Summary
我々は、皮質内マイクロ電極デバイスへのナノアーキテクチャのエッチングは、炎症反応を減少させ、電気生理学的記録を改善する可能性を有することを示した。本明細書に記載される方法は、非機能的かつ機能的な単一シャンクシリコン皮質内マイクロ電極の表面にナノアーキテクチャをエッチングするアプローチを概説する。
Abstract
エレクトロニクスおよび製造技術の進歩に伴い、皮質内マイクロ電極は、より大きな分解能と拡張された機能を備えた洗練されたマイクロ電極の製造を可能にする大幅な改善を受けています。製造技術の進歩は、脳性膵腫にシームレスに統合することを目指すバイオミメティック電極の開発を支え、電極挿入後に観察される神経炎症反応を低減し、品質を向上させ、電気生理学的記録の長寿。ここでは、最近ナノアーキテクチャに分類されるバイオミメティックアプローチを採用するプロトコルについて説明する。集束イオンビームリソグラフィ(FIB)の使用は、非機能的かつ機能的な単一シャンク皮質内マイクロ電極の表面に特定のナノアーキテクチャ機能をエッチングするために、このプロトコルで利用された。電極表面へのナノアーキテクチャのエッチングは、移植された装置の生体適合性および機能性の可能な改善を示した。FIBを使用する利点の1つは、デバイスの製造中とは対照的に、製造されたデバイスにエッチングする能力であり、製造後に多数の医療機器を変更する無限の可能性を促進します。本明細書に提示されるプロトコルは、様々な材料タイプ、ナノアーキテクチャ機能、およびデバイスの種類に最適化することができる。移植された医療機器の表面を増強することは装置の性能および組織への統合を改善できる。
Introduction
皮質内微小電極(IME)は、外部デバイスと大脳皮質1、2内のニューロン集団との間に直接インタフェースする手段を提供する侵襲的電極である。この技術は、神経機能を探索する科学者の能力を向上させ、神経疾患の理解を進め、潜在的な治療法を開発するための神経作用電位を記録するための貴重なツールです。脳機械インタフェース(BMI)システムの一部として使用される皮質内マイクロ電極は、個々または小群のニューロンからの作用電位の記録を可能にし、機能的出力3を生成するために使用できる運動意図を検出する。実際、BMIシステムは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)4および脊髄損傷5の患者におけるコンピュータカーソルを操作し、慢性四遊傷6に罹患している人々の運動を回復させる感覚運動リズム制御を獲得した感覚運動リズム制御などの補綴および治療目的で正常に使用されている。
残念ながら、IIMは、機械的、生物学的および材料因子7、8を含むいくつかの故障モードのために、多くの場合、時間の経過とともに一貫して記録することができません。電極移植後に生じる神経炎症反応は、電極不全9、10、11、12、13、14に寄与する相当な課題であると考えられる。神経炎症反応は、血液脳関門を断絶し、局所脳性脳性高肉腫を損傷し、グリアおよび神経ネットワークを破壊するIMEの初期挿入中に開始され、グリアおよび神経ネットワーク15、16を破壊する。この急性応答は、インプラント部位17、18、19、20の周りに炎症性および神経毒性分子を放出するグリア細胞(ミクログリア/マクロファージおよびアストロサイト)の活性化によって特徴付けられる。グリア細胞の慢性活性化は、健康な脳組織7、9、12、13、17、21、22から電極を単離するグリア瘢痕の形成を特徴とする異物反応をもたらす。最終的には、電極とニューロンとの間の物理的な障壁とニューロン23、24、25の変性死に起因する電極の神経作用電位を記録する能力を妨げる。
皮質内マイクロ電極の早期故障は、生物模倣戦略26、27、28、29、30に重点を置いて、次世代電極の開発にかなりの研究をもたらした。ここで説明するプロトコルに特に興味深いのは、IIM31に対するバイオミメティック表面変化のクラスとしてのナノアーキテクチャの使用である。自然生体内環境の建築を模倣した表面は、改善された生体適合応答32、33、34、35、36を有することが確立されている。したがって、このプロトコルを説得力のある仮説は、脳組織の粗いアーキテクチャと皮質内マイクロ電極の滑らかなアーキテクチャとの間の不連続性が、移植されたIEに対する神経炎症性および慢性異物応答に寄与し得る(完全なレビューについてはKim et al.31を参照)。我々は、脳の細胞外マトリックスアーキテクチャと同様のナノアーキテクチャ機能の利用は、ナノアーキテクチャ基板上で培養された細胞からのアストロサイト炎症マーカーを減少させることを示した。さらに、シリコンプローブに直接ナノアーキテクチャをエッチングする集束イオンビーム(FIB)リソグラフィーの応用により、ナノアーキテクチャプローブを移植した動物由来の神経生存率が著しく向上し、かつ、スムーズな対照群26と比較して炎症性遺伝子の発現が低下することが示された。そこで、ここで提示するプロトコルの目的は、製造された皮質内マイクロ電極デバイス上のエッチングナノアーキテクチャに対するFIBリソグラフィの使用を記述することである。このプロトコルは、自動化されたプロセスと手動プロセスの両方を利用して、皮質内マイクロ電極シャンクのシリコン表面にナノアーキテクチャサイズの特徴をエッチングするように設計されました。これらの方法は、複雑で再現性があり、さまざまなデバイス材料や必要な機能サイズに合わせて最適化できます。
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Protocol
メモ:ラボコートや手袋などの適切な個人用保護具を装着したまま、以下の手順を実行してください。
1. 集束イオンビーム(FIB)リソグラフィー用非機能シリコンプローブの取り付け
メモ:1,000プローブを使用したSOIウエハの製造を記述する完全な手順については、Ereifej et al.39を参照してください。
- 1,000個のプローブを含む絶縁体(SOI)ウエハ上のシリコンから2~3個のシリコンプローブのストリップを分離します。3つ以上のシリコンプローブを含むストリップを作らないで下さい。これにより、取り付けが緩くなる可能性が高くなり、FIB が誤ってエッチングするミスアライメントが発生する可能性があります。
注:ストリップ/プローブがアルミニウムスタブにしっかりと座っていない場合、2つの合併症を引き起こす可能性があります:1)ステージが次のセクションで動作するように移動すると、振動があり、プローブが落ち着くまでフライス加工が正確でなくなると2)高い変動を引き起こし、フォーカスプレーンから外れる可能性があります。- 手袋を着用している間は、細かい鉗子を使用してプローブの周囲に圧力をかけ、2~3個のプローブを含む小さな断面を断ち切ります。
- FIBエッチングの前に、すべてのほこりやごみのシリコンプローブを慎重に洗浄してください。3つの井戸に95%エタノールの3 mL/ウェルをピペットで6ウェルポリスチレンプレートを準備します。
- 細かい先端または真空鉗子を使用してシリコンプローブのカットストリップを慎重にピックアップし、セルストレーナーに置きます。プローブが破損しないように、ストレーナーごとにシリコンプローブのストリップを1つだけ配置します。シリコンプローブストリップを含むストレーナーを、洗浄用に95%エタノールを含む最初のウェルに入れられます。ストレーナーを最初の井戸に5分間保管してください。
- シリコンプローブを含むストレーナーを最初のウェルから移動し、さらに5分間95%エタノールを含む2番目のウェルに入れ、3番目のウェルをもう一度繰り返します。
- 洗浄されたシリコンプローブを含むストレーナーをポリテトラフルオロエチレンプレートの上に置き、空気乾燥させます。ほこりによる汚染を避けるために、滅菌フードでこのステップを行います。
- シリコンプローブの空気乾燥ストリップを密閉容器に入れ、SEM-FIBに輸送します。空気乾燥サンプルを含むストレーナーをプラスチックまたはアルミニウムホイルラップで包み、搬送や保管を行い、洗浄を維持します。
- 細かいチップまたは真空鉗子を使用して、シリコンプローブのクリーンストリップを慎重にピックアップし、取り付けに備えてきれいなアルミニウムスタブ(SEM-FIBイメージング/エッチングに使用)に置きます。
- 爪楊枝(または細い電線のような他の細い先端の器具)を使用して、プローブを取り囲むシリコン基板の端に銀色の塗料の小さな滴(〜10°L)を置きます。プローブを取り囲むシリコン基板の側面に銀色の塗料を広げて、ストリップを固定します。SEM-FIBにアルミニウムスタブを入れる前に、銀色の塗料を完全に乾燥させます。
注:エッチングされる部分ですので、電極のシャンクに銀色の塗料が付かないように注意してください。プローブのストリップがアルミニウムスタブにしっかりと固定されていない場合、ストリップは処理中に移動したり、異なる焦点面を持ったりして、FIBによる不適切なミリングを引き起こします。シリコンプローブのいくつかのストリップを同じアルミニウムスタブに取り付けることができ、エッチング後にスタブから取り外すことができるようにストリップの間に十分なスペースがあることを確認します。これにより、以下に説明する自動化機能を使用して、複数のプローブをより効率的にエッチングすることができます。
2. FIBをシリコンプローブに合わせる
- ビームコントロールタブのベントボタンをクリックしてチャンバーを通します。ホームステージを実行するには、Shift キーを押しながらF3 キーを押します。ポップアップウィンドウで「ホームステージ」ボタンを選択して、選択内容を確認します。
メモ:ホームステージ操作の実行は、ステージ軸がソフトウェアによって正しく読み取られ、顕微鏡が良好な状態であることを確認するための予防的なステップです。 - ホームステージが完了したら、ステージを座標 X = 70 mm、Y = 70 mm、Z = 0 mm、T = 0°、R = 0°に移動します。チャンバーが通ったら、きれいなニトリル手袋を着用し、チャンバードアを開けます。
注: 前のユーザーのアプリケーションによっては、ステージ アダプタの変更が必要になる場合があります。標準的な段階アダプター(例えば、FEI様式)は中央ボルトを反時計回りに外すことによって取除き、段階の回転版に時計回りにねじ込むによって取付けることができる。 - プローブを保持しているアルミニウムスタブをステージアダプタの上部に挿入します。ステージアダプターの側面にあるセットネジを締めて、アルミ製スタブを固定します。このタスクには、1.5 mm の六角レンチを使用します。
- アダプターを時計回りに回転させ、反時計回りに上げてステージ アダプターの高さを調整します。ナットがステージ回転プレートに対してしっかりと固定されるまで、ロックコーンナットを時計回りに回して、ステージアダプタを回転プレートに固定します。もう一方の手でステージアダプタを持ち、ロックコーンナットを締めながらアダプタとサンプルの回転を防ぎます。
メモ:付属の高さゲージを使用して、適切な高さを決定します。アルミニウムスタブの上部は、高さゲージに表示される最大ラインと同じ高さである必要があります。コーンナットを締め付け過ぎ、ステージやアダプターに損傷を与える可能性があります。サンプルを固定するのに十分な力のみを使用してください。 - ナビゲーションカメラの画像を取得します。ナビゲーションカメラのアームが停止するまで慎重にスイングします。顕微鏡ステージは自動的にカメラの下の位置に移動します。顕微鏡ユーザーインターフェイス(UI)の象限3に示されているライブ画像を見てください。
- 明るさレベルが自動的に適切なレベルに調整されたら、カメラブラケットのボタンを押し下げて画像を取得します。画像の取得全体が終了するのを待つようにしてください。これは、約10 s. カメラアームを閉じた位置に戻します。ステージが元の位置に戻ります。
- 顕微鏡室のドアを慎重に閉じます。ドアを閉めながら、象限4のCCDカメラ画像を見ます。サンプルとステージが顕微鏡室の重要なコンポーネントから安全な距離であることを確認します。
- ビームコントロールタブの[ポンプ]ボタンの横にある下矢印を選択します。ポンプの動きが激しい間にドアの顔を軽く押してドアを密閉してください。顕微鏡室のポンプ時間とプラズマ洗浄サイクルが完了するまで約8分間待ちます。
メモ:真空シールは、システムが真空下にある場合は閉じたままにするチャンバードアをゆっくりと引っ張ることによって確認できます。 - UI の右下隅にあるアイコンが緑色に変わったら、電子とイオンビームをオンにするビーム制御タブのウェイクアップボタンを押します。象限1を選択し、ビーム信号を電子線に設定し(まだ設定されていない場合)、象限2をイオンビームに設定する(まだ設定されていない場合)。
- SEM電圧を5kVに設定し、SEMビーム電流を0.20 nAに設定し、SEM検出器をETDに設定し、検出器モードを二次電子に設定します。FIB電圧を30kVに設定し、FIBビーム電流を24pAに設定し、FIB検出器をICE検出器に設定し、検出器モードを二次電子に設定します。
- ナビゲーションカメラ画像内のシリコンプローブをダブルクリックし、象限3をダブルクリックして、ステージをプローブのおおよその位置に移動させる。作業領域 1をクリックしてアクティブな作業領域として選択し、一時停止ボタンを押して SEM スキャンを開始します。スキャンドウェル時間を300 nsに設定し、スキャンインターレース、ラインインテグレーション、フレーム平均をオフにします。梁コントロール タブでスキャン回転を 0 に設定し、ビーム シフト 2D アジャスターを右クリックしてゼロを選択します。
- MUIパネルの倍率ノブを反時計回りに回して、倍率を最小値に調整します。MUI パネルのノブまたは自動コントラストの明るさツールバーアイコンを使用して、画像の明るさとコントラストを調整します。
- 機能上でマウスをダブルクリックして中央に移動するか、マウスホイールを押してジョイスティックマウスモードをアクティブにします。パターン化する目的のシリコンプローブをSEM画像の中心に移動します。
- エッジや、ほこりパーティクルやスクラッチなどのその他の機能を見つけます。倍率ノブを時計回りに回して倍率を 2,000 倍に増やします。画像がフォーカスされるまでMUIの粗いフォーカスノブと細かいフォーカスノブを回して、SEMのフォーカスを調整します。画像にフォーカスが移ったら、ツールバーの「サンプル Z を作業距離にリンク」ボタンを選択します。
- ナビゲーション タブで Z 軸座標を確認して、操作が完了したことを確認します。値は約11mmである必要があります。Z軸の位置に4.0mmで入力し、マウスで[移動]ボタンを押すか、キーボードのEnterキーを押すと、ステージは4mmの作業距離に移動します。
- X と Y のステージを移動して、シリコン プローブの肩を見つけます。できるだけ SEM の中心に近い位置に配置します。T座標に「52」と入力して入力してステージの傾きを52°に変更します。プローブの肩が画像内で上下に移動しているように見えるかどうかを確認します。ステージ Z スライダーを使用して、プローブの肩を SEM イメージの中心に戻します。Z の位置のみを調整し、X、Y、T、または R 軸を移動しないでください。
- ステージのドロップダウン メニューにある組み込みの"xT 整列機能" コマンドを実行します。マウスを使用して、プローブの端に平行な 2 点をクリックします。ポップアップ ウィンドウで水平ラジオ ボタンが選択されていることを確認し、[完了] をクリックします。ステージは回転し、プローブをステージの X 軸に位置合わせします。マウスを使用してX,Yのステージを調整し、プローブの下肩をSEM画像の中央に再度配置します。
注: 最初の点はプローブのグリップに向かい、2 番目の点はプローブのポイントに向かう必要があります。 - 象限 2 の FIB を選択し、ビーム電流が 24 pA のままであることを確認します。倍率を 5,000x に設定し、住み込み時間を 100 ns に設定します。キーボードのCtrl-Fと入力して、FIB フォーカスを 13.0 mm に設定します。[梁コントロール]タブで、スティグマ 2d アジャスターを右クリックしてゼロを選択し、また、ビーム シフト 2d アジャスターを右クリックしてゼロを選択します。スキャンの回転を 0° に設定し、ツールバーの自動コントラスト輝度ボタンを押します。
- 作業領域 2 のプローブショルダーの画像を探します。スナップショットツールを使用して、FIB でイメージを取得します。プローブショルダーがFIB画像の中央にあることを確認し、そうでない場合は、プローブショルダーをダブルクリックして中央に移動します。キーボードの左矢印キーを約10~15回押して、ステージを左に移動します。別のスナップショットを作成し、プローブ側がまだFIBの中央にあるかどうかを確認します。
注: そうでない場合は、ステージの回転を若干調整する必要があります。プローブがイメージの中心の上にある場合、ステージは負の方向に回転する必要があります。プローブが中心より下にある場合は、ステージを時計回りに回転させる必要があります。プローブの位置合わせに必要な方法に応じて、0.01 ~0.2 度の相対対心回転を入力します。 - プローブショルダーのエッジがステージのX軸に完全に位置合わせされるまで、手順2.16~2.17を必要な回数繰り返します(エッジは左に移動している間、FIBの中央にとどまります)。
- FIBを使用して、ステージをプローブの下側肩に戻します。[追加] ボタンをクリックして、ステージの位置を位置リストに保存します。FIBビーム電流を2.5 nAに変更し、FIBの倍率がまだ5000xであることを確認します。自動明るさコントラスト機能を実行し、FIBドウェル時間を100nsに設定します。
- 一時停止ボタンを押してスキャンを開始します。FIBフォーカスと乱視を、粗いフォーカスノブとファインフォーカスノブ、MUIパネルのXとYスティグマノブを使用して、可能な限り迅速かつ正確に調整します。FIB スキャンを停止するには、一時停止ボタンを押します。
3. エッチングの自動化プロセスの作成
- Windows の [スタート] メニューでソフトウェアを検索してソフトウェアを起動します (つまり、[スタート] ボタン\[プログラム]\[FEI 会社\アプリケーション\ナノビルダー])。UI が隠れないように、ソフトウェア ウィンドウをサイド モニターに配置します。[ファイル] をクリックし、 を開いてシリコン プローブをパターン化するファイルを開きます。Windows ブラウザをソフトウェア スクリプトの場所に移動します (補足ファイル 1 - ファイル名は "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj")。
- ソフトウェア内で、顕微鏡のドロップダウンメニューを選択し、[ステージ原点の設定] を選択します。ソフトウェア内で、顕微鏡のドロップダウンメニューを選択し、[検出器のキャリブレーション] を選択します。
- 顕微鏡の UI で、クアッド 1をマウスで 1 回クリックし、[クワッド 1] を選択します。ポップアップ ウィンドウに表示される他の命令は無視してください。[OK] をクリックしてキャリブレーションを開始します。プロセスは約5分かかります。ETDおよびICE検出器が校正されていることを確認してください。他の検出器にキャリブレーションの失敗がある場合は問題ありません。
- ソフトウェア内で顕微鏡のドロップダウンメニューを選択し、「実行」を選択してパターニングシーケンスを開始します。パターンが完成したら、ソフトウェアを閉じます。
メモ:ソフトウェアは、パターニングとアライメント機能のためのクワッド3と4を引き継ぐでしょう。スクリプトの実行には約 12 時間かかります。スクリプトの実行中は、顕微鏡のパラメータを変更しないでください。 - 顕微鏡のUIビーム制御タブで「ベント」を押して顕微鏡ビームをシャットダウンし、ベントサイクルを開始します。チャンバーが通気している間に、ステージを座標 X = 70 mm、Y = 70 mm、Z = 0 mm、T = 0°、R = 0°に移動します。チャンバーが通ったら、きれいなニトリル手袋を着用し、チャンバードアを開きます。
- 1.5 mm 六角レンチを使用して、スタブ アダプターのセット ねじを緩めます。パターン化されたプローブを含むアルミニウムスタブをチャンバーから取り外します。顕微鏡室のドアを慎重に閉じます。ドアを閉めながら、象限4のCCDカメラ画像を見ます。ステージアダプタが顕微鏡室の重要なコンポーネントから安全な距離にあることを確認します。
- ビームコントロールタブの[ポンプ]ボタンの横にある下矢印を選択します。ポンプの動きが激しい間にドアの顔を軽く押してドアを密閉してください。
メモ:真空シールは、システムが真空下にある場合は閉じたままにするチャンバードアをゆっくりと引っ張ることによって確認できます。ポンピング時間は約5分です。1 回の実行でエッチングできるのは、プローブの片側のみです。 - プローブの前面と背面側にエッチングが必要な場合は、最終的なエッチングを確認し、前面をイメージングした後、シリコンプローブのエッチングストリップを慎重に取り外します(画像が必要な場合)。銀色の塗料にアセトンを慎重にダビング/ブラッシングして、銀色の塗料をアセトンで溶かします。ストリップを裏側に慎重に回し、上の手順に従って、再マウント、整列、エッチングを行います。
4. 最終エッチングとイメージングの確認
- ミリングが完了したら、より高い倍率でSEMイメージングを使用して異なるセクションの均一性を確認します。
注:傾斜角度でのイメージングにより、フライス加工深さの変動をより良く評価できます。フライス加工場所間の遷移領域には特に注意が必要です。 - 光学顕微鏡で粉砕した後、サンプルを再度画像化します。
注: 周期的な切削線は屈折効果をもたらし、撮像角度の関数として異なる色を生み出します。色が粉砕されたラインの破壊の明確な徴候であるプローブと一緒に連続していない場合。
5. FIBエッチング用の機能シリコンプローブの取り付け
- 機能性シリコン電極をパッケージからゆっくりと取り外します。鉗子を使用して、ヘッドステージを覆うプラスチック保護タブを慎重に持ち上げます。所定の位置に保持する粘着性の接着剤からタブの片隅を持ち上げ始め、電極全体が取り外されるまで持ち上げ続けます。
- ステレオタキシックフレームへの取り付けに備えて、電極をヘモスタットで慎重にクランプします。覆われたタブを鉗子で押しながら、シリコンシャンクの上の緑色のシャフトの周りに曲がった止血をそっと配置し、止端の湾曲部分をタブに向かって上に向けます。止血。
- ヘッドステージを覆うプラスチック製の保護タブをゆっくりと取り外します。止血で電極を保持しながら、慎重に洗浄のためのステレオタキシックフレームに電極をクリップします。
- 95%エタノール(ペトリ皿あたり約10mL)で3ペトリ皿を充填します。ペトリ皿を、クリーニング用の立体税フレームに取り付けられた電極の下に置きます。マイクロマニピュレータを下向き(100μm/s)にして電極をゆっくりと下げて、シャンクが95%エタノールに沈みます。
注:マイクロマニピュレータを速すぎたり深すぎたりしないように注意してください(電極がペトリ皿に触れてはならない)。 - 電極シャンクを95%エタノールに5分間放置し、マイクロマニピュレータを上方(100μm/s)にして、95%エタノールから電極をゆっくりと上げます。この手順をさらに 2 回繰り返し、合計 3 回のワッシュを実行します。電極を5分間空気乾燥させます。
- ステレオタキシックフレームに電極を取り付けるのと同じ技術を使用して、ステレオタキシックフレームから電極を取り外します。電極のシャフトの周りに止血を慎重に配置します。止血がしっかりと握ったら、立体税フレームから電極を離し、ヘッドステージを覆うプラスチック保護タブを戻し、洗浄された電極を包装に戻します。
6. FIBを用いたエッチング機能シリコンプローブ
- 洗浄された機能シリコン電極をアルミニウムスタンドに取り付けます。鉗子を使用して洗浄された機能シリコン電極を慎重にピックアップし、ヘッドステージから保護タブを取り外します。電極シャンクをアルミニウムスタブの上に置き、エッジに掛かないようにし、小さなCuまたは炭素伝導テープを使用して、ヘッドステージをアルミニウムスタブにしっかりと固定します。
メモ:または、ロープロファイルクリップホルダーを使用して電極を押さえることができます。電極シャンクに触れないように注意してください。 - 上記の手順(セクション2)に従って、電極をユーセントリック高さに配置し、電極がSEMおよびFIBビームの一致点にあることを確認します。シャンクをステージの「X」方向に揃えます。
- 必要なナノアーキテクチャを粉砕するための最適な電流にFIBを設定し、フォーカスとスティグマが適切に修正されていることを確認します。シャンクの視野を覆うために、必要な間隔と長さの行の配列を準備します(500 μm セクション)。エッチングがシャンクを細いセクションに下ろすので、線の長さを調整します。
注:機能電極をエッチングする場合、プロセスを自動化するためにフィデューシャルマークを追加することはできません。したがって、サブセクション間の移動(〜500μm)は手動で行われます。 - 最初のセクションのフライス加工が完了したら、次のセクションに進む前に、ミリングの品質を確認してください。シャンクの次のセクションをエッチングするには、ステップ6.3を繰り返します。前のセクションの切削線を次のセクションで使用するパターンに合わせて、実行間の大きなギャップを防ぎます。
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Representative Results
単一シャンク皮質プローブの表面上のFIBエッチングナノアーキテクチャ
ここで説明する方法を利用して、皮質内プローブを確立されたプロトコル39に続いて特定のナノアーキテクチャでエッチングした。これらの方法で説明するナノアーキテクチャ設計の寸法および形状は、ここで説明するナノアーキテクチャ設計で培養した場合のグリア細胞反応性の低下を示す以前のin vitro結果から実施された。ここで説明する方法は、前述の39のように、ナノスケール平行溝を非機能的な単一シャンクシリコンマイクロ電極プローブの表面にエッチングするために集束ガリウムイオンビーム(FIB)を利用した。ナノスケールの平行溝は、ソフトウェアで書かれた自動スクリプトを使用して、プローブの裏側のシャンクに沿ってエッチングされました。エッチングされたナノアーキテクチャの最終的な寸法は、200 nm幅の平行線で、300 nm間隔を空け、深さは200nmでした(図1)。FIBを使用してナノアーキテクチャをデバイス表面にエッチングすることで、精密な設計を製造デバイスにエッチングすることができます。
エッチングされたナノアーキテクチャを神経炎症に及ぼす皮質内プローブ効果に
この以前に報告されたデータでは、エッチングされたナノアーキテクチャを有する皮内プローブを2~4週間ラットの皮質に移植し(n=4/タイムポイント)、ナノアーキテクチャエッチングを含む滑らかなプローブを移植した対照動物と比較して(n=4/タイムポイント)39。皮質内微小電極の臨床展開を妨げる障害のメカニズムの1つは、脳性腫瘍および血液脳関門を破壊することから誘発される神経炎症反応である。皮質内微小電極移植後に観察される神経炎症反応の完全な説明は、以下のレビュー13、14、22で見つけることができる。皮質内マイクロ電極がニューロンから作用電位を記録する能力は、皮質内微小電極記録部位40からの健康な神経体の距離に依存する。そこで、これまでに報告された研究では、神経密度、グリア細胞活性化および炎症マーカー39の遺伝子発現に対する組織学的マーカーを定量することにより皮質内プローブ移植部位周辺の神経炎症を評価した。その研究のハイライトは、プローブ表面にナノアーキテクチャをエッチングが神経炎症に及ぼした効果を表すために以下に提示される。
エッチングナノアーキテクチャがニューロン密度に及ぼす影響
プローブの表面へのナノアーキテクチャのエッチングがインプラントの周りの神経密度に及ぼす影響を決定するために、ニューロン核を染色し、以前に説明した免疫吸化学法39、41を利用して定量した。着床後2週間でナノアーキテクチャと制御プローブの周りのニューロン密度に有意な差はなかった(図2A)。しかし、インプラント部位から100~150μmの距離でナノアーキテクチャプローブの周囲に、着床後4週間で滑らかなコントロールインプラント(p< 0.05対コントロール)と比較して、かなり多くのニューロンがありました(図2B)。また、時間の経過とともにナノアーキテクチャプローブを取り巻くニューロン密度の増加傾向があり、対照インプラント周辺のニューロン密度の低下傾向とは対照的であることも分かった(図2)。微小電極を取り巻く生存可能なニューロンの高密度と相まって緩和された神経炎症反応を示す直接的な関係があり、マイクロ電極が質の高い記録を提供する能力が向上する結果15、40、42。したがって、神経密度データを解釈する場合、インプラント部位の周囲のニューロンの密度が高い場合は、神経炎症反応が低下し、皮質内微小電極からの記録品質および安定性が潜在的に改善される可能性がある。
エッチングナノアーキテクチャが神経炎症性分子マーカーに及ぼす影響
ヒスロジーは、インプラント部位の周りの細胞を識別するのに十分です。しかし、それは周囲の細胞の表現型を特徴付けるための感受性および特異性を欠いている。そこで、定量的遺伝子発現解析を利用した方法は、神経炎症マーカーの相対遺伝子発現を定量化するために用いられ、ナノアーキテクチャが細胞39の表現型に及ぼす影響を理解するために用いた。いくつかの神経炎症マーカーは、以前に報告された研究で調査された。ここでは、表現型がどのように変化したかについて議論するために、ミクログリア細胞に特異的な2つだけが強調表示されます。分化14のクラスター(CD14)は、細菌を認識し、傷害/移植後の炎症経路を知らせるミクログリアの膜上のパターン認識受容体である43、44、45である。一酸化窒素合成酵素(NOS2)は、炎症マーカー46、47の産生増加に関連するミクログリア/マクロファージで発現される酸化ストレスマーカーである。
以前に報告されたデータでは、2週間または4週間の移植後におけるナノアーキテクチャとコントロールインプラントの間のCD14相対遺伝子発現に有意な差はなかった。特に、ナノアーキテクチャインプラント部位の周囲でCD14相対遺伝子発現の有意な減少(p<0.05)が2〜4週間にわたり、炎症の可能性を示す(図3Aでは*で示される)。同様に、ナノアーキテクチャとコントロールインプラントとの間のNOS2相対遺伝子発現の有意な差は2週間であった。しかし、4週間後の移植後のコントロールインプラントと比較して、ナノアーキテクチャインプラント周辺のNOS2相対遺伝子発現は有意に少なかった(図3Bで#で示される)。さらに、対照インプラントの周囲にNOS2相対遺伝子発現が2~4週間(図3Bで示される)に有意に増加し、ナノアーキテクチャインプラントの周囲に時間の経過とともに変化が見られず、さらにナノアーキテクチャインプラント周辺の炎症の潜在的な減少を示す。このデータを解釈する際には、定量化する遺伝子の機能を理解することが重要です。例えば、炎症性遺伝子の減少は、電極部位の周囲の炎症反応の可能性が低下する可能性を示し、一方、これらのタイプの遺伝子の増加は、炎症の増加の可能性を示唆している。
機能性単一シャンクマイクロ電極表面のFIBエッチングナノアーキテクチャ
以前に報告された研究は、ニューロン密度のわずかな増加とナノアーキテクチャプローブインプラント部位の周りのミクログリア炎症表現型の潜在的な減少を示す有望な結果を有していた。これらの結果を電極機能に変換する研究のために、機能的な単一シャンクシリコンマイクロ電極を非機能単一シャンクシリコンマイクロ電極プローブと同じナノアーキテクチャ設計でエッチングし、同様のFIBエッチングプロトコルを利用した。指定されたナノアーキテクチャをエッチングする方法の唯一の違いは、フィデューシャルマーキングを作成するための余分な基板材料がなかったため、機能電極のプロトコルを自動化できないということです。従って、機能電極は、上記のプロトコルで説明したように、500μmごとにビームを再位置合わせすることによりFIBを用いて手動でエッチングした。最終的なエッチングは、200 nm幅の平行線で、300 nm間隔を空け、深さは200nmでした(図4)。
エッチングナノアーキテクチャが皮質内微小電極に及ぼす影響が電気生理学に及ぼす影響
皮質内マイクロ電極記録の成功は、インプラント部位の周囲のニューロンの近接性、デバイスの完全性および脳8、40、48、49からの単一ユニット活性の信頼性の高い伝達に依存する。電気生理学的記録は、8週間にわたり週2回収集された記録された指標を用いて定量した。この調査で利用されたメトリックは、単一ユニットを記録するチャンネルのパーセンテージ、記録されたユニットの最大振幅、信号対雑音比(SNR)であった。ルイ・ストークス・クリーブランド退役軍人医療センターの制度的動物ケア・利用委員会(IACUC)は、すべての動物の手続きを承認しました。スプレイグ・ドーリーラット(8〜10週齢および重量〜〜225g)を単一シャンクシリコンマイクロ電極で移植し、上記のナノアーキテクチャ(n=1)または滑らかな制御(n=6)を用いた。概念実証パイロット研究のために埋め込まれたナノアーキテクチャマイクロ電極が1つあったため、このデータに対する統計解析は行われず、行われました。それにもかかわらず、単一単位を記録するチャンネルの増加率を示す集合的な電気生理学的結果(図5A)、記録された単位の最大振幅(図5B)、及びナノアーキテクチャマイクロ電極からのSNR(図5C)は、滑らかな制御マイクロ電極と比較して、有望である。これらの結果は、マイクロ電極の表面にナノアーキテクチャをエッチングすることで、電気生理学的記録の品質向上と寿命の増加につながる可能性があることを示しています。これらの予備結果を検証するには、サンプルサイズを大きくしたさらなる評価が必要です。
図1:単一シャンク皮内プローブの表面上のFIBエッチングナノアーキテクチャシャンクの裏側に沿ってFIBエッチングナノアーキテクチャを備えた非機能シングルシャンクシリコンプローブのSEM画像。(A)120倍倍率で示すプローブポストエッチング全体の合成画像、スケールバー=400μm。フィデューシャルマーク(+記号が通る正方形のボックス)は、プローブを取り囲むシリコン基板に沿ってエッチングされる。プローブ先端の倍率SEM画像は、1,056倍の倍率(スケールバー= 40μm)の(B)、(C)は3,500倍の倍率(スケールバー= 10μm)、(D)は10,000倍の倍率、スケールバー=4μmで示されています。この図は参照39から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:エッチングナノアーキテクチャがニューロン密度に及ぼす影響ニューロン生存は、インプラント部位から50μmビンの距離で同じ動物からの背景領域のパーセンテージとして提示される。(A)着床後2週間で滑らかな表面(対照)とナノパターンインプラントとの間に神経細胞生存の有意な差は認められなかった。(B)4週間後の着床時の滑らかな表面(p<0.05)と比較して、100〜150μmの距離でナノパターンインプラントの周りに有意に高いニューロン生存率があった。ニューロンの代表的な画像(緑色に染色)、移植部位を示す黄色の輪郭を有する、「P」とマイクロ電極のエッチング側を示す「P」と、スケールバー=100μm。この図は39から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:エッチングナノアーキテクチャが神経炎症性分子マーカーに及ぼす影響組織は、ナノパターンおよび制御インプラントの両方について移植部位の半径約500μmを採取した。炎症マーカーの相対遺伝子発現は、両方のインプラントタイプ(差異はグラフ上の#で示される;p<0.05)と時間の経過とともに(差異はグラフ上で*で示される;p<0.05)との間で定量的に比較された。(A)CD14の相対遺伝子発現は、ナノパターンインプラントの周囲で2~4週間(*)に有意に減少した。(B)ナノパターンインプラント周辺のNOS2の相対的遺伝子発現は、4週間(#)での対照に比べて有意に少なく、滑らかな対照インプラント(*)の周りに2〜4週間のNOS2の有意な増加があった。この図は参照39から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:機能的単一シャンクマイクロ電極の表面上のFIBエッチングナノアーキテクチャ右上隅の差し込みは、この研究で利用されたマイクロ電極をダイムの横に表示し、電極シャンク(細い黒い線)の大きさを描写する。FIBエッチングナノアーキテクチャを持つマイクロ電極シャンクのSEM画像は、シャンクの裏側に沿って。シャンク全体が600倍倍(スケールバー= 50μm)で上部に表示され、インセットは25,000倍の倍率、スケールバー= 1 μmでナノパターン表面を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:エッチングナノアーキテクチャが皮質内微小電極に及ぼす影響電気生理学的測定基準の評価は、単単位を記録するチャンネルの(A)パーセンテージ、(B)記録された単位の最大振幅、および(C)ナノアーキテクチャでエッチングされたマイクロ電極からの信号対雑音比の有望な予備的増加傾向を、平滑制御電極と比較して発見した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:FIBエッチングナノアーキテクチャを用いた移植機能シングルシャンクマイクロ電極からの電気生理学的記録FIBを使用して製造されたマイクロ電極デバイス上のナノアーキテクチャをエッチングする際の課題の1つは、短絡記録コンタクトのリスクです。x軸は記録時間を秒単位で示し、y軸はニューロン作用電位を記録する電極チャネルを示す。y 軸上の各番号付きラインは異なる電極チャネルを表し、チャネル番号 1 は最も浅く、16 は最も深いチャネルです。赤いボックスは短絡チャネルの輪郭を描きますが、青いボックスは目に見えるニューロン活動を持つチャネルの輪郭を描きます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで概説する製造プロトコルは、焦点を当てたイオンビームリソグラフィーを利用して、非機能的で機能的な単一シャンクシリコンマイクロ電極の表面にナノアーキテクチャを効果的かつ再現的にエッチングします。集束イオンビーム(FIB)リソグラフィは、微細に集束イオンビーム50、51を用いて基板表面の選択的アブレーションを可能にする。FIBは、ナノスケールの解像度と高アスペクト比50、52、53で様々な機能を生成することができる直接書き込み技術です。様々なサイズの特徴を作成するために、イオンビーム電流の大きさは、3nm〜2μm50、51の範囲内でイオンビームスポットサイズを変更するように最適化することができる。FIBを使用して表面に特徴をエッチングする一般的な利点は、1)シリコン、金属、およびポリマー53、54、55、56、2)FIBを含む多種多様な材料に使用することができ、非平面上面でFIBを行うことができ、3)FIBは、個々のデバイス57上での後処理に使用することができる。
ここでは、FIBをSEM顕微鏡とソフトウェアと組み合わせて使用し、特定の機能を非機能的な単一シャンクプローブにエッチングするための特殊な自動化スクリプトを作成しました。スクリプトには、必要な正確な間隔(200 nm幅の並列溝、300 nmの間隔、深さ20nm)をエッチングするために必要なパラメータ(2.5 nAイオンビーム電流と30kV電圧)が含まれていました。電極の寸法がFIBの視野を超えたため、パターニングを複数のステージ位置で行いました。プロセスを自動化するために、フィデューシャルマークは、プローブを所定の位置に保持するシリコンシートの側面にエッチングされ、ソフトウェアがプローブシャンク上のパターンラインを正確に見つけられるようにしました。ステージモーションは、イオンビーム視野に対してパターン領域の位置に大きな(〜5μm)不確実性を生み出したため、フィデューシャルが必要でした。FIBがプローブシャンク上のビームを直接スキャンすることなくパターン領域を特定することを可能にするシリコンシート上のフィデューシャルの配置は、プローブシャンクを汚染または損傷する可能性があります。1シャンクの自動エッチングプロセス全体が完了するまでに約12時間かかり、パターニング開始後にオペレータの介入は必要ありません。総称して、FIBを使用してシリコンプローブシャンクに特徴をエッチングする利点は、ナノメートルサイズの特徴を作り、エッチングプロセスを自動化し、製造されたプローブにエッチングする能力でした。FIBには多大な利点がありますが、この製造方法を使用する欠点の1つは、最終的にナノアーキテクチャを持つデバイスの大量生産の可能性を表面58に制限する遅いスループットレートです。あるいは、特徴の大きさや目的の幾何学を作成するために利用される他の製造方法は、おそらくより速い速度および大量生産で、電子ビームリソグラフィーおよびナノインプリントリソグラフィー59、60、61、62、63、64、65を含む。しかし、これらの方法では、ナノアーキテクチャの特徴を製造デバイスにエッチングすることはできません。従来、これらの方法は、シリコンまたはポリマーのシート上の製造プロセス中に利用され、最終的な欺瞞を作製するために下流の処理工程で使用することができる。
機能電極は、電極シャンクの周囲にフィデューシャルマークを含める周囲の材料がないため、自動化されたプロセスを受けることができませんでした。したがって、機能電極を手動で整列させ、シャンクに沿って500μmのセクションでエッチングし、自動実行と同じイオン電流と電圧を使用して同じ特徴サイズを確保しました。ビームは、各500μm間隔を完了した後に手動で再配置し、次のセクションをエッチングするように設定する必要がありました。500 μm ごとにパターンを手動で再配置するプロセスは、意図したジオメトリと一致しないナノ構造または構造の損傷につながる可能性があります。これは、手動アライメント66に必要なイオンビームの露光時間が長いためである。これは、手動エッチングで遭遇した困難の一つでした。この合併症により、2つの記録接触が短絡し、神経作用電位を記録することができなかった(図6)。図6は、ナノアーキテクチャ電極を移植した動物からの電気生理学的ライブ記録セグメントを示す。青いボックスは、2つのデッドチャンネルを示す赤いボックスと比較して、強力なアクションポテンシャルを記録するチャンネルの概要を示します。したがって、製造後の電極に手動FIBエッチングを使用する課題の1つは、ビームが接触を短絡し、記録を妨げる可能性が高いということです。この課題は、単一シャンクシリコン電極の前面側をエッチングしようとする際に強化され、記録接触と痕跡が電極のシャンク全体に沿って行われる。記録の接触および痕跡の周りにシリコンをエッチングすることは可能であるが、電極の記録機能の損傷および低下を避けるために余分な注意が払われる。
前述したように、FIBは、表面に多数の特徴形状をエッチングするために様々な材料に利用することができます。ただし、さまざまな材料にラインなどのエッチング ジオメトリに対するパラメータは、予測が複雑であることに注意してください。特に線のパターンの場合、線の幅と深さは、加速電圧、ビーム電流、ドウェル時間、ピクセル間隔、絞りと材料タイプの寿命などの多くのパラメータに強く依存します。最適化の結果として生じるもう 1 つのパラメータは、各ラインをミルする合計時間です。より狭く、より深いラインは、より小さなビーム電流を使用して達成することができます。ただし、プローブシャンク全体のパターン時間は複数日に及びますが、これは実用的ではありません。したがって、ここで提示されるプロトコルを最適化することは可能であるが、未知の材料のパラメータを記述することは極めて困難であろう。このプロトコルで説明するシリコンプローブのパラメータのトラブルシューティングでは、シリコンの多数のテストカットが行われ、変化する条件がラインの幅と深さにどのような影響を与えたかを評価しました。評価条件が特定の特徴サイズと目的の形状(深さ200nmの200 nm幅のライン)をエッチングできるようになるとすぐに、これらのパラメータを使用してソフトウェアスクリプトを書き込んだ。このスクリプトは、各行の間隔を中央から中央まで制御するために使用されました。数百ナノメートルの特徴サイズを必要とするシリコン基板/デバイスを利用した将来の研究では、このプロトコルに記載されたパラメータを、所望の特徴サイズを作成するために必要な条件をトラブルシューティングするための出発点として使用することができます。エッチング条件のさらなる最適化とトラブルシューティングは、金属およびポリマー基板/デバイスに必要とされます。全体的に、材料表面にナノアーキテクチャをエッチングするためのFIBを利用することで、特徴形状、多数の互換性のある材料の使用、および製造されたデバイスを含むいくつかの表面タイプの十分な制御と柔軟性を可能にします。本明細書で提示された代表的な結果は、FIBを利用して皮質内微小電極の表面にナノアーキテクチャをエッチングする我々の研究で観察される潜在的な利点を実証した:1)神経密度の増加および2)ナノアーキテクチャを有する移植装置の周囲の神経炎症マーカーの減少、ならびに3)時間の経過に伴う電気生理学的記録の改善された品質を示す予備的知見。同様に、材料の表面に記載されたプロトコルエッチングナノアーキテクチャ機能の雇用と最適化は、多数の医療機器の機能性を向上させるために利用することができる。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、米国(米国)退役軍人省リハビリテーション研究開発サービス賞によって支持されました: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) と #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej).この内容は、米国退役軍人省や米国政府の見解を表すものではありません。著者らは、この研究で使用されるスクリプトの開発に役立ったスタッフの支援と計装の使用について、FEI社(現在はサーモフィッシャー・サイエンティフィックの一部)に感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
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