleair DNA.
  5. Zorgvuldig aspirate het medium met de fluorescerende kleurstoffen en was de cellen een keer met PBS.
  6. Voeg fenol roodvrije celcultuurmedium toe en houd de cellen in het donker in een CO2-incubator op 37 °C tot beeldvorming.
  7. Beeld levende cellen op een SR-SIM microscoop uitgerust met een incubatieeenheid (zie hieronder).

2. SR-SIM Image Acquisition

  1. Installeer een stage-top incubator op de microscoop podium. Stel de gewenste temperatuur en CO2-concentratie in (bijvoorbeeld 37 °C en 5% voor zoogdiercellen) en houd ten minste 1 uur warm voordat het beeld wordt verdaagd.
  2. Schakel alle onderdelen van de SR-SIM microscoop, inclusief de lasers, en laat ze opwarmen voor ten minste 1 uur.
  3. Kies een hoge vergroting, hoge numerieke diafragma (NA) onderdompeling doelstelling (bijvoorbeeld 100x 1,46 NA olie) aanbevolen voor SR-SIM door de microscoop fabrikant.
  4. Installeer een chambered slide of 35 mm schotel met gelabelde cellen (vanaf stap 1.6) op het geïncubeerde microscoopstadium.
  5. Zoek het interessegebied op het monster, bij voorkeur met oculair. Om de beste SR-SIM beeldkwaliteit te bereiken, kiest u de cellen die goed aan het glas zijn bevestigd.
  6. Gebruik een back-tinned high-end elektron vermenigvuldigen lading gekoppelde apparaat (EM-CCD) camera om SR-SIM beelden te verwerven.
  7. Stel met behulp van de software voor het verkrijgen van afbeeldingen een hoge EM-versterking in die wordt aanbevolen voor de gebruikte camera (bijvoorbeeld 300).
  8. Voordat u de time lapse-serie voor nucleoïde tracking, het verwerven van een twee-kleuren SR-SIM beeld van hetzelfde gezichtsveld: een kanaal voor mitochondriale vlekken en een ander voor SG. Stel het eerste kleurkanaal in dat geschikt is voor de gebruikte mitochondriale vlek (bijvoorbeeld voor een veel rode mitochondriale vlek stelt u de excitatie in op 633 nm of langer en een longpass-emissiefilter van 650 nm). Stel voor het SG-signaal de excitatie in op 488 nm en een 500-550 nm bandpass-emissiefilter.
  9. Met behulp van de software, stel de laagste laser vermogen mogelijk voor zowel 488 nm en veel rode vlek lijnen.
    LET OP: Een typische instelling is 1% laservermogen aangepast door een acousto-optische tunable filter (AOTF).
  10. Als de SIM-microscoop kanalen alleen sequentiële (single-camera setup) verwerft, schakel dan het ver-rode vlekdetectiekanaal uit.
  11. Stel de aankoop van een enkel brandpuntsvlak in door de Z-stack-acquisitie uit te schakelen door de Z-stack-box in de software los te maken.
  12. Stel de kortst mogelijke EM-CCD camera belichtingstijd in.
  13. Stel drie rotaties van het raster in plaats van vijf rotaties.
  14. Om de framesnelheid te verhogen, stelt u in het tabblad Acquisitie van de software de camera in om de gegevens alleen te lezen vanuit het centrale gebied van de camerasensor in plaats van "Full Chip".
    LET OP: Als u bijvoorbeeld overschakelt van het lezen van een gebied van 1.000 x 1.000 pixels volledige sensor naar het lezen van slechts 256 x 256 pixels, u de camerabelichtingstijd verkorten van 50 ms naar 13,4 ms en de totale frametijd van 1,8 s naar 1,2 s. Als slechts een centraal deel van de camerasensor wordt gelezen, dan zal het gezichtsveld zeer klein zijn voor een 63x of 100x doelstelling die meestal wordt gebruikt voor SR-SIM. Een kortere belichtingstijd vermindert de signaal-ruisverhouding van de beelden.
  15. Optimaliseer laserkracht en camerabelichtingstijd: verkrijg SR-SIM tweedimensionale (2D)-beelden van gelabelde cellen met verschillende laserkrachtwaarden (bijvoorbeeld 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) en meerdere blootstellingstijden (bijv. 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. De ruwe SIM-gegevenssets verwerken (zie stap 3.1).
  17. Kies laserkracht en camerabelichtingstijden die SIM-beelden opleveren met lichtpuntjes in de mitochondriën (d.w.z. de nucleoïden) met weinig of geen artefacten die worden gegenereerd door simverwerking. Inspecteer de gebieden buiten de mitochondriën (bijvoorbeeld 1% vermogen van de 488 nm solid-state laser en 25 ms blootstelling van EM-CCD camera).
  18. Start de acquisitie van de time lapse-serie met behulp van de instellingen die zijn geoptimaliseerd in stappen 2.15–2.17.

3. Gegevensverwerking en -analyse

  1. Verwerk ruwe SIM-datasets met de gestructureerde verlichtingsmodule van een geschikte software (Tabel van materialen):kies het automatische selectievakje voor SIM-verwerkingsparameters. Voor automatische verwerking van meerdere bestanden gebruikt u het batchverwerkingsgereedschap, schakelt u Stroom voor batch gebruikenuit, klikt u op Batch uitvoeren en selecteert u meerdere bestanden voor simverwerking.
  2. Sim-verwerkte tijdreeksgegevenssets converteren naar ims-formaat met Imaris-bestandsconvertersoftware (d.w.z. de versie die overeenkomt met de versie van Imaris-software).
  3. Open een geconverteerd bestand in de software (versie 8.4.1 of hoger) met een licentie voor de module Lineage (of Track).
  4. Start de wizard'Vlekken'maken door op pictogram Nieuwe plekken toevoegen te klikken. Er wordt een wizard voor creatie gelanceerd.
  5. Kies het tabblad Maken van de wizard.
  6. Klik in de eerste stap van de wizard op Vlekken bijhouden (na verloop van tijd) en ga naar de tweede stap van de wizard.
  7. Stel Geschatte XY-diameter in op 0,1-0,15 μm, klik op Achtergrondaftrekken en ga naar de derde stap.
  8. Pas de drempelwaarde in het filter"Kwaliteit" aan door de verticale lijn in het histogram te slepen, zodat de meerderheid van de nucleoïden worden gedetecteerd als "vlekken", terwijl de artefacten niet worden gedetecteerd (d.w.z. de gedetecteerde vlekken worden gemarkeerd als ballen die op de afbeelding zijn bedekt). Controleer of dit het geval is op elk frame en stel indien nodig de drempelwaarde aan. Ga naar de vierde en vervolgens naar de vijfde stap van de tovenaar.
  9. Kies het algoritme Autoregressive Motion. Stel de maximale afstand in op 0,5 μm. Stel de maximale tussenruimte in op 0.
  10. Kijk naar elk frame in de tijdreeks en controleer of er valse tracks worden getekend en of er hiaten tussen tracks worden geïntroduceerd (tracks die door de wizard met huidige instellingen zijn gebouwd, worden direct gemarkeerd als lijnen die op de afbeelding zijn bedekt). Pas indien nodig" Max Distance"aan. Ga naar de zesde stap van de tovenaar. Kies het filter Duur bijhouden en stel een drempelwaarde van 3-5 s in.
  11. Als de momenteel gedetecteerde vlekken of tracks niet optimaal zijn, gaat u terug naar de voorgaande stappen van de wizard met behulp van navigatieknoppen (onder aan het wizardvenster) die nodig zijn om een parameter voor vlekken of tracks te verfijnen.
  12. Wanneer de nauwkeurig afgestelde parameters de software in staat stellen om alle vlekken te detecteren en tracks correct te bouwen, klikt u op de groene pijlnavigatieknop in de wizard om het maken van de tracks te bevestigen.
  13. Haal de statistieken van de tracks eruit door op het pictogramvenster Statistieken te klikken. Kies de benodigde statistiekenparameters (tabbladenGedetailleerde en gemiddelde waarden onder Statistieken)en exporteer de waarden als csv-bestanden door op het pictogram Diskettestation te klikken voor kwantificering en visualisatie.
    LET OP: Maximale tracksnelheid, gemiddelde spoorsnelheid, spoorlengte en spoorverplaatsing zijn voorbeelden van parameters die belangrijk zijn.
  14. Als de afbeeldingsgegevensset moet worden gepresenteerd of gepubliceerd, maakt u vervolgens momentopnamen en/of videobestanden die de timelapse-reeks weergeven met optioneel bedekte tracks met behulp van de hulpprogramma's Momentopname of Animatie.

4. Confocal Image Acquisition

  1. Installeer een stage-top incubator op het microscoopstadium, stel de gewenste temperatuur en CO2-concentratie in (d.w.z. 37 °C en 5% voor zoogdiercellen) en houd minstens 1 uur warm voordat het beeld wordt vereengeïnstuwd.
  2. Schakel alle componenten van een confocale laserscanmicroscoop in, inclusief de lasers, en laat ze minstens 1 uur opwarmen.
  3. Kies een gewenste midden- tot hoge vergrotingsdoelstelling en ruimtelijke bemonstering volgens Nyquist-criteria.
  4. Stel voor het SG-kanaal de excitatie in op 488 nm en een detectiebereik van 500-550 nm. Voor het mitochondriale vlekkanaal, ingesteld op 561 nm en 570-630 nm emissie voor een rode kleurstof, of 633 nm excitatie en >650 nm emissie voor een veel rode kleurstof.
  5. Stel de laagst mogelijke laserkracht in (meestal 1% of minder) die het mogelijk maakt de signalen te verkrijgen met PMT-detectorwinsten van 700 mV.
  6. Verwerf tweekleurige confocale afbeeldingen van de cellen, waar de mitochondriale nucleoïden worden gedetecteerd in het "SG-kanaal" en mitochondriën worden gedetecteerd in het "rode" of "verre rode" kanaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering van live cellabeling met SG
Ten eerste werd de verdeling van SG in de cellen bij incubatie met de kleurstof bij verschillende verdunningen gekenmerkt door confocale microscopie. Na incubatie met hoge concentraties van SG of picoGreen, beide kleurstoffen meestal gelabeld de kernen en toonde een punctaat vlekken in het cytoplasma (Figuur 1), vergelijkbaar met gepubliceerde gegevens voor een andere positief geladen cyanine kleurstof (dat wil zeggen, picoGreen)15. Echter, bij incubatie met SG bij 1:10.000 verdunning, verscheen flauwe kleuring in de kernen, terwijl we in het cytoplasma een patroon van lichtpuntjes waargenomen(figuur 1). Aan de andere kant, incubatie met picoGroene kleurstof verdund 1:10,000 leverde meestal nucleaire kleuring. Het SG-signaal was veel helderder dan dat van picoGreen in dezelfde concentratie. De gegevens toonden aan dat SG meer geschikt is voor beeldvorming mitochondriaal DNA dan andere soortgelijke DNA-bindende kleurstoffen.

Om te bevestigen dat de heldere stippen zijn gelokaliseerd in de mitochondriën, we bevlekte levende cellen tegelijkertijd met SG en veel rode mitochondriale vlek. De laatste is een positief geladen cel doorlatende organische kleurstof die zich ophoopt in de mitochondriën van levende cellen. Bij incubatie met SG bij 1:10.000 en 1:50.000 verdunningen vond bijna alle SG-kleuring plaats in mitochondriën, terwijl bij etikettering op 1:500 en 1:1.000 verdunningen, significante kleuring van de kernen en cytoplasma opgetreden (Figuur 2).

Verder hebben we gekenmerkt de tijd natuurlijk van het bevlekken van levende cellen met SG door time lapse microscopie (Figuur 3). De percelen van SG fluorescentie intensiteit in mitochondriën vs. tijd (Figuur 3B) suggereerde dat na 45 min, nucleoïde vlekken was dicht bij verzadiging. Daarom raden we incubatietijden van ~ 30-60 min aan.

We hebben getest hoe SG intracellulaire distributie verandert bij fixatie en/of permeabilisatie van de cellen. Fixatie (2% paraformaldehyde [PFA]) van de met levend bevlekte cellen veroorzaakte een lichte herverdeling van de kleurstof naar de kern(figuur 4A,B). Permeabilisatie van de vaste cellen (0,1% Triton X100) elimineerde het SG-gestippelde patroon in mitochondriën en de kleuring van de kernen was dominant(figuur 4C). Als de SG werd toegevoegd aan de cellen na fixatie en permeabilisatie, verdeelde het gelijkmatig over het cytoplasma en de kernen(figuur 4D). Zo kunnen SG-gelabelde cellen indien nodig worden vastgesteld, maar de kleurstof is niet geschikt voor protocollen die permeabilisatie vereisen.

Live cel SR-SIM en mitochondriale nucleoïden tracking
Levende cellen costained met SG en een veel rode mitochondriale vlek (Tabel van materialen) werden 3D afgebeeld door een super-resolutie SIM-techniek. Net als in de confocale beelden (figuur 2), mitochondriale nucleoïden verschenen als lichtpuntjes in de mitochondriën (Figuur 5A). Verder verwierven we een tijdreeks van 2D SIM-beelden en bijgehouden de posities van de nucleoïden op een resolutie buiten de diffractie limiet. Vlak voor aanvang van de tijdreeks hebben we SIM 3D-stacks in de SG en de mitochondriale vlekkanalen aangeschaft. Toen kregen we alleen een tijdreeks in het SG-kanaal en volgden we de mitochondriale nucleoïden om hun bewegingen te kwantificeren. De gemiddelde snelheid van het spoor was 0,042 μm/s en de maximale directe snelheid van het spoor was 0,078 ± 0,012 μm/s. De meerderheid van de nucleoïden niet ver van hun oorspronkelijke posities, maar toonde korte afstand willekeurige bewegingen die waarschijnlijk beperkt tot de mitochondriale netwerk, als een overlay van sporen op de mitochondriale beelden suggereert (Figuur 5B). Weinig snelle directionele verplaatsingen opgetreden tijdens een typische tijdreeks(Movie 1).

Figure 1
Figuur 1: Vergelijking van picoGreen en SG live cell labeling. A549 cellen werden geïncubeerd met picoGreen of SG bij aangegeven verdunningen en afgebeeld. Representatieve weergavevelden van de gelabelde cellen in het groene kanaal. LSM880 Airyscan FAST, 20x/air objective, Scale bar = 50 μm. Enkele optische secties. Witte vierkanten markeren de gebieden die worden weergegeven bij een hogere vergroting rechts van de gehele gezichtsvelden van 423 x 423 μm. Voor 1:1.000 en 1:2.000 verdunningen worden dezelfde beelden weergegeven bij twee helderheidsinstellingen: de 'standaard' helderheidsinstellingen die zijn geoptimaliseerd voor verdunning van 1:10.000 en de instellingen voor 'verminderde helderheid' aangepast om verzadiging van detectoren te voorkomen. Dit cijfer is gewijzigd van Jevtic et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: SG lokalisatie in levende cellen op etikettering in verschillende concentraties. HeLa cellen werden 30 minuten geïncubeerd met een mengsel van 0,25 μM Mitotracker CMXRos Red en de aangegeven SG verdunning. De oplossing werd vervangen door DMEM, en de beelden werden verworven op een LSM880 Airyscan microscoop, 63x 1.4 olie doelstelling, met een sequentiële verwerving van kleurkanalen. Enkele optische segmenten worden weergegeven Schaalbalk = 10 μm). Dit cijfer is gewijzigd van Jevtic et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: HeLa cellen tijdens het labelen met SYBR Gold (SG). Eerst werden levende HeLa cellen gelabeld met Mitotracker CMXRos Red en gewassen. SG (laatste verdunning 1:10.000 in DMEM) werd toegevoegd aan de cellen en een time lapse-serie werd verworven. LSM880 microscoop, 63x 1.4 Olie doelstelling, sequentiële acquisitie. Z-stacks werden verworven op elk tijdstip. De maximale intensiteitsprojecties worden weergegeven. (A)Gemiddelde intensiteit van de SG-fluorescentie in de loop van de tijd in verschillende regio's van belang. (B) Representatieve gezichtsvelden met de gebieden waar SG-fluorescentie werd gemeten (gekleurde rechthoeken). (C) Een gezichtsveld op verschillende tijdstippen tijdens incubatie met SG. Een vierkant gebied dat is gemarkeerd met witte lijn wordt weergegeven bij een hogere vergroting in de rechterkolom. Dit cijfer is gewijzigd van Jevtic et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Effect van fixatie en permeabilisatie op SG-lokalisatie in de cellen. HeLa cellen werden gekleurd met SG (voorraad verdund 1:10,000) en Mitotracker CMXRos Red (0,25 μM) voor 30 min. Enkele optische plakjes werden verworven op een draaiende schijfmicroscoop; sequentiële verwerving; schaalbalk = 10 μm. (A) Live HeLa cellen bevlekt met SG. (B) Live HeLa cellen gekleurd met SG en vervolgens vastgesteld met 2% PFA in PBS voor 30 min. (C) Live HeLa cellen gekleurd met SG, vervolgens vastgesteld met 2% PFA in PBS voor 30 min en permeabiliseerd met 0,1% Triton X100 voor 15 min. Op het onderste paneel wordt dezelfde afbeelding weergegeven, maar de helderheid in het groene kanaal is hoger ingesteld. (D) HeLa cellen vastgesteld met 2% PFA, doordronmeabiliseerd met 0,1% Triton X100 voor 15 min, en vervolgens gekleurd met SG en Mitotracker CMXRos Red. Om de in (D)getoonde beelden te verkrijgen, werd de EMCCD-versterking van de camera voor het groene kanaal verminderd met een factor 12 in vergelijking met A-C om overbelichting te voorkomen. Dit cijfer is gewijzigd van Jevtic et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Nucleoid tracking op live SIM-beelden. Representatieve afbeeldingen van een gezichtsveld van SG-gekleurde cellen. Onderaan: de tweekleurige SIM-afbeelding die is gemaakt vóór de overname van de timelapse-serie. Groen = SG-kanaal; magenta = mitotracker kanaal. Top: nucleoid tracks van een 50-frame SIM-tijdserie in het SG-kanaal (Film 1); frametijd = 1,8 s; tracking door Imaris 8.4.1 software. Tracks zijn kleurgecodeerd door maximale spoorsnelheid (μm/s); Elyra PS.1, SIM-modus, 100x/1.46 Olie doelstelling; Schaalbalk = 10 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Jevtic et al.27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Movie 1
Film 1: SIM time lapse serie met representatieve SG-gekleurde cellen. Schaalbalk = 5 μm. Gedetecteerde mitochondriale nucleoïden zijn gemarkeerd als witte bollen. Tracks worden gevisualiseerd als "Dragon tails" (8 frames lengte) en kleurgecodeerd op basis van hun maximale instant snelheden (kleur balk in de rechterbenedenonderin toont snelheden in μm / s). Mitochondriale nucleoïden tracking en visualisatie door Imaris 8.4.1 software. Deze video is gepubliceerd in Jevtic et al.27. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn verschillende kritische componenten aan het protocol: Om preferentiële etikettering van mitochondriaal DNA te bereiken, moet de concentratie van de DNA-bindende kleurstof tijdens incubatie zeer laag worden gehouden (bijvoorbeeld een verdunning van 1:10.000 van een typisch handelsbestand) en de incubatietijd moet 30 min zijn. De incubatietijd mag nooit meer dan 1 uur bedragen. andere DNA-bindende kleurstoffen zijn niet helder genoeg om een sterk signaal te genereren bij het labelen bij een lage concentratie.

De beperking van ons protocol is dat de kleurstof wordt weggespoeld uit de mitochondriale nucleoïden tijdens een permeabilisatie stap. Daarom is de beschreven procedure niet geschikt voor conventionele immunofluorescentieprotocollen. In dit geval kunnen nucleoïden in vaste cellen efficiënt worden gelabeld met andere technieken, zoals antilichamen tegen DNA of mitochondriale transcriptiefactoren (TFAM).

Directe etikettering van mitochondriale nucleoïden met de DNA-bindende organische kleurstof heeft voordelen ten opzichte van fluorescerende eiwitetikettering: elk type cel kan binnen <1 h worden gelabeld, zonder tijdelijke of andere beperkingen van tijdelijke of stabiele expressie van fluorescerende eiwitgelabelde constructies. Ook in de huidige protocollen, conventionele fluorescerende eiwit-tagging van TFAM werd gemeld om artefacten veroorzaken. Bovendien bevlekt SG alleen op efficiënte wijze nucleoïden als het mitochondriale membraanpotentieel intact is. Dit voorkomt beeldverwerving van biologisch irrelevante "zieke" en dode cellen, die niet kunnen worden vermeden met FP-gebaseerde kleuring. Ten slotte, eerder gepubliceerde protocollen op basis van DNA-bindende kleurstoffen niet bereiken preferentiële kleuring van mitochondriaal DNA.

Het voorgestelde protocol is snel en eenvoudig, dus we gaan ervan uit dat het op grote schaal zal worden gebruikt voor live beeldvorming van mitochondriale nucleoïden door verschillende fluorescentietechnieken, zowel diffractie beperkt (bijvoorbeeld, laser scanning confocale, TIRF, enz.) als super-resolutie SIM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Asifa Akhtar en Angelika Rambold (zowel Max Planck Instituut voor Immunobiologie en Epigenetica) voor het verstrekken van HeLa cellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elyra PS1 Carl Zeiss multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)
High glucose DMEM GIBCO/ThermoFisher 31966021
ibidi 35 mm dish, glass bottom Ibidi Gmbh 81158
ibidi 8-well microSlide, glass bottom Ibidi Gmbh 80827
Imaris 8.4.1 Bitplane/Oxford Instruments image porcessing and visualisation software package
iXon 885 Andor Technologies EMCCD camera with back-illuminated sensor
LSM880 Airyscan Carl Zeiss laser scanning confocal microscope with array detector
Mitotracker CMXRos Red ThermoFischer M7512 red live cell mitochondrial stain
Mitotracker Deep Red FM ThermoFischer M22426 far red live cell mitochondrial stain
picoGreen ThermoFischer P7581 cell permeant DNA stain
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective Carl Zeiss
SYBR Gold ThermoFischer S11494 cell permeant DNA stain
Zen Black 2012 software Carl Zeiss image acquisition and processing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).

Tags

Biologie mitochondriale nucleoïde mitochondriaal DNA asymmetrische cyanine DNA fluorescerende vlek gestructureerde verlichtingsmicroscopie levende celmicroscopie
Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S.… More

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter