Summary
Abbiamo dimostrato che l'incisione della nano-architettura nei dispositivi intracorticali di microelettrodi può ridurre la risposta infiammatoria e ha il potenziale per migliorare le registrazioni elettrofisiologiche. I metodi descritti qui delineano un approccio per incidere le nano-architetture nella superficie di microelettrodi intracorticali in silicio a stilo non funzionali e funzionali.
Abstract
Con i progressi nell'elettronica e nella tecnologia di fabbricazione, i microelettrodi intracorticali hanno subito miglioramenti sostanziali che hanno permesso la produzione di microelettrodi sofisticati con maggiore risoluzione e capacità ampliate. I progressi nella tecnologia di fabbricazione hanno sostenuto lo sviluppo di elettrodi biomimetici, che mirano a integrarsi senza soluzione di continuità nel parenchyma cerebrale, ridurre la risposta neuroinfiammatoria osservata dopo l'inserimento degli elettrodi e migliorare la qualità e longevità delle registrazioni elettrofisiologiche. Qui descriviamo un protocollo per impiegare un approccio biomimetico recentemente classificato come nano-architettura. L'uso della litografia del fascio ionico focalizzato (FIB) è stato utilizzato in questo protocollo per incidere specifiche caratteristiche nano-architettoniche nella superficie di microelettrodi intracorticali a singolo gambo non funzionali e funzionali. L'incisione di nano-architetture nella superficie dell'elettrodo ha indicato possibili miglioramenti della biocompatibilità e della funzionalità del dispositivo impiantato. Uno dei vantaggi dell'utilizzo di FIB è la possibilità di incidere su dispositivi fabbricati, al contrario durante la fabbricazione del dispositivo, facilitando possibilità illimitate di modificare numerosi dispositivi medici dopo la produzione. Il protocollo qui presentato può essere ottimizzato per vari tipi di materiali, funzionalità di nano-architettura e tipi di dispositivi. L'aumento della superficie dei dispositivi medici impiantati può migliorare le prestazioni del dispositivo e l'integrazione nel tessuto.
Introduction
I microelettrodi intracorticali (IME) sono elettrodi invasivi che forniscono un mezzo di interfacciamento diretto tra dispositivi esterni e le popolazioni neuronali all'interno della corteccia cerebrale1,2. Questa tecnologia è uno strumento inestimabile per registrare i potenziali di azione neurale per migliorare la capacità degli scienziati di esplorare la funzione neuronale, far progredire la comprensione delle malattie neurologiche e sviluppare potenziali terapie. Il microelettrodo intracorticale, utilizzato come parte dei sistemi HMI (Brain Machine Interface), consente la registrazione dei potenziali d'azione da un singolo o piccolo gruppo di neuroni per rilevare le intenzioni motorie che possono essere utilizzate per produrre uscite funzionali3. Infatti, i sistemi BMI sono stati utilizzati con successo per scopi protesici e terapeutici, come il controllo del ritmo sensomotorio acquisito per azionare un cursore computerin pazienti con sclerosi laterale amiotrofica (SLA)4 e lesioni del midollo spinale5 e ripristinare il movimento in persone che soffrono di tetraplegia cronica6.
Purtroppo, gli IME spesso non riescono a registrare costantemente nel tempo a causa di diverse modalità di guasto che includono fattori meccanici, biologici e materiali7,8. La risposta neuroinfiammatoria che si verifica dopo l'impianto dell'elettrodo è pensata per essere una sfida considerevole contribuendo al fallimento degli elettrodi9,10,11,12,13,14. La risposta neuroinfiammatoria viene avviata durante l'inserimento iniziale dell'IME che recisso la barriera ematoencefalica, danneggia il parenchyma cerebrale locale e interrompe le reti gliali e neuronali15,16. Questa risposta acuta è caratterizzata dall'attivazione di cellule gliali (microglia/macrofati e astrociti), che rilasciano molecole pro-infiammatorie e neurotossiche intorno al sito dell'impianto17,18,19,20. L'attivazione cronica delle cellule gliali si traduce in una reazione del corpo estraneo caratterizzata dalla formazione di una cicatrice gliale isolando l'elettrodo dal tessuto cerebrale sano7,9,12,13,17,21,22. In definitiva, ostacolando la capacità dell'elettrodo di registrare i potenziali di azione neuronale, a causa della barriera fisica tra l'elettrodo e i neuroni e la degenerazione e la morte dei neuroni23,24,25.
Il fallimento precoce dei microelettrodi intracorticali ha portato a notevoli ricerche nello sviluppo di elettrodi di nuova generazione, con particolare attenzione alle strategie biomimetiche26,27,28,29,30. Di particolare interesse per il protocollo qui descritto, è l'uso della nano-architettura come classe di alterazioni di superficie biomimetiche per gli IME31. È stato stabilito che le superfici che imitano l'architettura dell'ambiente naturale in vivo hanno una risposta biocompatibile migliorata32,33,34,35,36. Pertanto, l'ipotesi che implichi questo protocollo è che la discontinuità tra l'architettura ruvida del tessuto cerebrale e l'architettura liscia dei microelettrodi intracorticali può contribuire alla risposta neuroinfiammatoria e cronica del corpo estraneo agli IME impiantati (per una revisione completa si riferisce a Kim et al.31). Abbiamo dimostrato in precedenza che l'utilizzo di caratteristiche nano-architettura simili all'architettura a matrice extracellulare del cervello riduce i marcatori infiammatori degli astrociti dalle cellule coltivate su substrati nano-architetturati, rispetto alle superfici di controllo piatte nei modelli in vitro ed ex vivo della neuroinfiammazione37,38. Inoltre, abbiamo dimostrato l'applicazione della litografia del fascio ionico focalizzato (FIB) per incidere le nano-architetture direttamente sulle sonde in silicio ha portato a una vitalità neuronale significativamente aumentata e a una minore espressione di geni pro-infiammatori da animali impiantati con le sonde nano-architettura rispetto al gruppo di controllo liscio26. Pertanto, lo scopo del protocollo qui presentato è quello di descrivere l'uso della litografia FIB per eguagliare nano-architetture su dispositivi a microelettrodi intracorticali fabbricati. Questo protocollo è stato progettato per incidere caratteristiche di nano-architettura in superfici di silicio di fazzoletti intracorticali di microelettrodi utilizzando sia processi automatizzati che manuali. Questi metodi sono semplici, riproducibili e possono certamente essere ottimizzati per vari materiali del dispositivo e dimensioni di lavorazione desiderate.
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Protocol
NOTA: Effettuare le seguenti operazioni indossando l'attrezzatura protettiva personale appropriata, ad esempio un camice da laboratorio e guanti.
1. Sonda di silicone non funzionale per litografia del fascio ionico focalizzato (FIB)
NOTA: Per la procedura completa che descrive la fabbricazione del wafer SOI con le 1.000 sonde, si prega di fare riferimento a Ereifej et al.39.
- Isolare una striscia di 2-3 sonde di silicio dal wafer in silicio sull'isolante (SOI) contenente 1.000 sonde. Non fare strisce contenenti più di tre sonde in silicio. Ciò può aumentare le probabilità di montaggio allentato e può causare un disallineamento con conseguente incisivo del FIB in modo non corretto.
NOTA: Strisce / sonde non saldamente seduti sul mozzicone di alluminio possono causare due complicazioni: 1) quando la fase si muove per lavorare sulla sezione successiva, ci saranno vibrazioni e la fresatura non sarà accurata fino a quando la sonda si deposita e 2) può causare una variazione elevata ed essere fuori dal piano di messa a fuoco.- Mentre si indossano i guanti, utilizzare pinze sottili per mettere pressione intorno alle sonde per rompere una piccola sezione contenente due o tre sonde.
- Pulire con cura la sonda di silicio di tutta la polvere e i detriti prima dell'incisione FIB. Preparare una piastra di polistirolo 6 pozzetto con la pipimernatura 3 mL/pozzetto del 95% di etanolo in tre pozzetti.
- Raccogliere con attenzione la striscia tagliata delle sonde di silicio utilizzando punte sottili o pinze sottovuoto e posizionarla nel colino cellulare. Posizionare una sola striscia di sonde di silicio per colino per evitare di rompere le sonde. Posizionare il colino contenente la striscia di schesche di silicio nel primo pozzo contenente il 95% di etanolo per la pulizia. Tenere il colino nel primo pozzo per 5 min.
- Spostare il colino contenente le sonde di silicio dal primo pozzo e posizionarlo nel secondo pozzo contenente il 95% di etanolo per altri 5 min. Ripetere ancora una volta nel terzo pozzo.
- Posizionare il colino contenente le sonde in silicio pulito su una piastra di politetrafluoroetilene per asciugare all'aria. Eseguire questa fase in un cappuccio sterile per evitare la contaminazione da polvere.
- Collocare la striscia di sonde di silicio essiccata all'aria in un contenitore sigillato per il trasporto al SEM-FIB. Avvolgere il colino contenente i campioni essiccati all'aria con un involucro di plastica o alluminio per il trasporto e/o lo stoccaggio per mantenere la pulizia.
- Utilizzare pinze sottili ribaltate o sottovuoto per raccogliere con cura la striscia pulita di sonde di silicio e metterle su uno stub di alluminio pulito (utilizzato per l'imaging/incisione SEM-FIB) per prepararlo al montaggio.
- Utilizzare uno stuzzicadenti (o un altro strumento con punta fine come un sottile filo elettrico), per posizionare una piccola goccia (10 dollari) di vernice d'argento sul bordo del substrato di silicio che circonda le sonde. Fissare la striscia verso il basso diffondendo la vernice d'argento intorno ai lati del substrato di silicio che circonda la sonda. Lasciare asciugare completamente la vernice d'argento prima di posizionare lo stub di alluminio nel SEM-FIB.
NOTA: Fare attenzione a non ottenere vernice d'argento sul gambo dell'elettrodo perché questa è la parte che verrà incisa. Se la striscia di sonde non è saldamente ancorata allo stub di alluminio, la striscia può muoversi durante la lavorazione o avere un piano focale diverso, risultando così in una fresatura errata da parte del FIB. Diverse strisce di sonde di silicio possono essere montate sullo stesso mozzicone di alluminio, assicurandosi che ci sia ampio spazio tra le strisce per consentire la rimozione dallo stub dopo l'incisione. Ciò consentirà un'incisione più efficiente di più sonde utilizzando la funzione automatizzata descritta di seguito.
2. Allineamento del FIB alle sonde di silicio
- Fare clic sul pulsante di sfiato nella scheda di controllo del fascio per sfiatare la camera. Premete Maiusc e F3 per eseguire la fase iniziale. Confermare la selezione selezionando il pulsante Home Stage nella finestra popup.
NOTA: l'esecuzione del funzionamento dello stadio iniziale è una fase preventiva per garantire che l'asse dello stage venga letto correttamente dal software e che il microscopio sia in buone condizioni. - Una volta completato lo stadio iniziale, spostare lo stage in modo che si disperda su X , 70 mm, Y, 70 mm, 0 mm, T, R e 0. Una volta che la camera è ventilata, mettere su guanti nitrile puliti e aprire la porta della camera.
NOTA: a seconda dell'applicazione dell'utente precedente, potrebbe essere necessario modificare l'adattatore dello stage. Gli adattatori standard (ad esempio, lo stile FEI) possono essere rimossi svitando il bullone centrale in senso antiorario e installati avvitando in senso orario nella piastra di rotazione del palco. - Inserire lo stub di alluminio tenendo le sonde nella parte superiore dell'adattatore da palco. Fissare lo stub di alluminio stringendo la vite impostata sul lato dell'adattatore da palco. Utilizzare la chiave inglese esadecimale da 1,5 mm per questa attività.
- Regolare l'altezza dell'adattatore da stage ruotando l'adattatore in senso orario per abbassarlo o in senso antiorario per sollevarlo. Fissare l'adattatore da palco sulla piastra di rotazione ruotando il dado cono di bloccaggio in senso orario fino a quando il dado non è sicuro contro la piastra di rotazione dello stadio. Tenere l'adattatore con l'altra mano per evitare la rotazione dell'adattatore e i campioni mentre si stringe il dado cono di bloccaggio.
NOTA: utilizzare il misuratore di altezza fornito per determinare l'altezza appropriata. La parte superiore dello stub di alluminio dovrebbe essere la stessa altezza della linea massima mostrata sul misuratore di altezza. Se si stringe il dado del cono può causare danni allo stadio e all'adattatore. Utilizzare solo una forza sufficiente per fissare i campioni. - Acquisire un'immagine della fotocamera di navigazione. Ruotare con attenzione il braccio della telecamera di navigazione fino a quando non si ferma. Lo stadio del microscopio si sposterà automaticamente in una posizione sotto la fotocamera. Guarda l'immagine dal vivo mostrata nel Quadrante 3 dell'interfaccia utente del microscopio .
- Una volta che il livello di luminosità si adatta automaticamente a un livello appropriato, acquisisci l'immagine premendo il pulsante verso il basso sulla staffa della fotocamera. Assicurarsi di attendere il completamento dell'acquisizione dell'intera immagine, indicato da un simbolo di pausa che appare nel Quadrante 3 e l'illuminazione della fotocamera disattivata. Questo richiede circa 10 s. Ruotare il braccio della fotocamera nella posizione chiusa. Lo stage tornerà alla posizione originale.
- Chiudere con attenzione la porta della camera del microscopio. Guarda l'immagine della telecamera CCD in Quadrant 4 mentre chiudi la porta. Assicurarsi che i campioni e lo stadio siano distanti per una distanza di sicurezza da qualsiasi componente critico nella camera del microscopio.
- Selezionare la freccia verso il basso accanto al pulsante Pompa nella scheda controllo trave. Selezionare Pompa con il pulsante Pulizia campione nel software dell'interfaccia utente per avviare la pompa a vuoto della camera e costruito in detergente al plasma. Assicurarsi che la porta sia sigillata spingendo delicatamente sulla faccia della porta mentre la pompa è in funzione. Attendere circa 8 min per il tempo di pompaggio e il ciclo di pulizia del plasma per completare la camera al microscopio.
NOTA: Un sigillo sottovuoto può essere confermato tirando delicatamente sulla porta della camera, che dovrebbe rimanere chiusa se il sistema è sottovuoto. - Una volta che l'icona nell'angolo in basso a destra dell'interfaccia utente diventa verde, premi il pulsante Wake-Up nella scheda di controllo del fascio che attiva i fasci di elettroni e ioni. Selezionare il quadrante 1 e impostare il segnale del fascio su fascio di elettroni (se non già impostato), impostare il quadrante 2 sul fascio ionico (se non già impostato).
- Impostare la tensione SEM su 5 kV, impostare la corrente del fascio SEM su 0,20 nA, impostare il rilevatore SEM su ETD, impostare la modalità del rilevatore su Elettrone secondario. Impostare la tensione FIB su 30 kV, impostare la corrente del fascio FIB su 24 pA, impostare il rilevatore FIB su rilevatore ICE, impostare la modalità del rilevatore sull'elettrone secondario.
- Fare doppio clic sulla sonda di silicio nell'immagine della telecamera di navigazione, quadrante 3 per spostare lo stage nella posizione approssimativa della sonda. Fare clic sul quadrante 1 per selezionarlo come quadrante attivo e premere il pulsante di pausa per avviare la scansione SEM. Impostare il tempo di analisi su 300 ns e disattivare l'interlacciamentodella scansione, l'integrazionedella linea e la media del frame. Impostare la rotazione della scansione su 0 nella scheda di controllo del fascio e fare clic con il pulsante destro del mouse sul regolatore di spostamento del fascio 2d e selezionare zero.
- Regolare l'ingrandimento sul valore minimo ruotando la manopola di ingrandimento in senso antiorario sul pannello MUI. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine utilizzando le manopole del pannello MUI o l'icona della barra degli strumenti Luminosità contrasto automatico.
- Spostare lo stage facendo doppio clic con il pulsante sinistro del mouse su una funzione per centrarla o premendo la rotellina del mouse e attivando la modalità mouse joystick. Spostare la sonda di silicio desiderata per essere modellata al centro dell'immagine SEM.
- Individuare un bordo o altre caratteristiche, ad esempio una particella di polvere o un graffio. Aumentare l'ingrandimento a 2.000x ruotando la manopola di ingrandimento in senso orario. Regolare la messa a fuoco del SEM ruotando le manopole di messa a fuoco grossolana e fine sul MUI fino a quando l'immagine è a fuoco. Una volta che l'immagine è a fuoco, selezionare il pulsante Collega campione - alla distanza di lavoro nella barra degli strumenti.
- Verificare che l'operazione sia stata completata esaminando la coordinata dell'asse z nella scheda di navigazione. Il valore deve essere di circa 11 mm. Digitare 4,0 mm nella posizione dell'asse z e premere il pulsante Vai a con il mouse o premere il tasto Invio sulla tastiera e lo stage si sposterà alla distanza di lavoro di 4 mm.
- Spostare la fase in X e Y per individuare la spalla della sonda di silicio. Posizionarlo il più vicino possibile al centro del SEM. Modificare l'inclinazione dello stage a 52 gradi digitando "52" nella coordinata T e premendo Invio. Osservare se la spalla della sonda sembra muoversi verso l'alto o verso il basso nell'immagine. Utilizzare il dispositivo di scorrimento Stage per riportare la spalla della sonda al centro dell'immagine SEM. Regola solo la posizione z, non spostare gli assi X, Y, T o R.
- Eseguire il comando incorporato "xT Align Feature" situato nel menu a discesa della fase. Utilizzare il mouse per fare clic su due punti paralleli al bordo della sonda. Assicurarsi che il pulsante di opzione orizzontale sia selezionato nella finestra popup e fare clic su Fine. Lo stage ruoterà per allineare la sonda con l'asse X dello stage. Regolare lo stage in X,Y utilizzando il mouse per mettere di nuovo la spalla inferiore della sonda al centro dell'immagine SEM.
NOTA: il primo punto dovrebbe essere verso l'aderenza della sonda e il secondo punto verso il punto della sonda. - Selezionare la FIB nel quadrante 2 e assicurarsi che la corrente del fascio sia ancora 24 pA. Impostare l'ingrandimento su 5.000x e il tempo di permane o 100 ns. Digitare Ctrl-F sulla tastiera per impostare lo stato attivo FIB su 13,0 mm. Nella scheda di controllo del fascio, fare clic con il pulsante destro del mouse sul regolatore stigmatizzatore 2d e selezionare zero e, inoltre, fare clic con il pulsante destro del mouse sul regolatore Beam Shift 2d e selezionare zero. Impostare la rotazione della scansione su 0 e premere il pulsante luminosità contrasto automatico nella barra degli strumenti.
- Cercare un'immagine della spalla della sonda nel quadrante 2. Utilizzare lo strumento snapshot per acquisire un'immagine con la FIB. Verificare che la spalla della sonda si trova al centro dell'immagine FIB, in caso contrario, fare doppio clic sulla spalla della sonda per spostarla al centro. Spostare lo stage verso sinistra premendo il tasto freccia sinistra sulla tastiera circa 10-15 volte. Scattare un'altra istantanea e osservare se il lato sonda è ancora al centro della FIB.
NOTA: in caso contrario, la rotazione dello stage deve essere regolata leggermente. Se la sonda si trova sopra il centro dell'immagine, lo stage deve essere ruotato nella direzione negativa. Se la sonda è al di sotto del centro, lo stage deve essere ruotato in senso orario. Immettere una rotazione compucentrica relativa compresa tra 0,01 e 0,2 gradi a seconda del modo in cui è necessario allineare la sonda. - Ripetere i passaggi da 2,16 a 2,17 tutte le volte necessarie fino a quando il bordo della spalla della sonda non è perfettamente allineato con l'asse X dello stage (il bordo rimane al centro della FIB mentre si sposta a sinistra).
- Utilizzando la FIB, spostare lo stage di nuovo sulla spalla inferiore della sonda. Salvare la posizione dello stage nell'elenco delle posizioni facendo clic sul pulsante Aggiungi. Modificare la corrente del fascio FIB a 2,5 nA e assicurarsi che l'ingrandimento della FIB sia ancora 5000x. Eseguire la funzione di contrasto della luminosità automatica e impostare il tempo di dimora FIB a 100 ns.
- Premere il pulsante di pausa per avviare la scansione. Regolare la messa a fuoco FIB e l'astigmatismo, nel modo più rapido e preciso possibile, utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolana e fine e le manopole dello stigmatore X e Y sul pannello MUI. Premere il pulsante di pausa per interrompere la scansione FIB.
3. Scrittura di un processo automatizzato per l'incisione
- Avviare il software individuandolo nel menu di avvio di Windows (ad esempio, Start , Programmi , FEI Company , Applicazioni , Nanobuilder ). Posizionare la finestra del software sul monitor laterale in modo che l'interfaccia utente non sia coperta. Aprire il file per la modellazione delle sonde di silicio facendo clic sul file e quindi aprire. Indirizzare il browser di Windows al percorso dello script software (Supplementary File 1 - il nome del file è "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
- All'interno del software, selezionare il menu a discesa del microscopio e selezionare Imposta origine fase. All'interno del software, selezionare il menu a discesa del microscopio, quindi selezionare Calibrate Detectors.
- Nell'interfaccia utente del microscopio, fare clic su Quad 1 una volta con il mouse per selezionare Quad 1. Ignorare le altre istruzioni visualizzate nella finestra popup, non sono necessarie per questo progetto. Fare clic su OK per avviare la calibrazione. Il processo richiederà circa 5 min. Assicurarsi che i rilevatori ETD e ICE si calibrano. E 'ok se qualsiasi altro rilevatore hanno guasti di calibrazione.
- All'interno del software, selezionare il menu a discesa del microscopio e scegliere Esegui per avviare la sequenza di patterning. Quando il modello è completo, chiudere il software.
NOTA: Il software assumerà il quad 3 e 4 per le funzioni di modellazione e allineamento. L'esecuzione dello script richiederà circa 12 h. Durante l'esecuzione dello script, non modificare alcun parametro nel microscopio. - Premere "Vent" nella scheda di controllo del fascio dell'interfaccia utente al microscopio per spegnere i fasci del microscopio e avviare il ciclo di ventilazione. Mentre la camera si sta sfogando, spostare lo stage in modo che si disperda su X , 70 mm, Y, 70 mm, 0 mm, T, R e 0 . Una volta che la camera è ventilata, mettere su guanti nitrile puliti e tirare aprire la porta della camera.
- Allentare la vite impostata sull'adattatore stub utilizzando la chiave inglese da 1,5 mm. Rimuovere lo stub di alluminio contenente la sonda modellata dalla camera. Chiudere con attenzione la porta della camera del microscopio. Guarda l'immagine della telecamera CCD in Quadrant 4 mentre chiudi la porta. Assicurarsi che l'adattatore per palco sia a una distanza di sicurezza da qualsiasi componente critico nella camera del microscopio.
- Selezionare la freccia verso il basso accanto al pulsante Pompa nella scheda controllo trave. Assicurarsi che la porta sia sigillata spingendo delicatamente sulla faccia della porta mentre la pompa è in funzione.
NOTA: Un sigillo sottovuoto può essere confermato tirando delicatamente sulla porta della camera, che dovrebbe rimanere chiusa se il sistema è sottovuoto. Il tempo di pompaggio sarà di circa 5 min. Solo un lato della sonda può essere inciso durante una singola corsa. - Se il lato anteriore e posteriore della sonda richiede l'incisione, rimuovere con attenzione la striscia incisa delle sonde di silicio dopo aver controllato l'incisione finale e aver creato l'immagine del lato anteriore (se sono necessarie immagini). Sciogliere la vernice d'argento con acetone, tamponando con cautela / spazzolando l'acetone sulla vernice d'argento. Ruotare con attenzione la striscia sul retro, montare nuovamente, allineare e incidere seguendo i passaggi descritti in precedenza.
4. Controllo dell'incisione finale e dell'imaging
- Una volta completata la fresatura, verificare l'uniformità delle diverse sezioni utilizzando l'imaging SEM con un ingrandimento più elevato.
NOTA: l'imaging con l'angolo inclinato consente una migliore valutazione della variazione della profondità di fresatura. Occorre prestare particolare attenzione alle regioni di transizione tra le posizioni di fresatura. - Riimmaginiare i campioni dopo la fresatura con un microscopio ottico.
NOTA: Le linee fresate periodiche generano un effetto di rifrazione che dà origine a colori diversi in funzione dell'angolo di imaging. Se il colore non è continuo insieme alla sonda che è una chiara indicazione della rottura nelle linee fresate.
5. Montaggio di una sonda di silicone funzionale per l'incisione FIB
- Rimuovere delicatamente l'elettrodo di silicio funzionale dalla sua confezione. Utilizzare pinze per sollevare con attenzione la linguetta protettiva in plastica che copre lo stadio della testa. Iniziare a sollevare un angolo della linguetta verso l'alto dalla colla appiccicosa tenendola in posizione e continuare a sollevare fino a quando l'intero elettrodo viene rimosso.
- Bloccare con attenzione l'elettrodo con gli emostati per prepararsi al montaggio nel telaio stereotassico. Tenendo la linguetta coperta con le pinze, posizionare delicatamente gli emostati curvi intorno all'albero verde sopra il gambo di silicio, con la parte curva degli emostat rivolti verso l'alto verso l'alto verso la linguetta. gli emostati.
- Rimuovere delicatamente la linguetta protettiva in plastica che copre lo stadio della testa. Mentre si tiene l'elettrodo con gli emostati, tagliare con attenzione l'elettrodo nel telaio stereotassico per la pulizia.
- Riempire 3 piatti Petri con 95% di etanolo (10 mL per piatto petri). Posizionare la parabola Petri sotto l'elettrodo che è montato nel telaio stereotassico per la pulizia. Abbassare lentamente l'elettrodo ruotando il micromanipolatore verso il basso (100 m/s) in modo che il gambo sia immerso nel 95% di etanolo.
NOTA: Fare attenzione a non girare il micromanipolatore troppo veloce o troppo profondo, questo può causare la rottura dell'elettrodo (cioè, l'elettrodo non deve toccare la parabola Petri). - Lasciare il gambo dell'elettrodo nel 95% di etanolo per 5 min, quindi sollevare lentamente l'elettrodo dal 95% di etanolo ruotando il micromanipolo verso l'alto (100 m/s). Ripetere questo passaggio altre due volte, per un totale di tre lavamenti. Lasciare asciugare all'aria l'elettrodo per cinque minuti.
- Utilizzare la stessa tecnica per montare l'elettrodo nel telaio stereotassico, per rimuovere l'elettrodo dal telaio stereotassico. Posizionare con attenzione gli emostati intorno all'albero dell'elettrodo. Una volta che gli emostati sono stretti, rilasciare l'elettrodo dal telaio stereotassico, restituire la linguetta protettiva in plastica che copre lo stadio della testa e rimettere l'elettrodo pulito nella sua confezione.
6. Incisione funzionale sonda in silicone utilizzando FIB
- Montare l'elettrodo funzionale in silicio pulito su un supporto in alluminio. Sollevare con attenzione l'elettrodo di silicio funzionale pulito con pinze e rimuovere la linguetta protettiva dal headstage. Posizionare il gambo dell'elettrodo sullo stub di alluminio in modo che non penda su alcun bordo, quindi utilizzando un piccolo pezzo di Cu o nastro conduttivo in carbonio, pin il headstage in modo sicuro allo stub di alluminio.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un supporto clip a basso profilo per tenere premuto l'elettrodo. Fare attenzione a non toccare il gambo dell'elettrodo. - Seguendo i passaggi descritti sopra (Sezione 2), posizionare l'elettrodo all'altezza eucentrica e assicurarsi che l'elettrodo si trova nel punto di coincidenza dei fasci SEM e FIB. Allineare il gambo con la direzione "X" dello stage.
- Impostare la FIB sulla corrente ottimale per la fresatura della nano-architettura richiesta e assicurarsi che la messa a fuoco e la stigmatizzazione siano corrette correttamente. Preparare una serie di linee con la spaziatura e la lunghezza desiderate per coprire il campo visivo del gambo (500 sezioni m). Regolare le lunghezze delle linee quando l'incisione scende lungo il gambo fino alle sezioni più sottili.
NOTA: quando si estrae l'elettrodo funzionale, non è possibile aggiungere marchi fiduciari per automatizzare il processo. Di conseguenza, lo spostamento tra le sottosezioni (500 m) viene eseguito manualmente. - Una volta completata la fresatura della prima sezione, assicurarsi di controllare la qualità di fresatura prima di passare alla sezione successiva. Ripetere il passaggio 6.3 per inserire la sezione successiva del gambo. Allineare le linee fresate della sezione precedente alle ripetizioni utilizzate per la sezione successiva per evitare grandi spazi tra le rampe.
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Representative Results
FIB Inciso Nano-architettura sulle superfici di sonde intracorticali singolo Shank
Utilizzando i metodi descritti qui, le sonde intracorticali sono state incise con nano-architetture specifiche seguendo protocolli stabiliti39. Le dimensioni e la forma del progetto nano-architettura descritto in questi metodi sono state implementate dai precedenti risultati in vitro che illustrano una diminuzione della reattività delle cellule gliali quando coltivate con il progetto nano-architettura descritto qui37,38. I metodi qui descritti hanno utilizzato un fascio di ioni di gallio focalizzato (FIB) per incidere scanalature parallele su nanoscala nella superficie di sonde a microelettrodo in silicio a gambo singolo non funzionali, come descritto in precedenza39. Le scanalature parallele su nanoscala sono state incise lungo il gambo del retro della sonda utilizzando uno script automatizzato scritto nel software. Le dimensioni finali della nanoarchitettura incisa erano linee parallele larghe 200 nm, distanziate di 300 nm e avevano una profondità di 200 nm (Figura 1). L'uso di FIB per incidere nano-architetture in una superficie del dispositivo consente l'incisione di progetti precisi nei dispositivi fabbricati.
Inciso Nano-architettura in Sonde Intracorticali Effetto sulla Neuroinfiammazione
In questi dati precedentemente riportati, le sonde intracorticali con nano-architetture incise sono state impiantate nella corteccia dei ratti per due o quattro settimane (n. 4 per punto temporale) e confrontate con animali di controllo impiantati con sonde lisce che non contengono incisioni nano-architetture (n. 4 per punto temporale)39. Uno dei meccanismi di fallimento che impediscono la distribuzione clinica di microelettrodi intracorticali è la risposta neuroinfiammatoria indotta da interrompere il parenchyma cerebrale e la barriera ematoencefalica9,10,11,12,15. Una descrizione completa della risposta neuroinfiammatoria osservata dopo l'impianto intracorticale di microelettrodi può essere trovata nelle seguenti recensioni13,14,22. La capacità dei microelettrodi intracorticali di registrare i potenziali d'azione dei neuroni dipende dalla distanza dei corpi neuronali sani dal sito di registrazione dei microelettrodi intracorticali40. Pertanto, lo studio precedentemente riportato ha valutato la neuroinfiammazione intorno al sito di impianto della sonda intracorticale quantificando i marcatori istologici per la densità neuronale, l'attivazione delle cellule gliali e l'espressione genica dei marcatori infiammatori39. I punti salienti di questo studio sono presentati di seguito per rappresentare gli effetti che le nano-architetture incisioni sulla superficie della sonda hanno avuto sulla neuroinfiammazione.
Effetti della nano-architettura incisa sulla densità dei neuroni
Per determinare come l'incisione di nano-architetture nella superficie della sonda effetti la densità neuronale immediatamente intorno all'impianto, i nuclei neuronali sono stati macchiati e quantificati utilizzando precedentemente descrivendo i metodi di immunoistochimica39,41. Non c'erano differenze significative di densità dei neuroni intorno alle sonde nano-architettura e di controllo a 2 settimane dopo l'impianto (Figura 2A). Tuttavia, c'erano significativamente più neuroni intorno alle sonde nano-architettura a 100-150 m di distanza dal sito dell'impianto rispetto agli impianti di controllo liscio (p < 0.05 vs controlli) (Figura 2B) a 4 settimane dopo l'impianto. Si è anche scoperto che c'era una tendenza aumentata della densità neuronale che circondava le sonde nano-architettura nel corso del tempo, contraddindo la tendenza minore della densità neuronale intorno agli impianti di controllo (Figura 2). C'è una relazione diretta raffigurante una risposta neuroinfiammatoria mitigata accoppiato con una maggiore densità di neuroni vitali che circondano il microelettrodo, si traduce in una maggiore capacità per il microelettrodo di fornire registrazioni di qualità15,40,42. Pertanto, quando si interpretano i dati di densità neuronale, una maggiore densità di neuroni intorno al sito dell'impianto può indicare una minore risposta neuroinfiammatoria e potenzialmente una migliore qualità di registrazione e stabilità da microelettrodi intracorticali.
Effetti della nano-architettura incisa sui marcatori molecolari neuroinfiammatori
L'istologia è sufficiente per identificare le cellule intorno a un sito di impianto; tuttavia, manca la sensibilità e la specificità per caratterizzare il fenotipo delle cellule circostanti. Di conseguenza, sono stati impiegati metodi che utilizzano l'analisi quantitativa dell'espressione genica per quantificare l'espressione genica relativa dei marcatori neuroinfiammatori, al fine di comprendere l'effetto che la nanoarchitettura ha sul fenotipo delle cellule39. Diversi marcatori neuroinfiammatori sono stati studiati nello studio precedentemente riportato. Qui ne verranno evidenziati solo due che sono specifici per le cellule di microglia, al fine di discutere come il loro fenotipo potrebbe essere stato alterato. Il cluster di differenziazione 14 (CD14) è un recettore di riconoscimento modello sulla membrana della microglia che riconosce i batteri e segnala la via infiammatoria dopo lesione/impianto43,44,45. L'ossido nitrico synthase (NOS2), è un marcatore di stress ossidativo espresso in microglia/macrofagi che è associato ad un aumento della produzione di marcatori proinfiammatori46,47.
Nei dati precedentemente riportati, non c'erano differenze significative di espressione genica relativa del CD14 tra nano-architettura e impianti di controllo a due o quattro settimane dopo l'impianto. In particolare, c'è stata una significativa diminuzione (p < 0.05) dell'espressione genica relativa CD14 da due a quattro settimane intorno al sito degli impianti di nanoarchitettura, indicando una possibile diminuzione dell'infiammazione (indicata da , nella Figura 3A). Allo stesso modo, non erano differenze significative di espressione genica relativa di NOS2 tra nano-architettura e impianti di controllo a due settimane. Tuttavia, c'era significativamente meno (p < 0.05) l'espressione genica relativa NOS2 intorno all'impianto nano-architettura rispetto all'impianto di controllo a quattro settimane dopo l'impianto (indicato dal segno di sù nella Figura 3B). Inoltre, c'è stato un aumento significativo da 2 a 4 settimane di espressione genica relativa di NOS2 intorno agli impianti di controllo (indicati da , nella figura 3B),e non si sono osservate differenze intorno agli impianti nano-architettura nel corso del tempo, indicando ulteriormente una potenziale diminuzione dell'infiammazione intorno agli impianti di nanoarchitettura. Nell'interpretazione di questi dati, è importante comprendere la funzione del gene quantificato. Ad esempio, le diminuzioni dei geni pro-infiammatori indicano una probabile diminuzione della risposta infiammatoria intorno al sito dell'elettrodo, mentre un aumento di questi tipi di geni suggerisce un probabile aumento dell'infiammazione.
FIB Incisa Nano-architettura sulle superfici di singoli microbietti funzionali
Lo studio precedentemente riportato ha avuto risultati promettenti che dimostrano un leggero aumento della densità del neurone e la potenziale diminuzione del fenotipo infiammatorio della microglia intorno al sito dell'impianto della sonda nano-architettura. Per studiare la traduzione di questi risultati alla funzionalità degli elettrodi, è stato inciso un microelettrodo in silicone a singolo gambo funzionale con lo stesso design di nano-architettura delle sonde a microelettrodo in silicio a singolo gambo non funzionali, utilizzando un protocollo di incisione FIB simile. L'unica differenza nella metodologia per l'incisione della nano-architettura specificata era che il protocollo per gli elettrodi funzionali non poteva essere automatizzato, in quanto non esisteva alcun materiale di substrato aggiuntivo per creare marcature fiduciarie. Pertanto, l'elettrodo funzionale è stato inciso manualmente utilizzando FIB ri-allineamento del fascio ogni 500 m, come descritto nel protocollo precedente. Le incisioni finali erano linee parallele larghe 200 nm, distanziate di 300 nm e avevano una profondità di 200 nm (Figura 4).
Effetti della nano-architettura incisa nei microelettrodi intracorticali sull'elettrofisiologia
Le registrazioni di microelettrodi intracorticali di successo dipendono dalla vicinanza dei neuroni intorno ai siti implantari, dall'integrità del dispositivo e dalla trasmissione affidabile dell'attività di una singola unità dal cervello8,40,48,49. Le registrazioni elettrofisiologiche sono state quantificate utilizzando le metriche registrate raccolte due volte alla settimana per otto settimane. Le metriche utilizzate in questo studio erano, la percentuale di canali che registrano singole unità, ampiezza massime di unità registrate, e rapporto segnale-rumore (SNR). L'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) del Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center ha approvato tutte le procedure sugli animali. I ratti Sprague Dawley (8-10 settimane e del peso di 225 g) sono stati impiantati con microelettrodo in silicio a gambo singolo, con la nano-architettura di cui sopra (n. 1) o i controlli lisci (n.6). Non è stata eseguita alcuna analisi statistica su questi dati, poiché è stato impiantato un microelettrodo nano-architettura per uno studio pilota proof-of-concept. Ciò nonostante, sono promettenti risultati elettrofisiologici collettivi che mostrano una percentuale maggiore di canali che registrano singole unità (Figura 5A), ampiezza massime (Figura 5B) di unità registrate e SNR (Figura 5C) dai microelettrodi nano-architettura rispetto ai microelettrodi a controllo regolare. Questi risultati indicano che l'incisione della nano-architettura nella superficie dei microelettrodi può potenzialmente portare a una migliore qualità e una maggiore longevità delle registrazioni elettrofisiologiche. Per verificare questi risultati preliminari è necessaria un'ulteriore valutazione con una maggiore dimensione del campione.
Figura 1: FIB Inciso Nano-architettura sulle superfici di sonde intracorticali a scanalano singolo. Immagini SEM delle sonde in scessio singolo non funzionali con nano-architetture FIB incise lungo la parte posteriore del gambo. (A) Immagini composite dell'intera sonda post incisione mostrate a un ingrandimento di 120 x, barra di scala - 400 m. I marchi fiduciari, (scatola quadrata con un simbolo di z che lo attraversa), sono incisi lungo il substrato di silicio che circonda la sonda. Le immagini SEM ingrandite della punta del probe sono mostrate nell'ingrandimento (B) all'ingrandimento di 1.056x (barra di scala - 40 m), (C) a un ingrandimento di 3.500x (barra di scala 10 m) e (D) a un ingrandimento di 10.000x, barra della scala . Questa cifra è stata modificata dal riferimento39. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti dell'architettura Nano incisa sulla densità dei neuroni. La sopravvivenza neuronale è presentata come percentuale della regione di fondo dagli stessi animali a distanze di 50 m bidoni dal sito dell'impianto. (A) Non sono state osservate differenze significative di sopravvivenza neuronale tra le superfici lisce (controllo) e gli impianti nanomodellati a 2 settimane dopo l'impianto. (B) C'è stata una sopravvivenza neuronale significativamente più elevata intorno agli impianti nanomodellati alla distanza di 100-150 m rispetto alle superfici lisce (p < 0,05) a 4 settimane dopo l'impianto. Immagini rappresentative dei neuroni (verde macchiato), con il contorno giallo raffigurante il sito di impianto, e la "P" che indica il lato inciso del microelettrodo, barra di scala : 100 m. Questa cifra è stata modificata a partire da39. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti dell'architettura nano-architettura incisa sui marcatori molecolari neuroinfiammatori. Il tessuto è stato raccolto circa 500 m di raggio del sito di impianto sia per gli impianti nanomodellati che per quelli di controllo. L'espressione genica relativa dei marcatori infiammatori è stata confrontata quantitativamente tra entrambi i tipi di impianto (le differenze sono indicate da , sul grafico; p < 0,05) e nel tempo (le differenze sono indicate da , sul grafico; p < 0,05). (A) L'espressione genica relativa del CD14 è diminuita significativamente intorno agli impianti nanomodellati da due a quattro settimane. (B) C'è stata un'espressione genica significativamente minore di NOS2 intorno all'impianto nanomodello rispetto al controllo a quattro settimane (in dollari) e c'è stato un aumento significativo di NOS2 da due a quattro settimane intorno agli impianti di controllo liscio. Questa cifra è stata modificata dal riferimento39. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: FIB Inciso Nano-architettura sulle superfici di singoli microbirdi Shank singolo funzionale. L'insetto nell'angolo in alto a destra mostra il microelettrodo utilizzato in questo studio accanto a un centesimo per ritrarre le dimensioni del gambo dell'elettrodo (sottile linea nera). Immagini SEM del gambo microelettrodi con nano-architetture incise FIB sul retro del gambo. L'intero gambo è mostrato in alto con un ingrandimento di 600x (barra di scala - 50 m), mentre l'insetto raffigura la superficie nanomodellata a un ingrandimento di 25.000x, barra di scala : 1 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetti della nanoarchitettura incisa sui microelettrodi intracorticali sull'elettrofisiologia. La valutazione delle metriche elettrofisiologiche ha scoperto una promettente tendenza preliminare aumentata della percentuale di canali (A)dei canali che registrano singole unità,(B) le ampiezza massime delle unità registrate e il rapporto segnale-rumore(C)dal microelettrodo inciso con nano-architetture rispetto agli elettrodi a controllo liscio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Registrazione elettrofisiologica da microelettrodi a singolo shank funzionale impiantato con FIB Intched Nano-architectures. Una delle sfide dell'utilizzo del FIB per incidere nano-architetture su dispositivi a microelettrodi fabbricati è il rischio di contatti di registrazione in cortocircuito. L'asse x rappresenta il tempo di registrazione in secondi, e l'asse y mostra i canali degli elettrodi che registrano i potenziali dell'azione neuronale. Ogni linea numerata sull'asse y rappresenta un canale di elettrodo diverso, con il canale numero 1 è il più superficiale e 16 è il più profondo. Le caselle rosse delineano i canali cortocircuiti, mentre le caselle blu delineano i canali con attività neuronale visibile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo di fabbricazione qui descritto utilizza la litografia focalizzata del fascio ionico per eguagliare in modo efficace e riproducibile nano-architetture nella superficie di microelettrodi in silicio a gambo singolo non funzionale e funzionale. La litografia del fascio ionico focalizzato (FIB) consente l'ablazione selettiva della superficie del substrato utilizzando un fascio ionico a fuoco fine50,51. FIB è una tecnica di scrittura diretta che può produrre varie caratteristiche con risoluzione su nanoscala e alti rapporti di aspetto50,52,53. Per creare le varie caratteristiche di dimensioni, la grandezza della corrente della trave ionica può essere ottimizzata per modificare la dimensione del punto della trave ionica all'interno di un intervallo compreso tra 3 nm e 2 m50,51. Alcuni vantaggi generali dell'utilizzo di FIB per etch feature sulle superfici sono: 1) può essere utilizzato su una vasta gamma di materiali, tra cui silicio, metalli e polimeri53,54,55,56 ,2)FIB può essere eseguito su superfici non planari, e 3) FIB può essere utilizzato per la post-elaborazione su singoli dispositivi57.
In questo caso, FIB è stato utilizzato in combinazione con un microscopio SEM e un software utilizzato per scrivere uno script automatizzato specializzato per l'incisione di caratteristiche specifiche in sonde a singolo gambo non funzionali. Lo script includeva parametri necessari (2,5 nA corrente del fascio ionico e tensione di 30 kV) per incidere la spaziatura esatta desiderata (200 nm scanalature parallele larghe, distanziate 300 nm e profonde 20 nm). Le dimensioni dell'elettrodo hanno superato il campo visivo per la FIB, quindi il patterning è stato eseguito in più posizioni di fase. Al fine di automatizzare il processo, i marchi fiduciari sono stati incisi nel lato del foglio di silicio tenendo le sonde in posizione, per consentire al software di individuare con precisione le linee modellate sul gambo della sonda. I fiduciali erano necessari perché il movimento dello stage creava una grande incertezza nella posizione dell'area del modello rispetto al campo visivo della trave ionico. Il posizionamento dei fiduciari sul foglio di silicio ha permesso al FIB di localizzare le aree del modello senza scansionare direttamente il fascio sul gambo della sonda, che potrebbe potenzialmente contaminare o danneggiare il gambo della sonda. L'intero processo di incisione automatizzato per un gambo ha richiesto circa 12 h per essere completato e non ha richiesto alcun intervento da parte dell'operatore dopo l'avvio del patterning. Collettivamente, i vantaggi dell'utilizzo di FIB per incidere le caratteristiche nel gambo della sonda di silicio erano la capacità di creare caratteristiche di dimensioni nanometriche, automatizzare il processo di incisione e la capacità di incidere su una sonda fabbricata. Anche se FIB ha numerosi vantaggi, uno degli svantaggi dell'utilizzo di questo metodo di fabbricazione è la velocità effettiva lenta che limita in ultima analisi il potenziale per la produzione di massa di dispositivi con nano-architetture nella loro superficie58. In alternativa, altri metodi di fabbricazione utilizzati per creare dimensioni e geometrie di interesse, magari a velocità più elevate e a produzioni di massa, includono litografia a fascio di elettroni e litografia nanoimprint59,60,61,62,63,64,65. Tuttavia, questi metodi non consentono l'incisione di funzionalità di nanoarchitettura nei dispositivi fabbricati. Tradizionalmente questi metodi vengono utilizzati durante il processo di fabbricazione su un foglio di silicio o polimero, che può quindi essere utilizzato in fasi di elaborazione a valle per fabbricare l'inganno finale.
Gli elettrodi funzionali non sono stati in grado di subire un processo automatizzato a causa del fatto di non avere alcun materiale circostante intorno al gambo dell'elettrodo in cui includere i segni fiduciari nella conduttura. Pertanto, gli elettrodi funzionali sono stati allineati manualmente e incisi a 500 sezioni di m lungo il gambo, utilizzando la stessa corrente iolaristica e la stessa tensione della corsa automatizzata per garantire le stesse dimensioni delle caratteristiche. La trave doveva essere riallineata manualmente dopo aver completato ogni intervallo di 500 m e impostato per incidere la sezione successiva. Il processo di riallineamento manuale dei modelli ogni 500 m può potenzialmente portare a nanostrutture o strutture danneggiate che non corrispondono alla geometria prevista. Ciò è dovuto a tempi di esposizione più lunghi che il fascio ionico ha bisogno per l'allineamento manuale66. Questa è stata una delle difficoltà incontrate con l'incisione manuale. A causa di questa complicazione, due contatti di registrazione sono stati cortocircuito e non sono stati in grado di registrare potenziali di azione neuronale (Figura 6). La Figura 6 mostra un segmento di registrazione dal vivo elettrofisiologico dell'animale impiantato con l'elettrodo nano-architettura. Le caselle blu delineano i canali che registrano forti potenzialità d'azione, rispetto alle caselle rosse che denotano i due canali morti. Quindi, una delle sfide dell'utilizzo dell'incisione FIB manuale sugli elettrodi post-fabbricati è che c'è la possibilità che il fascio possa cortocircuito i contatti e impedire loro di registrare. Questa sfida è migliorata quando si tenta di incidere il lato anteriore di singoli elettrodi di silicio a gambo, in cui i contatti di registrazione e le tracce sono lungo l'intero gambo dell'elettrodo. Anche se è possibile incidere il silicio intorno ai contatti di registrazione e tracce, si consiglia di prestare particolare attenzione per evitare danni e una diminuzione delle prestazioni di registrazione dell'elettrodo.
Come accennato in precedenza, FIB può essere utilizzato su vari materiali per incidere numerose geometrie di lavorazione nella superficie. Tuttavia, è importante notare che i parametri per estrarle geometrie, come le linee nei vari materiali, sono complicati da prevedere. In particolare per i modelli di linea, la larghezza e la profondità della linea dipendono fortemente da molti parametri come la tensione di accelerazione, la corrente del fascio, il tempo di permanente, la spaziatura dei pixel, la durata dell'apertura e il tipo di materiale. Un altro parametro risultante dall'ottimizzazione è il tempo totale di fresatura di ogni linea. Linee più strette e più profonde potrebbero essere raggiunte utilizzando correnti di fascio più piccole; tuttavia, il tempo di modello per un intero gambo della sonda si estenderebbe a più giorni, il che non è pratico. Pertanto, anche se è possibile ottimizzare il protocollo qui presentato, sarebbe estremamente difficile descrivere i parametri per i materiali sconosciuti. Nella risoluzione dei problemi relativi ai parametri per le sonde in silicio descritti in questo protocollo, sono stati effettuati numerosi tagli di prova in silicio per valutare in che modo le condizioni mutevoli hanno influito sulla larghezza e sulla profondità della linea. Non appena le condizioni valutate sono state in grado di incidere la dimensione specifica della feature e la geometria di interesse (200 nm di linee di larghezza che erano 200 nm di profondità), tali parametri sono stati utilizzati per scrivere lo script software. Lo script è stato utilizzato per controllare la spaziatura di ogni riga, dal centro al centro, che in questo protocollo è di 300 nm. Studi futuri che utilizzano substrati/dispositivi di silicio che richiedono dimensioni di funzionalità in centinaia di nanometri, possono utilizzare i parametri descritti in questo protocollo come punto di partenza per la risoluzione delle condizioni necessarie per creare le dimensioni di funzionalità desiderate. Ulteriori ottimizzazioni e risoluzione dei problemi delle condizioni di incisione saranno necessarie per i substrati/dispositivi metallici e polimerici. Nel complesso, l'utilizzo di FIB per l'incisione di nano-architetture in superfici di materiali consente un ampio controllo e flessibilità nelle geometrie delle caratteristiche, l'uso di numerosi materiali compatibili e diversi tipi di superficie, tra cui dispositivi fabbricati. I risultati rappresentativi presentati qui hanno dimostrato i potenziali benefici osservati nei nostri studi sull'utilizzo della FIB per incidere le nano-architetture nella superficie dei microelettrodi intracorticali: 1) aumento della densità neuronale e 2) riduzione dei marcatori neuroinfiammatori intorno ai dispositivi impiantati con nano-architetture, così come 3) risultati preliminari che rappresentano una migliore qualità delle registrazioni elettrofisiologiche nel tempo. Allo stesso modo, l'impiego e l'ottimizzazione del protocollo descritto che incide le caratteristiche nano-architettura nella superficie di un materiale può essere utilizzato per migliorare la funzionalità di numerosi dispositivi medici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Dipartimento dei Veterani per la Ricerca e lo Sviluppo del Dipartimento degli Affari Veterani: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) e #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). I contenuti non rappresentano le opinioni del Dipartimento degli Affari Veterani degli Stati Uniti o del Governo degli Stati Uniti. Gli autori desiderano ringraziare FEI Co. (Ora parte di Thermofisher Scientific) per l'assistenza del personale e l'uso della strumentazione, che ha aiutato a sviluppare gli script utilizzati in questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
References
- Salcman, M., Bak, M. J. A new chronic recording intracortical microelectrode. Medical and Biological Engineering. 14 (1), 42-50 (1976).
- Im, C., Seo, J. -M. A review of electrodes for the electrical brain signal recording. Biomedical Engineering Letters. 6 (3), 104-112 (2016).
- Donoghue, J. Bridging the Brain to the World: A Perspective on Neural Interface Systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
- Gilja, V., et al. Clinical translation of a high-performance neural prosthesis. Nature medicine. 21 (10), 1142-1145 (2015).
- Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17849-17854 (2004).
- Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping in a person with tetraplegia through brain-controlled muscle stimulation: a proof-of-concept demonstration. Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
- Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neurosciences. 6 (1), 48-67 (2015).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Michelson, N. J., et al. Multi-scale, multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
- Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
- Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
- Ravikumar, M., et al. The Roles of Blood-derived Macrophages and Resident Microglia in the Neuroinflammatory Response to Implanted Intracortical Microelectrodes. Biomaterials. 0142 (35), 8049-8064 (2014).
- Hermann, J., Capadona, J. Understanding the Role of Innate Immunity in the Response to Intracortical Microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
- Ereifej, E. S., et al. Implantation of Intracortical Microelectrodes Elicits Oxidative Stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00009 (2018).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
- Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862 (2017).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 7 (3), 315-326 (1999).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
- Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11 (5), 056014 (2014).
- Wei, X., et al. Nanofabricated Ultraflexible Electrode Arrays for High-Density Intracortical Recording. Advanced Science. , 1700625 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Kim, Y., et al. Nano-Architectural Approaches for Improved Intracortical Interface Technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chemical Neurosciences. 1 (1), 36-48 (2010).
- Ding, H., Millet, L. J., Gillette, M. U., Popescu, G. Actin-driven cell dynamics probed by Fourier transform light scattering. Biomedical Optical Express. 1 (1), 260-267 (2010).
- Kotov, N. A., et al. Nanomaterials for Neural Interfaces. Advanced Materials. 21 (40), 3970-4004 (2009).
- Curtis, A. S., et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Trans Nanobioscience. 3 (1), 61-65 (2004).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5 (1), 13406 (2011).
- Ereifej, E. S., et al. Nanopatterning effects on astrocyte reactivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (6), 1743-1757 (2013).
- Ereifej, E. S., Cheng, M. M. -C., Mao, G., VandeVord, P. J. Examining the inflammatory response to nanopatterned polydimethylsiloxane using organotypic brain slice methods. Journal of Neuroscience Methods. 217 (1-2), 17-25 (2013).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
- Sladek, Z., Rysanek, D. Expression of macrophage CD14 receptor in the course of experimental inflammatory responses induced by lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. Veterinarni Medicina. 53 (7), 347-357 (2008).
- Janova, H., et al. CD14 is a key organizer of microglial responses to CNS infection and injury. Glia. , (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Ulevitch, R. J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell Science. 117 (14), 2865-2867 (2004).
- Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences. 75 (6), 639-653 (2004).
- Kozai, T. D., et al. Comprehensive chronic laminar single-unit, multi-unit, and local field potential recording performance with planar single shank electrode arrays. Journal of Neurosciences Methods. 242, 15-40 (2015).
- Kozai, T. D., et al. Mechanical failure modes of chronically implanted planar silicon-based neural probes for laminar recording. Biomaterials. 37, 25-39 (2015).
- Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. FIB-nanostructured surfaces and investigation of bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Transactions on Nanobioscience. 7 (1), 1-10 (2008).
- Lehrer, C., Frey, L., Petersen, S., Ryssel, H. Limitations of focused ion beam nanomachining. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures Processing, Measurement, and Phenomena. 19 (6), 2533-2538 (2001).
- Watkins, R., Rockett, P., Thoms, S., Clampitt, R., Syms, R. Focused ion beam milling. Vacuum. 36 (11-12), 961-967 (1986).
- Veerman, J., Otter, A., Kuipers, L., Van Hulst, N. High definition aperture probes for near-field optical microscopy fabricated by focused ion beam milling. Applied Physics Letters. 72 (24), 3115-3117 (1998).
- Lanyon, Y. H., Arrigan, D. W. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. Sensors and Actuators B: Chemical. 121 (1), 341-347 (2007).
- Menard, L. D., Ramsey, J. M. Fabrication of sub-5 nm nanochannels in insulating substrates using focused ion beam milling. Nano Letters. 11 (2), 512-517 (2010).
- Ziberi, B., Cornejo, M., Frost, F., Rauschenbach, B. Highly ordered nanopatterns on Ge and Si surfaces by ion beam sputtering. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (22), 224003 (2009).
- Reyntjens, S., Puers, R. A review of focused ion beam applications in microsystem technology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 11 (4), 287 (2001).
- Heyderman, L., David, C., Kläui, M., Vaz, C., Bland, J. Nanoscale ferromagnetic rings fabricated by electron-beam lithography. Journal of Applied Physics. 93 (12), 10011-10013 (2003).
- Baquedano, E., Martinez, R. V., Llorens, J. M., Postigo, P. A. Fabrication of Silicon Nanobelts and Nanopillars by Soft Lithography for Hydrophobic and Hydrophilic Photonic Surfaces. Nanomaterials. 7 (5), 109 (2017).
- Eom, H., et al. Nanotextured polymer substrate for flexible and mechanically robust metal electrodes by nanoimprint lithography. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (45), 25171-25179 (2015).
- Li, K., Morton, K., Veres, T., Cui, B. 5.11 Nanoimprint Lithography and Its Application in Tissue Engineering and Biosensing. Comprehensive Biotechnology. , 125-139 (2011).
- Dong, B., Zhong, D., Chi, L., Fuchs, H. Patterning of conducting polymers based on a random copolymer strategy: Toward the facile fabrication of nanosensors exclusively based on polymers. Advanced Materials. 17 (22), 2736-2741 (2005).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Wilkinson, C. D. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (4), 973-979 (2008).
- Tseng, A. A., Chen, K., Chen, C. D., Ma, K. J. Electron beam lithography in nanoscale fabrication: recent development. IEEE Transactions on Electronics Packaging Manufacturing. 26 (2), 141-149 (2003).
- Yang, Y., Leong, K. W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 478-495 (2010).
- Vermeij, T., Plancher, E., Tasan, C. Preventing damage and redeposition during focused ion beam milling: The "umbrella" method. Ultramicroscopy. 186, 35-41 (2018).
