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Bioengineering

माइक्रोइलेक्ट्रोड में ईच नैनो-आर्किटेक्चर के लिए केंद्रित आयन बीम लिथोग्राफी

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60004
Automatic Translation
1, 2,4, 5, 6, 2,3,4
1Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, 2Veteran Affairs Ann Arbor Healthcare System, 3Department of Neurology, School of Medicine, University of Michigan, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 5Michigan Center for Materials Characterization, University of Michigan, 6Carl Zeiss SMT, Inc.

Summary

हमने दिखाया है कि इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड उपकरणों में नैनो-आर्किटेक्चर की नक़्क़ाशी भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम कर सकती है और इसमें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में सुधार करने की क्षमता है। यहां वर्णित विधियां गैर-कार्यात्मक और कार्यात्मक एकल टांग सिलिकॉन इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड की सतह में नक़्क़ाशी नैनो-आर्किटेक्चर के लिए एक दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयार करती हैं।

Abstract

इलेक्ट्रॉनिक्स और निर्माण प्रौद्योगिकी में प्रगति के साथ, इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड में पर्याप्त सुधार हुए हैं जो अधिक संकल्प और विस्तारित क्षमताओं के साथ परिष्कृत माइक्रोइलेक्ट्रोड के उत्पादन को सक्षम करते हैं । निर्माण प्रौद्योगिकी में प्रगति ने बायोमिमेटिक इलेक्ट्रोड के विकास का समर्थन किया है, जिसका उद्देश्य मस्तिष्क पैरान्चिमा में मूल रूप से एकीकृत करना, इलेक्ट्रोड प्रविष्टि के बाद देखी गई न्यूरोभड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करना और गुणवत्ता में सुधार करना है और गुणवत्ता में सुधार करना है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की दीर्घायु। यहां हम हाल ही में नैनो-आर्किटेक्चर के रूप में वर्गीकृत एक बायोमिमेटिक दृष्टिकोण को नियोजित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। केंद्रित आयन बीम लिथोग्राफी (एफआईबी) का उपयोग इस प्रोटोकॉल में गैर-कार्यात्मक और कार्यात्मक एकल टांग इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड की सतह में विशिष्ट नैनो-आर्किटेक्चर सुविधाओं को नक़्क़ाशी करने के लिए किया गया था। इलेक्ट्रोड सतह में नैनो-आर्किटेक्चर नक़्क़ाशी ने प्रत्यारोपित डिवाइस की जैव अनुकूलता और कार्यक्षमता में संभावित सुधार का संकेत दिया। एफआईबी का उपयोग करने के लाभों में से एक विनिर्मित उपकरणों पर नक़्क़ाशी करने की क्षमता है, जैसा कि डिवाइस के निर्माण के दौरान किया गया था, विनिर्माण के बाद कई चिकित्सा उपकरणों को संशोधित करने के लिए असीम संभावनाओं को सुविधाजनक बनाता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को विभिन्न सामग्री प्रकारों, नैनो-आर्किटेक्चर सुविधाओं और उपकरणों के प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों की सतह को बढ़ाने के ऊतकों में डिवाइस प्रदर्शन और एकीकरण में सुधार कर सकते हैं ।

Introduction

इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड (आईएएम) वेसिव इलेक्ट्रोड हैं जो बाहरी उपकरणों और सेरेब्रल कॉर्टेक्स1,2के अंदर न्यूरोनल आबादी के बीच प्रत्यक्ष इंटरफेसिंग का एक साधन प्रदान करते हैं। यह तकनीक तंत्रिका कार्य क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए एक अमूल्य उपकरण है ताकि न्यूरोनल फ़ंक्शन का पता लगाने, न्यूरोलॉजिकल रोगों की अग्रिम समझ और संभावित उपचारविकसित करने की वैज्ञानिकों की क्षमता में सुधार किया जा सके। इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड, जिसे ब्रेन मशीन इंटरफेस (बीएमआई) सिस्टम के हिस्से के रूप में उपयोग किया जाता है, न्यूरॉन्स के किसी व्यक्ति या छोटे समूहों से कार्रवाई क्षमता की रिकॉर्डिंग को मोटर इरादों का पता लगाने में सक्षम बनाता है जिसका उपयोग कार्यात्मक आउटपुट3का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। वास्तव में, बीएमआई प्रणालियों का सफलतापूर्वक कृत्रिम और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए उपयोग किया गया है, जैसे कि एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस (एएलएस)4 और रीढ़ की हड्डी की चोटों5 के साथ रोगियों में कंप्यूटर कर्सर संचालित करने के लिए अधिग्रहीत सेंसरीमोटर रिदम नियंत्रण और रीढ़ की हड्डी की चोट5 और पुरानी टेट्राप्लेजिया6से पीड़ित लोगों में आंदोलन बहाल करना।

दुर्भाग्य से, आईएमएस अक्सर कई विफलता मोड के कारण समय के साथ लगातार रिकॉर्ड करने में विफल रहता है जिसमें यांत्रिक, जैविक और भौतिक कारक7,8शामिल होते हैं। इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण के बाद होने वाली न्यूरोभड़काऊ प्रतिक्रिया को इलेक्ट्रोड विफलता9, 10 ,11,12,13,14में योगदान देने के लिए एक काफी चुनौती माना जाता है । आईएमई के प्रारंभिक सम्मिलन के दौरान न्यूरोभड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू की जाती है जो रक्त मस्तिष्क बाधा को तोड़ता है, स्थानीय मस्तिष्क परेंचिमा को नुकसान पहुंचाता है और ग्लियल और न्यूरोनल नेटवर्क15,16को बाधित करता है। इस तीव्र प्रतिक्रिया की विशेषता ग्लडियल कोशिकाओं (माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज और एस्ट्रोसाइट्स) की सक्रियता है, जो प्रत्यारोपण स्थल17,18,19,20के आसपास प्रो -भड़काऊ और न्यूरोटॉक्सिक अणुओं को छोड़ती है । ग्लियल कोशिकाओं की पुरानी सक्रियता के परिणामस्वरूप विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया होती है जो मस्तिष्क के स्वस्थ ऊतक7,9,12,13,17,21,22से इलेक्ट्रोड को अलग करने वाली ग्लियल निशान के गठन की विशेषता होती है । अंततः, इलेक्ट्रोड और न्यूरॉन्स के बीच शारीरिक बाधा और न्यूरॉन्स23,24,25के पतन और मृत्यु के कारण, न्यूरोनल कार्रवाई क्षमता रिकॉर्ड करने की इलेक्ट्रोड की क्षमता में बाधा।

इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड की शुरुआती विफलता से अगली पीढ़ी के इलेक्ट्रोड के विकास में काफी शोध हुआ है , जिसमें बायोमिमेटिक रणनीतियों26,27,28,29,30पर जोर दिया गया है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए विशेष रुचि का, आईआईएमएस31के लिए बायोमिमेटिक सतह परिवर्तन के एक वर्ग के रूप में नैनो-आर्किटेक्चर का उपयोग है। यह स्थापित किया गया है कि वीवो वातावरण में प्राकृतिक की वास्तुकला की नकल करने वाली सतहों में जैव संगत प्रतिक्रिया32,33 ,34,35,36है . इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को मजबूर करने वाली परिकल्पना यह है कि मस्तिष्क के ऊतकों की किसी न किसी वास्तुकला और इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड की चिकनी वास्तुकला के बीच विच्छेदन प्रत्यारोपित आईएमएस के न्यूरोभड़काऊ और पुरानी विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया में योगदान दे सकता है (पूरी समीक्षा के लिए किम एट अल31को संदर्भित करता है)। हमने पहले दिखाया है कि नैनो-आर्किटेक्चर के उपयोग में मस्तिष्क के बाह्य मैट्रिक्स वास्तुकला के समान विशेषताएं नैनो-आर्किटेक्चर्ड सब्सट्रेट्स पर सुसंस्कृत कोशिकाओं से एस्ट्रोसाइट भड़काऊ मार्कर को कम करती हैं, जबकि न्यूरोसूजन37,38के इन विट्रो और पूर्व वीवो मॉडल में फ्लैट नियंत्रण सतहों की तुलना में। इसके अलावा, हमने सिलिकॉन जांच पर सीधे नैनो-आर्किटेक्चर के लिए केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) लिथोग्राफी के आवेदन को दिखाया है, जिसके परिणामस्वरूप चिकनी नियंत्रण समूह26की तुलना में नैनो-आर्किटेक्चर जांच के साथ प्रत्यारोपित जानवरों से न्यूरोनल व्यवहार्यता और समर्थक भड़काऊ जीन की कम अभिव्यक्ति हुई है। इसलिए, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य निर्मित इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड उपकरणों पर नैनो-आर्किटेक्चर को एफआईबी लिथोग्राफी के उपयोग का वर्णन करना है। इस प्रोटोकॉल को स्वचालित और मैनुअल दोनों प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड टांगों की सिलिकॉन सतहों में नैनो-आर्किटेक्चर आकार की विशेषताओं को नक़्क़ाशी करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। ये विधियां सीधी, प्रजनन योग्य हैं, और निश्चित रूप से विभिन्न डिवाइस सामग्रियों और वांछित सुविधा आकारों के लिए अनुकूलित की जा सकती हैं।

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Protocol

नोट: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते समय निम्नलिखित चरण करें, जैसे प्रयोगशाला कोट और दस्ताने।

1. फोकस्ड आयन बीम (एफआईबी) लिथोग्राफी के लिए बढ़ते गैर-कार्यात्मक सिलिकॉन प्रोब

नोट: पूरी प्रक्रिया के लिए 1,000 जांच के साथ SOI वेफर के निर्माण का वर्णन, कृपया Ereifej एट अल39का उल्लेख है.

  1. इंसुलेटर (एसओआई) वेफर पर सिलिकॉन से 2-3 सिलिकॉन जांच की एक पट्टी अलग १,००० जांच युक्त । तीन से अधिक सिलिकॉन जांच युक्त स्ट्रिप्स न बनाएं। इससे ढीले बढ़ते जाने की संभावना बढ़ सकती है और इसके परिणामस्वरूप एफआईबी गलत तरीके से नक़्क़ाशी कर सकता है।
    नोट: स्ट्रिप्स/जांच दृढ़ता से एल्यूमीनियम स्टब पर नहीं बैठे दो जटिलताओं का कारण बन सकता है: 1) जब मंच अगले खंड पर काम करने के लिए कदम, वहां कंपन होगा और मिलिंग सही नहीं होगा जब तक जांच सुलझेगी और 2) यह एक उच्च भिन्नता पैदा कर सकता है और ध्यान विमान से बाहर हो सकता है ।
    1. दस्ताने पहने हुए, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए जांच के आसपास दबाव डालने के लिए बंद एक छोटे से दो से तीन जांच युक्त अनुभाग को तोड़ने के लिए ।
  2. ध्यान से FIB नक़्क़ाशी से पहले सभी धूल और मलबे की सिलिकॉन जांच साफ करें । तीन कुओं में 95% इथेनॉल के 3 mL/well पाइपिंग करके 6 अच्छी तरह पॉलीस्टीरिन प्लेट तैयार करें।
    1. ध्यान से ठीक टिप या वैक्यूम संदंश का उपयोग कर सिलिकॉन जांच की कटौती पट्टी उठाओ और यह सेल छलनी में जगह है । जांच को तोड़ने से रोकने के लिए प्रति छलनी सिलिकॉन जांच की केवल एक पट्टी रखें। सफाई के लिए 95% इथेनॉल युक्त पहले कुएं में सिलिकॉन प्रोब्स स्ट्रिप युक्त छलनी रखें। छलनी को 5 मिन के लिए पहले कुएं में रखें।
    2. पहले अच्छी तरह से सिलिकॉन जांच युक्त छलनी ले जाएँ और यह दूसरे अच्छी तरह से एक और 5 मिन के लिए 95% इथेनॉल युक्त में जगह है. तीसरे कुएं में एक बार और दोहराएं.
    3. साफ सिलिकॉन जांच युक्त छलनी को एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन प्लेट पर सूखी हवा में रखें। धूल से संदूषण से बचने के लिए एक बाँझ हुड में यह कदम उठाएं।
  3. एसईएम-एफआईबी के परिवहन के लिए एक सीलबंद कंटेनर में सिलिकॉन जांच की हवा से सूखी पट्टी रखें। सफाई बनाए रखने के लिए परिवहन और/या भंडारण के लिए प्लास्टिक या एल्यूमीनियम पन्नी लपेटो के साथ हवा में सूखे नमूनों युक्त छलनी लपेटें ।
  4. सिलिकॉन जांच की साफ पट्टी को ध्यान से लेने के लिए ठीक इत्तला दे दी या वैक्यूम संदंश का उपयोग करें और बढ़ते के लिए तैयार करने के लिए उन्हें एक साफ एल्यूमीनियम स्टब (एसईएम-एफआईबी इमेजिंग/नक़्क़ाशी के लिए उपयोग किया जाता है) पर रखें।
  5. एक टूथपिक (या अन्य ठीक इत्तला दे दी उपकरण एक पतली बिजली के तार की तरह उपयोग करें), एक छोटे से बूंद (~ 10 μL) जांच के आसपास सिलिकॉन सब्सट्रेट के किनारे पर चांदी के रंग की एक छोटी सी बूंद (~ 10 μL) जगह है । जांच के आसपास सिलिकॉन सब्सट्रेट के किनारों के चारों ओर चांदी के रंग को फैलाकर पट्टी को सुरक्षित करें। सेम-एफआईबी में एल्यूमीनियम स्टब रखने से पहले सिल्वर पेंट को पूरी तरह से सूखने दें।
    नोट: सावधान रहें कि इलेक्ट्रोड के टांग पर चांदी का पेंट न हो क्योंकि यही वह हिस्सा है जो नक़्क़ाशीपर होगा। यदि जांच की पट्टी सुरक्षित रूप से एल्यूमीनियम स्टब के लिए लंगर डाले नहीं है, पट्टी प्रसंस्करण के दौरान स्थानांतरित कर सकते है या एक अलग फोकल विमान है, जिससे FIB द्वारा गलत मिलिंग में जिसके परिणामस्वरूप । सिलिकॉन जांच के कई स्ट्रिप्स एक ही एल्यूमीनियम स्टब पर मुहिम शुरू की जा सकती है, यकीन है कि वहां स्ट्रिप्स के बीच पर्याप्त जगह के लिए नक़्क़ाशी के बाद स्टब से हटाने के लिए अनुमति है । यह नीचे वर्णित स्वचालित सुविधा का उपयोग करके कई जांचों के अधिक कुशल नक़्क़ाशी की अनुमति देगा।

2. सिलिकॉन जांच के लिए एफआईबी संरेखित

  1. चैंबर वेंट करने के लिए बीम कंट्रोल टैब में वेंट बटन पर क्लिक करें। प्रेस शिफ्ट + F3 घर के मंच प्रदर्शन करने के लिए । पॉपअप विंडो में होम स्टेज बटन का चयन करके चयन की पुष्टि करें।
    नोट: घर चरण आपरेशन चल रहा है एक निवारक कदम सुनिश्चित करने के लिए मंच धुरी सॉफ्टवेयर द्वारा सही ढंग से पढ़ा रहे है और माइक्रोस्कोप अच्छी हालत में है ।
  2. होम स्टेज पूरा होने के बाद, एक्स = 70 मिमी, वाई = 70 मिमी, जेड = 0 मिमी, टी = 0 डिग्री, आर = 0 डिग्री को निर्देशित करने के लिए चरण को स्थानांतरित करें। एक बार चैंबर निकाल दिया जाता है, साफ नाइट्रिक दस्ताने पर डाल दिया और चैंबर का दरवाजा खोलो।
    नोट: पिछले उपयोगकर्ता के आवेदन के आधार पर, स्टेज एडाप्टर को बदलना आवश्यक हो सकता है। मानक चरण एडाप्टर (जैसे, एफआईई शैली) को केंद्रीय बोल्ट काउंटरक्लॉकवाइज को अनस्क्रूकर हटाया जा सकता है और मंच की रोटेशन प्लेट में दक्षिणावर्त पंगा लेकर स्थापित किया जा सकता है।
  3. मंच एडाप्टर के शीर्ष में जांच पकड़े एल्यूमीनियम स्टब डालें। मंच एडाप्टर के किनारे पर सेट पेंच कस कर एल्यूमीनियम स्टब सुरक्षित करें। इस कार्य के लिए 1.5 मिमी हेक्स रिंच का उपयोग करें।
  4. इसे कम करने के लिए एडाप्टर क्लॉकवाइज को मोड़कर स्टेज एडाप्टर की ऊंचाई को समायोजित करें या इसे उठाने के लिए वामावर्त। मंच रोटेशन प्लेट के खिलाफ अखरोट सुरक्षित होने तक लॉकिंग कोन अखरोट दक्षिणावर्त मोड़ कर रोटेशन प्लेट में स्टेज एडाप्टर सुरक्षित करें। लॉकिंग कोन अखरोट को कसते हुए एडाप्टर और नमूनों के रोटेशन को रोकने के लिए दूसरे हाथ से स्टेज एडाप्टर पकड़ो।
    नोट: उचित ऊंचाई निर्धारित करने के लिए प्रदान की गई ऊंचाई गेज का उपयोग करें। एल्यूमीनियम स्टब के शीर्ष ऊंचाई गेज पर दिखाया अधिकतम लाइन के रूप में एक ही ऊंचाई होना चाहिए। शंकु अखरोट कस पर मंच और एडाप्टर को नुकसान हो सकता है। केवल नमूनों को सुरक्षित करने के लिए पर्याप्त बल का उपयोग करें।
  5. नेविगेशन कैमरा छवि प्राप्त करें। ध्यान से नेविगेशन कैमरा हाथ खुला स्विंग जब तक यह बंद हो जाता है । माइक्रोस्कोप स्टेज स्वचालित रूप से कैमरे के नीचे एक स्थिति में चला जाएगा। माइक्रोस्कोप यूजर इंटरफेस (यूआई) के क्वाड्रेंट 3 में दिखाई गई लाइव इमेज देखें।
    1. एक बार जब चमक स्तर ऑटो एक उपयुक्त स्तर पर समायोजित हो जाता है, तो कैमरा ब्रैकेट पर बटन को नीचे धकेलकर छवि प्राप्त करें। पूरी छवि अधिग्रहण को खत्म करने के लिए इंतजार करना सुनिश्चित करें, जो क्वाड्रेंट 3 में प्रदर्शित होने वाले ठहराव प्रतीक और कैमरे की रोशनी बंद होने से संकेत मिलता है। यह लगभग 10 एस लेता है कैमरा हाथ वापस बंद स्थिति में स्विंग । मंच मूल पद पर लौट आएगा।
  6. माइक्रोस्कोप चैंबर का दरवाजा सावधानी से बंद करें। दरवाजा बंद करते समय क्वाड्रेंट 4 में सीसीडी कैमरा इमेज देखें। सुनिश्चित करें कि नमूने और चरण माइक्रोस्कोप कक्ष में किसी भी महत्वपूर्ण घटक से एक सुरक्षित दूरी हैं।
  7. बीम कंट्रोल टैब में पंप बटन के बगल में नीचे तीर का चयन करें चैंबर वैक्यूम पंप शुरू करने के लिए यूआई सॉफ्टवेयर में नमूना सफाई बटन के साथ पंप का चयन करें और प्लाज्मा क्लीनर में बनाया गया है। सुनिश्चित करें कि दरवाजा धीरे दरवाजे के चेहरे पर धक्का द्वारा बंद कर दिया है, जबकि पंप चल रहा है । माइक्रोस्कोप चैंबर को पूरा करने के लिए पंपिंग समय और प्लाज्मा सफाई चक्र के लिए लगभग 8 मिन की प्रतीक्षा करें।
    नोट: एक वैक्यूम सील धीरे चैंबर दरवाजे पर खींच द्वारा पुष्टि की जा सकती है, जो बंद रहना चाहिए अगर प्रणाली वैक्यूम के तहत है ।
  8. एक बार यूआई के निचले दाहिने कोने में आइकन हरा हो जाता है, बीम कंट्रोल टैब में वेक-अप बटन दबाएं जो इलेक्ट्रॉन और आयन बीम पर बदल जाता है। चतुर्भुज 1 का चयन करें और इलेक्ट्रॉन बीम के लिए बीम संकेत सेट (यदि पहले से ही सेट नहीं है), आयन बीम के लिए चक्र 2 सेट (यदि पहले से ही सेट नहीं है) ।
    1. एसईएम वोल्टेज को 5 केवी में सेट करें, एसईएम बीम करंट को 0.20 एए पर सेट करें, एसईएम डिटेक्टर को ईटीडी में सेट करें, सेकेंडरी इलेक्ट्रॉन के लिए डिटेक्टर मोड सेट करें। 30 केवी के लिए एफआईबी वोल्टेज सेट करें, एफआईबी बीम करंट को 24 पीए पर सेट करें, एफआईबी डिटेक्टर को आईस डिटेक्टर सेट करें, सेकेंडरी इलेक्ट्रॉन को डिटेक्टर मोड सेट करें ।
  9. नेविगेशन कैमरा छवि में सिलिकॉन जांच पर डबल क्लिक करें, चक्र 3 जांच के अनुमानित स्थान पर मंच ले जाने के लिए । इसे एक्टिव क्वाड्रंट के रूप में चुनने के लिए क्वाड्रंट 1 पर क्लिक करें और एसईएम स्कैनिंग शुरू करने के लिए ठहराव बटन को हिट करें। स्कैन को 300 एनएस पर सेट करें और स्कैन इंटरलेसिंग, लाइन इंटीग्रेशनऔर फ्रेम को औसत बंद कर दें. बीम कंट्रोल टैब में 0 के लिए स्कैन रोटेशन सेट करें और बीम शिफ्ट 2डी एडजस्टर पर सही क्लिक करें और शून्यका चयन करें।
  10. MUI पैनल पर आवर्धन घुंडी पलटवार करके न्यूनतम मूल्य के लिए आवर्धन समायोजित करें । एमयूआई पैनल या ऑटो कंट्रास्ट ब्राइटनेस टूलबार आइकन पर नॉब्स का उपयोग करके छवि चमक और विपरीत समायोजित करें।
  11. इसे केंद्र में रखने के लिए माउस को एक सुविधा पर डबल-लेफ्ट-क्लिक करके, या माउस व्हील को दबाकर और जॉयस्टिक माउस मोड को सक्रिय करके मंच को स्थानांतरित करें। एसईएम छवि के केंद्र में पैटर्न होने के लिए वांछित सिलिकॉन जांच को स्थानांतरित करें।
  12. एक किनारे या अन्य सुविधाओं जैसे धूल कण या खरोंच का पता लगाएं। आवर्धन घुंडी दक्षिणावर्त मोड़ द्वारा 2,000x करने के लिए आवर्धन बढ़ाएं। जब तक छवि ध्यान में न हो, तब तक एमयूआई पर मोटे और ठीक फोकस घुंडी को मोड़कर एसईएम का ध्यान समायोजित करें। एक बार छवि ध्यान में है, टूलबार में दूरी बटन काम करने के लिए लिंक नमूना Z का चयन करें ।
  13. इस बात की पुष्टि करें कि नेविगेशन टैब में जेड-एक्सिस समन्वय को देखकर ऑपरेशन पूरा किया गया था। मूल्य लगभग 11 मिमी होना चाहिए। जेड एक्सिस स्थिति में 4.0 मिमी में टाइप करें और माउस के साथ गो टू बटन को पुश करें या कीबोर्ड पर प्रवेश कुंजी को हिट करें और चरण 4 मिमी कार्य दूरी तक बढ़ जाएगा।
  14. सिलिकॉन जांच के कंधे का पता लगाने के लिए एक्स और वाई में मंच ले जाएँ। इसे यथासंभव एसईएम के केंद्र के करीब रखें। टी समन्वय और मार दर्ज में "52" में टाइप करके चरण झुकाव को 52 डिग्री तक बदलें। देखें कि क्या जांच का कंधा छवि में ऊपर या नीचे जाने लगता है । जांच के कंधे को एसईएम छवि के केंद्र में वापस लाने के लिए स्टेज जेड स्लाइडर का उपयोग करें। केवल जेड स्थिति को समायोजित करें, एक्स, वाई, टी या आर एक्सिस को स्थानांतरित न करें।
  15. स्टेज ड्रॉप डाउन मेन्यू में स्थित'xT align फ़ीचर'कमांड में निर्मित भागो। जांच के किनारे के समानांतर दो बिंदुओं पर क्लिक करने के लिए माउस का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि क्षैतिज रेडियो बटन पॉपअप विंडो में चुना गया है और खत्म क्लिक करें। मंच के एक्स धुरी के साथ जांच संरेखित करने के लिए मंच घुमाया जाएगा । एसईएम छवि के केंद्र में जांच के निचले कंधे को फिर से रखने के लिए माउस का उपयोग करके एक्स, वाई में चरण को समायोजित करें।
    नोट- पहला मुद्दा जांच की पकड़ की ओर होना चाहिए और दूसरा बिंदु जांच की ओर होना चाहिए।
  16. चतुर्भुज 2 में एफआईबी का चयन करें और सुनिश्चित करें कि बीम वर्तमान अभी भी 24 पीए है। आवर्धन को 5,000x और 100 एनएस के लिए निवास समय निर्धारित करें। एफआईबी फोकस को 13.0 मिमी तक सेट करने के लिए कीबोर्ड पर सीटीआरएल-एफ टाइप करें। बीम कंट्रोल टैब में, कलंक 2डी एडजस्टर में सही क्लिक करें और शून्य का चयन करें और, बीम शिफ्ट 2डी एडजस्टर में सही क्लिक करें और शून्यका चयन करें। स्कैन रोटेशन को 0 डिग्री तक सेट करें और टूलबार में ऑटो कंट्रास्ट ब्राइटनेस बटन को पुश करें।
  17. चक्र 2 में जांच कंधे की एक छवि के लिए देखो । एफआईबी के साथ एक छवि प्राप्त करने के लिए स्नैपशॉट टूल का उपयोग करें। जांच कंधे की पुष्टि FIB छवि के केंद्र में है, अगर नहीं, जांच कंधे पर डबल क्लिक करने के लिए यह केंद्र में ले जाने के लिए । लगभग 10-15 बार कीबोर्ड पर बाएं तीर कुंजी को धक्का देकर बाईं ओर मंच को स्थानांतरित करें। एक और स्नैपशॉट लें और देखें कि क्या जांच पक्ष अभी भी एफआईबी के केंद्र में है।
    नोट: यदि नहीं, तो चरण रोटेशन को थोड़ा समायोजित किया जाना चाहिए। यदि जांच छवि केंद्र से ऊपर है, तो मंच को नकारात्मक दिशा में घुमाया जाना चाहिए। यदि जांच केंद्र से नीचे है, तो मंच को दक्षिणावर्त घुमाया जाना चाहिए । जांच को संरेखित करने के लिए किस तरह से आवश्यक है, इसके आधार पर 0.01 से 0.2 डिग्री का सापेक्ष कम्पुकेंद्रित रोटेशन दर्ज करें।
  18. बार-बार चरण कंधे के किनारे के साथ आवश्यक चरण 2.16 से 2.17 तक दोहराएं, (बाएं बढ़ने के दौरान किनारे एफआईबी के केंद्र में रहता है)।
  19. एफआईबी का उपयोग करके, मंच को जांच के निचले कंधे पर वापस ले जाएं। ऐड बटन पर क्लिक कर के पोजीशन लिस्ट में स्टेज पोजीशन को सेव करें। एफआईबी बीम वर्तमान को 2.5 ना में बदलें और सुनिश्चित करें कि एफआईबी का आवर्धन अभी भी 5000x है। ऑटो ब्राइटनेस कंट्रास्ट फंक्शन चलाएं और एफआईबी को १०० ns के लिए समय देना तय करें ।
  20. स्कैनिंग शुरू करने के लिए ठहराव बटन मारो। एफआईबी फोकस और एस्टिमेटिज्म को समायोजित करें, जितनी जल्दी हो सके, मोटे और ठीक फोकस घुंडी का उपयोग करके, और MUI पैनल पर एक्स और वाई कलंक घुंडी का उपयोग करें। एफआईबी स्कैनिंग को रोकने के लिए ठहराव बटन मारो।

3. नक़्क़ाशी के लिए एक स्वचालित प्रक्रिया लेखन

  1. विंडोज स्टार्ट मेनू (यानी, स्टार्ट\प्रोग्राम \ एफईआई कंपनी \ अनुप्रयोगों में इसका पता लगाकर सॉफ्टवेयर शुरू करें। साइड मॉनिटर पर सॉफ्टवेयर विंडो की स्थिति इसलिए यूआई कवर नहीं किया गया है। फाइल पर क्लिक करके सिलिकॉन जांच पैटर्न िंग के लिए फ़ाइल खोलें और फिर खोलें। विंडोज ब्राउज़र को सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट(सप्लीमेंट्री फाइल 1 - फाइल नाम "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.जेजेज़") के स्थान पर निर्देशित करें।
  2. सॉफ्टवेयर के भीतर, माइक्रोस्कोप ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें और सेट चरण मूलका चयन करें। सॉफ्टवेयर के भीतर, माइक्रोस्कोप ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें और फिर कैलिब्रेट डिटेक्टरोंका चयन करें।
  3. माइक्रोस्कोप यूआई पर क्वाड 1 का चयन करने के लिए माउस के साथ एक बार क्वाड 1 में क्लिक करें। पॉपअप विंडो में दिखाए गए अन्य निर्देशों पर ध्यान न दें, वे इस परियोजना के लिए आवश्यक नहीं हैं। अंशांकन शुरू करने के लिए ठीक क्लिक करें। इस प्रक्रिया में लगभग 5 मिन लगेंगे। सुनिश्चित करें कि ईटीडी और आइस डिटेक्टर कैलिब्रेट करते हैं। यदि किसी अन्य डिटेक्टर में अंशांकन विफलताएं हैं तो यह ठीक है।
  4. सॉफ्टवेयर के भीतर, माइक्रोस्कोप ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें और पैटर्निंग अनुक्रम शुरू करने के लिए निष्पादित चुनें। जब पैटर्न पूरा हो जाए, तो सॉफ्टवेयर बंद कर दिया।
    नोट: सॉफ्टवेयर पैटर्निंग और अलाइनमेंट कार्यों के लिए क्वाड 3 और 4 पर ले जाएगा। स्क्रिप्ट को चलाने में लगभग 12 घंटे लगेंगे । जबकि स्क्रिप्ट चल रही है, माइक्रोस्कोप पर किसी भी पैरामीटर में बदलाव नहीं है।
  5. माइक्रोस्कोप बीम को बंद करने और वेंट चक्र शुरू करने के लिए माइक्रोस्कोप यूआई बीम कंट्रोल टैब में"वेंट"मारो। जबकि कक्ष निकाल रहा है, एक्स = 70 मिमी, वाई = 70 मिमी, जेड = 0 मिमी, टी = 0 डिग्री, आर = 0 डिग्री को निर्देशित करने के लिए मंच को स्थानांतरित करें। एक बार चैंबर निकाल दिया जाता है, साफ नाइट्रिक दस्ताने पर डाल दिया और चैंबर का दरवाजा खुला खींचो ।
  6. 1.5 मिमी हेक्स रिंच का उपयोग करस्ट एडाप्टर पर सेट पेंच ढीला। कक्ष से नमूनों की जांच युक्त एल्यूमीनियम स्टब निकालें। माइक्रोस्कोप चैंबर का दरवाजा सावधानी से बंद करें। दरवाजा बंद करते समय क्वाड्रेंट 4 में सीसीडी कैमरा इमेज देखें। सुनिश्चित करें कि मंच एडाप्टर माइक्रोस्कोप कक्ष में किसी भी महत्वपूर्ण घटक से दूर एक सुरक्षित दूरी है।
  7. बीम कंट्रोल टैब में पंप बटन के बगल में नीचे तीर का चयन करें। कक्ष वैक्यूम पंप शुरू करने के लिए पंप बटन का चयन करें। सुनिश्चित करें कि दरवाजा धीरे दरवाजे के चेहरे पर धक्का द्वारा बंद कर दिया है, जबकि पंप चल रहा है ।
    नोट: एक वैक्यूम सील धीरे चैंबर दरवाजे पर खींच द्वारा पुष्टि की जा सकती है, जो बंद रहना चाहिए अगर प्रणाली वैक्यूम के तहत है । पंपिंग का समय लगभग 5 मिन होगा। एक ही रन के दौरान जांच का केवल एक पक्ष ही नक़्क़ाशी पर लगाया जा सकता है ।
  8. यदि जांच के सामने और पीछे की ओर नक़्क़ाशी की आवश्यकता है, तो ध्यान से अंतिम नक़्क़ाशी की जांच और सामने की ओर इमेजिंग के बाद सिलिकॉन जांच की नक़्क़ाशी पट्टी को हटा दें (यदि छवियों की जरूरत है) । चांदी के पेंट को एसीटोन के साथ भंग करें, चांदी के पेंट पर एसीटोन को सावधानी से डबिंग/ब्रश करके। ऊपर वर्णित चरणों के बाद पट्टी को बैकसाइड में घुमाएं, फिर से माउंट करें, संरेखित करें और नक़्क़ाशी करें।

4. अंतिम Etch और इमेजिंग की जांच

  1. एक बार मिलिंग पूरी हो जाने के बाद एक उच्च आवर्धन पर एसईएम इमेजिंग का उपयोग करके विभिन्न वर्गों की एकरूपता को सत्यापित करें।
    नोट: झुका कोण पर इमेजिंग मिलिंग गहराई में भिन्नता का बेहतर आकलन करने की अनुमति देता है। मिलिंग स्थानों के बीच संक्रमण क्षेत्रों पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए।
  2. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ मिलिंग के बाद फिर से नमूनों की छवि ।
    नोट: आवधिक मिल्ड लाइनों के परिणामस्वरूप इमेजिंग कोण के एक समारोह के रूप में विभिन्न रंगों को जन्म देने वाला अपवर्तन प्रभाव होता है। यदि जांच के साथ रंग निरंतर नहीं है जो मिल्ड लाइनों में व्यवधान का स्पष्ट संकेत है।

5. एफआईबी नक़्क़ाशी के लिए एक कार्यात्मक सिलिकॉन जांच बढ़ते

  1. धीरे-धीरे इसकी पैकेजिंग से फंक्शनल सिलिकॉन इलेक्ट्रोड को हटा दें। सिर के चरण को कवर करने वाले प्लास्टिक सुरक्षात्मक टैब को सावधानीपूर्वक उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें। टैब के एक कोने को चिपचिपा गोंद से उठाना शुरू करें और पूरे इलेक्ट्रोड को हटाने तक उठाते रहें।
  2. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में बढ़ते के लिए तैयार करने के लिए हेमोस्टेट के साथ इलेक्ट्रोड को सावधानीपूर्वक दबाएं। संदंश के साथ कवर टैब को पकड़ते समय, धीरे-धीरे सिलिकॉन टांग के ऊपर हरे शाफ्ट के चारों ओर घुमावदार हेमोसेंट रखें, जिसमें हेब्स्ट्स के घुमावदार हिस्से टैब की ओर ऊपर की ओर सामना कर रहे हैं। इलेक्ट्रोड को सुनिश्चित करने के लिए हेमोस्टेट को लॉक करें हेमोस्टट्स।
  3. सिर के चरण को कवर करने वाले प्लास्टिक प्रोटेक्टिव टैब को धीरे से हटा दें। हेमोस्टेट के साथ इलेक्ट्रोड पकड़े हुए, ध्यान से सफाई के लिए स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में इलेक्ट्रोड क्लिप।
  4. 95% इथेनॉल (~ 10 mL प्रति पेट्री डिश) के साथ 3 पेट्री व्यंजन भरें। पेट्री डिश को इलेक्ट्रोड के नीचे रखें जो सफाई के लिए स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखा गया है। माइक्रोजोड़क को नीचे की ओर मोड़कर इलेक्ट्रोड को धीरे-धीरे कम करें (100 माइक्रोन/एस) ताकि टांग 95% इथेनॉल में डूब जाए।
    नोट: सावधान रहें कि माइक्रोरिपुलेटर को बहुत तेज या बहुत गहरा न करें, इससे इलेक्ट्रोड टूट सकता है (यानी, इलेक्ट्रोड पेट्री डिश को नहीं छूना चाहिए)।
  5. इलेक्ट्रोड टांग को 5 मिन के लिए 95% इथेनॉल में छोड़ दें, और फिर धीरे-धीरे माइक्रोजोड़क को ऊपर की ओर मोड़कर 95% इथेनॉल से इलेक्ट्रोड को ऊपर की ओर बढ़ाएं (100 माइक्रोन/एस)। कुल तीन वॉश के लिए इस कदम को दो बार और दोहराएं। इलेक्ट्रोड को पांच मिनट के लिए सूखी हवा की अनुमति दें।
  6. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से इलेक्ट्रोड को हटाने के लिए, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में इलेक्ट्रोड को बढ़ाने के लिए एक ही तकनीक का उपयोग करें। ध्यान से इलेक्ट्रोड के शाफ्ट के आसपास हेमोस्टट्स रखें। एक बार जब हेमोस्टेट तंग हो जाते हैं, तो स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से इलेक्ट्रोड जारी करें, सिर के चरण को कवर करने वाले प्लास्टिक सुरक्षात्मक टैब को वापस करें, और साफ किए गए इलेक्ट्रोड को अपनी पैकेजिंग में वापस डाल दें।

6. एफआईबी का उपयोग कर कार्यात्मक सिलिकॉन जांच नक़्क़ाशी

  1. एक एल्यूमीनियम स्टैंड पर साफ कार्यात्मक सिलिकॉन इलेक्ट्रोड माउंट। सावधानी से संदंश का उपयोग करके साफ कार्यात्मक सिलिकॉन इलेक्ट्रोड उठाएं और हेडस्टेज से सुरक्षात्मक टैब को हटा दें। एल्यूमीनियम स्टब पर इलेक्ट्रोड टांग रखें ताकि यह किसी भी किनारे पर लटका न हो, फिर क्यू या कार्बन कंडक्टिव टेप के एक छोटे से टुकड़े का उपयोग करके, एल्यूमीनियम स्टब को हेडस्टेज को सुरक्षित रूप से पिन करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रोड को नीचे रखने के लिए एक कम प्रोफ़ाइल क्लिप धारक का उपयोग किया जा सकता है। इलेक्ट्रोड टांग को न छूने के लिए सावधान रहें।
  2. ऊपर वर्णित चरणों (धारा 2) के बाद, यूकेंद्रित ऊंचाई पर इलेक्ट्रोड की स्थिति और सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड एसईएम और एफआईबी बीम के संयोग बिंदु पर है। मंच की "एक्स" दिशा के साथ टांग को संरेखित करें।
  3. आवश्यक नैनो-आर्किटेक्चर को मिलिंग के लिए एफआईबी को इष्टतम वर्तमान में सेट करें और सुनिश्चित करें कि ध्यान और कलंक को ठीक से ठीक किया जाए। टांग (500 माइक्रोन सेक्शन) के दृश्य के क्षेत्र को कवर करने के लिए वांछित अंतर और लंबाई के साथ लाइनों की एक सरणी तैयार करें। लाइन की लंबाई को समायोजित करें क्योंकि नक़्क़ाशी पतली वर्गों के लिए टांग नीचे हो जाता है।
    नोट: कार्यात्मक इलेक्ट्रोड नक़्क़ाशी करते समय, प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए प्रत्ययी चिह्न जोड़ना संभव नहीं है। इसलिए, उप-वर्गों (~ 500 माइक्रोन) के बीच चलना मैन्युअल रूप से किया जाता है।
  4. पहले सेक्शन की मिलिंग पूरी होने के बाद अगले सेक्शन पर जाने से पहले मिलिंग क्वालिटी की जांच जरूर कर लें। टांग के अगले खंड को नक़्क़ाशी करने के लिए चरण 6.3 दोहराएं। रन के बीच बड़े अंतराल को रोकने के लिए अगले खंड के लिए उपयोग किए जाने वाले पैटर्न के लिए पिछले खंड से मिल्ड लाइनों को संरेखित करें।

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Representative Results

एकल टांग इंट्राकॉर्टिकल जांच की सतहों पर एफआईबी नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर
यहां वर्णित तरीकों का उपयोग करते हुए, स्थापित प्रोटोकॉल39के बाद विशिष्ट नैनो-आर्किटेक्चर के साथ इंट्राकॉर्टिकल जांच की गई थी। इन विधियों में वर्णित नैनो-आर्किटेक्चर डिजाइन के आयाम ों और आकार को पिछले इन विट्रो परिणामों से लागू किया गया था, जिसमें ग्लियल सेल प्रतिक्रियाशीलता में कमी को दर्शाया गया था, जब नैनो-आर्किटेक्चर डिजाइन के साथ सुसंस्कृत37,38वर्णित था। यहां वर्णित तरीकों ने गैर-कार्यात्मक एकल टांग सिलिकॉन माइक्रोइलेक्ट्रोड जांच की सतह में नैनोस्केल समानांतर खांचे को नक़्क़ाशी करने के लिए एक केंद्रित गैलियम आयन बीम (एफआईबी) का उपयोग किया, जैसा कि पहलेवर्णित था 39। नैनोस्केल समानांतर खांचे सॉफ्टवेयर में लिखी गई एक स्वचालित स्क्रिप्ट का उपयोग करके जांच के पीछे की टांग के साथ नक़्क़ाशीदार थे। नक़्क़ाशीदार नैनो-आर्किटेक्चर के अंतिम आयाम 200 एनएम चौड़ी समानांतर रेखाएं थीं, 300 एनएम के अलावा दूरी पर थीं, और 200 एनएम(चित्रा 1)की गहराई थी। एक डिवाइस की सतह में नैनो आर्किटेक्चर को नक़्क़ाशी करने के लिए एफआईबी का उपयोग निर्मित उपकरणों में सटीक डिजाइनों को नक़्क़ाशी करने की अनुमति देता है।

न्यूरोसूजन पर इंट्राकॉर्टिकल जांच प्रभाव में नक़्क़ाशीड नैनो वास्तुकला
इस पहले रिपोर्ट किए गए डेटा में, नक़्क़ाशी नैनो-आर्किटेक्चर के साथ इंट्राकॉर्टिकल जांच को चूहों के कॉर्टेक्स में या तो दो या चार सप्ताह (एन = 4 प्रति समय बिंदु) के लिए प्रत्यारोपित किया गया था और चिकनी जांच के साथ प्रत्यारोपित जानवरों को नियंत्रित करने की तुलना में कोई नैनो-आर्किटेक्चर नक़्क़ाशी (एन =4 प्रति समय बिंदु)39नहीं था। इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड की नैदानिक तैनाती में बाधा डालने के तंत्र में से एक मस्तिष्क परेंचिमा और रक्त मस्तिष्क बाधा9,10,11,12,15को बाधित करने से प्रेरित न्यूरोभड़काऊ प्रतिक्रिया है । इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड इम्प्लांटेशन के बाद देखी गई न्यूरोभड़काऊ प्रतिक्रिया का पूरा वर्णननिम्नलिखित समीक्षाओं में पायाजा सकता है 13 ,14,22. न्यूरॉन्स से कार्रवाई क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड की क्षमता इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग साइट40से स्वस्थ न्यूरोनल शरीर की दूरी पर निर्भर करती है। इसलिए, पहले बताए गए अध्ययन में न्यूरोनल घनत्व, ग्लियल सेल सक्रियण और भड़काऊ मार्कर39के जीन अभिव्यक्ति के लिए हिस्टोलॉजिकल मार्कर की मात्रा निर्धारित करके इंट्राकॉर्टिकल प्रोब इम्प्लांटेशन साइट के आसपास न्यूरोसूजन का मूल्यांकन किया गया था। उस अध्ययन से हाइलाइट्स न्यूरोसूजन पर जांच सतह में नैनो-आर्किटेक्चर को नक़्क़ाशी करने वाले प्रभावों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नीचे प्रस्तुत किए जाते हैं।

न्यूरॉन घनत्व पर Etched नैनो वास्तुकला के प्रभाव
यह निर्धारित करने के लिए कि जांच की सतह प्रभावों में नैनो-आर्किटेक्चर प्रत्यारोपण के तुरंत चारों ओर न्यूरोनल घनत्व कैसे है, न्यूरोनल न्यूक्लिकको पहले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विधियों39,41का वर्णन करते हुए नज़दीक नाभिक को दाग दिया गया था और मात्रा निर्धारित किया गया था। प्रत्यारोपण के बाद 2 सप्ताह में नैनो-आर्किटेक्चर और नियंत्रण जांच के आसपास न्यूरॉन घनत्व का कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था(चित्रा 2ए)। हालांकि, प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह में चिकनी नियंत्रण प्रत्यारोपण (पी एंड एलटी; 0.05 बनाम नियंत्रण)(चित्रा 2बी)की तुलना में प्रत्यारोपण साइट से 100-150 माइक्रोन दूरी पर नैनो-आर्किटेक्चर जांच के आसपास काफी अधिक न्यूरॉन्स थे। यह भी पाया गया कि समय के साथ नैनो-आर्किटेक्चर जांच के आसपास न्यूरोनल घनत्व की प्रवृत्ति में वृद्धि हुई थी, जो नियंत्रण प्रत्यारोपण(चित्रा 2)के आसपास न्यूरोनल घनत्व की कमी की प्रवृत्ति के विपरीत थी। माइक्रोइलेक्ट्रोड के आसपास व्यवहार्य न्यूरॉन्स के उच्च घनत्व के साथ एक शमन न्यूरोभड़काऊ प्रतिक्रिया को दर्शाती एक सीधा संबंध है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए गुणवत्ता रिकॉर्डिंग15,40,42प्रदान करने की क्षमता में वृद्धि होती है। इसलिए, न्यूरोनल घनत्व डेटा की व्याख्या करते समय, प्रत्यारोपण साइट के आसपास न्यूरॉन्स का एक उच्च घनत्व एक कम न्यूरोभड़काऊ प्रतिक्रिया और संभावित रूप से इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड से रिकॉर्डिंग गुणवत्ता और स्थिरता में सुधार का संकेत दे सकता है।

न्यूरोभड़काऊ आणविक मार्कर पर Etched नैनो वास्तुकला के प्रभाव
हिस्टोरोलॉजी एक प्रत्यारोपण साइट के आसपास की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, यह आसपास की कोशिकाओं के फेनोटाइप की विशेषता के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता का अभाव है। इसलिए, मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का उपयोग करने वाले तरीकों को न्यूरोभड़काऊ मार्कर की सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया था, ताकि कोशिकाओं39के फेनोटाइप पर नैनो-आर्किटेक्चर के प्रभाव को समझने के लिए। पहले बताए गए अध्ययन में कई न्यूरोभड़काऊ मार्कर की जांच की गई थी । यहां केवल दो पर प्रकाश डाला जाएगा कि माइक्रोग्लिया कोशिकाओं के लिए विशिष्ट हैं, ताकि चर्चा करने के लिए कैसे उनके फेनोटाइप बदल दिया गया हो सकता है । विभेदन 14 (सीडी14) का क्लस्टर माइक्रोग्लिया की झिल्ली पर एक पैटर्न मान्यता रिसेप्टर है जो बैक्टीरिया को पहचानता है और चोट/प्रत्यारोपण43,44,45के बाद भड़काऊ मार्ग का संकेत देता है। नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथासे (NOS2), माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज में व्यक्त किया गया एक ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस मार्कर है जो भड़काऊ मार्कर46,47के बढ़ते उत्पादन से जुड़ा हुआ है।

पहले रिपोर्ट किए गए आंकड़ों में, नैनो-आर्किटेक्चर और नियंत्रण प्रत्यारोपण के बीच CD14 सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति का कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जो प्रत्यारोपण के बाद या तो दो या चार सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण करते थे । विशेष रूप से, नैनो-आर्किटेक्चर प्रत्यारोपण साइट के आसपास दो से चार सप्ताह तक CD14 सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कमी (पी एंड एलटी; 0.05) थी, जो सूजन में संभावित कमी का संकेत है (चित्रा 3एमें * द्वारा दर्शाया गया)। इसी तरह, नैनो वास्तुकला और नियंत्रण प्रत्यारोपण के बीच NOS2 सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति का कोई महत्वपूर्ण अंतर दो सप्ताह में थे । हालांकि, प्रत्यारोपण के बाद चार सप्ताह में नियंत्रण प्रत्यारोपण की तुलना में नैनो-आर्किटेक्चर प्रत्यारोपण के आसपास काफी कम (पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०५) NOS2 सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति थी (चित्रा 3बीमें # द्वारा दर्शाया गया) । इसके अलावा, नियंत्रण प्रत्यारोपण के आसपास NOS2 सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति के 2 से 4 सप्ताह से एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी (चित्रा 3बीमें * द्वारा निरूपित), और समय के साथ नैनो-आर्किटेक्चर प्रत्यारोपण के आसपास कोई अंतर नहीं देखा गया, आगे नैनो-आर्किटेक्चर प्रत्यारोपण के आसपास सूजन की संभावित कमी का संकेत है। इस डेटा की व्याख्या करते समय, जीन के कार्य को समझना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, समर्थक भड़काऊ जीन की कमी इलेक्ट्रोड साइट के आसपास भड़काऊ प्रतिक्रिया में संभावित कमी का संकेत देती है, जबकि इस प्रकार के जीन में वृद्धि से सूजन में संभावित वृद्धि का पता चलता है ।

कार्यात्मक एकल टांग माइक्रोइलेक्ट्रोड की सतहों पर एफआईबी नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर
पहले रिपोर्ट किए गए अध्ययन में न्यूरॉन घनत्व की थोड़ी वृद्धि और नैनो-आर्किटेक्चर जांच प्रत्यारोपण साइट के आसपास माइक्रोग्लिया भड़काऊ फेनोटाइप में संभावित कमी का प्रदर्शन करने वाले परिणाम थे। इलेक्ट्रोड कार्यक्षमता के लिए इन परिणामों के अनुवाद की जांच करने के लिए, एक कार्यात्मक एकल टांग सिलिकॉन माइक्रोइलेक्ट्रोड को एक समान एफआईबी नक़्क़ाशी प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए गैर-कार्यात्मक एकल टांग सिलिकॉन माइक्रोइलेक्ट्रोड जांच के रूप में एक ही नैनो-आर्किटेक्चर डिजाइन के साथ नक़्क़ाशी किया गया था। निर्दिष्ट नैनो-आर्किटेक्चर को नक़्क़ाशी करने की कार्यप्रणाली में एकमात्र अंतर यह था कि कार्यात्मक इलेक्ट्रोड के लिए प्रोटोकॉल स्वचालित नहीं किया जा सकता है, क्योंकि प्रत्ययी चिह्न बनाने के लिए कोई अतिरिक्त सब्सट्रेट सामग्री नहीं थी। इस प्रकार, कार्यात्मक इलेक्ट्रोड को प्रत्येक 500 माइक्रोन बीम को फिर से संरेखित करके एफआईबी का उपयोग करके मैन्युअल रूप से नक़्क़ाशीपर किया गया था, जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है। अंतिम नक़्क़ाशी 200 एनएम चौड़ी समानांतर लाइनें थीं, 300 एनएम के अलावा दूरी पर थीं, और 200 एनएम(चित्रा 4)की गहराई थी।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड में नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर का प्रभाव
सफल इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग प्रत्यारोपण साइटों के आसपास न्यूरॉन्स की निकटता, डिवाइस की अखंडता और मस्तिष्क8,40,48,49से एकल इकाई गतिविधि के विश्वसनीय संचरण पर निर्भर हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग आठ सप्ताह से अधिक प्रति सप्ताह दो बार एकत्र दर्ज मैट्रिक्स का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। इस अध्ययन में उपयोग किए गए मीट्रिक, एकल इकाइयों को रिकॉर्ड करने वाले चैनलों का प्रतिशत, रिकॉर्ड की गई इकाइयों के अधिकतम आयाम, और सिग्नल-टू-शोर अनुपात (SNR) थे। लुई स्टोक्स क्लीवलैंड दिग्गजों मामलों के मेडिकल सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUC) सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी । स्प्राग डाले चूहों (8-10 सप्ताह पुराने और ~225 ग्राम वजनी) को एकल टांग सिलिकॉन माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ प्रत्यारोपित किया गया था, जिसमें उपरोक्त नैनो-आर्किटेक्चर (एन = 1) या चिकनी नियंत्रण (एन = 6) थे। इस डेटा पर कोई सांख्यिकीय विश्लेषण नहीं किया गया था, क्योंकि एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट पायलट अध्ययन के लिए प्रत्यारोपित एक नैनो-आर्किटेक्चर माइक्रोइलेक्ट्रोड था। फिर भी, सामूहिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परिणाम एकल इकाइयों(चित्रा 5ए),रिकॉर्ड की गई इकाइयों के अधिकतम आयाम(चित्रा 5बी),और चिकनी नियंत्रण माइक्रोइलेक्ट्रोड की तुलना में नैनो-आर्किटेक्चर माइक्रोइलेक्ट्रोड से एसएनआर(चित्रा 5सी)रिकॉर्ड करने वाले चैनलों का प्रतिशत दिखाते हैं, आशाजनक हैं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि माइक्रोइलेक्ट्रोड की सतह में नैनो-आर्किटेक्चर की नक़्क़ाशी संभावित रूप से बेहतर गुणवत्ता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की दीर्घायु में वृद्धि हो सकती है। इन प्रारंभिक निष्कर्षों को सत्यापित करने के लिए बढ़े हुए नमूना आकार के साथ आगे मूल्यांकन आवश्यक है।

Figure 1
चित्रा 1: एकल टांग इंट्राकॉर्टिकल प्रोब्स की सतहों पर एफआईबी नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर। टांग के पीछे एफआईबी नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर के साथ गैर-कार्यात्मक एकल टांग सिलिकॉन जांच की एसईएम छवियां। (A)120x आवर्धन, स्केल बार = 400 माइक्रोन में दिखाए गए पूरे प्रोब पोस्ट की समग्र छवियां। प्रत्ययी निशान, (एक + प्रतीक के साथ वर्ग बॉक्स के माध्यम से जा रहा है), जांच के आसपास सिलिकॉन सब्सट्रेट के साथ नक़्क़ाशीपर हैं । जांच टिप की बढ़ादी SEM छवियों में दिखाया गया है(बी)में 1,056x आवर्धन (स्केल बार = 40 μm),(C)पर 3,500x आवर्धन (स्केल बार = 10 μm), और(डी)पर 10,000x आवर्धन, स्केल बार = 4 μm । इस आंकड़े को संदर्भ39से संशोधित किया गया है . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: न्यूरॉन घनत्व पर Etched नैनो वास्तुकला के प्रभाव। न्यूरोनल अस्तित्व प्रत्यारोपण साइट से दूर ५० μm डिब्बे की दूरी में एक ही जानवरों से पृष्ठभूमि क्षेत्र के एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया है । (क)प्रत्यारोपण के बाद 2 सप्ताह में चिकनी सतहों (नियंत्रण) और नैनोपैटर्न प्रत्यारोपण के बीच न्यूरोनल अस्तित्व का कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया । (ख)प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह में चिकनी सतहों (पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०५) की तुलना में 100-150 माइक्रोन दूरी पर नैनोपैटर्न प्रत्यारोपण के आसपास काफी अधिक न्यूरोनल अस्तित्व था । प्रत्यारोपण साइट का चित्रण करने वाली पीली रूपरेखा के साथ न्यूरॉन्स (दाग दार हरे रंग) की प्रतिनिधि छवियां, और माइक्रोइलेक्ट्रोड, स्केल बार = 100 माइक्रोन के नक़्क़ाशीदार पक्ष को दर्शाती "पी"। इस आंकड़े को39से संशोधित किया गया है . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: न्यूरोभड़काऊ आणविक मार्कर पर Etched नैनो वास्तुकला के प्रभाव । ऊतक दोनों नैनोनमूनों और नियंत्रण प्रत्यारोपण के लिए प्रत्यारोपण साइट के लगभग ५०० μm त्रिज्या एकत्र किया गया था । भड़काऊ मार्कर की सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की तुलना दोनों प्रत्यारोपण प्रकारों के बीच मात्रात्मक रूप से की गई थी (अंतर को ग्राफ पर # द्वारा दर्शाया जाता है; पी एंड एलटी; 0.05) के साथ-साथ समय के साथ (अंतर ग्राफ पर * द्वारा दर्शाया जाता है; पी एंड एलटी; 0.05)। (A)CD14 की सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति काफी दो से चार सप्ताह (*) से नैनोनमूनप्रत्यारोपण के आसपास कमी आई । (ख)चार सप्ताह (#) पर नियंत्रण की तुलना में नैनोपैटर्न प्रत्यारोपण के आसपास NOS2 की काफी कम सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति थी और चिकनी नियंत्रण प्रत्यारोपण (*) के आसपास दो से चार सप्ताह तक NOS2 की एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी । इस आंकड़े को संदर्भ39से संशोधित किया गया है . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कार्यात्मक एकल टांग माइक्रोइलेक्ट्रोड की सतहों पर एफआईबी नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर। शीर्ष दाएं कोने पर इनसेट इलेक्ट्रोड टांग (पतली काली रेखा) के आकार को चित्रित करने के लिए एक पैसा के बगल में इस अध्ययन में उपयोग किए गए माइक्रोइलेक्ट्रोड को प्रदर्शित करता है। टांग के पीछे एफआईबी नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर के साथ माइक्रोइलेक्ट्रोड टांग की एसईएम छवियां। पूरे टांग को 600x आवर्धन (स्केल बार = 50 माइक्रोन) में शीर्ष पर दिखाया गया है, जबकि इनसेट में नैनोपैटर्न की सतह को 25,000x आवर्धन, स्केल बार = 1 माइक्रोन पर दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड में नक़्क़ाशीड नैनो-आर्किटेक्चर का प्रभाव। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मैट्रिक्स के मूल्यांकन ने एकल इकाइयों की रिकॉर्डिंगकरनेवाले चैनलों के एक आशाजनक प्रारंभिक वृद्धि की प्रवृत्ति की खोज की,(बी)दर्ज इकाइयों के अधिकतम आयाम, और(सी)चिकनी नियंत्रण इलेक्ट्रोड की तुलना में नैनो-आर्किटेक्चर के साथ नक़्क़ाशीदार माइक्रोइलेक्ट्रोड से सिग्नल-टू-शोर अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एफआईबी Etched नैनो आर्किटेक्चर के साथ प्रत्यारोपित कार्यात्मक एकल टांग माइक्रोइलेक्ट्रोड से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग। निर्मित माइक्रोइलेक्ट्रोड उपकरणों पर नैनो-आर्किटेक्चर को नक़्क़ाशी करने के लिए एफआईबी का उपयोग करने की चुनौतियों में से एक शॉर्ट-सर्किटिंग रिकॉर्डिंग संपर्कों का खतरा है। एक्स-एक्सिस सेकंड में रिकॉर्डिंग समय को दर्शाया गया है, और वाई-एक्सिस न्यूरोनल एक्शन क्षमता रिकॉर्डकरने वाले इलेक्ट्रोड चैनलों को दिखाता है। वाई-एक्सिस पर प्रत्येक गिने वाली लाइन एक अलग इलेक्ट्रोड चैनल का प्रतिनिधित्व करती है, जिसमें चैनल संख्या 1 उथला और 16 सबसे गहरा है। लाल बक्से शॉर्ट-सर्किट चैनलों की रूपरेखा तैयार करते हैं, जबकि नीले बक्से दृश्यमान न्यूरोनल गतिविधि के साथ चैनलों की रूपरेखा तैयार करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

यहां उल्लिखित फैब्रिकेशन प्रोटोकॉल गैर-कार्यात्मक और कार्यात्मक एकल टांग सिलिकॉन माइक्रोइलेक्ट्रोड की सतह में नैनो-आर्किटेक्चर को प्रभावी ढंग से और पुन: उत्पन्न करने के लिए केंद्रित आयन बीम लिथोग्राफी का उपयोग करता है। केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) लिथोग्राफी एक पतले केंद्रित आयन बीम50,51का उपयोग करके सब्सट्रेट सतह के चयनात्मक एब्लेशन के लिए अनुमति देता है। एफआईबी एक प्रत्यक्ष-लेखन तकनीक है जो नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन और उच्च पहलू अनुपात50,52,53के साथ विभिन्न विशेषताओं का उत्पादन कर सकती है। विभिन्न आकार की विशेषताओं को बनाने के लिए, आयन बीम वर्तमान की भयावहता को आयन बीम स्पॉट आकार को 3 एनएम से 2 माइक्रोन50,51की सीमा के भीतर बदलने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सतहों पर सुविधाओं को नक़्क़ाशी के लिए एफआईबी का उपयोग करने के कुछ सामान्य फायदे हैं: 1) इसका उपयोग सिलिकॉन, धातुओं और पॉलिमर53,54,55,56,2) एफआईबी सहित विभिन्न प्रकार की सामग्रियों पर किया जा सकता है, जो गैर-प्लानर सतहों पर किया जा सकता है, और 3) एफआईबी का उपयोग व्यक्तिगत उपकरणों57पर पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए किया जा सकता है।

यहां, एफआईबी का उपयोग एसईएम माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर के संयोजन में किया गया था जो गैर-कार्यात्मक एकल टांग जांच में विशिष्ट सुविधाओं को नक़्क़ाशी के लिए एक विशेष स्वचालित स्क्रिप्ट लिखने के लिए उपयोग किया जाता था। स्क्रिप्ट में आवश्यक पैरामीटर (2.5 ए. ए. आयन बीम वर्तमान और 30 केवी वोल्टेज) शामिल थे ताकि सटीक रिक्ति वांछित (200 एनएम चौड़े समानांतर खांचे, दूरी 300 एनएम के अलावा और 20 एनएम गहरी) को ईच किया जा सके। इलेक्ट्रोड के आयाम एफआईबी के लिए देखने के क्षेत्र से अधिक हो गए, इसलिए पैटर्निंग कई चरण पदों में किया गया था। इस प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए, प्रत्ययी चिह्नों को सिलिकॉन शीट के किनारे में जांच करने की अनुमति दी गई थी, ताकि सॉफ्टवेयर को जांच टांग पर नमूनों वाली लाइनों का ठीक से पता लगाने की अनुमति दी जा सके । प्रत्ययी आवश्यक थी क्योंकि चरण गति ने आयन बीम क्षेत्र के संबंध में पैटर्न क्षेत्र के स्थान में एक बड़ी (~ 5 μm) अनिश्चितता पैदा की। सिलिकॉन शीट पर प्रत्ययी की नियुक्ति एफआईबी के लिए अनुमति दी जांच टांग, जो संभवतः दूषित या जांच टांग नुकसान सकता है पर बीम स्कैनिंग के बिना पैटर्न क्षेत्रों का पता लगाने के लिए । एक टांग के लिए पूरी स्वचालित नक़्क़ाशी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए लगभग 12 घंटे लग गए और पैटर्निंग शुरू होने के बाद कोई ऑपरेटर हस्तक्षेप की आवश्यकता नहीं थी। सामूहिक रूप से, सिलिकॉन जांच टांग में सुविधाओं को नक़्क़ाशी करने के लिए एफआईबी का उपयोग करने के लाभ नैनोमीटर आकार की विशेषताएं बनाने, नक़्क़ाशी प्रक्रिया को स्वचालित करने और एक मनगढ़ंत जांच पर नक़्क़ाशी करने की क्षमता थे। हालांकि एफआईबी के प्रचुर लाभ हैं, इस निर्माण विधि का उपयोग करने की कमियों में से एक धीमी थ्रूपुट दर है जो अंततः नैनो-आर्किटेक्चर के साथ उपकरणों के बड़े पैमाने पर उत्पादन की क्षमता को उनकी सतह58में सीमित करती है। वैकल्पिक रूप से, ब्याज की सुविधा आकार और ज्यामिति बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य निर्माण विधियों में शायद तेज दरों पर और बड़े पैमाने पर प्रस्तुतियों में, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी और नैनोइम्प्रिंट लिथोग्राफी59,60,61,62,63,64,65शामिल हैं। हालांकि, ये विधियां निर्मित उपकरणों में नैनो-आर्किटेक्चर सुविधाओं को नक़्क़ाशी करने की अनुमति नहीं देती हैं। परंपरागत रूप से इन तरीकों का उपयोग सिलिकॉन या बहुलक की शीट पर निर्माण प्रक्रिया के दौरान किया जाता है, जिसका उपयोग अंतिम धोखा देने के लिए डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण चरणों में किया जा सकता है।

कार्यात्मक इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड टांग के आसपास किसी भी आसपास की सामग्री नहीं होने के कारण एक स्वचालित प्रक्रिया से गुजरना करने में असमर्थ थे जिसमें प्रत्ययी निशान को चलाने में शामिल किया गया था । इसलिए, कार्यात्मक इलेक्ट्रोड मैन्युअल रूप से गठबंधन किया गया था और टांग के साथ 500 माइक्रोन वर्गों पर नक़्क़ाशी, एक ही सुविधा आकार सुनिश्चित करने के लिए स्वचालित रन के रूप में एक ही आयन वर्तमान और वोल्टेज का उपयोग कर। बीम को प्रत्येक 500 माइक्रोन अंतराल को पूरा करने के बाद मैन्युअल रूप से फिर से संरेखित किया जाना था और अगले खंड को नक़्क़ाशी करने के लिए स्थापित किया जाना था। हर 500 माइक्रोन पैटर्न के मैनुअल पुनर्संरेखण की प्रक्रिया संभावित रूप से क्षतिग्रस्त नैनोस्ट्रक्चर या संरचनाओं का कारण बन सकती है जो इच्छित ज्यामिति से मेल नहीं खाती हैं। यह आयन बीम को मैनुअल अलाइनमेंट66के लिए लंबे समय तक एक्सपोजर बार की आवश्यकता के कारण है। यह मैनुअल नक़्क़ाशी के साथ सामना करना पड़ा कठिनाइयों में से एक था । इस जटिलता के कारण, दो रिकॉर्डिंग संपर्क शॉर्ट-सर्किट थे और न्यूरोनल एक्शन क्षमता(चित्रा 6)रिकॉर्ड करने में असमर्थ थे। चित्रा 6 नैनो-आर्किटेक्चर इलेक्ट्रोड के साथ प्रत्यारोपित जानवर से एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लाइव रिकॉर्डिंग सेगमेंट को दर्शाता है। नीले बक्से दो मृत चैनलों को निरूपित लाल बक्से की तुलना में मजबूत कार्रवाई क्षमता रिकॉर्डिंग चैनलों की रूपरेखा । इसलिए, मैनुअल एफआईबी के बाद निर्मित इलेक्ट्रोड पर नक़्क़ाशी का उपयोग करने की चुनौतियों में से एक यह है कि एक मौका है कि बीम शॉर्ट-सर्किट संपर्क कर सकता है और उन्हें रिकॉर्डिंग से रोक सकता है। यह चुनौती एकल टांग सिलिकॉन इलेक्ट्रोड के सामने की ओर नक़्क़ाशी करने का प्रयास करते समय बढ़ाई जाती है, जिसमें रिकॉर्डिंग संपर्क और निशान इलेक्ट्रोड के पूरे टांग के साथ होते हैं। हालांकि रिकॉर्डिंग संपर्कों और निशान के आसपास सिलिकॉन को नक़्क़ाशी करना संभव है, लेकिन इलेक्ट्रोड की रिकॉर्डिंग क्षमताओं के नुकसान और कम प्रदर्शन से बचने के लिए अतिरिक्त सावधानी की सलाह दी जाती है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एफआईबी का उपयोग सतह में कई सुविधा ज्यामिति को नक़्क़ाशी करने के लिए विभिन्न सामग्रियों पर किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ज्यामिति, जैसे विभिन्न सामग्रियों में लाइनों के लिए मापदंडों की भविष्यवाणी करने के लिए जटिल हैं। विशेष रूप से लाइन पैटर्न के लिए, लाइन चौड़ाई और गहराई तेजी वोल्टेज, बीम वर्तमान, निवास समय, पिक्सेल स्पेसिंग, एपर्चर और सामग्री प्रकार के जीवनकाल जैसे कई मापदंडों पर दृढ़ता से निर्भर हैं। अनुकूलन से परिणाम देने वाला एक और पैरामीटर प्रत्येक लाइन को मिल करने का कुल समय है। संकरा और गहरी लाइनों छोटे बीम धाराओं का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, एक पूरी जांच टांग के लिए पैटर्न समय कई दिनों के लिए विस्तार होगा, जो व्यावहारिक नहीं है । इस प्रकार, हालांकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना संभव है, अज्ञात सामग्रियों के लिए मापदंडों का वर्णन करना बेहद मुश्किल होगा। इस प्रोटोकॉल में वर्णित सिलिकॉन जांच के लिए मापदंडों की समस्या निवारण में, सिलिकॉन में कई परीक्षण कटौती का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था कि बदलती स्थितियों ने लाइन चौड़ाई और गहराई को कैसे प्रभावित किया। जैसे ही मूल्यांकन की गई स्थितियां विशिष्ट फीचर आकार और ब्याज की ज्यामिति (200 एनएम चौड़ी लाइनें जो 200 एनएम गहरी थीं) को नक़्क़ाशी करने में सक्षम थीं, उन मापदंडों का उपयोग सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट लिखने के लिए किया गया था। स्क्रिप्ट का उपयोग प्रत्येक पंक्ति की रिक्ति को नियंत्रित करने के लिए किया गया था, केंद्र से केंद्र तक, जो इस प्रोटोकॉल में 300 एनएम है। सैकड़ों नैनोमीटर में सुविधा आकार की आवश्यकता वाले सिलिकॉन सब्सट्रेट्स/उपकरणों का उपयोग करने वाले भविष्य के अध्ययन, वांछित सुविधा आकार बनाने के लिए आवश्यक स्थितियों को परेशान करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित मापदंडों का उपयोग कर सकते हैं । धातु और बहुलक सब्सट्रेट्स/उपकरणों के लिए नक़्क़ाशी की स्थिति का और अनुकूलन और समस्या निवारण आवश्यक होगा । कुल मिलाकर, भौतिक सतहों में नैनो-आर्किटेक्चर को नक़्क़ाशी के लिए एफआईबी का उपयोग करने से सुविधा ज्यामिति, कई संगत सामग्रियों के उपयोग और निर्मित उपकरणों सहित कई सतह प्रकारों में पर्याप्त नियंत्रण और लचीलेपन की अनुमति मिल जाती है। यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों ने इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड की सतह में नैनो-आर्किटेक्चर को नक़्क़ाशी करने के लिए एफआईबी का उपयोग करने के हमारे अध्ययनों में देखे गए संभावित लाभों का प्रदर्शन किया: 1) न्यूरोनल घनत्व में वृद्धि और 2) नैनो-आर्किटेक्चर के साथ प्रत्यारोपित उपकरणों के आसपास न्यूरोभड़काऊ मार्कर की कमी, साथ ही 3) प्रारंभिक निष्कर्षसमय के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की बेहतर गुणवत्ता का चित्रण करते हैं। इसी तरह, एक सामग्री की सतह में वर्णित प्रोटोकॉल नक़्क़ाशी नैनो वास्तुकला सुविधाओं के रोजगार और अनुकूलन का उपयोग कई चिकित्सा उपकरणों की कार्यक्षमता में सुधार करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) के दिग्गजों मामलों के पुनर्वास अनुसंधान और विकास सेवा पुरस्कार: #RX001664-01A1 (सीडीए-1, Ereifej) और #RX002628-01A1 (सीडीए-2, Ereifej) द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री अमेरिका के दिग्गजों मामलों या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के विभाग के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते । लेखकों को कर्मचारियों की सहायता और इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग के लिए FEI कंपनी (अब थर्मोफिशर वैज्ञानिक का हिस्सा) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, जो इस शोध में इस्तेमाल की गई लिपियों को विकसित करने में सहायता प्राप्त है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-Channel ZIF-Clip Headstage Tucker Davis Technologies ZC16 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrapped Thomas Scientific 1213F04 Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder Tucker Davis Technologies Z-ROD32 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml Ted Pella 16023 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter Hemostat Fine Science Tools 13013-14 Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double Coated Ted Pella 16084-7 The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well Sigma Aldrich CLS3736-100EA Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11251-30 Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs Fisher Scientific 22-032-600 Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm Ted Pella 16148 Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll Fisher Scientific 01-213-101 Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes Fisher Scientific 02-617-149 Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrode NeuroNexus A1x16-3mm-100-177 http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holder KOPF Model 1772 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument KOPF Model 900-U Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly KOPF Model 960 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') Ted Pella 807-5 https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V Ted Pella 520-1-220 Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver Paint Ted Pella 16062 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab Thermo Fisher Scientific Helios G2 650 This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

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Mahajan, S., Sharkins, J. A.,… More

Mahajan, S., Sharkins, J. A., Hunter, A. H., Avishai, A., Ereifej, E. S. Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes. J. Vis. Exp. (155), e60004, doi:10.3791/60004 (2020).

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