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Bioengineering

Lithographie focalisée de faisceau d'ion à Etch Nano-architectures dans des microélectrodes

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60004
Automatic Translation
1, 2,4, 5, 6, 2,3,4
1Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, 2Veteran Affairs Ann Arbor Healthcare System, 3Department of Neurology, School of Medicine, University of Michigan, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 5Michigan Center for Materials Characterization, University of Michigan, 6Carl Zeiss SMT, Inc.

Summary

Nous avons montré que la gravure de nano-architecture dans des dispositifs intracortical de microélectrode peut réduire la réponse inflammatoire et a le potentiel d'améliorer des enregistrements électrophysiologiques. Les méthodes décrites ci-contre décrivent une approche pour équerler les nano-architectures à la surface des microélectrodes intracorticales non fonctionnelles et fonctionnelles de silicium à tige unique.

Abstract

Grâce aux progrès de l'électronique et de la technologie de fabrication, les microélectrodes intracorticales ont subi des améliorations substantielles permettant la production de microélectrodes sophistiquées avec une plus grande résolution et des capacités accrues. Les progrès de la technologie de fabrication ont soutenu le développement d'électrodes biomimétiques, qui visent à s'intégrer de façon transparente dans le parenchyme cérébral, à réduire la réponse neuroinflammatoire observée après l'insertion d'électrodes et à améliorer la qualité et longévité des enregistrements électrophysiologiques. Ici, nous décrivons un protocole pour employer une approche biomimétique récemment classée comme nano-architecture. L'utilisation de la lithographie focalisée de faisceau d'ions (FIB) a été employée dans ce protocole pour définir des dispositifs spécifiques de nano-architecture dans la surface des microélectrodes intracorticales non fonctionnelles et fonctionnelles de tige simple. L'enchautreisation des nano-architectures dans la surface de l'électrode a indiqué des améliorations possibles de la biocompatibilité et de la fonctionnalité du dispositif implanté. Un des avantages de l'utilisation de fib est la capacité à émousser sur les dispositifs manufacturés, par opposition à lors de la fabrication de l'appareil, facilitant les possibilités illimitées de modifier de nombreux dispositifs médicaux après la fabrication. Le protocole présenté ci-contre peut être optimisé pour divers types de matériaux, caractéristiques nano-architecture et types d'appareils. L'augmentation de la surface des dispositifs médicaux implantés peut améliorer les performances et l'intégration de l'appareil dans le tissu.

Introduction

Les microélectrodes intracorticales (IME) sont des électrodes invasives qui fournissent un moyen d'interfaçage direct entre les dispositifs externes et les populations neuronales à l'intérieur du cortex cérébral1,2. Cette technologie est un outil inestimable pour enregistrer les potentiels d'action neuronale afin d'améliorer la capacité des scientifiques à explorer la fonction neuronale, à faire progresser la compréhension des maladies neurologiques et à développer des thérapies potentielles. La microélectrode intracorticale, utilisée dans le cadre des systèmes d'interface de machine cérébrale (IMC), permet l'enregistrement des potentiels d'action d'un individu ou de petits groupes de neurones pour détecter les intentions motrices qui peuvent être utilisées pour produire des sorties fonctionnelles3. En fait, les systèmes d'IMC ont été utilisés avec succès à des fins prothétiques et thérapeutiques, telles que le contrôle sensoriel acquis du rythme pour faire fonctionner un curseur informatique chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (SLA)4 et les lésions de la moelle épinière5 et la restauration du mouvement chez les personnes souffrant de tétraplégie chronique6.

Malheureusement, les IME ne parviennent souvent pas à enregistrer uniformément au fil du temps en raison de plusieurs modes de défaillance qui comprennent des facteurs mécaniques, biologiques et matériels7,8. La réponse neuroinflammatoire se produisant après l'implantation d'électrode est pensée pour être un défi considérable contribuant à l'échec d'électrode9,10,11,12,13,14. La réponse neuroinflammatoire est initiée lors de l'insertion initiale de l'IME qui coupe la barrière hémato-encéphalique, endommage le parenchyme cérébral local et perturbe les réseaux glial et neuronal15,16. Cette réponse aigue est caractérisée par l'activation des cellules gliales (microglia/macrophages et astrocytes), qui libèrent des molécules pro-inflammatoires et neurotoxiques autour du site de l'implant17,18,19,20. L'activation chronique des cellules gliales a comme conséquence une réaction de corps étrangère caractérisée par la formation d'une cicatrice gliale isolant l'électrode du tissu sain de cerveau7,9,12,13,17,21,22. En fin de compte, entravant la capacité de l'électrode à enregistrer les potentiels d'action neuronale, en raison de la barrière physique entre l'électrode et les neurones et la dégénérescence et la mort des neurones23,24,25.

L'échec précoce des microélectrodes intracorticales a entraîné des recherches considérables dans le développement des électrodes de prochaine génération, en mettant l'accent sur les stratégies biomimétiques26,27,28,29,30. D'intérêt particulier pour le protocole décrit ici, est l'utilisation de la nano-architecture comme une classe d'altérations de surface biomimétique pour les IME31. Il a été établi que les surfaces imitant l'architecture de l'environnement naturel in vivo ont une réponse biocompatible améliorée32,33,34,35,36. Ainsi, l'hypothèse qui oblige ce protocole est que la discontinuité entre l'architecture rugueuse du tissu cérébral et l'architecture lisse des microélectrodes intracorticales peut contribuer à la réponse neuro-inflammatoire et chronique du corps étranger aux IME implantés (pour un examen complet de Kim et al.,31). Nous avons déjà montré que l'utilisation de caractéristiques nano-architecture similaires à l'architecture de matrice extracellulaire du cerveau réduit les marqueurs inflammatoires des astrocytes à partir de cellules cultivées sur des substrats nano-architectured, par rapport aux surfaces de contrôle plat dans les modèles in vitro et ex vivo de neuroinflammation37,38. En outre, nous avons montré l'application de la lithographie focalisée de faisceau d'ions (FIB) pour équerler les nano-architectures directement sur les sondes de silicium a eu comme conséquence la viabilité neuronale sensiblement accrue et l'expression inférieure des gènes pro-inflammatoires des animaux implantés avec les sondes de nano-architecture comparées au groupe de contrôle lisse26. Par conséquent, le but du protocole présenté ici est de décrire l'utilisation de la lithographie FIB pour équeter les nano-architectures sur les dispositifs intracortical de microélectrode manufacturés. Ce protocole a été conçu pour réduire les caractéristiques de la taille d'une nano-architecture dans les surfaces de silicium des jarrets de microélectrodes intracorticales en utilisant des processus automatisés et manuels. Ces méthodes sont simples, reproductibles, et peuvent certainement être optimisées pour divers matériaux d'appareil et tailles d'entitédésirée désirées.

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Protocol

REMARQUE : Faites les étapes suivantes tout en portant l'équipement de protection individuelle approprié, comme une blouse de laboratoire et des gants.

1. Montage de sonde de silicium non fonctionnelle pour la lithographie focalisée de faisceau d'ion (FIB)

REMARQUE : Pour la procédure complète décrivant la fabrication de la plaquette SOI avec les 1 000 sondes, veuillez consulter Ereifej et al.,39.

  1. Isolez une bande de 2-3 sondes de silicium du silicium sur l'isolant (SOI) plaquette contenant 1000 sondes. Ne fabriquez pas de bandes contenant plus de trois sondes de silicium. Cela peut augmenter les chances de montage lâche et peut causer un désalignement résultant en la FIB à la gravée incorrecte.
    REMARQUE : Les bandes/sondes qui ne sont pas fermement assises sur le talon d'aluminium peuvent causer deux complications : 1) lorsque l'étape se déplace pour travailler sur la section suivante, qu'il y aura des vibrations et que le fraisage ne sera pas précis tant que la sonde ne s'installera pas et 2) elle peut causer une variation élevée et être hors du plan de mise au point.
    1. Tout en portant des gants, utilisez des forceps fins pour faire pression autour des sondes pour briser une petite section contenant deux à trois sondes.
  2. Nettoyez soigneusement la sonde de silicium de toute la poussière et les débris avant la gravure FIB. Préparer une plaque de polystyrène de 6 puits en taper 3 ml/puits d'éthanol à 95 % dans trois puits.
    1. Prenez soigneusement la bande coupée des sondes de silicium à l'aide de pointefine ou de forceps sous vide et placez-la dans une passoire cellulaire. Placez une seule bande de sondes de silicium par passoire pour éviter de briser les sondes. Placez la passoire contenant la bande de sondes de silicium dans le premier puits contenant 95% d'éthanol pour le nettoyage. Garder la passoire dans le premier puits pendant 5 min.
    2. Déplacez la passoire contenant les sondes de silicium du premier puits et placez-la dans le deuxième puits contenant 95 % d'éthanol pendant 5 min. Répétez une fois de plus dans le troisième puits.
    3. Placez la passoire contenant les sondes de silicium nettoyées sur une plaque de polytetrafluoroéthylène pour sécher à l'air. Faites cette étape dans une hotte stérile pour éviter la contamination par la poussière.
  3. Placez la bande séchée à l'air des sondes de silicium dans un récipient scellé pour le transport vers le SEM-FIB. Enveloppez la passoire contenant les échantillons séchés à l'air d'une pellicule de papier d'aluminium ou de plastique pour le transport et/ou l'entreposage afin de maintenir le nettoyage.
  4. Utilisez des pointes fines ou des forceps à vide pour ramasser soigneusement la bande propre des sondes de silicium et les placer sur un talon d'aluminium propre (utilisé pour l'imagerie SEM-FIB / gravure) pour se préparer pour le montage.
  5. Utilisez un cure-dent (ou un autre instrument à pointe fine comme un fil électrique mince), pour placer une petite goutte (10 l) de peinture argentée sur le bord du substrat de silicium entourant les sondes. Fixez la bande vers le bas en répandant la peinture argentée autour des côtés du substrat de silicium entourant la sonde. Laisser sécher complètement la peinture argentée avant de placer le talon d'aluminium dans le SEM-FIB.
    REMARQUE: Veillez à ne pas obtenir de peinture argentée sur la tige de l'électrode parce que c'est la partie qui sera gravée. Si la bande de sondes n'est pas solidement ancrée dans le talon d'aluminium, la bande peut se déplacer pendant le traitement ou avoir un plan focal différent, ce qui entraîne un broyage incorrect par la FIB. Plusieurs bandes de sondes de silicium peuvent être montées sur le même talon d'aluminium, en s'assurant qu'il y a suffisamment d'espace entre les bandes pour permettre l'enlèvement du talon après la gravure. Cela permettra une gravure plus efficace de plusieurs sondes à l'aide de la fonctionnalité automatisée décrite ci-dessous.

2. Alignement de la FIB sur les sondes de silicium

  1. Cliquez sur le bouton d'évent dans l'onglet de commande du faisceau pour évacuer la chambre. Appuyez sur Shift-F3 pour effectuer la scène à domicile. Confirmez la sélection en sélectionnant le bouton Home Stage dans la fenêtre popup.
    REMARQUE : L'exécution de l'opération de scène à la maison est une étape préventive pour s'assurer que l'axe de scène sont lus correctement par le logiciel et le microscope est en bon état.
  2. Une fois la scène d'accueil terminée, déplacez la scène pour coordonner X 70 mm, Y , 70 mm, Z et 0 mm, T et 0, R et 0. Une fois que la chambre est ventilée, mettez des gants nitriles propres et ouvrez la porte de la chambre.
    REMARQUE : Selon l'application de l'utilisateur précédent, il peut être nécessaire de changer l'adaptateur de scène. Les adaptateurs de scène standard (p. ex., style FEI) peuvent être enlevés en dévissant le boulon central dans le sens inverse des aiguilles d'une montre et installés en baisant dans le sens des aiguilles d'une montre dans la plaque de rotation de la scène.
  3. Insérez le talon d'aluminium tenant les sondes dans le haut de l'adaptateur de scène. Fixez le talon d'aluminium en resserrant la vis de jeu sur le côté de l'adaptateur de scène. Utilisez la clé hexagonale de 1,5 mm pour cette tâche.
  4. Ajustez la hauteur de l'adaptateur de scène en tournant l'adaptateur dans le sens des aiguilles d'une montre pour l'abaisser ou dans le sens inverse des aiguilles d'une montre pour le soulever. Fixez l'adaptateur de scène à la plaque de rotation en tournant le cône de verrouillage dans le sens des aiguilles d'une montre jusqu'à ce que l'écrou soit bien fixe contre la plaque de rotation de l'étape. Maintenez l'adaptateur de scène avec l'autre main pour empêcher la rotation de l'adaptateur et des échantillons tout en resserrant l'écrou de cône de verrouillage.
    REMARQUE : Utilisez la jauge de hauteur fournie pour déterminer la hauteur appropriée. Le dessus du talon d'aluminium doit être de la même hauteur que la ligne maximale indiquée sur la jauge de hauteur. Le serrage excessif de l'écrou de cône peut causer des dommages à la scène et à l'adaptateur. Utilisez seulement assez de force pour sécuriser les échantillons.
  5. Acquérir une image de caméra de navigation. Faites basculer soigneusement le bras de la caméra de navigation jusqu'à ce qu'il s'arrête. L'étape du microscope se déplacera automatiquement vers une position sous la caméra. Regardez l'image en direct montrée dans Quadrant 3 de l'interface utilisateur du microscope (Interface utilisateur).
    1. Une fois que l'auto de niveau de luminosité s'ajuste à un niveau approprié, acquérir l'image en appuyant sur le bouton vers le bas sur le support de la caméra. Assurez-vous d'attendre que l'acquisition d'image entière se termine, ce qui est indiqué par un symbole de pause apparaissant dans Quadrant 3 et l'éclairage de la caméra s'ébutant. Cela prend environ 10 s. Swing le bras de la caméra de retour à la position fermée. La scène sera de retour à la position d'origine.
  6. Fermez soigneusement la porte de la chambre de microscope. Regardez l'image de la caméra CCD dans Quadrant 4 tout en fermant la porte. Assurez-vous que les échantillons et le stade sont à une distance sécuritaire de tout composant critique dans la chambre de microscope.
  7. Sélectionnez la flèche vers le bas à côté du bouton De la pompe dans l'onglet de contrôle du faisceau. Sélectionnez pompe avec bouton de nettoyage d'échantillon dans le logiciel d'interface à vide pour démarrer la pompe à vide de chambre et construit dans le nettoyeur de plasma. Assurez-vous que la porte est scellée en poussant doucement sur la face de la porte pendant que la pompe est en marche. Attendez environ 8 min pour le temps de pompage et le cycle de nettoyage du plasma pour la chambre de microscope à compléter.
    REMARQUE : Un joint sous vide peut être confirmé en tirant doucement sur la porte de la chambre, qui doit rester fermée si le système est sous vide.
  8. Une fois que l'icône dans le coin inférieur droit de l'interface uI devient verte, appuyez sur le bouton Wake-Up dans l'onglet de contrôle du faisceau qui allume les faisceaux d'électrons et d'ions. Sélectionnez quadrant 1 et définir le signal de faisceau au faisceau d'électrons (si ce n'est déjà réglé), définir quadrant 2 à faisceau ionique (si ce n'est déjà réglé).
    1. Définir la tension SEM à 5 kV, définir le faisceau SEM courant à 0,20 nA, définir le détecteur SEM à ETD, définir le mode détecteur à L'électron secondaire. Définir la tension FIB à 30 kV, définir le faisceau FIB courant à 24 pA, définir le détecteur FIB au détecteur ICE, définir le mode détecteur à l'électron secondaire.
  9. Double clic sur la sonde de silicium dans l'image de la caméra de navigation, quadrant 3 pour déplacer la scène à l'emplacement approximatif de la sonde. Cliquez sur le quadrant 1 pour le sélectionner comme quadrant actif et appuyez sur le bouton pause pour démarrer la numérisation SEM. Définir le temps d'assistance d'analyse à 300 ns et désactiver l'entrelacement de balayage, l'intégrationde ligne , et la moyenne du cadre. Réglez la rotation d'analyse à 0 dans l'onglet de commande du faisceau et cliquez à droite sur l'ajusteur 2d de décalage de faisceau et sélectionnez zéro.
  10. Ajustez le grossissement à la valeur minimale en tournant le bouton de grossissement dans le sens inverse des aiguilles d'une montre sur le panneau MUI. Ajustez la luminosité et le contraste de l'image à l'aide des boutons du panneau MUI ou de l'icône de la barre d'outils Auto Contrast Brightness.
  11. Déplacez la scène soit en cliquant deux fois à gauche sur une fonctionnalité pour la centrer, soit en appuyant sur la roue de la souris et en activant le mode souris joystick. Déplacez la sonde de silicium désirée pour être modelée dans le centre de l'image SEM.
  12. Localisez un bord ou d'autres caractéristiques telles qu'une particule de poussière ou une égratignure. Augmenter le grossissement à 2 000x en tournant le bouton de grossissement dans le sens des aiguilles d'une montre. Ajustez la mise au point de la SEM en tournant les boutons grossiers et fins de mise au point sur le MUI jusqu'à ce que l'image soit au point. Une fois que l'image est au point, sélectionnez l'échantillon de lien Z au bouton de distance de travail dans la barre d'outils.
  13. Confirmer que l'opération a été complétée en regardant la coordonnées de l'axe Z dans l'onglet de navigation. La valeur doit être d'environ 11 mm. Type en 4,0 mm dans la position de l'axe Z et appuyez sur le bouton Go To avec la souris ou appuyez sur la touche d'entrée sur le clavier et la scène se déplacera à 4 mm de distance de travail.
  14. Déplacez la scène en X et Y pour localiser l'épaule de la sonde de silicium. Placez-le le plus près possible du centre du SEM. Changez l'inclinaison de l'étape à 52 degrés en tapant dans «52» dans la coordonnées T et en frappant entrer. Observez si l'épaule de la sonde semble se déplacer vers le haut ou vers le bas dans l'image. Utilisez le curseur Stage Z pour ramener l'épaule de la sonde au centre de l'image SEM. N'ajustez que la position Z, ne bougez pas l'axe X, Y, T ou R.
  15. Exécutez la commande «xT Align Feature» intégrée dans le menu de descente de scène. Utilisez la souris pour cliquer sur deux points parallèles au bord de la sonde. Assurez-vous que le bouton radio horizontal est sélectionné dans la fenêtre popup et cliquez sur la finition. La scène tournera pour aligner la sonde avec l'axe X de la scène. Ajuster la scène dans X,Y en utilisant la souris pour mettre l'épaule inférieure de la sonde au centre de l'image SEM à nouveau.
    REMARQUE : Le premier point doit être vers l'adhérence de la sonde et le deuxième point doit être vers le point de la sonde.
  16. Sélectionnez le FIB dans le quadrant 2 et assurez-vous que le courant du faisceau est toujours 24 pA. Définir le grossissement à 5000x et le temps d'arrêt à 100 ns. Tapez Ctrl-F sur le clavier pour définir la mise au point FIB à 13,0 mm. Dans l'onglet de contrôle du faisceau, cliquez à droite dans l'ajusteur 2d et sélectionnez zéro et, aussi, cliquez à droite dans l'ajusteur Beam Shift 2d et sélectionnez zéro. Définir la rotation d'analyse à 0 degrés et appuyer sur le bouton de luminosité de contraste automatique dans la barre d'outils.
  17. Recherchez une image de l'épaule de la sonde dans le quadrant 2. Utilisez l'outil instantané pour acquérir une image avec la FIB. Confirmer l'épaule de la sonde est au centre de l'image FIB, sinon, double clic sur l'épaule de la sonde pour le déplacer au centre. Déplacez la scène vers la gauche en poussant la touche de flèche gauche sur le clavier environ 10-15 fois. Prenez un autre instantané et observez si le côté de la sonde est toujours au centre de la FIB.
    REMARQUE : Si ce n'est pas le cas, la rotation de l'étape doit être ajustée légèrement. Si la sonde est au-dessus du centre d'image, la scène doit être tournée dans la direction négative. Si la sonde est au-dessous du centre, la scène doit être tournée dans le sens des aiguilles d'une montre. Entrez une rotation compucentrique relative de 0,01 à 0,2 degré selon la manière nécessaire pour aligner la sonde.
  18. Répétez les étapes 2.16 à 2.17 autant de fois que nécessaire jusqu'à ce que le bord de l'épaule de la sonde soit parfaitement aligné avec l'axe X de la scène, (le bord reste au centre de la FIB tout en se déplaçant à gauche).
  19. À l'aide de la FIB, déplacez la scène vers l'épaule inférieure de la sonde. Enregistrez la position de l'étape dans la liste de position en cliquant sur le bouton Ajouter. Changer le courant de faisceau FIB à 2,5 nA et assurez-vous que le grossissement de la FIB est encore 5000x. Exécutez la fonction de contraste de luminosité automatique et fixez le temps d'arrêt FIB à 100 ns.
  20. Appuyez sur le bouton pause pour commencer la numérisation. Ajustez la mise au point FIB et l'astigmatisme, aussi rapidement et précisément que possible, en utilisant les boutons de mise au point grossier et fine, et les boutons de stigmatisation X et Y sur le panneau MUI. Appuyez sur le bouton pause pour arrêter la numérisation FIB.

3. Rédaction d'un processus automatisé pour l'étanchéité

  1. Démarrez le logiciel en le situant dans le menu de démarrage Windows (c.-à-d., Start-Programs-FEI Company-Applications-Nanobuilder). Placez la fenêtre logicielle sur le moniteur latéral afin que l'interface du jour ne soit pas recouverte. Ouvrez le fichier pour le modelage des sondes de silicium en cliquant sur le fichier, puis ouvrez. Dirigez le navigateur Windows vers l'emplacement du script logiciel(Fichier supplémentaire 1 - le nom du fichier est "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
  2. Dans le logiciel, sélectionnez le menu de décalence de microscope et sélectionnez l'origine de l'étape Set. Dans le logiciel, sélectionnez le menu de décrochage microscope, puis sélectionnez Détecteurs de calibre.
  3. Sur l'interface du microscope, cliquez sur Quad 1 une fois avec la souris pour sélectionner Quad 1. Ignorer les autres instructions indiquées dans la fenêtre popup, ils ne sont pas nécessaires pour ce projet. Cliquez OK pour commencer l'étalonnage. Le processus prendra environ 5 min. Assurez-vous que les détecteurs ETD et ICE calibrent. Il est ok si d'autres détecteurs ont des défaillances d'étalonnage.
  4. Dans le logiciel, sélectionnez le menu de décaissement du microscope et choisissez Execute pour démarrer la séquence de modelage. Lorsque le modèle est terminé, fermez le logiciel.
    REMARQUE : Le logiciel prendra en charge les quads 3 et 4 pour les fonctions de modelage et d'alignement. Le script prendra environ 12 h pour fonctionner. Pendant que le script est en cours d'exécution, ne modifiez aucun paramètre sur le microscope.
  5. Frappez "Vent" dans l'onglet de commande du faisceau d'interface à faisceau d'interface uI du microscope pour arrêter les faisceaux de microscope et démarrer le cycle d'évent. Pendant que la chambre s'évacue, déplacez la scène pour coordonner X 70 mm, Y , 70 mm, Z et 0 mm, T, 0, R et 0. Une fois que la chambre est ventilée, mettez des gants nitriles propres et ouvrez la porte de la chambre.
  6. Relâchez la vis de l'ensemble sur l'adaptateur de talon à l'aide de la clé hexagonale de 1,5 mm. Retirez le talon d'aluminium contenant la sonde à motifs de la chambre. Fermez soigneusement la porte de la chambre de microscope. Regardez l'image de la caméra CCD dans Quadrant 4 tout en fermant la porte. Assurez-vous que l'adaptateur de scène est à une distance sécuritaire de tout composant critique dans la chambre de microscope.
  7. Sélectionnez la flèche vers le bas à côté du bouton De la pompe dans l'onglet de commande du faisceau. Sélectionnez le bouton Pompe pour démarrer la pompe à vide de chambre. Assurez-vous que la porte est scellée en poussant doucement sur la face de la porte pendant que la pompe est en marche.
    REMARQUE : Un joint sous vide peut être confirmé en tirant doucement sur la porte de la chambre, qui doit rester fermée si le système est sous vide. Le temps de pompage sera d'environ 5 min. Un seul côté de la sonde peut être gravé au cours d'une seule course.
  8. Si le côté avant et arrière de la sonde nécessite une gravure, retirez soigneusement la bande gravée des sondes de silicium après avoir vérifié la gravure finale et l'imagerie de la face avant (si des images sont nécessaires). Dissoudre la peinture argentée avec de l'acétone, en tamponnant prudemment/ brossant l'acétone sur la peinture argentée. Tournez soigneusement la bande vers l'arrière, re-monter, aligner et la betterave en suivant les étapes décrites ci-dessus.

4. Vérification de l'etch final et de l'imagerie

  1. Une fois le fraisage terminé, vérifiez l'uniformité des différentes sections à l'aide de l'imagerie SEM à un grossissement plus élevé.
    REMARQUE : L'imagerie à l'angle incliné permet une meilleure évaluation de la variation de la profondeur de fraisage. Une attention particulière devrait être accordée aux régions de transition entre les lieux de fraisage.
  2. Imagez à nouveau les échantillons après le mouture à l'effime avec un microscope optique.
    REMARQUE : Les lignes périodiques moulues donnent un effet de réfraction donnant lieu à différentes couleurs en fonction de l'angle d'imagerie. Si la couleur n'est pas continue avec la sonde qui est une indication claire de la perturbation dans les lignes moulues.

5. Montage d'une sonde de silicium fonctionnelle pour l'étrage FIB

  1. Retirez délicatement l'électrode de silicium fonctionnelle de son emballage. Utilisez des forceps pour soulever soigneusement l'onglet de protection en plastique qui recouvre l'étage de la tête. Commencez à soulever un coin de l'onglet à partir de la colle collante le tenant en place et continuez à soulever jusqu'à ce que l'électrode entière soit enlevée.
  2. Serrez soigneusement l'électrode avec des hemostats pour se préparer au montage dans le cadre stéréotaxique. Tout en tenant l'onglet couvert avec les forceps, placez délicatement les hemostats courbés autour de l'arbre vert au-dessus de la tige de silicium, avec la partie courbée des hemostats orientéevers vers le haut vers l'onglet. Verrouillez les hemostats en place pour s'assurer que l'électrode ne tombera pas de les hemostats.
  3. Retirez délicatement l'onglet de protection en plastique qui recouvre l'étage de la tête. Tout en tenant l'électrode avec les hemostats, coupez soigneusement l'électrode dans le cadre stéréotaxique pour le nettoyage.
  4. Remplir 3 plats Petri avec 95 % d'éthanol (10 ml par plat de pétri). Placez le plat Petri sous l'électrode qui est montée dans le cadre stéréotaxique pour le nettoyage. Baissez lentement l'électrode en retournant le micromanipulateur vers le bas (100 m/s) de sorte que la tige soit immergée dans l'éthanol à 95 %.
    REMARQUE : Veillez à ne pas tourner le micromanipulateur trop vite ou trop profond, ce qui peut provoquer la rupture de l'électrode (c.-à-d., l'électrode ne doit pas toucher le plat Petri).
  5. Laissez la tige d'électrode dans l'éthanol à 95 % pendant 5 min, puis soulevez lentement l'électrode de l'éthanol de 95 % en tournant le micromanipulateur vers le haut (100 m/s). Répétez cette étape deux fois de plus, pour un total de trois lavages. Laisser sécher l'électrode pendant cinq minutes.
  6. Utilisez la même technique pour monter l'électrode dans le cadre stéréotaxique, pour enlever l'électrode du cadre stéréotaxique. Placez soigneusement les hemostats autour de l'arbre de l'électrode. Une fois que les hemostats sont serrés, relâchez l'électrode du cadre stéréotaxique, retournez l'onglet de protection en plastique couvrant l'étage de tête, et remettez l'électrode nettoyée dans son emballage.

6. Gravure sonde de silicium fonctionnelle à l'aide de FIB

  1. Montez l'électrode de silicium fonctionnelle nettoyée sur un support en aluminium. Prenez soigneusement l'électrode de silicium fonctionnelle nettoyée à l'aide de forceps et retirez l'onglet protecteur de la scène. Placez la tige d'électrode sur le talon d'aluminium afin qu'elle ne pende pas sur n'importe quel bord, puis en utilisant un petit morceau de ruban adhésif Cu ou de ruban conducteur de carbone, épinglez la tête solidement au talon d'aluminium.
    REMARQUE : Alternativement, un support de clip à profil bas peut être utilisé pour maintenir l'électrode vers le bas. Veillez à ne pas toucher la tige d'électrode.
  2. Suivant les étapes décrites ci-dessus (section 2), placez l'électrode à la hauteur eucentrique et assurez-vous que l'électrode est au point de coïncidence des faisceaux SEM et FIB. Alignez la tige avec la direction "X" de la scène.
  3. Définir la FIB au courant optimal pour moudre la nano-architecture requise et assurez-vous que la mise au point et la stigmatisation sont correctement corrigées. Préparer un éventail de lignes avec l'espacement et la longueur désirés pour couvrir le champ de vision de la tige (sections de 500 m). Ajustez les longueurs de ligne lorsque la gravure descend la tige jusqu'aux sections plus minces.
    REMARQUE : Lors de la gravure de l'électrode fonctionnelle, il n'est pas possible d'ajouter des marques fiduciales pour automatiser le processus. Par conséquent, le déplacement entre les sous-sections (500 m) se fait manuellement.
  4. Une fois le fraisage de la première section terminé, assurez-vous de vérifier la qualité du fraisage avant de passer à la section suivante. Répétez l'étape 6.3 pour équerquer la section suivante de la tige. Alignez les lignes moulues de la section précédente aux modèles utilisés pour la section suivante afin d'éviter de grands écarts entre les pistes.

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Representative Results

FIB Etched Nano-architecture sur les surfaces des sondes intracorticales Single Shank
Utilisant les méthodes décrites ici, les sondes intracorticales ont été gravées avec des nano-architectures spécifiques suivant les protocoles établis39. Les dimensions et la forme de la conception nano-architecture décrite dans ces méthodes ont été mises en œuvre à partir de résultats in vitro précédents représentant une diminution de la réactivité des cellules gliales lorsqu'ils sont cultivés avec la conception nano-architecture décrite ici37,38. Les méthodes décrites ici ont utilisé un faisceau d'ions gallium focalisé (FIB) pour émousser des rainures parallèles à l'échelle nanométrique à la surface des sondes de microélectrode de silicium à tige unique non fonctionnelles, comme décrit précédemment39. Les rainures parallèles à l'échelle nanométrique ont été gravées le long de la tige de l'arrière de la sonde à l'aide d'un script automatisé écrit dans le logiciel. Les dimensions finales de la nano-architecture gravée étaient de 200 nm de large lignes parallèles, espacées de 300 nm et avaient une profondeur de 200 nm (Figure 1). L'utilisation de FIB pour équerquer les nano-architectures dans une surface de l'appareil permet de gravure de dessins précis dans des dispositifs manufacturés.

Nano-architecture gravée dans l'effet de sondes intracorticales sur la neuroinflammation
Dans ces données précédemment rapportées, les sondes intracorticales avec des nano-architectures gravées ont été implantées dans le cortex des rats pendant deux ou quatre semaines (n -4 par point de temps) et comparées aux animaux témoins implantés avec des sondes lisses ne contenant aucune gravure nano-architecture (n -4 par point de temps)39. Un des mécanismes de l'échec empêchant le déploiement clinique des microélectrodes intracorticales est la réponse neuroinflammatoire induite de perturber le parenchyme de cerveau et la barrière hémato-encéphalique9,10,11,12,15. Une description complète de la réponse neuroinflammatoire observée après l'implantation intracorticale de microélectrode peut être trouvée dans les revues suivantes13,14,22. La capacité des microélectrodes intracorticales d'enregistrer les potentiels d'action des neurones dépend de la distance des corps neuronaux sains du site d'enregistrement intracortical de microélectrode40. Par conséquent, l'étude précédemment rapportée a évalué la neuroinflammation autour du site intracortical d'implantation de sonde en quantifiant des marqueurs histologiques pour la densité neuronale, l'activation gliale de cellules et l'expression de gène des marqueurs proinflammatoires39. Les faits saillants de cette étude sont présentés ci-dessous pour représenter les effets de gravure nano-architectures dans la surface de la sonde avait sur la neuroinflammation.

Effets de la nano-architecture gravée sur la densité neuronale
Pour déterminer comment la gravure des nano-architectures dans la surface de la sonde affecte la densité neuronale immédiatement autour de l'implant, les noyaux neuronaux ont été tachés et quantifiés en utilisant précédemment décrivant les méthodes d'immunohistochimie39,41. Il n'y avait aucune différence significative de densités neuronales autour de la nano-architecture et des sondes de contrôle à 2 semaines après l'implantation (Figure 2A). Cependant, il y avait beaucoup plus de neurones autour des sondes de nano-architecture à 100-150 m de distance du site de l'implant par rapport aux implants de contrôle lisse (p lt; 0,05 vs contrôles) (Figure 2B) à 4 semaines après l'implantation. On a également constaté qu'il y avait une tendance accrue de densité neuronale entourant les sondes nano-architecture au fil du temps, contrastant la tendance diminuée de la densité neuronale autour des implants témoins (Figure 2). Il y a une relation directe dépeignant une réponse neuroinflammatoire atténuée couplée avec une densité plus élevée des neurones viables entourant le microélectrode, a comme conséquence une capacité accrue pour le microélectrode de fournir des enregistrements de qualité15,40,42. Par conséquent, en interprétant des données de densité neuronale, une densité plus élevée de neurones autour du site d'implant peut indiquer une réponse neuroinflammatoire abaissée et potentiellement amélioré la qualité et la stabilité d'enregistrement des microélectrodes intracorticales.

Effets de la nano-architecture gravée sur les marqueurs moléculaires neuroinflammatoires
L'histologie suffit pour identifier les cellules autour d'un site implantaire; cependant, il manque la sensibilité et la spécificité pour caractériser le phénotype des cellules environnantes. Par conséquent, des méthodes utilisant l'analyse quantitative d'expression de gène ont été employées pour quantifier l'expression génique relative des marqueurs neuroinflammatoires, afin de comprendre l'effet de la nano-architecture a sur le phénotype des cellules39. Plusieurs marqueurs neuroinflammatoires ont été étudiés dans l'étude précédemment rapportée. Ici seulement deux seront mis en évidence qui sont spécifiques aux cellules de microglies, afin de discuter de la façon dont leur phénotype peut avoir été modifié. Le groupe de différenciation 14 (CD14) est un récepteur de reconnaissance de modèle sur la membrane des microglies qui reconnaît des bactéries et signale la voie inflammatoire après des dommages/implantation43,44,45. La synthase d'oxyde nitrique (NOS2), est un marqueur de stress oxydatif exprimé dans les microglies/macrophages qui est associé à une production accrue de marqueurs proinflammatoires46,47.

Dans les données précédemment rapportées, il n'y avait aucune différence significative de l'expression relative de gène cD14 entre la nano-architecture et les implants témoins à deux ou quatre semaines après l'implantation. Notamment, il y a eu une diminution significative (p lt; 0,05) de l'expression relative du gène CD14 de deux à quatre semaines autour du site des implants nano-architecture, ce qui indique une diminution possible de l'inflammation (dénotée par la figure 3A). De même, il n'y avait pas de différences significatives d'expression génique relative NOS2 entre la nano-architecture et les implants témoins à deux semaines. Cependant, il y avait beaucoup moins (p lt; 0.05) l'expression relative du gène NOS2 autour de l'implant nano-architecture par rapport à l'implant témoin à quatre semaines après l'implantation (dénoté par 'dans la figure 3B). En outre, il y a eu une augmentation significative de 2 à 4 semaines de l'expression relative du gène NOS2 autour des implants témoins (dénotépar par la figure 3B),et aucune différence n'a été observée autour des implants nano-architecture au fil du temps, ce qui indique une diminution potentielle de l'inflammation autour des implants nano-architecture. Lors de l'interprétation de ces données, il est important de comprendre la fonction du gène quantifié. Par exemple, les diminutions des gènes pro-inflammatoires indiquent une diminution probable de la réponse inflammatoire autour du site d'électrodes, tandis qu'une augmentation de ces types de gènes suggère une augmentation probable de l'inflammation.

FIB Etched Nano-architecture sur les surfaces de microélectrodes shank unique fonctionnelles
L'étude précédemment rapportée a eu des résultats prometteurs démontrant une légère augmentation de la densité de neurone et la diminution potentielle du phénotype inflammatoire de microglies autour du site d'implant de sonde de nano-architecture. Pour étudier la traduction de ces résultats à la fonctionnalité d'électrode, un microélectrode fonctionnel de silicium de tige simple a été gravé avec la même conception de nano-architecture que les sondes de microélectrode de silicium simple de tige non fonctionnelles, utilisant un protocole semblable de gravure de FIB. La seule différence dans la méthodologie de gravure de la nano-architecture spécifiée était que le protocole pour les électrodes fonctionnelles ne pouvait pas être automatisé, car il n'y avait pas de matériau de substrat supplémentaire pour créer des marques fiduciales. Ainsi, l'électrode fonctionnelle a été gravée manuellement à l'aide de FIB en réalignant le faisceau tous les 500 m, tel que décrit dans le protocole ci-dessus. Les gravures finales étaient de 200 nm de large lignes parallèles, espacées de 300 nm et avaient une profondeur de 200 nm (Figure 4).

Effets de la nano-architecture gravée dans les microélectrodes intracorticales sur l'électrophysiologie
Les enregistrements réussis de microélectrodes intracorticales dépendent de la proximité des neurones autour des sites d'implant, de l'intégrité de l'appareil et de la transmission fiable de l'activité d'une seule unité du cerveau8,40,48,49. Les enregistrements électrophysiologiques ont été quantifiés à l'aide de mesures enregistrées recueillies deux fois par semaine sur huit semaines. Les mesures utilisées dans cette étude étaient le pourcentage de canaux enregistrant des unités uniques, les amplitudes maximales des unités enregistrées et le rapport signal-bruit (RNS). Les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center ont approuvé toutes les procédures relatives aux animaux. Les rats de Sprague Dawley (8-10 semaines et pesant 225 g) ont été implantés avec la microélectrode de silicium de tige simple, avec la nano-architecture mentionnée ci-dessus (n-1) ou les contrôles lisses (n-6). Aucune analyse statistique n'a été effectuée sur ces données, car il y avait un microélectrode nano-architecture implanté pour une étude pilote de preuve de concept. Néanmoins, les résultats électrophysiologiques collectifs montrant un pourcentage accru de canaux enregistrant des unités uniques (figure 5A),des amplitudes maximales (figure 5B) d'unités enregistrées, et sNR (figure 5C) des microélectrodes nano-architecture par rapport aux microélectrodes de contrôle lisse, sont prometteurs. Ces résultats indiquent que la gravure de nano-architecture à la surface des microélectrodes peut potentiellement entraîner une amélioration de la qualité et une longévité accrue des enregistrements électrophysiologiques. Une évaluation plus approfondie avec une augmentation de la taille de l'échantillon est nécessaire pour vérifier ces résultats préliminaires.

Figure 1
Figure 1 : FIB Etched Nano-architecture on the Surfaces of Single Shank Intracortical Probes. Images SEM des sondes de silicium de tige simple non fonctionnelles avec fib gravé nano-architectures le long de l'arrière de la tige. (A) Images composites de l'ensemble de la sonde après la gravure montrée à 120x grossissement, barre d'échelle de 400 m. Les marques fiduciales (boîte carrée avec un symbole de l'apo par l'intermédiaire) sont gravées le long du substrat de silicium entourant la sonde. Les images SEM agrandies de l'extrémité de la sonde sont affichées dans (B) à 1 056x grossissement (barre d'échelle de 40 m), (C) à 3 500x grossissement (barre d'échelle de 10 m), et (D) à 10 000x grossissement, barre d'échelle à 4 m. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence39. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Effets de la nano-architecture gravée sur la densité neuronale. La survie neuronale est présentée comme un pourcentage de la région de fond des mêmes animaux dans des distances de 50 bacs m loin du site de l'implant. (A) Aucune différence significative de survie neuronale n'a été observée entre les surfaces lisses (contrôle) et les implants nanopatterned à 2 semaines après l'implantation. (B) Il y avait une survie neuronale significativement plus élevée autour des implants nanopatterned à la distance de 100-150 m par rapport aux surfaces lisses (p lt; 0.05) à 4 semaines après l'implantation. Images représentatives des neurones (vert teinté), avec le contour jaune représentant le site d'implantation, et le "P" indiquant le côté gravé de la microélectrode, barre d'échelle de 100 m. Ce chiffre a été modifié à partir de39. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Effets de la nano-architecture gravée sur les marqueurs moléculaires neuroinflammatoires. Des tissus ont été prélevés autour d'un rayon de 500 m du site d'implantation pour les implants nanopatterned et de contrôle. L'expression génique relative des marqueurs inflammatoires a été comparée quantitativement entre les deux types d'implants (les différences sont indiquées par le graphique sur le graphique; p lt; 0,05) ainsi qu'au fil du temps (les différences sont indiquées par ' sur le graphique; p 'lt; 0,05). (A) L'expression relative des gènes du CD14 a considérablement diminué autour des implants nanopatterned de deux à quatre semaines. (B) Il y avait une expression génétique relative significativement moindre de NOS2 autour de l'implant nanomodèle par rapport au contrôle à quatre semaines (en) et il y avait une augmentation significative de NOS2 de deux à quatre semaines autour des implants de contrôle lisse (). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence39. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : FIB Etched Nano-architecture on the Surfaces of Functional Single Shank Microelectrodes. L'enset sur le coin supérieur droit affiche la microélectrode utilisée dans cette étude à côté d'un sou pour dépeindre la taille de la tige d'électrode (mince ligne noire). Images SEM de la tige de microélectrodes avec fib gravé nano-architectures le long de l'arrière de la tige. La tige entière est montrée en haut à un grossissement de 600x (barre d'échelle de 50 m), tandis que l'enset représente la surface nanopatternée à un grossissement de 25 000x, barre d'échelle de 1 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Effets de la nano-architecture gravée dans les microélectrodes intracorticales sur l'électrophysiologie. L'évaluation des mesures électrophysiologiques arévélé une tendance préliminaire prometteuse à la hausse du pourcentage de canaux enregistrant des unités uniques(B) des amplitudes maximales des unités enregistrées et (C) rapport signal-bruit du microélectrode gravé avec des nano-architectures par rapport aux électrodes de contrôle lisse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Enregistrement d'électrophysiologie à partir de microélectrodes Shank fonctionnelles implantées avec des nano-architectures gravées FIB. L'un des défis de l'utilisation de fib pour équerler les nano-architectures sur des dispositifs de microélectrode manufacturés est le risque de court-circuiter les contacts d'enregistrement. L'axe X représente le temps d'enregistrement en quelques secondes, et l'axe y montre les canaux d'électrode enregistrant les potentiels d'action neuronale. Chaque ligne numérotée sur l'axe y représente un canal d'électrode différent, le canal numéro 1 étant le plus bas et le 16 étant le plus profond. Les boîtes rouges décrivent les canaux court-circuités, tandis que les boîtes bleues décrivent les canaux avec l'activité neuronale visible. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole de fabrication décrit ici utilise la lithographie focalisée de faisceau d'ions pour effectivement et reproductiblement éduquer des nano-architectures dans la surface des microélectrodes de silicium de tige simple non fonctionnelles et fonctionnelles. La lithographie focalisée du faisceau d'ions (FIB) permet l'ablation sélective de la surface du substrat à l'aide d'un faisceau d'ions finement focalisé50,51. FIB est une technique d'écriture directe qui peut produire diverses caractéristiques avec une résolution nanométrique et un rapport d'aspect élevé50,52,53. Afin de créer les différentes caractéristiques de taille, l'ampleur du courant de faisceau d'ions peut être optimisée pour changer la taille de tache de faisceau d'ion dans une gamme de 3 nm à 2 'm50,51. Certains avantages généraux de l'utilisation fib pour époêler les caractéristiques sur les surfaces sont les: 1) il peut être utilisé sur une grande variété de matériaux, y compris le silicium, les métaux et les polymères53,54,55,56 ,2)FIB peut être effectuée sur des surfaces non-planaires, et 3) FIB peut être utilisé pour le post-traitement sur les appareils individuels57.

Ici, FIB a été utilisé en combinaison avec un microscope SEM et un logiciel utilisé pour écrire un script automatisé spécialisé pour la gravure de caractéristiques spécifiques dans les sondes non fonctionnelles de tige unique. Le script comprenait les paramètres requis (2,5 nA de faisceau d'ions courant et 30 kV tension) pour réduire l'espacement exact souhaité (200 nm de large rainures parallèles, espacé 300 nm de distance et 20 nm de profondeur). Les dimensions de l'électrode ont dépassé le champ de vision de la FIB, de sorte que le modelage a été effectué dans plusieurs positions de scène. Afin d'automatiser le processus, des marques fiduciales ont été gravées sur le côté de la feuille de silicium tenant les sondes en place, afin de permettre au logiciel de localiser précisément les lignes modelées sur la tige de la sonde. Les fiducials étaient nécessaires parce que le mouvement de l'étape créait une grande incertitude (5 m) dans l'emplacement de la zone de modèle par rapport au champ de vision du faisceau d'ions. Le placement des fiducials sur la feuille de silicium a permis à la FIB de localiser les zones de motif sans scanner directement le faisceau sur la tige de la sonde, ce qui pourrait potentiellement contaminer ou endommager la tige de la sonde. L'ensemble du processus de gravure automatisée pour une tige a pris environ 12 h à compléter et n'a nécessité aucune intervention de l'opérateur après le début du modelage. Collectivement, les avantages de l'utilisation de FIB pour émousser les caractéristiques dans la tige de la sonde de silicium étaient la capacité de faire des caractéristiques de taille nanomètre, d'automatiser le processus de gravure, et la capacité d'émousser sur une sonde fabriquée. Bien que la FIB ait de nombreux avantages, l'un des inconvénients de l'utilisation de cette méthode de fabrication est le taux de débit lent qui limite finalement le potentiel de production de masse d'appareils avec des nano-architectures dans leur surface58. Alternativement, d'autres méthodes de fabrication utilisées pour créer des tailles de fonctionnalités et des géométries d'intérêt, peut-être à des taux plus rapides et à des productions de masse, comprennent la lithographie par faisceau d'électrons et la lithographie nanoempreinte59,60,61,62,63,64,65. Cependant, ces méthodes ne permettent pas la gravure des dispositifs de nano-architecture dans les dispositifs manufacturés. Traditionnellement, ces méthodes sont utilisées pendant le processus de fabrication sur une feuille de silicium ou de polymère, qui peut ensuite être utilisé dans les étapes de traitement en aval pour fabriquer le trompeur final.

Les électrodes fonctionnelles n'ont pas pu subir un processus automatisé en raison de l'imposition d'un matériau environnant autour de la tige d'électrode dans lequel inclure des marques fiduciales dans la course. Par conséquent, les électrodes fonctionnelles ont été alignées manuellement et gravées à des sections de 500 m le long de la tige, en utilisant le même courant ionique et la même tension que la course automatisée pour assurer les mêmes tailles d'entités. Le faisceau a dû être réaligné manuellement après avoir terminé chaque intervalle de 500 m et mis en place pour définir la section suivante. Le processus de réalignement manuel des motifs tous les 500 m peut potentiellement conduire à des nanostructures ou structures endommagées qui ne correspondent pas à la géométrie prévue. Cela est dû à des temps d'exposition plus longs le faisceau d'ions a besoin pour l'alignement manuel66. Ce fut l'une des difficultés rencontrées avec la gravure manuelle. En raison de cette complication, deux contacts d'enregistrement ont été court-circuités et n'ont pas été en mesure d'enregistrer les potentiels d'action neuronale (figure 6). La figure 6 montre un segment électrophysiologique d'enregistrement en direct de l'animal implanté avec l'électrode nano-architecture. Les boîtes bleues décrivent les canaux qui enregistrent de forts potentiels d'action, par rapport aux boîtes rouges dénotant les deux canaux morts. Par conséquent, l'un des défis de l'utilisation de gravure manuelle FIB sur les électrodes post-fabriquées est qu'il ya une chance que le faisceau peut court-circuiter les contacts et les empêcher d'enregistrer. Ce défi est renforcé lorsque vous tentez d'émousser le côté avant des électrodes de silicium à tige unique, dans lesquelles les contacts d'enregistrement et les traces sont le long de la tige entière de l'électrode. Bien qu'il soit possible d'équerler le silicium autour des contacts et des traces d'enregistrement, il est conseillé d'éviter des dommages et une diminution des performances des capacités d'enregistrement de l'électrode.

Comme mentionné précédemment, FIB peut être utilisé sur divers matériaux pour éduquer de nombreuses géométries caractéristiques dans la surface. Cependant, il est important de noter que les paramètres des géométries d'etch, telles que les lignes dans les différents matériaux, sont compliqués à prévoir. Particulièrement pour les modèles de ligne, la largeur et la profondeur de ligne dépendent fortement de beaucoup de paramètres tels que la tension d'accélération, le courant de faisceau, le temps d'habiter, l'espacement de pixel, la durée de vie de l'ouverture et le type de matériel. Un autre paramètre qui résulte de l'optimisation est le temps total de moulin chaque ligne. Des lignes plus étroites et plus profondes pourraient être réalisées à l'aide de courants de faisceauplus petits; cependant, le temps de modèle pour une tige entière de sonde s'étendrait à plusieurs jours, qui n'est pas pratique. Ainsi, bien qu'il soit possible d'optimiser le protocole présenté ici, il serait extrêmement difficile de décrire les paramètres des matériaux inconnus. En dévisant les paramètres des sondes de silicium décrites dans ce protocole, de nombreuses coupes d'essai dans le silicium ont été effectuées pour évaluer comment les conditions changeantes affectaient la largeur et les profondeurs de la ligne. Dès que les conditions évaluées ont été en mesure d'émousser la taille des caractéristiques spécifiques et la géométrie d'intérêt (200 nm de large lignes qui étaient de 200 nm de profondeur), ces paramètres ont été utilisés pour écrire le script du logiciel. Le script a été utilisé pour contrôler l'espacement de chaque ligne, du centre au centre, qui dans ce protocole est de 300 nm. Les études futures utilisant des substrats/dispositifs de silicium exigeant des tailles d'entités dans les centaines de nanomètres, peuvent employer les paramètres décrits dans ce protocole comme point de départ pour dépanner les conditions nécessaires pour créer les tailles d'entité s'ils sont souhaitées. Une optimisation et un dépannage supplémentaires des conditions de gravure seront nécessaires pour les substrats/dispositifs métalliques et polymères. Dans l'ensemble, l'utilisation de FIB pour la gravure de nano-architectures dans les surfaces des matériaux permet un contrôle et une flexibilité suffisants dans les géométries des caractéristiques, l'utilisation de nombreux matériaux compatibles et plusieurs types de surface, y compris les dispositifs manufacturés. Les résultats représentatifs présentés ici ont démontré les avantages potentiels observés dans nos études de l'utilisation de FIB pour équerler les nano-architectures à la surface des microélectrodes intracorticales : 1) augmentation de la densité neuronale et 2) réduction des marqueurs neuroinflammatoires autour des dispositifs implantés avec des nano-architectures, ainsi que 3) résultats préliminaires illustrant l'amélioration de la qualité des enregistrements électrophysiologiques au fil du temps. De même, l'emploi et l'optimisation des caractéristiques de nano-architecture de gravure de protocole décrites dans la surface d'un matériau peuvent être utilisés pour améliorer la fonctionnalité de nombreux dispositifs médicaux.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par les prix du Département des anciens combattants des États-Unis pour la recherche et le développement en réadaptation : #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) et #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). Le contenu ne représente pas les vues du ministère des Anciens Combattants des États-Unis ou du gouvernement des États-Unis. Les auteurs tient à remercier FEI Co. (maintenant partie de Thermofisher Scientific) pour l'aide du personnel et l'utilisation de l'instrumentation, qui a aidé à développer les scripts utilisés dans cette recherche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-Channel ZIF-Clip Headstage Tucker Davis Technologies ZC16 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrapped Thomas Scientific 1213F04 Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder Tucker Davis Technologies Z-ROD32 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml Ted Pella 16023 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter Hemostat Fine Science Tools 13013-14 Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double Coated Ted Pella 16084-7 The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well Sigma Aldrich CLS3736-100EA Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11251-30 Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs Fisher Scientific 22-032-600 Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm Ted Pella 16148 Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll Fisher Scientific 01-213-101 Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes Fisher Scientific 02-617-149 Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrode NeuroNexus A1x16-3mm-100-177 http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holder KOPF Model 1772 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument KOPF Model 900-U Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly KOPF Model 960 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') Ted Pella 807-5 https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V Ted Pella 520-1-220 Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver Paint Ted Pella 16062 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab Thermo Fisher Scientific Helios G2 650 This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

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Bioengineering Numéro 155 lithographie focalisée de faisceau d'ions microélectrodes intracorticales nano-architecture électrophysiologie neuroinflammation biocompatibilité
Lithographie focalisée de faisceau d'ion à Etch Nano-architectures dans des microélectrodes
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Mahajan, S., Sharkins, J. A.,… More

Mahajan, S., Sharkins, J. A., Hunter, A. H., Avishai, A., Ereifej, E. S. Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes. J. Vis. Exp. (155), e60004, doi:10.3791/60004 (2020).

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