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Bioengineering

Litografía de haz de iones enfocado a etch nano-arquitecturas en microelectrodos

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60004
Automatic Translation
1, 2,4, 5, 6, 2,3,4
1Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, 2Veteran Affairs Ann Arbor Healthcare System, 3Department of Neurology, School of Medicine, University of Michigan, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 5Michigan Center for Materials Characterization, University of Michigan, 6Carl Zeiss SMT, Inc.

Summary

Hemos demostrado que el grabado de nanoarquitectura en dispositivos de microelectrodos intracorticales puede reducir la respuesta inflamatoria y tiene el potencial de mejorar las grabaciones electrofisiológicas. Los métodos descritos aquí describen un enfoque de nanoarquitecturas de etch en la superficie de microelectrodos intracorticales de silicio de vástago único no funcionales y funcionales.

Abstract

Con los avances en electrónica y tecnología de fabricación, los microelectrodos intracorticales han experimentado mejoras sustanciales que permiten la producción de sofisticados microelectrodos con mayor resolución y capacidades ampliadas. El progreso en la tecnología de fabricación ha apoyado el desarrollo de electrodos biomiméticos, que tienen como objetivo integrarse perfectamente en el parénquima cerebral, reducir la respuesta neuroinflamatoria observada después de la inserción del electrodo y mejorar la calidad y longevidad de las grabaciones electrofisiológicas. Aquí describimos un protocolo para emplear un enfoque biomimético recientemente clasificado como nano-arquitectura. El uso de litografía de haz iónico focalizado (FIB) se utilizó en este protocolo para grabar características de nanoarquitectura específicas en la superficie de microelectrodos intracorticales de vástago único no funcionales y funcionales. La entrada en nanoarquitecturas en la superficie del electrodo indicó posibles mejoras de biocompatibilidad y funcionalidad del dispositivo implantado. Uno de los beneficios de utilizar FIB es la capacidad de grabar en dispositivos fabricados, a diferencia de durante la fabricación del dispositivo, facilitando posibilidades ilimitadas para modificar numerosos dispositivos médicos post-fabricación. El protocolo presentado en este documento se puede optimizar para varios tipos de materiales, características de nanoarquitectura y tipos de dispositivos. Aumentar la superficie de los dispositivos médicos implantados puede mejorar el rendimiento del dispositivo y la integración en el tejido.

Introduction

Los microelectrodos intracorticales (IME) son electrodos invasivos que proporcionan un medio de interconexión directa entre los dispositivos externos y las poblaciones neuronales dentro de la corteza cerebral1,2. Esta tecnología es una herramienta invaluable para registrar potenciales de acción neuronal para mejorar la capacidad de los científicos para explorar la función neuronal, avanzar en la comprensión de las enfermedades neurológicas y desarrollar terapias potenciales. El microelectrodo intracortical, utilizado como parte de los sistemas de interfaz de máquina cerebral (IMC), permite registrar potenciales de acción de un individuo o pequeños grupos de neuronas para detectar intenciones motoras que se pueden utilizar para producir salidas funcionales3. De hecho, los sistemas de IMC se han utilizado con éxito con fines protésicos y terapéuticos, como el control del ritmo sensorimotor adquirido para operar un cursor informático en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA)4 y lesiones de la médula espinal5 y restaurar el movimiento en personas que sufren de tetraplejia crónica6.

Desafortunadamente, los IME a menudo no graban consistentemente con el tiempo debido a varios modos de falla que incluyen factores mecánicos, biológicos y materiales7,8. La respuesta neuroinflamatoria que se produce después de la implantación del electrodo se cree que es un reto considerable que contribuye a la falla del electrodo9,10,11,12,13,14. La respuesta neuroinflamatoria se inicia durante la inserción inicial del IME que corta la barrera hematoencefálica, daña el parénquima cerebral local y interrumpe las redes gliales y neuronales15,16. Esta respuesta aguda se caracteriza por la activación de células gliales (microglia/macrofagos y astrocitos), que liberan moléculas proinflamatorias y neurotóxicas alrededor del sitio del implante17,18,19,20. La activación crónica de las células gliales da lugar a una reacción del cuerpo extraño caracterizada por la formación de una cicatriz glial aislando el electrodo del tejido cerebral sano7,9,12,13,17,21,22. En última instancia, dificultando la capacidad del electrodo para registrar potenciales de acción neuronal, debido a la barrera física entre el electrodo y las neuronas y la degeneración y muerte de las neuronas23,24,25.

El fracaso temprano de los microelectrodos intracorticales ha llevado a cabo una considerable investigación en el desarrollo de electrodos de próxima generación, con énfasis en las estrategias biomiméticas26,27,28,29,30. De particular interés para el protocolo descrito aquí, es el uso de la nanoarquitectura como una clase de alteraciones biomiméticas de la superficie paraiME 31. Se ha establecido que las superficies que imitan la arquitectura del entorno natural in vivo tienen una respuesta biocompatible mejorada32,33,34,35,36. Por lo tanto, la hipótesis que obliga a este protocolo es que la discontinuidad entre la arquitectura áspera del tejido cerebral y la arquitectura lisa de los microelectrodos intracorticales puede contribuir a la respuesta neuroinflamatoria y crónica del cuerpo extraño a las IME implantadas (para una revisión completa se refieren a Kim et al.31). Hemos demostrado anteriormente que la utilización de características de nanoarquitectura similares a la arquitectura de matriz extracelular del cerebro reduce los marcadores inflamatorios de astrocitos de células cultivadas en sustratos nano-arquitecturados, en comparación con las superficies de control planas en modelos in vitro y ex vivo de neuroinflamación37,38. Además, hemos demostrado la aplicación de litografía de haz iónico focalizado (FIB) a nanoarquitecturas de grabado directamente en sondas de silicio dio lugar a un aumento significativo de la viabilidad neuronal y una menor expresión de genes proinflamatorios de animales implantados con las sondas de nanoarquitectura en comparación con el grupo de control suave26. Por lo tanto, el propósito del protocolo presentado aquí es describir el uso de la litografía FIB para grabar nanoarquitecturas en dispositivos de microelectrodos intracorticales fabricados. Este protocolo fue diseñado para grabar características de tamaño nano-arquitectura en superficies de silicio de vástagos de microelectrodos intracorticales utilizando procesos automatizados y manuales. Estos métodos son sencillos, reproducibles y, sin duda, se pueden optimizar para diversos materiales de dispositivos y tamaños de características deseados.

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Protocol

NOTA: Realice los siguientes pasos mientras usa el equipo de protección personal adecuado, como una capa de laboratorio y guantes.

1. Montaje de la sonda de silicio no funcional para la litografía del haz de iones focalizado (FIB)

NOTA: Para el procedimiento completo que describe la fabricación de la oblea SOI con las 1.000 sondas, consulte Ereifej et al.39.

  1. Aísle una tira de 2-3 sondas de silicio del silicio en la oblea aislante (SOI) que contiene 1.000 sondas. No haga tiras que contengan más de tres sondas de silicio. Esto puede aumentar las posibilidades de un montaje suelto y puede causar una desalineación, lo que puede provocar que la FIB se conste incorrectamente.
    NOTA: Las tiras/sondas que no estén firmemente sentadas en el talón de aluminio pueden causar dos complicaciones: 1) cuando el escenario se mueve para trabajar en la siguiente sección, habrá vibraciones y el fresado no será preciso hasta que la sonda se asiente y 2) puede causar una alta variación y estar fuera del plano de enfoque.
    1. Mientras usa guantes, utilice fórceps finos para poner presión alrededor de las sondas para romper una pequeña sección que contiene de dos a tres sondas.
  2. Limpie cuidadosamente la sonda de silicio de todo el polvo y los residuos antes del grabado de la FIB. Preparar una placa de poliestireno de 6 pocillos pipeteando 3 ml/pozo de etanol al 95% en tres pozos.
    1. Recoja cuidadosamente la tira cortada de las sondas de silicio usando punta fina o fórceps de vacío y colóquela en el colador de la célula. Coloque sólo una tira de sondas de silicio por colador para evitar que se rompan las sondas. Coloque el colador que contiene la tira de sondas de silicio en el primer pozo que contiene 95% de etanol para la limpieza. Mantenga el colador en el primer pozo durante 5 minutos.
    2. Mueva el colador que contiene las sondas de silicio del primer pozo y colóquelo en el segundo pozo que contenga 95% de etanol durante otros 5 minutos. Repetir una vez más en el tercer pozo.
    3. Coloque el colador que contiene las sondas de silicio limpias en una placa de politetrafluoroetileno para secarse al aire. Realice este paso en una campana estéril para evitar la contaminación por el polvo.
  3. Coloque la tira seca por aire de las sondas de silicio en un contenedor sellado para su transporte al SEM-FIB. Envuelva el colador que contiene las muestras secas al aire con una envoltura de plástico o papel de aluminio para su transporte y/o almacenamiento para mantener la limpieza.
  4. Utilice fórceps de punta fina o fórceps de vacío para recoger cuidadosamente la tira limpia de sondas de silicio y colocarlas en un talón de aluminio limpio (utilizado para imágenes/grabados SEM-FIB) para prepararse para el montaje.
  5. Utilice un palillo de dientes (u otro instrumento de punta fina como un alambre eléctrico delgado), para colocar una pequeña gota (-10 l) de pintura plateada en el borde del sustrato de silicio que rodea las sondas. Asegure la tira extendiendo la pintura plateada alrededor de los lados del sustrato de silicio que rodea la sonda. Deje que la pintura plateada se seque completamente antes de colocar el talón de aluminio en el SEM-FIB.
    NOTA: Tenga cuidado de no obtener pintura plateada en el vástago del electrodo porque esa es la parte que se grabará. Si la tira de sondas no está anclada de forma segura al talón de aluminio, la tira puede moverse durante el procesamiento o tener un plano focal diferente, lo que resulta en un fresado incorrecto por parte de la FIB. Varias tiras de sondas de silicio se pueden montar en el mismo talón de aluminio, asegurándose de que hay un amplio espacio entre las tiras para permitir la eliminación del talón después del grabado. Esto permitirá un grabado más eficiente de múltiples sondas utilizando la función automatizada que se describe a continuación.

2. Alineación de la FIB con las sondas de silicio

  1. Haga clic en el botón de ventilación en la pestaña de control de haz para ventilar la cámara. Pulse Mayús+F3 para realizar la etapa de inicio. Confirme la selección seleccionando el botón Etapa de inicio en la ventana emergente.
    NOTA: Ejecutar la operación de la etapa doméstica es un paso preventivo para garantizar que el software lea correctamente el eje del escenario y que el microscopio esté en buenas condiciones.
  2. Una vez completada la etapa de inicio, mueva el escenario a las coordenadas de X a 70 mm, Y a 70 mm, Z a 0 mm, T a 0o, R a 0o. Una vez ventilada la cámara, ponte guantes de nitrilo limpios y abre la puerta de la cámara.
    NOTA: Dependiendo de la aplicación del usuario anterior, puede ser necesario cambiar el adaptador de etapa. Los adaptadores de etapa estándar (por ejemplo, estilo FEI) se pueden quitar desenroscando el perno central en sentido antihorario e instalados atornillando en el sentido de las agujas del reloj en la placa de rotación de la etapa.
  3. Inserte el talón de aluminio que sujeta las sondas en la parte superior del adaptador de escenario. Fije el talón de aluminio apretando el tornillo de ajuste en el lado del adaptador de escenario. Utilice la llave hexagonal de 1,5 mm para esta tarea.
  4. Ajuste la altura del adaptador de escenario girando el adaptador en el sentido de las agujas del reloj para bajarlo o en sentido contrario a las agujas del reloj para elevarlo. Fije el adaptador de etapa a la placa de rotación girando la tuerca del cono de bloqueo en el sentido de las agujas del reloj hasta que la tuerca esté asegurada contra la placa de rotación del escenario. Sujete el adaptador de escenario con la otra mano para evitar la rotación del adaptador y las muestras mientras aprieta la tuerca del cono de bloqueo.
    NOTA: Utilice el medidor de altura proporcionado para determinar la altura adecuada. La parte superior del talón de aluminio debe tener la misma altura que la línea máxima que se muestra en el medidor de altura. Sobre apretar la tuerca del cono puede causar daños en el escenario y el adaptador. Utilice sólo la fuerza suficiente para asegurar las muestras.
  5. Adquiera una imagen de cámara de navegación. Gire con cuidado el brazo de la cámara de navegación abierto hasta que se detenga. La etapa del microscopio se moverá automáticamente a una posición debajo de la cámara. Vea la imagen en vivo que se muestra en el cuadrante 3 de la interfaz de usuario (UI) del microscopio.
    1. Una vez que el nivel de brillo se ajusta automáticamente a un nivel adecuado, adquiera la imagen presionando el botón hacia abajo en el soporte de la cámara. Asegúrese de esperar a que finalice toda la adquisición de la imagen, que se indica mediante un símbolo de pausa que aparece en el cuadrante 3 y la iluminación de la cámara apagada. Esto toma aproximadamente 10 s. Gire el brazo de la cámara de nuevo a la posición cerrada. La etapa volverá a la posición original.
  6. Cierre con cuidado la puerta de la cámara del microscopio. Vea la imagen de la cámara CCD en el cuadrante 4 mientras cierra la puerta. Asegúrese de que las muestras y el escenario estén a una distancia segura de cualquier componente crítico de la cámara del microscopio.
  7. Seleccione la flecha hacia abajo junto al botón Bomba en la pestaña de control de haz. Asegúrese de que la puerta esté sellada empujando suavemente la cara de la puerta mientras la bomba está en marcha. Espere aproximadamente 8 minutos para el tiempo de bombeo y el ciclo de limpieza de plasma para que la cámara del microscopio se complete.
    NOTA: Un sello de vacío se puede confirmar tirando suavemente de la puerta de la cámara, que debe permanecer cerrada si el sistema está bajo vacío.
  8. Una vez que el icono en la esquina inferior derecha de la interfaz de usuario se vuelve verde, presione el botón De activación en la pestaña de control de haz que enciende los haces de electrones e iones. Seleccione el cuadrante 1 y establezca la señal de haz en haz de electrones (si no se ha establecido ya), establezca el cuadrante 2 en el haz iónico (si aún no se ha establecido).
    1. Ajuste la tensión SEM a 5 kV, ajuste la corriente del haz SEM a 0,20 nA, establezca el detector SEM en ETD, ajuste el modo de detector a Electron secundario. Ajuste la tensión FIB a 30 kV, ajuste la corriente del haz FIB a 24 pA, ajuste el detector FIB al detector ICE, ajuste el modo de detector al electrón secundario.
  9. Haga doble clic en la sonda de silicio en la imagen de la cámara de navegación, cuadrante 3 para mover el escenario a la ubicación aproximada de la sonda. Haga clic en el cuadrante 1 para seleccionarlo como el cuadrante activo y pulse el botón de pausa para iniciar el escaneo SEM. Establezca el tiempo de permanencia del escaneado en 300 ns y desactive el entrelazadode escaneado, la integraciónde líneas y el promedio de fotogramas. Establezca la rotación de escaneado en 0 en la pestaña de control de viga y haga clic con el botón derecho en el ajustador 2d de desplazamiento de viga y seleccione cero.
  10. Ajuste el aumento al valor mínimo girando la perilla de ampliación en sentido antihorario en el panel MUI. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen con los mandos del panel MUI o en el icono de la barra de herramientas Brillo de contraste automático.
  11. Mueva el escenario haciendo doble clic izquierdo en el ratón sobre una entidad para centrarla, o presionando hacia abajo la rueda del ratón y activando el modo de ratón joystick. Mueva la sonda de silicio deseada para ser modelada en el centro de la imagen SEM.
  12. Localice una arista u otras características, como una partícula de polvo o un rasguño. Aumente la ampliación a 2.000x girando la perilla de ampliación en el sentido de las agujas del reloj. Ajuste el enfoque del SEM girando las perillas de enfoque gruesas y finas de la MUI hasta que la imagen esté enfocada. Una vez que la imagen esté enfocada, seleccione el botón Vincular muestra Z a distancia de trabajo en la barra de herramientas.
  13. Confirme que la operación se completó examinando la coordenada del eje Z en la pestaña de navegación. El valor debe ser de aproximadamente 11 mm. Escriba en 4,0 mm en la posición del eje Z y presione el botón Ir a con el ratón o presione la tecla Intro en el teclado y el escenario se moverá a una distancia de trabajo de 4 mm.
  14. Mueva la etapa en X e Y para localizar el hombro de la sonda de silicio. Colóquelo lo más cerca posible del centro del SEM. Cambie la inclinación del escenario a 52o escribiendo "52" en la coordenada T y pulsando enter. Observe si el hombro de la sonda parece moverse hacia arriba o hacia abajo en la imagen. Utilice el control deslizante Etapa Z para devolver el hombro de la sonda al centro de la imagen SEM. Sólo ajuste la posición Z, no mueva los ejes X, Y, T o R.
  15. Ejecute el comando integrado "xT Align Feature" ubicado en el menú desplegable del escenario. Utilice el ratón para hacer clic en dos puntos paralelos al borde de la sonda. Asegúrese de que el botón de opción horizontal esté seleccionado en la ventana emergente y haga clic en Finalizar. La etapa girará para alinear la sonda con el eje X de la etapa. Ajuste el escenario en X,Y usando el ratón para poner el hombro inferior de la sonda en el centro de la imagen SEM de nuevo.
    NOTA: El primer punto debe ser hacia el agarre de la sonda y el segundo punto debe ser hacia el punto de la sonda.
  16. Seleccione la BOLA en el cuadrante 2 y asegúrese de que la corriente de la viga sigue siendo 24 pA. Establezca el aumento en 5.000x y el tiempo de permanencia en 100 ns. Escriba Ctrl-F en el teclado para establecer el foco FIB en 13,0 mm. En la pestaña de control de viga, haga clic con el botón derecho en el ajustador 2d del estigma y seleccione cero y, también, haga clic con el botón derecho en el Ajustador 2d de Beam Shift y seleccione cero. Establezca la rotación de escaneado en 0o y pulse el botón de brillo de contraste automático en la barra de herramientas.
  17. Busque una imagen del hombro de la sonda en el cuadrante 2. Utilice la herramienta de instantáneas para adquirir una imagen con la FIB. Confirme que el hombro de la sonda está en el centro de la imagen FIB, si no, haga doble clic en el hombro de la sonda para moverlo al centro. Mueva el escenario hacia la izquierda presionando la tecla de flecha izquierda en el teclado aproximadamente 10-15 veces. Tome otra instantánea y observe si el lado de la sonda todavía está en el centro de la BOLA.
    NOTA: Si no es así, la rotación de la etapa debe ajustarse ligeramente. Si la sonda está por encima del centro de la imagen, el escenario debe girarse en la dirección negativa. Si la sonda está por debajo del centro, el escenario debe girarse en el sentido de las agujas del reloj. Introduzca una rotación compucéntrica relativa de 0,01 a 0,2 grados, dependiendo de la forma en que sea necesario para alinear la sonda.
  18. Repita los pasos 2.16 a 2.17 tantas veces como sea necesario hasta que el borde del hombro de la sonda esté perfectamente alineado con el eje X del escenario, (el borde permanece en el centro de la BOLA mientras se mueve a la izquierda).
  19. Con la FIB, mueva el escenario de nuevo al hombro inferior de la sonda. Guarde la posición del escenario en la lista de posiciones haciendo clic en el botón Agregar. Cambie la corriente de la viga FIB a 2.5 nA y asegúrese de que la ampliación de la BOLA es todavía 5000x. Ejecute la función de contraste de brillo automático y ajuste el tiempo de permanencia de la BOLA a 100 ns.
  20. Pulse el botón de pausa para iniciar el escaneo. Ajuste el enfoque y el astigmatismo de la FIB, de la forma más rápida y precisa posible, utilizando las perillas de enfoque grueso y fino, y las perillas del estigma X e Y en el panel MUI. Pulse el botón de pausa para detener el escaneo de la FIB.

3. Escribir un proceso automatizado para el grabado

  1. Inicie el software localizándolo en el menú de inicio de Windows (es decir, Inicio, Programas, Empresa FEI, Aplicaciones, Nanobuilder). Coloque la ventana de software en el monitor lateral para que la interfaz de usuario no esté cubierta. Abra el archivo para el patrón de las sondas de silicio haciendo clic en el archivo y, a continuación, abra . Dirija el navegador de Windows a la ubicación del script de software(Archivo complementario 1 - el nombre del archivo es "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
  2. En el software, seleccione el menú desplegable del microscopio y seleccione Establecer origen de etapa. En el software, seleccione el menú desplegable del microscopio y, a continuación, seleccione Calibrar detectores.
  3. En la interfaz de usuario del microscopio, haga clic en Quad 1 una vez con el ratón para seleccionar Quad 1. Ignore las otras instrucciones que se muestran en la ventana emergente, no son necesarias para este proyecto. Haga clic en Aceptar para iniciar la calibración. El proceso tomará alrededor de 5 minutos. Asegúrese de que los detectores ETD y ICE se calibran. Está bien si cualquier otro detector tiene fallas de calibración.
  4. En el software, seleccione el menú desplegable del microscopio y elija Ejecutar para iniciar la secuencia de patrones. Cuando el patrón esté completo, cierre el software.
    NOTA: El software se hará cargo de los quads 3 y 4 para las funciones de patrón y alineación. El script tardará aproximadamente 12 h en ejecutarse. Mientras se ejecuta el script, no cambie ningún parámetro en el microscopio.
  5. Pulse "Vent" en la pestaña de control del haz de la interfaz de usuario del microscopio para apagar los haces del microscopio e iniciar el ciclo de ventilación. Mientras la cámara se está ventilando, mueva el escenario para coordinar X a 70 mm, Y a 70 mm, Z a 0 mm, T a 0o, R a 0o. Una vez ventilada la cámara, ponte guantes de nitrilo limpios y abre la puerta de la cámara.
  6. Afloje el tornillo de fijación del adaptador de talón con la llave hexagonal de 1,5 mm. Retire el talón de aluminio que contiene la sonda estampada de la cámara. Cierre con cuidado la puerta de la cámara del microscopio. Vea la imagen de la cámara CCD en el cuadrante 4 mientras cierra la puerta. Asegúrese de que el adaptador de etapa esté a una distancia segura de cualquier componente crítico de la cámara del microscopio.
  7. Seleccione la flecha hacia abajo junto al botón Bomba en la pestaña de control de haz. Asegúrese de que la puerta esté sellada empujando suavemente la cara de la puerta mientras la bomba está en marcha.
    NOTA: Un sello de vacío se puede confirmar tirando suavemente de la puerta de la cámara, que debe permanecer cerrada si el sistema está bajo vacío. El tiempo de bombeo será de aproximadamente 5 min. Solo se puede grabar un lado de la sonda durante una sola ejecución.
  8. Si la parte delantera y trasera de la sonda requiere aguafuerte, retire cuidadosamente la tira grabada de sondas de silicio después de comprobar el grabado final y la imagen del lado frontal (si se necesitan imágenes). Disolver la pintura plateada con acetona, delicadamente dabbing / cepillado de la acetona en la pintura de plata. Gire con cuidado la tira hacia atrás, vuelva a montarla, alinee y etch siguiendo los pasos descritos anteriormente.

4. Comprobación del etch final y las imágenes

  1. Una vez completado el fresado, verifique la uniformidad de las diferentes secciones utilizando imágenes SEM con un aumento más alto.
    NOTA: La imagen en el ángulo inclinado permite una mejor evaluación de la variación en la profundidad de fresado. Se debe prestar especial atención a las regiones de transición entre las ubicaciones de fresado.
  2. Vuelva a tomar una imagen de las muestras después de fresarlas con un microscopio óptico.
    NOTA: Las líneas fresadas periódicas dan como resultado un efecto de refracción que da lugar a diferentes colores en función del ángulo de imagen. Si el color no es continuo junto con la sonda que es una clara indicación de la interrupción en las líneas fresadas.

5. Montaje de una sonda de silicio funcional para el grabado FIB

  1. Retire suavemente el electrodo de silicio funcional de su embalaje. Utilice fórceps para levantar cuidadosamente la pestaña protectora de plástico que cubre la etapa de la cabeza. Comience a levantar una esquina de la pestaña hacia arriba del pegamento pegajoso que lo mantiene en su lugar y siga levantando hasta que se retire todo el electrodo.
  2. Sujete cuidadosamente el electrodo con hemostats para prepararse para el montaje en el marco estereotaxico. Mientras sostiene la pestaña cubierta con los fórceps, coloque suavemente hemostats curvos alrededor del eje verde por encima del vástago de silicio, con la parte curva da la cara de los hemostats hacia arriba hacia la pestaña. los hemostats.
  3. Retire suavemente la pestaña protectora de plástico que cubre la etapa de la cabeza. Mientras sostiene el electrodo con los hemostats, sujete cuidadosamente el electrodo en el marco estereotaxico para su limpieza.
  4. Llenar 3 platos de Petri con 95% de etanol (10 ml por plato de petri). Coloque la placa Petri debajo del electrodo que se monta en el marco estereotaxico para su limpieza. Baje lentamente el electrodo girando el micromanipulador hacia abajo (100 m/s) para que el vástago se sumerde en el etanol del 95%.
    NOTA: Tenga cuidado de no girar el micromanipulador demasiado rápido o demasiado profundo, esto puede hacer que el electrodo se rompa (es decir, el electrodo no debe tocar la placa Petri).
  5. Deje el mango del electrodo en el etanol del 95% durante 5 minutos, y luego levante lentamente el electrodo del etanol del 95% girando el micromanipulador hacia arriba (100 m/s). Repita este paso dos veces más, para un total de tres lavados. Deje que el electrodo se seque al aire durante cinco minutos.
  6. Utilice la misma técnica para montar el electrodo en el marco estereotaxico, para eliminar el electrodo del marco estereotaxico. Coloque cuidadosamente los hemostats alrededor del eje del electrodo. Una vez que los hemostats estén apretados, suelte el electrodo del marco estereotaxico, devuelva la pestaña protectora de plástico que cubre la etapa de la cabeza y vuelva a colocar el electrodo limpio en su embalaje.

6. Sonda de silicio funcional de grabado con FIB

  1. Monte el electrodo de silicio funcional limpiado en un soporte de aluminio. Recoja cuidadosamente el electrodo de silicio funcional limpiado usando fórceps y retire la pestaña protectora del escenario. Coloque el vástago del electrodo en el talón de aluminio para que no cuelgue sobre ningún borde, luego usando una pequeña pieza de Cu o cinta conductora de carbono, fija el escenario firmemente al talón de aluminio.
    NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un soporte de clip de bajo perfil para mantener el electrodo hacia abajo. Tenga cuidado de no tocar el vástago del electrodo.
  2. Siguiendo los pasos descritos anteriormente (Sección 2), coloque el electrodo a la altura eucéntrica y asegúrese de que el electrodo está en el punto de coincidencia de los haces SEM y FIB. Alinee el vástago con la dirección "X" del escenario.
  3. Fije la FIB a la corriente óptima para fresar la nanoarquitectura requerida y asegúrese de que el enfoque y la estigmas se corrijan correctamente. Prepare una matriz de líneas con el espaciado y la longitud deseados para cubrir el campo de visión del vástago (secciones de 500 m). Ajuste las longitudes de línea a medida que el grabado baja el vástago hasta las secciones más delgadas.
    NOTA: Al grabar el electrodo funcional, no es posible añadir marcas fiduciales para automatizar el proceso. Por lo tanto, el movimiento entre las subsecciones (500 m) se realiza manualmente.
  4. Una vez completado el fresado de la primera sección, asegúrese de comprobar la calidad del fresado antes de pasar a la siguiente sección. Repita el paso 6.3 para grabar la siguiente sección del vástago. Alinee las líneas fresadas de la sección anterior con los patrones utilizados para la siguiente sección para evitar grandes separaciones entre corridas.

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Representative Results

FIB Grabado Nano-arquitectura en las superficies de las sondas intracorticales de un solo vástago
Utilizando los métodos descritos aquí, las sondas intracorticales fueron grabadas con nanoarquitecturas específicas siguiendo los protocolos establecidos39. Las dimensiones y la forma del diseño de nanoarquitectura descrito en estos métodos se implementaron a partir de resultados in vitro anteriores que representan una disminución en la reactividad de las células gliales cuando se cultiva con el diseño de nanoarquitectura descrito aquí37,38. Los métodos descritos aquí utilizaron un haz de iones de galio enfocado (FIB) para grabar ranuras paralelas a nanoescala en la superficie de las sondas de microelectrodos de silicio de vástago único no funcionales, como se describió anteriormente39. Las ranuras paralelas a nanoescala se grabaron a lo largo del vástago de la parte posterior de la sonda utilizando un script automatizado escrito en el software. Las dimensiones finales de la nanoarquitectura grabada eran líneas paralelas de 200 nm de ancho, separadas por 300 nm y con una profundidad de 200 nm(Figura 1). El uso de FIB para grabar nanoarquitecturas en una superficie de dispositivo permite el grabado de diseños precisos en dispositivos fabricados.

Nano-arquitectura grabada en sondas intracorticales Efecto en la neuroinflamación
En estos datos notificados anteriormente, las sondas intracorticales con nanoarquitecturas grabadas se implantaron en la corteza de ratas durante dos o cuatro semanas (n-4 por punto de tiempo) y en comparación con los animales de control implantados con sondas lisas que no contenían aguafuertes de nanoarquitectura (n-4 por punto de tiempo)39. Uno de los mecanismos de fallo que impiden el despliegue clínico de microelectrodos intracorticales es la respuesta neuroinflamatoria inducida por alterar el parénquima cerebral y la barrera hematoencefálica9,10,11,12,15. Una descripción completa de la respuesta neuroinflamatoria observada después de la implantación de microelectrodos intracorticales se puede encontrar en los siguientes comentarios13,14,22. La capacidad de los microelectrodos intracorticales para registrar los potenciales de acción de las neuronas depende de la distancia de los cuerpos neuronales sanos del sitio de registro de microelectrodos intracorticales40. Por lo tanto, el estudio previamente reportado evaluó la neuroinflamación alrededor del sitio de implantación de la sonda intracortical mediante la cuantificación de marcadores histológicos para la densidad neuronal, activación de células gliales y expresión génica de marcadores proinflamatorios39. Los aspectos más destacados de ese estudio se presentan a continuación para representar los efectos que las nanoarquitecturas de grabado en la superficie de la sonda tuvieron en la neuroinflamación.

Efectos de la nanoarquitectura grabada en la densidad de las neuronas
Para determinar cómo el grabado de nanoarquitecturas en la superficie de la sonda afecta la densidad neuronal inmediatamente alrededor del implante, los núcleos neuronales se tiñeron y cuantificaron utilizando previamente métodos de inmunohistoquímica39,41. No hubo diferencias significativas de densidades neuronales alrededor de la nanoarquitectura y las sondas de control a las 2 semanas posteriores a la implantación(Figura 2A). Sin embargo, había significativamente más neuronas alrededor de las sondas de nanoarquitectura a 100-150 m de distancia del sitio del implante en comparación con los implantes de control liso (p < 0.05 vs controles)(Figura 2B) a las 4 semanas posteriores a la implantación. También se encontró que había una tendencia creciente de densidad neuronal que rodeaba las sondas de nanoarquitectura a lo largo del tiempo, contrastando la disminución de la tendencia de la densidad neuronal alrededor de los implantes de control(Figura 2). Existe una relación directa que representa una respuesta neuroinflamatoria mitigada junto con una mayor densidad de neuronas viables que rodean el microelectrodo, resulta en una mayor capacidad para que el microelectrodo proporcione grabaciones de calidad15,40,42. Por lo tanto, al interpretar los datos de densidad neuronal, una mayor densidad de neuronas alrededor del sitio del implante puede indicar una respuesta neuroinflamatoria disminuida y potencialmente mejorada la calidad de grabación y la estabilidad de los microelectrodos intracorticales.

Efectos de la nanoarquitectura grabada en marcadores moleculares neuroinflamatorios
La histología es suficiente para identificar las células alrededor de un sitio de implante; sin embargo, carece de la sensibilidad y especificidad para caracterizar el fenotipo de las células circundantes. Por lo tanto, se emplearon métodos que utilizan análisis cuantitativos de la expresión génica para cuantificar la expresión génica relativa de los marcadores neuroinflamatorios, con el fin de comprender el efecto que la nanoarquitectura tiene en el fenotipo de las células39. Varios marcadores neuroinflamatorios fueron investigados en el estudio reportado anteriormente. Aquí sólo se resaltarán dos que son específicos de las células de microglia, con el fin de discutir cómo su fenotipo puede haber sido alterado. El grupo de diferenciación 14 (CD14) es un receptor de reconocimiento de patrones en la membrana de la microglia que reconoce las bacterias y señala la vía inflamatoria después de una lesión/implantación43,44,45. El óxido nítrico sintasa (NOS2), es un marcador de estrés oxidativo expresado en microglia/macrofago que se asocia con un aumento de la producción de marcadores proinflamatorios46,47.

En los datos notificados anteriormente, no hubo diferencias significativas de la expresión génica relativa CD14 entre la nanoarquitectura y los implantes de control a las dos o cuatro semanas después de la implantación. En particular, hubo una disminución significativa (p < 0.05) de la expresión génica relativa CD14 de dos a cuatro semanas alrededor del sitio de los implantes de nanoarquitectura, lo que indica una posible disminución de la inflamación (denotado por * en la Figura 3A). Del mismo modo, no hubo diferencias significativas de la expresión génica relativa de NOS2 entre la nanoarquitectura y los implantes de control a las dos semanas. Sin embargo, hubo una expresión génica relativa NOS2 significativamente menor (p < 0.05) alrededor del implante de nanoarquitectura en comparación con el implante de control a las cuatro semanas posteriores a la implantación (denotado por el valor de la Figura 3B). Además, hubo un aumento significativo de 2 a 4 semanas de expresión génica relativa NOS2 alrededor de los implantes de control (denotado por * en la Figura 3B),y no se observaron diferencias alrededor de los implantes de nanoarquitectura a lo largo del tiempo, lo que indica una posible disminución de la inflamación alrededor de los implantes de nanoarquitectura. Al interpretar estos datos, es importante comprender la función del gen que se cuantifica. Por ejemplo, las disminuciones de genes proinflamatorios indican una probable disminución en la respuesta inflamatoria alrededor del sitio del electrodo, mientras que un aumento en estos tipos de genes sugiere un probable aumento de la inflamación.

FIB Grabado Nano-arquitectura en las superficies de microelectrodos funcionales de un solo vástago
El estudio previamente reportado tuvo resultados prometedores que demuestran un ligero aumento de la densidad de las neuronas y la posible disminución del fenotipo inflamatorio de la microglia alrededor del sitio del implante de sonda de nanoarquitectura. Para investigar la traducción de estos resultados a la funcionalidad de electrodos, se grabó un microelectrodo funcional de silicio de un solo vástago con el mismo diseño de nanoarquitectura que las sondas de microelectrodo de silicio de vástago único no funcionales, utilizando un protocolo de grabado de fiB similar. La única diferencia en la metodología para el grabado de la nanoarquitectura especificada era que el protocolo para los electrodos funcionales no podía automatizarse, ya que no había material de sustrato adicional para crear marcas fiduciales. Por lo tanto, el electrodo funcional se grabó manualmente utilizando FIB realineando el haz cada 500 m, como se describe en el protocolo anterior. Los grabados finales eran líneas paralelas de 200 nm de ancho, separadas 300 nm, y tenían una profundidad de 200 nm(Figura 4).

Efectos de la nanoarquitectura grabada en microelectrodos intracorticales en electrofisiología
Las grabaciones exitosas de microelectrodos intracorticales dependen de la proximidad de las neuronas alrededor de lossitios del implante, la integridad del dispositivo y la transmisión fiable de la actividad de una sola unidad desde el cerebro8,40,48,49. Las grabaciones electrofisiológicas se cuantificaron utilizando métricas grabadas recopiladas dos veces por semana durante ocho semanas. Las métricas utilizadas en este estudio fueron el porcentaje de canales que registran unidades individuales, las amplitudes máximas de las unidades grabadas y la relación señal-ruido (SNR). Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus días) en el Centro Médico de Asuntos de Veteranos louis Stokes Cleveland aprobaron todos los procedimientos con animales. Las ratas Sprague Dawley (8-10 semanas de edad y un peso de 225 g) fueron implantadas con microelectrodo de silicio de un solo vástago, con la nanoarquitectura antes mencionada (n-1) o los controles suaves (n-6). No se realizó ningún análisis estadístico de estos datos, ya que se implantó un microelectrodo de nanoarquitectura para un estudio piloto de prueba de concepto. No obstante, los resultados electrofisiológicos colectivos que muestran un mayor porcentaje de canales que registran unidades individuales(Figura 5A),amplitudes máximas(Figura 5B)de unidades grabadas, y SNR(Figura 5C)de los microelectrodos de nanoarquitectura en comparación con los microelectrodos de control suave, son prometedores. Estos resultados indican que el grabado de nanoarquitectura en la superficie de los microelectrodos puede potencialmente resultar en una mejor calidad y una mayor longevidad de las grabaciones electrofisiológicas. Es necesaria una evaluación adicional con un mayor tamaño de la muestra para verificar estos hallazgos preliminares.

Figure 1
Figura 1: FIB Grabado Nano-arquitectura en las superficies de sondas intracorticales de un solo vástago. Imágenes SEM de las sondas de silicio de vástago único no funcionales con nanoarquitecturas grabadas FIB a lo largo de la parte posterior del vástago. (A) Imágenes compuestas de todo el grabado posterior de la sonda que se muestran con un aumento de 120x, Barra de escala a 400 m. Las marcas fiduciales, (caja cuadrada con un símbolo + que pasa a través de ella), se graban a lo largo del sustrato de silicio que rodea la sonda. Las imágenes SEM ampliadas de la punta de la sonda se muestran en (B) con un aumento de 1.056x (barra de escala a 40 m),(C) a un aumento de 3.500x (barra de escala a 10 m) y (D) a un aumento de 10.000x, barra de escala a 4 m. Esta cifra se ha modificado de la referencia39. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Efectos de la nanoarquitectura grabada en la densidad de neuronas. La supervivencia neuronal se presenta como un porcentaje de la región de fondo de los mismos animales a distancias de 50 m de distancia del sitio del implante. (A) No se observaron diferencias significativas de supervivencia neuronal entre las superficies lisas (control) y los implantes nanopatrones a las 2 semanas posteriores a la implantación. (B) Hubo una supervivencia neuronal significativamente mayor alrededor de los implantes nanopatrónicos a la distancia de 100-150 m en comparación con las superficies lisas (p < 0.05) a las 4 semanas después de la implantación. Imágenes representativas de las neuronas (verde manchado), con el contorno amarillo que representa el sitio de implantación, y la "P" que denota el lado grabado del microelectrodo, barra de escala a 100 m. Esta cifra se ha modificado a partir de39. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efectos de la nanoarquitectura grabada en marcadores moleculares neuroinflamatorios. El tejido se recogió alrededor de 500 m de radio del sitio de implantación tanto para los implantes nanopatrones como para los implantes de control. La expresión génica relativa de los marcadores inflamatorios se comparó cuantitativamente entre ambos tipos de implantes (las diferencias se indican con el valor de la palabra s en el gráfico; p < 0,05) así como con el tiempo (las diferencias se indican con * en el gráfico; p < 0,05). (A) La expresión génica relativa de CD14 disminuyó significativamente alrededor de los implantes nanopatrones de dos a cuatro semanas (*). (B) Hubo una expresión génica relativa significativamente menor de NOS2 alrededor del implante nanopatrón en comparación con el control a las cuatro semanas (o) y hubo un aumento significativo de NOS2 de dos a cuatro semanas alrededor de implantes de control liso (*). Esta cifra se ha modificado de la referencia39. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: FIB Grabado Nano-arquitectura en las superficies de microelectrodos de vástago único funcionales. El recuadro en la esquina superior derecha muestra el microelectrodo utilizado en este estudio junto a un centavo para retratar el tamaño del vástago del electrodo (línea negra delgada). Imágenes SEM del vástago de microelectrodos con nanoarquitecturas grabadas FIB a lo largo de la parte posterior del vástago. El vástago entero se muestra en la parte superior con un aumento de 600x (barra de escala a 50 m), mientras que el recuadro representa la superficie nanopatrónizada con un aumento de 25.000x, barra de escala a 1 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Efectos de la nanoarquitectura grabada en microelectrodos intracorticales en electrofisiología. La evaluación de las métricas electrofisiológicas descubrió un aumento preliminar prometedor de la tendencia de(A) porcentaje de canales que registran unidades individuales, (B) amplitudes máximas de unidades grabadas, y(C) relación señal-ruido del microelectrodo grabado con nanoarquitecturas en comparación con los electrodos de control suave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Grabación de electrofisiología a partir de microelectrodos de vástago único funcionales implantados con nanoarquitecturas grabadas FIB. Uno de los desafíos de utilizar las nanoarquitecturas FIB to etch en dispositivos de microelectrodos fabricados es el riesgo de contactos de grabación de cortocircuito. El eje X representa el tiempo de grabación en segundos, y el eje Y muestra los canales de electrodos que registran los potenciales de acción neuronal. Cada línea numerada en el eje Y representa un canal de electrodo diferente, siendo el canal número 1 el más superficial y el 16 el más profundo. Las cajas rojas describen los canales cortocircuitados, mientras que las cajas azules perfilan los canales con actividad neuronal visible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo de fabricación descrito aquí utiliza litografía de haz iónico focalizado para grabar de manera efectiva y reproducible nanoarquitecturas en la superficie de microelectrodos de silicio de un solo vástago no funcionales y funcionales. La litografía de haz iónico focalizado (FIB) permite la ablación selectiva de la superficie del sustrato mediante el uso de un haz de iones finamente enfocado50,51. FIB es una técnica de escritura directa que puede producir varias características con resolución a nanoescala y alta relación de aspecto50,52,53. Con el fin de crear las diversas características de tamaño, la magnitud de la corriente del haz iónico se puede optimizar para cambiar el tamaño del punto del haz de iones dentro de un rango de 3 nm a 2 m50,51. Algunas ventajas generales de utilizar las características de FIB para grabar en superficies son: 1) se puede utilizar en una amplia variedad de materiales, incluyendo silicio, metales y polímeros53,54,55,56, 2) FIB se puede realizar en superficies no planas, y 3) FIB se puede utilizar para el postprocesamiento en dispositivos individuales57.

Aquí, FIB se utilizó en combinación con un microscopio SEM y software utilizado para escribir un script automatizado especializado para grabar características específicas en sondas de vástago único no funcionales. El script incluía parámetros requeridos (2,5 nA corriente de haz iónico y voltaje de 30 kV) para grabar el espaciado exacto deseado (200 nm de ranuras paralelas anchas, separados 300 nm y 20 nm de profundidad). Las dimensiones del electrodo excedían el campo de visión de la FIB, por lo que el patrón se realizó en múltiples posiciones de etapa. Con el fin de automatizar el proceso, las marcas fiduciales se grabaron en el lado de la hoja de silicio que sostiene las sondas en su lugar, para permitir que el software localice con precisión las líneas de patrón en el vástago de la sonda. Los fiduciales eran necesarios porque el movimiento de la etapa creaba una gran incertidumbre en la ubicación del área de patrón con respecto al campo de visión de la viga iónial. La colocación de los fiduciales en la lámina de silicio permitió a la FIB localizar las áreas del patrón sin escanear directamente el haz en el vástago de la sonda, lo que podría contaminar o dañar el vástago de la sonda. Todo el proceso de grabado automatizado para un vástago tardó aproximadamente 12 h en completarse y no requirió intervención del operador después de que se inició el patrón. Colectivamente, los beneficios de usar LAS características de FIB to etch en el vástago de la sonda de silicio fueron la capacidad de hacer características de tamaño nanométrico, automatizar el proceso de grabado y la capacidad de grabar en una sonda fabricada. Aunque FIB tiene grandes beneficios, uno de los inconvenientes del uso de este método de fabricación es la velocidad de producción lenta que, en última instancia, limita el potencial de producción en masa de dispositivos con nanoarquitecturas en su superficie58. Alternativamente, otros métodos de fabricación utilizados para crear tamaños de entidad y geometrías de interés, tal vez a velocidades más rápidas y en producciones en masa, incluyen litografía de haz de electrones y litografía de nanoimpresión59,60,61,62,63,64,65. Sin embargo, estos métodos no permiten el grabado de características de nanoarquitectura en dispositivos fabricados. Tradicionalmente, estos métodos se utilizan durante el proceso de fabricación en una hoja de silicio o polímero, que luego se puede utilizar en pasos de procesamiento aguas abajo para fabricar el engaño final.

Los electrodos funcionales no pudieron someterse a un proceso automatizado debido a no tener ningún material circundante alrededor del vástago del electrodo en el que incluir marcas fiduciales en la carrera. Por lo tanto, los electrodos funcionales se alinearon manualmente y se grabaron a 500 m secciones a lo largo del vástago, utilizando la misma corriente iónica y voltaje que la ejecución automatizada para asegurar los mismos tamaños de característica. La viga tuvo que ser realineada manualmente después de completar cada intervalo de 500 m y configurar para grabar la siguiente sección. El proceso de realineación manual de los patrones cada 500 m puede conducir potencialmente a nanoestructuras o estructuras dañadas que no coincidan con la geometría prevista. Esto se debe a tiempos de exposición más largos que la viga iónial necesita para la alineación manual66. Esta fue una de las dificultades encontradas con el grabado manual. Debido a esta complicación, dos contactos de grabación fueron cortocircuitados y no pudieron registrar potenciales de acción neuronal(Figura 6). La Figura 6 muestra un segmento electrofisiológico de grabación en vivo del animal implantado con el electrodo de nanoarquitectura. Las cajas azules describen los canales que registran fuertes potenciales de acción, en comparación con las cajas rojas que denotan los dos canales muertos. Por lo tanto, uno de los desafíos del uso de grabado manual FIB en electrodos post-fabricados es que existe la posibilidad de que el haz pueda cortocircuitar contactos y evitar que graben. Este desafío se mejora al intentar grabar la parte frontal de los electrodos de silicio de un solo vástago, en los que los contactos de grabación y las trazas están a lo largo de todo el vástago del electrodo. Aunque es factible grabar el silicio alrededor de los contactos y trazas de grabación, se recomienda precaución adicional para evitar daños y disminución del rendimiento de las capacidades de grabación del electrodo.

Como se mencionó anteriormente, FIB se puede utilizar en diversos materiales para grabar numerosas geometrías de características en la superficie. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los parámetros de las geometrías de etch, como las líneas en los diversos materiales, son complicados de predecir. Especialmente para los patrones de línea, el ancho y la profundidad de la línea dependen en gran medida de muchos parámetros, como la tensión de aceleración, la corriente de haz, el tiempo de permanencia, el espaciado de píxeles, la duración de la apertura y el tipo de material. Otro parámetro que resulta de la optimización es el tiempo total para fresar cada línea. Las líneas más estrechas y profundas podrían lograrse utilizando corrientes de haz más pequeñas; sin embargo, el tiempo de patrón para un vástago de sonda completo se extendería a varios días, lo que no es práctico. Por lo tanto, aunque es factible optimizar el protocolo aquí presentado, sería extremadamente difícil describir los parámetros para materiales desconocidos. Al solucionar problemas de los parámetros de las sondas de silicio descritos en este protocolo, se realizaron numerosos cortes de prueba en silicio para evaluar cómo las condiciones cambiantes afectaban al ancho y las profundidades de la línea. Tan pronto como las condiciones evaluadas fueron capaces de grabar el tamaño específico de la entidad y la geometría de interés (200 nm de líneas anchas que eran 200 nm de profundidad), esos parámetros se utilizaron para escribir el script de software. El script se utilizó para controlar el espaciado de cada línea, de centro a centro, que en este protocolo es de 300 nm. Los estudios futuros que utilizan sustratos/dispositivos de silicio que requieren tamaños de característica en los cientos de nanómetros, pueden utilizar los parámetros descritos en este protocolo como punto de partida para solucionar las condiciones necesarias para crear los tamaños de característica deseados. Se requerirá una mayor optimización y solución de problemas de las condiciones de grabado para sustratos/dispositivos metálicos y polímeros. En general, la utilización de FIB para el grabado de nanoarquitecturas en superficies de materiales permite un amplio control y flexibilidad en geometrías de características, el uso de numerosos materiales compatibles y varios tipos de superficies, incluidos los dispositivos fabricados. Los resultados representativos presentados en este documento demostraron los beneficios potenciales observados en nuestros estudios de utilización de FIB para grabar nanoarquitecturas en la superficie de los microelectrodos intracorticales: 1) aumento de la densidad neuronal y 2) reducción de marcadores neuroinflamatorios alrededor de dispositivos implantados con nanoarquitecturas, así como 3) hallazgos preliminares que representan una mejor calidad de las grabaciones electrofisiológicas a lo largo del tiempo. Del mismo modo, el empleo y la optimización de las características de nanoarquitectura de grabado de protocolo descritos en la superficie de un material se pueden utilizar para mejorar la funcionalidad de numerosos dispositivos médicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por los premios del Servicio de Investigación y Desarrollo de Rehabilitación de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (EE.UU.): #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) y #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). El contenido no representa las opiniones del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos ni del Gobierno de los Estados Unidos. Los autores desean agradecer a FEI Co. (Ahora parte de Thermofisher Scientific) por la asistencia del personal y el uso de la instrumentación, que ayudó en el desarrollo de los guiones utilizados en esta investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-Channel ZIF-Clip Headstage Tucker Davis Technologies ZC16 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrapped Thomas Scientific 1213F04 Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder Tucker Davis Technologies Z-ROD32 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml Ted Pella 16023 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter Hemostat Fine Science Tools 13013-14 Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double Coated Ted Pella 16084-7 The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well Sigma Aldrich CLS3736-100EA Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11251-30 Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs Fisher Scientific 22-032-600 Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm Ted Pella 16148 Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll Fisher Scientific 01-213-101 Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes Fisher Scientific 02-617-149 Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrode NeuroNexus A1x16-3mm-100-177 http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holder KOPF Model 1772 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument KOPF Model 900-U Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly KOPF Model 960 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') Ted Pella 807-5 https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V Ted Pella 520-1-220 Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver Paint Ted Pella 16062 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab Thermo Fisher Scientific Helios G2 650 This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

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Litografía de haz de iones enfocado a etch nano-arquitecturas en microelectrodos
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Mahajan, S., Sharkins, J. A.,… More

Mahajan, S., Sharkins, J. A., Hunter, A. H., Avishai, A., Ereifej, E. S. Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes. J. Vis. Exp. (155), e60004, doi:10.3791/60004 (2020).

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