Summary
Vi har visat att etsning av Nano-arkitektur i intracortical mikroelektrod enheter kan minska den inflammatoriska reaktionen och har potential att förbättra elektrofysiologiska inspelningar. De metoder som beskrivs häri skissera en strategi för etch nano-arkitekturer i ytan av icke-funktionella och funktionella enda skaft kisel intracortical mikroelektroder.
Abstract
Med framstegen inom elektronik och tillverkningsteknik har intracortical mikroelektroder genomgått betydande förbättringar som möjliggör produktion av sofistikerade mikroelektroder med högre upplösning och utökad kapacitet. Framstegen inom tillverkningsteknik har stött utvecklingen av biomimetiska elektroder, som syftar till att sömlöst integreras i hjärnparenkymet, minska det neuroinflammatoriska svaret observeras efter elektrod insättning och förbättra kvaliteten och livslängden för elektrofysiologiska inspelningar. Här beskriver vi ett protokoll för att anställa en biomimetisk metod som nyligen klassificerats som nano-arkitektur. Användningen av fokuserad jonstråle litografi (FIB) utnyttjades i detta protokoll för att etch specifika nano-arkitektur funktioner i ytan av icke-funktionella och funktionella enda skaft intracortical mikroelektroder. Etsning nano-arkitekturer i elektrod ytan indikerade möjliga förbättringar av biokompatibilitet och funktionalitet av den implanterade enheten. En av fördelarna med att använda FIB är förmågan att etch på tillverkade enheter, i motsats till under tillverkningen av enheten, att underlätta gränslösa möjligheter att ändra många medicintekniska produkter efter tillverkning. Det protokoll som presenteras häri kan optimeras för olika materialtyper, nano-arkitekturfunktioner och typer av enheter. Utöka ytan av inopererade medicinska enheter kan förbättra enhetens prestanda och integration i vävnaden.
Introduction
Intracortical mikroelektroder (IME) är invasiva elektroder som ger ett sätt att direkt gränssnitt mellan externa enheter och neuronala populationer inuti hjärnbarken1,2. Denna teknik är ett ovärderligt verktyg för att spela in neurala åtgärder potentialer för att förbättra forskarnas förmåga att utforska neuronala funktion, Advance förståelse av neurologiska sjukdomar och utveckla potentiella terapier. Intracortical mikroelektrod, som används som en del av hjärnan maskin Interface (BMI) system, möjliggör inspelning av åtgärder potentialer från en individ eller små grupper av nervceller för att upptäcka motor avsikter som kan användas för att producera funktionella utgångar3. I själva verket har BMI-system framgångsrikt använts för protes och terapeutiska ändamål, såsom förvärvade sensorimotorik rytmkontroll för att driva en dator markör hos patienter med amyotrofisk lateral skleros (ALS)4 och ryggmärgsskador5 och återställa rörelsen hos personer som lider av kronisk tetraplegi6.
Tyvärr, IMEs ofta misslyckas med att spela in konsekvent över tiden på grund av flera fel lägen som inkluderar mekaniska, biologiska och materiella faktorer7,8. Det neuroinflammatoriska svaret som inträffar efter elektrodens implantation tros vara en avsevärd utmaning som bidrar till elektrod fel9,10,11,12,13,14. Den neuroinflammatoriska reaktionen initieras under den inledande införandet av IME som klipper blod-hjärnbarriären, skadar den lokala hjärnan parenkymet och stör gliaceller och neuronala nätverk15,16. Detta akuta svar kännetecknas av aktivering av gliaceller (mikroglia/makrofager och astrocyter), som frigör pro-inflammatoriska och neurotoxiska molekyler runt implantatstället17,18,19,20. Den kroniska aktiveringen av gliaceller celler resulterar i en främmande kropp reaktion kännetecknas av bildandet av en gliaceller ärr isolera elektroden från friska hjärnvävnad7,9,12,13,17,21,22. Ytterst, hindrar elektrodens förmåga att spela in neuronala åtgärder potentialer, på grund av den fysiska barriären mellan elektroden och nervceller och degeneration och död nervceller23,24,25.
Det tidiga misslyckandet med intracortical mikroelektroder har medfört betydande forskning i utvecklingen av nästa generations elektroder, med betoning på biomimetiska strategier26,27,28,29,30. Av särskilt intresse för det protokoll som beskrivs här, är användningen av Nano-arkitektur som en klass av biomimetiska ytförändringar för IMEs31. Det har fastställts att ytor som imitera den naturliga in vivo-miljöns arkitektur har ett förbättrat biokompatibelt svar32,33,34,35,36. Således hypotesen övertygande detta protokoll är att diskontinuitet mellan grov arkitektur av hjärnvävnad och slät arkitektur av intracortical mikroelektroder kan bidra till den neuroinflammatoriska och kroniska främmande kropp svar på implanterade IMEs (för en fullständig översyn hänvisa till Kim et al.31). Vi har tidigare visat att utnyttjandet av Nano-arkitektur funktioner som liknar hjärnans extracellulära matris arkitektur minskar astrocyt inflammatoriska markörer från celler odlade på nano-arkitektoniska substrat, jämfört med platta kontroll ytor i både in vitro-och ex vivo modeller av neuroinflammation37,38. Dessutom har vi visat att tillämpningen av fokuserad jonstråle (FIB) litografi till etch nano-arkitekturer direkt på kisel sonder resulterade i signifikant ökad neuronala lönsamhet och lägre uttryck av pro-inflammatoriska gener från djur implanteras med nano-arkitektur sonder jämfört med smidig kontrollgrupp26. Därför är syftet med det protokoll som presenteras här att beskriva användningen av FIB litografi till etch nano-arkitekturer på tillverkade intracortical mikroelektrod enheter. Detta protokoll har utformats för att etch nano-arkitektur stora funktioner i kisel ytor av intracortical mikroelektrod skaft med både automatiserade och manuella processer. Dessa metoder är okomplicerade, reproducerbara, och kan säkert optimeras för olika enhets material och önskade funktions storlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: gör följande steg medan du bär rätt personlig skyddsutrustning, såsom en labbrock och handskar.
1. montering icke-funktionell kisel sond för fokuserad jonstråle (FIB) litografi
Anmärkning: för komplett förfarande som beskriver tillverkning av SOI wafer med 1 000 sonder, hänvisas till Ereifej et al.39.
- Isolera en remsa av 2-3 kisel sonder från kisel på isolator (SOI) wafer som innehåller 1 000 sonder. Gör inte remsor som innehåller mer än tre kisel sonder. Detta kan öka chanserna för lös montering och kan orsaka feljustering resulterar i FIB till etch felaktigt.
Anmärkning: remsor/sonder som inte sitter fast på aluminium stub kan orsaka två komplikationer: 1) när scenen rör sig för att arbeta på nästa avsnitt, kommer det att finnas vibrationer och fräsning kommer inte att vara korrekt tills sonden lägger sig och 2) det kan orsaka en hög variation och vara ur fokus planet.- Medan du bär handskar, använda fina pinproppar att sätta tryck runt sonderna att bryta en liten sektion som innehåller två till tre sonder.
- Rengör kiselproben försiktigt på allt damm och skräp före FIB etsning. Bered en 6 väl polystyren platta genom att Pipettera 3 mL/brunn av 95% etanol i tre brunnar.
- Plocka försiktigt upp den skurna remsan av kisel sonder med hjälp av fin spets eller vakuum tång och placera den i cell SIL. Placera bara en remsa av kisel sonder per sil för att förhindra att bryta sonderna. Placera den SIL som innehåller kisel sonderna remsa i den första brunnen som innehåller 95% etanol för rengöring. Håll SIL i den första brunnen i 5 min.
- Flytta SIL som innehåller kisel sonderna från den första brunnen och placera den i den andra brunnen som innehåller 95% etanol för ytterligare 5 min. Upprepa en gång i den tredje brunnen.
- Placera silen som innehåller de rengjorda silikonsonderna på en polytetrafluoretetsplattan för lufttorka. Gör detta steg i en steril huva för att undvika kontaminering från damm.
- Placera den lufttorkade remsan av kisel sonder i en förseglad behållare för transport till SEM-FIB. Wrap den SIL som innehåller lufttorkad prover med en plast eller aluminiumfolie wrap för transport och/eller lagring för att bibehålla rengöringen.
- Använd fina tippade eller vakuum tång för att försiktigt plocka upp den rena remsan av kisel sonder och placera dem på en ren aluminium stub (används för SEM-FIB Imaging/etsning) för att förbereda för montering.
- Använd en tandpetare (eller andra fina tippade instrument som en tunn elektrisk tråd), att placera en liten droppe (~ 10 μL) av silver färg på kanten av kisel substrat som omger sonderna. Fäst remsan ner genom att sprida silver färg runt sidorna av kisel substrat som omger sonden. Låt silverfärgen torka helt innan du placerar aluminium stub i SEM-FIB.
Obs: var noga med att inte få silver färg på skaftet av elektroden eftersom det är den del som kommer att etsad. Om remsan av sonder inte är säkert förankrat till aluminium stub, kan remsan röra sig under bearbetningen eller har ett annat fokalplan, vilket resulterar i felaktig fräsning av FIB. Flera remsor av kisel sonder kan monteras på samma aluminium stub, se till att det finns gott om utrymme mellan remsorna för att möjliggöra borttagning från stub efter etsning. Detta kommer att möjliggöra effektivare etsning av flera sonder med hjälp av den automatiserade funktionen som beskrivs nedan.
2. Justera FIB till Silikonsonderna
- Klicka på Vent -knappen på fliken balk kontroll för att ventilera kammaren. Tryck på Skift + F3 för att utföra startfasen. Bekräfta valet genom att välja knappen Home Stage i popup-fönstret.
Obs: att köra hem scenen operationen är ett förebyggande steg för att säkerställa att scenen axeln läses korrekt av programvaran och mikroskopet är i gott skick. - När hemma scenen är klar flyttar du scenen till koordinaterna X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. När kammaren har ventileras, sätt på rena nitrilhandskar och öppna kammar luckan.
Beroende på den tidigare användarens program kan det vara nödvändigt att ändra Stage-adaptern. Standardadaptrarna (t. ex. FEI-stil) kan avlägsnas genom att skruva loss den centrala bulten moturs och installeras genom att vrida medurs i rotations plattan på scenen. - För in den aluminium stub som håller sonderna i toppen av scenadaptern. Säkra aluminium stub genom att dra åt ställskruven på sidan av scen adaptern. Använd 1,5 mm insexnyckel för denna uppgift.
- Justera höjden på scenadaptern genom att vrida adaptern medurs för att sänka den eller moturs för att höja den. Fäst scenadaptern på rotations plattan genom att vrida låsmuttern medurs tills muttern är säkrad mot scen rotations plattan. Håll Stage-adaptern med den andra handen för att förhindra rotation av adaptern och prover medan du drar åt låsningskona muttern.
Använd den medföljande höjdmätaren för att bestämma lämplig höjd. Den övre delen av aluminium stub bör vara samma höjd som den maximala linje som visas på höjdmätaren. Över åtdragning av konen muttern kan orsaka skador på scenen och adaptern. Använd endast tillräckligt med kraft för att säkra proverna. - Hämta en navigations kamera bild. Sväng försiktigt navigerings kameraarmen tills den tar stopp. Mikroskopet scenen kommer automatiskt att flytta till en position under kameran. Titta på Live-bilden som visas i kvadrant 3 i Mikroskop användargränssnittet (UI).
- När ljusstyrkenivån automatiskt justeras till en lämplig nivå, ska du hämta bilden genom att trycka ned knappen på kamerafästet. Var noga med att vänta på hela bilden förvärvet till, vilket indikeras av en paus symbol visas i kvadrant 3 och belysningen av kameran stängs av. Detta tar cirka 10 s. sväng kameraarmen tillbaka till stängt läge. Scenen återgår till den ursprungliga positionen.
- Stäng Mikroskop kammarens lucka noggrant. Titta på CCD-kameravyn i kvadrant 4 när du stänger luckan. Se till att proverna och scenen är ett säkert avstånd från alla kritiska komponenter i Mikroskop kammaren.
- Välj nedpilen bredvid pump knappen på fliken balk kontroll. Välj pump med prov rengöring knappen i UI programvara för att starta kammaren vakuumpumpen och inbyggd plasma renare. Se till att dörren är förseglad genom att försiktigt trycka på framsidan av dörren medan pumpen är igång. Vänta ca 8 min för pumpnings tiden och plasma rengöringscykeln för att Mikroskop kammaren ska kunna slutföras.
Anmärkning: en vakuum tätning kan bekräftas genom att försiktigt dra på kammaren dörren, som bör förbli stängd om systemet är under vakuum. - När ikonen i det nedre högra hörnet av ANVÄNDARGRÄNSSNITTET blir grön, tryck på väckningsknappen i balken kontroll fliken som slår på elektronen och jonstrålar. Välj kvadrant 1 och Ställ in beam-signalen på elektronstrålen (om den inte redan är inställd), Ställ in kvadrant 2 på jonstrålen (om den inte redan är inställd).
- Ställ SEM spänning till 5 kV, Ställ SEM beam ström till 0,20 nA, som SEM detektor till ETD, Ställ detektor läge till sekundär elektron. Ställ FIB spänning till 30 kV, Ställ FIB balk ström till 24 pA, Ställ FIB detektor till ICE Detector, Ställ detektor läge till sekundär elektron.
- Dubbelklicka på kisel sonden i navigations kamerans bild, kvadrant 3 för att flytta scenen till den ungefärliga platsen för sonden. Klicka på kvadrant 1 för att välja den som den aktiva kvadranten och tryck på pausknappen för att starta SEM scanning. Ange genomsökningen Dwell tid till 300 ns och stänga av Skanna interlacing, linje integrationoch Frame medelvärdes. Ställ in skannings rotation på 0 på fliken beam Control och högerklicka på beam Shift 2D-justeraren och välj noll.
- Justera förstoringen till minimivärdet genom att vrida förstorings ratten moturs på MUI-panelen. Justera bildens ljusstyrka och kontrast med hjälp av rattarna på MUI-panelen eller i verktygsfältsikonen för automatisk kontrast ljusstyrka .
- Flytta scenen genom att dubbelklicka vänster-klicka med musen på en funktion för att centrera den, eller genom att trycka ned mushjulet och aktivera joystick Mouse-läge. Flytta önskad kisel sond för att mönstra in i mitten av SEM-bilden.
- Lokalisera en kant eller andra funktioner som en damm partikel eller scratch. Öka förstoringen till 2, 000x genom att vrida förstorings vredet medurs. Justera skärpan i SEM genom att vrida på grova och fina fokus rattar på MUI tills bilden är i fokus. När bilden är i fokus väljer du knappen Länka exempel Z till arbetsavstånd i verktygsfältet.
- Bekräfta att åtgärden slutfördes genom att titta på Z-axelkoordinaten på fliken navigering. Värdet ska vara ca 11 mm. Skriv in 4,0 mm i Z-axelns position och tryck på Go to -knappen med musen eller tryck på Enter på tangentbordet och scenen kommer att flytta till 4 mm arbetsavstånd.
- Flytta scenen i X och Y för att lokalisera axeln av kisel sonden. Placera den så nära mitten av SEM som möjligt. Ändra scentilt till 52 ° genom att skriva in "52" i T-koordinaten och trycka på Enter. Observera om sondens axel verkar röra sig uppåt eller nedåt i bilden. Använd reglaget Stage Z för att ta tillbaka sondens axel till mitten av SEM-bilden. Justera bara Z-positionen, flytta inte X-, Y-, T-eller R-axeln.
- Springa den bygget i "XT anpassa huvudnummer" befalla lokaliserat på det scen droppa ned menyn. Använd musen för att klicka på två punkter parallellt med kanten av sonden. Kontrollera att den vågräta alternativknappen är markerad i popup-fönstret och klicka på Slutför. Scenen kommer att rotera för att justera sonden med X-axeln på scenen. Justera scenen i X, Y med musen för att sätta den nedre axeln av sonden i mitten av SEM-bilden igen.
Anmärkning: den första punkten bör vara mot sonden grepp och den andra punkten bör vara mot sonden ' s Point. - Välj FIB i kvadrant 2 och se till att strålen strömmen är fortfarande 24 pA. Ställ in förstoringen på 5 000 x och uppehållstiden till 100 ns. Skriv CTRL-F på tangentbordet för att ställa in FIB fokus till 13,0 mm. I balken kontroll fliken, högerklicka på stigmator 2D Adjuster och välj noll och, även, högerklicka i beam Shift 2D justeraren och välj noll. Ställ in skannings rotationen på 0 ° och tryck på knappen automatisk kontrast ljusstyrka i verktygsfältet.
- Leta efter en bild av sonden skuldra i kvadrant 2. Använd Snapshot-verktyget för att hämta en bild med FIB. Bekräfta sonden skuldra är i mitten av FIB bilden, om inte, dubbelklicka på sonden axeln för att flytta den till centrum. Flytta scenen till vänster genom att trycka på vänsterpiltangenten på tangentbordet ungefär 10-15 gånger. Ta en annan ögonblicksbild och observera om sonden sidan är fortfarande i mitten av FIB.
Obs: om inte, måste scenrotationen justeras något. Om sonden ligger ovanför bild centret måste scenen roteras i negativ riktning. Om sonden är under mitten, måste scenen roteras medurs. Ange en relativ compucentric rotation av 0,01 till 0,2 grader beroende på vilket sätt är nödvändigt att justera sonden. - Upprepa steg 2,16 till 2,17 så många gånger som behövs tills kanten av sonden axeln är perfekt i linje med X-axeln på scenen, (kanten stannar i mitten av FIB medan du flyttar åt vänster).
- Med hjälp av FIB, flytta scenen tillbaka till den nedre axeln av sonden. Spara scen positionen i positions listan genom att klicka på knappen Lägg till . Ändra FIB balken ström till 2,5 nA och se till att förstoringen av FIB är fortfarande 5000x. Kör funktionen automatisk ljusstyrka kontrast och Ställ in tiden för FIB Dwell till 100 ns.
- Tryck på pausknappen för att starta skanningen. Justera FIB fokus och astigmatism, så snabbt och exakt som möjligt, med hjälp av grova och fina fokus rattar, och X och Y stigmator rattar på MUI-panelen. Tryck på pausknappen för att stoppa FIB-skanningen.
3. skriva en automatiserad process för etsning
- Starta programvaran genom att hitta den i Windows Start-menyn (dvs Start\Programs\FEI Company\Applications\Nanobuilder). Placera programvaru fönstret på sido skärmen så att ANVÄNDARGRÄNSSNITTET inte täcks. Öppna filen för mönster av silikonsonderna genom att klicka på Arkiv och sedan Öppna. Dirigera Windows-webbläsaren till platsen för programvaru skriptet (tilläggsfil 1 -filnamnet är "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime. jbj").
- I programvaran väljer du den nedrullningsbara menyn Mikroskop och väljer Ange scenursprung. I programvaran väljer du rullgardinsmenyn med Mikroskop och väljer sedan kalibrera detektorer.
- På Mikroskop UI, klicka i Quad 1 en gång med musen för att välja Quad 1. Ignorera de andra instruktionerna som visas i popup-fönstret, de är inte nödvändiga för detta projekt. Klicka på OK för att starta kalibreringen. Processen kommer att ta ca 5 min. se till att ETD och ICE detektorer kalibrera. Det är OK om några andra detektorer har Kalibreringsfel.
- I programvaran, Välj Mikroskop rullgardinsmenyn och välj Kör för att starta mönstersekvensen. När mönstret är klart stänger du programvaran.
Obs: programvaran kommer att ta över Quad 3 och 4 för mönkning och justering funktioner. Skriptet tar cirka 12 h att köra. När skriptet körs, ändra inte någon parameter på mikroskopet. - Tryck på "Vent" i Mikroskop UI balk kontroll fliken för att stänga av Mikroskop balkar och starta ventilen cykeln. Medan kammaren ventilerar, flytta scenen till koordinater X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. När kammaren är ventilerade, sätta på rena nitrilhandskar och dra öppna kammaren dörren.
- Lossa ställskruven på stub-adaptern med 1,5 mm insexnyckel. Ta bort den aluminium stub som innehåller den mönstrade sonden från kammaren. Stäng Mikroskop kammarens lucka noggrant. Titta på CCD-kameravyn i kvadrant 4 när du stänger luckan. Se till att scenadaptern är ett säkert avstånd från alla kritiska komponenter i Mikroskop kammaren.
- Välj nedpilen bredvid pump knappen på fliken balk kontroll. Välj pump knappen för att starta kammar vakuumpumpen. Se till att dörren är förseglad genom att försiktigt trycka på framsidan av dörren medan pumpen är igång.
Anmärkning: en vakuum tätning kan bekräftas genom att försiktigt dra på kammaren dörren, som bör förbli stängd om systemet är under vakuum. Pumpnings tiden kommer att vara cirka 5 min. Endast en sida av sonden kan etsad under en enda körning. - Om fram-och baksidan av sonden kräver etsning, sedan försiktigt bort etsad remsa av kisel sonder efter kontroll av den slutliga etch och avbildning på framsidan (om bilder behövs). Lös silverfärgen med aceton, genom att försiktigt dabbing/borsta aceton på silver färg. Vänd försiktigt remsan runt till baksidan, montera, justera och etch enligt stegen som beskrivs ovan.
4. Kontrollera den slutliga etch och Imaging
- När fräsningen är klar, kontrollera enhetligheten hos de olika sektionerna med SEM-avbildning vid en högre förstoring.
Anmärkning: bildtagning i lutningsvinkeln möjliggör en bättre bedömning av variationen i fräsdjupet. Särskild uppmärksamhet bör ägnas övergångsregionerna mellan fräs platserna. - Bild proverna igen efter fräsning med ett optiskt mikroskop.
Anmärkning: de periodiska frästa linjerna resulterar i en refraktion effekt som ger upphov till olika färger som en funktion av bildvinkeln. Om färgen inte är kontinuerlig tillsammans med sonden som är en tydlig indikation på störningar i frästa linjer.
5. montering av en funktionell kisel sond för FIB etsning
- Ta försiktigt bort den funktionella kisel elektroden från förpackningen. Använd tång för att försiktigt lyfta plast skyddande fliken som täcker huvudet scenen. Börja lyfta ett hörn av fliken upp från det klibbiga limmet som håller den på plats och fortsätt att lyfta tills hela elektroden avlägsnas.
- Spänn försiktigt elektroden med hemostatika för att förbereda för montering i stereotaxic-ramen. Håll den täckta fliken med tången, Placera försiktigt böjda Peanger runt den gröna axeln ovanför kisel skaft, med den böjda delen av hemostatika vänd uppåt mot fliken. Lås Peanger på plats för att säkerställa att elektroden inte kommer att tappa den hemostats.
- Ta försiktigt bort plastskyddsfliken som täcker huvudscenen. Medan du håller elektroden med hemostatika, försiktigt klämma elektroden i stereotaxic ramen för rengöring.
- Fyll 3 petriskålar med 95% etanol (~ 10 mL per petriskål). Placera petriskål under elektroden som är monterad i stereotaxic ramen för rengöring. Sänk långsamt elektroden genom att vrida mikromanipulatorn nedåt (100 μm/s) så att skaftet är nedsänkt i 95% etanol.
Obs: var noga med att inte vrida mikromanipulatorn för fort eller för djupt, detta kan orsaka elektroden att bryta (dvs, elektroden bör inte röra petriskål). - Lämna elektrod skaftet i 95% etanol i 5 min, och sedan långsamt höja elektroden ur 95% etanol genom att vrida mikromanipulatorn uppåt (100 μm/s). Upprepa detta steg ytterligare två gånger, för totalt tre tvättar. Låt elektroden lufttorka i fem minuter.
- Använd samma teknik för att montera elektroden i stereotaxic-ramen, för att ta bort elektroden från stereotaxic-ramen. Placera försiktigt hemostatika runt axeln av elektroden. När Peanger är knäppta tight, släppa elektroden från stereotaxic ram, returnera plast skyddande fliken som täcker huvudet scenen, och sätta den rengjorda elektroden tillbaka i förpackningen.
6. etsning funktionell kisel sond med FIB
- Montera den rengjorda funktionella silikon elektroden på ett aluminium stativ. Plocka försiktigt upp den rengjorda funktionella kisel elektroden med hjälp av tång och ta bort skyddsfliken från huvudscenen. Placera elektrod skaftet på aluminium stub så det inte hänga över någon kant, sedan använda en liten bit cu eller Carbon ledande tejp, stift headstage säkert till aluminium stub.
Obs: Alternativt kan en låg profil Clip Holder användas för att hålla elektroden ner. Var försiktig så att du inte vidrör elektrod skaftet. - Enligt stegen som beskrivs ovan (avsnitt 2), placera elektroden vid den eucentriska höjden och se till att elektroden är vid slump punkten för SEM-och FIB-strålarna. Rikta in skaftet med "X"-riktningen på scenen.
- Ställ in FIB till den optimala strömmen för fräsning krävs nano-arkitektur och se till att fokus och stigmation korrigeras korrekt. Förbered en matris med linjer med önskat mellanrum och längd för att täcka synfält av skaftet (500 μm sektioner). Justera linje längder som etsning får ner skaftet till de tunnare sektionerna.
Obs: när du etsning den funktionella elektroden, är det inte möjligt att lägga relaterat märken för att automatisera processen. Därför sker förflyttning mellan underavsnitten (~ 500 μm) manuellt. - Efter fräsning av det första avsnittet är klar, se till att kontrollera fräs kvaliteten innan du går vidare till nästa avsnitt. Upprepa steg 6,3 till etch nästa avsnitt av skaftet. Justera frästa linjer från föregående avsnitt till de mönster som används för nästa avsnitt för att förhindra stora luckor mellan körningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FIB etsad nano-arkitektur på ytorna av enstaka skaft intracortical sonder
Använda de metoder som beskrivs här, intracortical sonder var etsad med specifika nano-arkitekturer enligt etablerade protokoll39. Dimensioner och form av Nano-arkitektur design som beskrivs i dessa metoder genomfördes från tidigare in vitro-resultat som skildrar en minskning av gliaceller cell reaktivitet när odlade med nano-arkitektur design beskrivs här37,38. De metoder som beskrivs här utnyttjas en fokuserad gallium Ion beam (FIB) till etch nanoskala parallella spår i ytan av icke-funktionella enda skaft kisel mikroelektrod sonder, som tidigare beskrivits39. Den nanoskala parallella spåren var etsad längs skaftet av baksidan av sonden med hjälp av ett automatiserat skript skrivet i programvaran. De slutliga dimensionerna av den etsade nano-arkitekturen var 200 nm breda parallella linjer, fördelade 300 nm isär, och hade ett djup på 200 nm (figur 1). Användningen av FIB till etch nano-arkitekturer i en enhet yta möjliggör etsning av exakta mönster i tillverkade enheter.
Etsad nano-arkitektur till intracortical sonder effekt på neuroinflammation
I denna tidigare rapporterade data, den intracortical sonder med etsad nano-arkitekturer implanterades i cortex av råttor för antingen två eller fyra veckor (n = 4 per tidpunkt) och jämfört med kontrolldjur implanteras med släta sonder som innehåller inga nano-arkitektur etsningar (n = 4 per tidpunkt)39. En av mekanismerna för misslyckande hindrar den kliniska utbyggnaden av intracortical mikroelektroder är den neuroinflammatoriska reaktionen induceras från att störa hjärnparenkymet och blod-hjärnbarriären9,10,11,12,15. En fullständig beskrivning av den neuroinflammatoriska respons som observerats efter intracortical mikroelektrod implantation finns i följande recensioner13,14,22. Förmågan hos intracortical mikroelektroder att registrera åtgärder potentialer från nervceller är beroende av avståndet mellan friska neuronala organ från intracortical mikroelektrod inspelningsplats40. Därför utvärderade den tidigare rapporterade studien neuroinflammationen runt intracortical sond implantationsstället genom att kvantifiera histologiska markörer för neuronala densitet, glialcellsaktivering och genuttryck av proinflammatoriska markörer39. Höjdpunkter från denna studie presenteras nedan för att representera effekterna etsning nano-arkitekturer i sonden ytan hade på neuroinflammation.
Effekter av etsad nano-arkitektur på neuron densitet
För att avgöra hur etsning nano-arkitekturer i sonden yta effekter neuronala densitet omedelbart runt implantatet, den neuronala kärnor färgas och kvantifieras utnyttja tidigare beskriver immunohistokemi metoder39,41. Det fanns inga signifikanta skillnader i neuron densiteter runt nano-arkitektur och kontroll sonder vid 2 veckor efter implantation (figur 2A). Emellertid, det fanns betydligt fler nervceller runt nano-arkitekturen sonder på 100-150 μm avstånd från implantatstället jämfört med de släta kontroll implantaten (p < 0,05 vs kontroller) (figur 2B) vid 4 veckor efter implantation. Det konstaterades också att det fanns en ökad trend av neuronala densitet kring nano-arkitektur sonder över tid, kontrasterande den minskade trenden av neuronala densitet runt kontroll implantaten (figur 2). Det finns en direkt relation som skildrar en mildras neuroinflammatoriskt svar tillsammans med en högre densitet av livskraftiga nervceller som omger mikroelektroden, resulterar i en ökad förmåga för mikroelektroden att ge kvalitet inspelningar15,40,42. Därför, när man tolkar neuronala densitet data, en högre densitet av nervceller runt implantatplatsen kan tyda på en minskat neuroinflammatoriskt svar och potentiellt förbättrad inspelningskvalitet och stabilitet från intracortical mikroelektroder.
Effekter av etsad nano-arkitektur på neuroinflammatoriska molekylära markörer
Histologi är tillräckligt för att identifiera cellerna runt en implantat plats; emellertid, det saknar känslighet och specificitet för att karakterisera fenotyp av de omgivande cellerna. Därför användes metoder som utnyttjar kvantitativ gen uttrycks analys för att kvantifiera det relativa genuttrycket för neuroinflammatoriska markörer, för att förstå den effekt som nano-arkitekturen har på fenotypen i cellerna39. Flera neuroinflammatoriska markörer undersöktes i den tidigare rapporterade studien. Här kommer endast två att markeras som är specifika för mikroglia celler, för att diskutera hur deras fenotyp kan ha ändrats. Klustret av differentiering 14 (CD14) är en mönstra erkännande receptor på membranen av mikroglia som känner igen bakterier och signalerar den inflammatoriska vägen efter skada/implantation43,44,45. Kväveoxid syntas (NOS2), är en oxidativ stress markör uttryckt i mikroglia/makrofager som är förknippad med en ökad produktion av proinflammatoriska markörer46,47.
I de tidigare rapporterade uppgifterna fanns inga signifikanta skillnader i CD14 relativa genuttryck mellan nanoarkitektur och kontroll implantat vid antingen två eller fyra veckors efter implantation. I synnerhet sågs en signifikant minskning (p < 0,05) av CD14 relativa genuttryck från två till fyra veckor runt nanoarkitekturimplantatens anläggning, vilket indikerar en möjlig minskning av inflammationen (betecknade med * i figur 3a). Likaså, var inga signifikanta skillnader i NOS2 relativa genuttryck mellan nano-arkitektur och kontroll implantat på två veckor. Det var dock betydligt mindre (p < 0,05) NOS2 relativa genuttryck runt nano-arkitekturimplantatet jämfört med kontroll implantatet vid fyra veckor efter implantation (betecknade med # i figur 3B). Dessutom, det fanns en signifikant ökning från 2 till 4 veckor av NOS2 relativa genuttryck runt kontroll implantaten (betecknas med * i figur 3B), och inga skillnader observerades runt nano-arkitektur implantat över tid, ytterligare indikerar en potentiell minskning av inflammation runt nano-arkitektur implantat. Vid tolkningen av dessa data är det viktigt att förstå funktionen hos genen som kvantifieras. Till exempel indikerar minskningar av pro-inflammatoriska gener en sannolik minskning av det inflammatoriska svaret runt elektrod stället, medan en ökning av dessa typer av gener antyder en sannolik ökning av inflammationen.
FIB etsad nano-arkitektur på ytorna hos funktionella Enskafts mikroelektroder
Den tidigare rapporterade studien hade lovande resultat som visade en liten ökning av neuron densitet och den potentiella minskningen av mikroglia inflammatorisk fenotyp runt nano-arkitektur sonden implantat plats. För att undersöka översättningen av dessa resultat till elektrod funktioner, en funktionell enda skaft kisel mikroelektrod var etsad med samma nano-arkitektur design som den icke-funktionella enda skaft kisel mikroelektrod sonder, med hjälp av en liknande FIB etsning protokoll. Den enda skillnaden i metoden för etsning av den specificerade nano-arkitekturen var att protokollet för de funktionella elektroderna inte kunde automatiseras, eftersom det inte fanns något extra substratmaterial för att skapa relaterat märkningar. Således var den funktionella elektroden manuellt etsad med hjälp av FIB genom att justera balken varje 500 μm, som beskrivs i protokollet ovan. De slutliga etsningar var 200 nm breda parallella linjer, fördelade 300 nm isär, och hade ett djup på 200 nm (figur 4).
Effekter av etsad nano-arkitektur i intracortical mikroelektroder på elektrofysiologi
Framgångsrika intracortical mikroelektrod inspelningar är beroende av närheten av nervceller runt implantat platser, integriteten hos enheten och tillförlitlig överföring av enstaka enhet aktivitet från hjärnan8,40,48,49. Elektrofysiologiska inspelningar kvantifierades med hjälp av inspelade mätvärden som samlats in två gånger per vecka under åtta veckor. De mått som används i denna studie var, andelen kanaler som spelar in enstaka enheter, maximala amplituder av inspelade enheter och signal-brus-förhållande (SNR). Den institutionella djuromsorg och användning kommittéer (IACUC) vid Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center godkänt alla djurförsök. Sprague Dawley rats (8-10 veckor gammal och vägning ~ 225 g) implanterades med enda skaft kisel mikroelektrod, med den ovan nämnda nano-arkitektur (n = 1) eller släta kontroller (n = 6). Ingen statistisk analys utfördes på dessa data, eftersom det fanns en nano-arkitektur mikroelektrod implanteras för en proof-of-Concept pilotstudie. Icke desto mindre, kollektiva elektrofysiologiska resultat visar en ökad andel av kanalerna inspelning av enstaka enheter (figur 5a), maximala amplituder (figur 5B) av inspelade enheter, och SNR (figur 5C) från nano-arkitektur mikroelektroder jämfört med de släta kontroll mikroelektroder, är lovande. Dessa resultat tyder på att etsning av Nano-arkitektur i ytan av mikroelektroder kan potentiellt resultera i förbättrad kvalitet och ökad livslängd av elektrofysiologiska inspelningar. Ytterligare utvärdering med ökad urvalsstorlek är nödvändig för att kontrollera dessa preliminära resultat.
Figur 1: FIB etsad nano-arkitektur på ytorna på enstaka skaft intracortical sonder. SEM bilder av de icke-funktionella enda skaft kisel sonder med FIB etsade nano-arkitekturer längs baksidan av skaftet. (A) sammansatta bilder av hela sonden post etsning visas på 120x förstoring, Scale bar = 400 μm. Den relaterat märken, (fyrkantig ruta med en + symbol går igenom det), är etsad längs kisel substrat som omger sonden. Förstorade SEM bilder av sonden spetsen visas i (B) vid 1, 056x förstoring (Scale bar = 40 μm), (C) vid 3, 500X förstoring (Scale bar = 10 μm), och (D) vid 10, 000x förstoring, Scale Bar = 4 μm. Denna siffra har modifierats från referens39. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effekter av etsad nano-arkitektur på neuron densitet. Neuronal överlevnad presenteras som en procentandel av bakgrunden regionen från samma djur i avstånd av 50 μm lagerplatser bort från implantatplatsen. (A) inga signifikanta skillnader i neuronala överlevnad observerades mellan släta ytor (kontroll) och nanopatterned implantat vid 2 veckor efter implantation. (B) det fanns en signifikant högre neuronala överlevnad runt de nanopatterned implantaten vid 100-150 μm avstånd jämfört med släta ytor (p < 0,05) vid 4 veckor efter implantation. Representativa bilder av nervceller (färgade gröna), med den gula kontur som skildrar implantationsstället, och "P" som betecknar den etsade sidan av mikroelektroden, Scale bar = 100 μm. Denna siffra har modifierats från39. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekter av etsad nano-arkitektur på neuroinflammatoriska molekylära markörer. Vävnad samlades runt 500 μm radie av implantationsstället för både nanopatterned och kontroll implantat. Relativ genuttryck för inflammatoriska markörer jämfördes kvantitativt mellan båda implantat typerna (skillnaderna betecknas med # på grafen, p < 0,05) samt över tid (skillnaderna betecknas med * på grafen, p < 0,05). (A) relativ genuttryck för CD14 minskade signifikant runt nanopatterned implantat från två till fyra veckor (*). (B) det fanns en signifikant mindre relativ genuttryck av NOS2 runt nanopattern implantat jämfört med kontroll vid fyra veckor (#) och det fanns en signifikant ökning av NOS2 från två till fyra veckor runt mjuk kontroll implantat (*). Denna siffra har modifierats från referens39. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: FIB etsad nano-arkitektur på ytorna hos funktionella Enskafts mikroelektroder. Den infällt i det övre högra hörnet visar mikroelektroden utnyttjas i denna studie bredvid en dime att skildra storleken på elektrod skaft (tunn svart linje). SEM-bilder av mikroelektroderna skaft med FIB etsade nano-arkitekturer längs baksidan av skaftet. Hela skaftet visas högst upp på 600x förstoring (Scale bar = 50 μm), medan infälld skildrar nanopatterned yta vid 25, 000x förstoring, Scale bar = 1 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: effekter av etsad nano-arkitektur i intracortical mikroelektroder på elektrofysiologi. Utvärdering av elektrofysiologiska mätvärden upptäckte en lovande preliminär ökning av (a) procent av kanaler som spelar in enstaka enheter, (B) maximala amplituder av inspelade enheter, och (C) signal-brus-förhållande från mikroelektroden etsad med nano-arkitekturer jämfört med de släta kontroll elektroderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: elektrofysiologi inspelning från implanterade funktionella Enskafts mikroelektroder med FIB etsade nano-arkitekturer. En av utmaningarna med att använda FIB till etch nano-arkitekturer på tillverkade mikroelektrodapparater är risken för kortslutning av inspelnings kontakter. X-axeln skildrar inspelningstiden i sekunder, och y-axeln visar elektrod kanalerna som registrerar neuronala actionpotentialer. Varje numrerad linje på y-axeln representerar en annan elektrod kanal, med kanalnummer 1 som är den grundaste och 16 är den djupaste. De röda rutorna beskriver de kortsluten kanalerna, medan de blå rutorna skisserar kanaler med synlig neuronala aktivitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillverknings protokollet som beskrivs här använder fokuserad jonstråle litografi för att effektivt och reproducerbart etch nano-arkitekturer i ytan av icke-funktionella och funktionella enda skaft kisel mikroelektroder. Fokuserad jonstråle (FIB) litografi möjliggör selektiv ablation av underlaget ytan med hjälp av en finfokuserad jonstråle50,51. FIB är en direkt-skriva teknik som kan producera olika funktioner med nanoskala upplösning och hög bildförhållande50,52,53. För att skapa de olika storlek funktioner, kan omfattningen av jonstrålen ström optimeras för att ändra jonstrålen spot storlek inom ett område av 3 nm till 2 μm50,51. Några generella fördelar med att använda FIB till etch-funktioner på ytor är: 1) det kan användas på en mängd olika material, inklusive kisel, metaller och polymerer53,54,55,56, 2) FIB kan utföras på icke-plana ytor, och 3) FIB kan användas för efter bearbetning på enskilda enheter57.
Här, FIB användes i kombination med en SEM Mikroskop och programvara som används för att skriva ett specialiserat automatiserat skript för etsning specifika funktioner i icke-funktionella enda skaft sonder. Skriptet inkluderade parametrar som krävs (2,5 nA jonstråleström och 30 kV spänning) till etch det exakta avståndet önskas (200 nm wide parallella spår, fördelade 300 nm isär och 20 nm djup). Måtten på elektroden överskred synfält för FIB, så mönkning utfördes i flera steg positioner. För att automatisera processen, var relaterat märken etsad i sidan av kisel ark hålla sonderna på plats, så att programvaran för att exakt lokalisera de mönstrade linjerna på sonden skaftet. De fiducials var nödvändiga eftersom scenen rörelse skapade en stor (~ 5 μm) osäkerhet i placeringen av mönstret området med avseende på jonstrålen synfält. Placeringen av fiducials på kisel blad tillåts för FIB att lokalisera mönster områden utan direkt skanning av strålen på sonden skaft, som potentiellt kan förora eller skada sonden skaft. Hela automatiserad etsning process för ett skaft tog cirka 12 h för att slutföra och krävde ingen operatör ingripande efter mönkning startades. Kollektivt, fördelarna med att använda FIB till etch funktioner i kisel sond skaft var förmågan att göra nanometer stora funktioner, automatisera etsning processen, och kapacitet att etch på en fabricerad sond. Även FIB har kopiösa fördelar, en av nackdelarna med att använda denna tillverkningsmetod är den långsamma genomströmningen som i slutändan begränsar potentialen för massproduktion av enheter med nano-arkitekturer i deras yta58. Alternativt, andra tillverkningsmetoder utnyttjas för att skapa funktions storlekar och geometrier av intresse, kanske i snabbare takt och vid Mass produktioner, inkluderar elektronstråle litografi och Nanoimprint litografi59,60,61,62,63,64,65. Dessa metoder tillåter dock inte etsning av Nano-arkitekturfunktioner till tillverkade enheter. Traditionellt dessa metoder utnyttjas under tillverkningsprocessen på ett blad av kisel eller polymer, som sedan kan användas i nedströms bearbetning steg för att fabricera den slutliga bedra.
De funktionella elektroderna kunde inte genomgå en automatiserad process på grund av att inte ha något omgivande material runt elektroden skaft där att inkludera relaterat märken i körningen. Därför var de funktionella elektroderna manuellt justerade och etsade på 500 μm sektioner längs skaftet, med samma Jon ström och spänning som den automatiserade körningen för att säkerställa samma funktions storlekar. Strålen måste justeras manuellt efter varje 500 μm intervall och ställa in till etch nästa avsnitt. Processen för manuell omjustering av mönstren varje 500 μm kan potentiellt leda till skadade nanostrukturer eller strukturer som inte matchar den avsedda geometrin. Detta beror på längre exponeringstider jonstrålen behöver för manuell justering66. Detta var en av de svårigheter som uppstått med den manuella etsning. På grund av denna komplikation var två inspelnings kontakter kortslutna och kunde inte spela in neuronala actionpotentialer (figur 6). Figur 6 visar ett Elektro fysiologiskt liveinspelningssegment från djuret som implanterats med nanoarkitekturelektroden. De blå rutorna beskriva kanalerna inspelning starka åtgärder potentialer, i jämförelse med de röda rutorna som betecknar de två döda kanalerna. Därför är en av utmaningarna med att använda manuella FIB etsning på post-tillverkade elektroder att det finns en chans att strålen kan kortslutning kontakter och hindra dem från att spela in. Denna utmaning förstärks när man försöker etch på framsidan av enstaka skaft kisel elektroder, där inspelningen kontakter och spår är längs hela skaftet av elektroden. Även om det är möjligt att etch kisel runt inspelningen kontakter och spår, extra försiktighet rekommenderas att undvika skador och minskad prestanda inspelningskapacitet av elektroden.
Som tidigare nämnts kan FIB utnyttjas på olika material för att etch många funktions geometrier i ytan. Det är dock viktigt att notera att parametrarna till etch-geometrier, såsom linjer i olika material, är komplicerade att förutsäga. Särskilt för linjemönster, linjebredden och djupet är starkt beroende av många parametrar såsom accelererande spänning, balk ström, uppehållstid, pixel avstånd, livstid bländare och materialtyp. En annan parameter som är resultatet av optimeringen är total tid att mala varje rad. Smalare och djupare linjer kan uppnås med hjälp av mindre balk strömmar; dock skulle mönstret tid för en hel sond skaft sträcker sig till flera dagar, vilket inte är praktiskt. Även om det är möjligt att optimera det protokoll som presenteras här, skulle det därför vara ytterst svårt att beskriva parametrarna för okända material. Vid felsökning av parametrarna för de kisel sonder som beskrivs i detta protokoll gjordes många test nedskärningar i kisel för att utvärdera hur de förändrade förhållandena påverkade linjens bredd och djup. Så snart de utvärderade villkoren kunde etch den specifika funktionen storlek och geometri av intresse (200 nm breda linjer som var 200 nm djup), dessa parametrar användes för att skriva programvaru skriptet. Skriptet användes för att styra avståndet för varje rad, från centrum till centrum, som i detta protokoll är 300 nm. Framtida studier som utnyttjar kisel substrat/enheter som kräver funktions storlekar i hundratals nanometrar, kan använda parametrarna som beskrivs i detta protokoll som utgångspunkt för felsökning av de villkor som krävs för att skapa de önskade funktions storlekarna. Ytterligare optimering och felsökning av etsning villkor kommer att krävas för metall och polymer substrat/enheter. Sammantaget använder FIB för etsning nano-arkitekturer till material ytor möjliggör gott om kontroll och flexibilitet i funktionen geometrier, användning av många kompatibla material, och flera typer av yta, inklusive tillverkade enheter. Representativa resultat som presenteras häri visat de potentiella fördelarna som observerats i våra studier att utnyttja FIB till etch nano-arkitekturer i ytan av intracortical mikroelektroder: 1) ökad neuronala densitet och 2) minskning av neuroinflammatoriska markörer runt implanterade enheter med nano-arkitekturer, samt 3) preliminära resultat som skildrar förbättrad kvalitet av elektrofysiologiska inspelningar över tiden. Likaså kan sysselsättningen och optimeringen av det beskrivna protokollet etsning nano-arkitektur funktioner i ytan av ett material utnyttjas för att förbättra funktionaliteten hos många medicintekniska produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Förenta staterna (US) Department of Veterans Affairs rehabilitering forskning och utveckling Service Awards: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) och #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). Innehållet representerar inte synpunkter från US Department of Veterans Affairs eller USA: s regering. Författarna vill tacka FEI Co (nu en del av thermofisher Scientific) för personal hjälp och användning av instrumentering, som hjälpte till att utveckla de skript som används i denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
References
- Salcman, M., Bak, M. J. A new chronic recording intracortical microelectrode. Medical and Biological Engineering. 14 (1), 42-50 (1976).
- Im, C., Seo, J. -M. A review of electrodes for the electrical brain signal recording. Biomedical Engineering Letters. 6 (3), 104-112 (2016).
- Donoghue, J. Bridging the Brain to the World: A Perspective on Neural Interface Systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
- Gilja, V., et al. Clinical translation of a high-performance neural prosthesis. Nature medicine. 21 (10), 1142-1145 (2015).
- Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17849-17854 (2004).
- Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping in a person with tetraplegia through brain-controlled muscle stimulation: a proof-of-concept demonstration. Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
- Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neurosciences. 6 (1), 48-67 (2015).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Michelson, N. J., et al. Multi-scale, multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
- Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
- Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
- Ravikumar, M., et al. The Roles of Blood-derived Macrophages and Resident Microglia in the Neuroinflammatory Response to Implanted Intracortical Microelectrodes. Biomaterials. 0142 (35), 8049-8064 (2014).
- Hermann, J., Capadona, J. Understanding the Role of Innate Immunity in the Response to Intracortical Microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
- Ereifej, E. S., et al. Implantation of Intracortical Microelectrodes Elicits Oxidative Stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00009 (2018).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
- Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862 (2017).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 7 (3), 315-326 (1999).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
- Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11 (5), 056014 (2014).
- Wei, X., et al. Nanofabricated Ultraflexible Electrode Arrays for High-Density Intracortical Recording. Advanced Science. , 1700625 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Kim, Y., et al. Nano-Architectural Approaches for Improved Intracortical Interface Technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chemical Neurosciences. 1 (1), 36-48 (2010).
- Ding, H., Millet, L. J., Gillette, M. U., Popescu, G. Actin-driven cell dynamics probed by Fourier transform light scattering. Biomedical Optical Express. 1 (1), 260-267 (2010).
- Kotov, N. A., et al. Nanomaterials for Neural Interfaces. Advanced Materials. 21 (40), 3970-4004 (2009).
- Curtis, A. S., et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Trans Nanobioscience. 3 (1), 61-65 (2004).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5 (1), 13406 (2011).
- Ereifej, E. S., et al. Nanopatterning effects on astrocyte reactivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (6), 1743-1757 (2013).
- Ereifej, E. S., Cheng, M. M. -C., Mao, G., VandeVord, P. J. Examining the inflammatory response to nanopatterned polydimethylsiloxane using organotypic brain slice methods. Journal of Neuroscience Methods. 217 (1-2), 17-25 (2013).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
- Sladek, Z., Rysanek, D. Expression of macrophage CD14 receptor in the course of experimental inflammatory responses induced by lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. Veterinarni Medicina. 53 (7), 347-357 (2008).
- Janova, H., et al. CD14 is a key organizer of microglial responses to CNS infection and injury. Glia. , (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Ulevitch, R. J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell Science. 117 (14), 2865-2867 (2004).
- Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences. 75 (6), 639-653 (2004).
- Kozai, T. D., et al. Comprehensive chronic laminar single-unit, multi-unit, and local field potential recording performance with planar single shank electrode arrays. Journal of Neurosciences Methods. 242, 15-40 (2015).
- Kozai, T. D., et al. Mechanical failure modes of chronically implanted planar silicon-based neural probes for laminar recording. Biomaterials. 37, 25-39 (2015).
- Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. FIB-nanostructured surfaces and investigation of bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Transactions on Nanobioscience. 7 (1), 1-10 (2008).
- Lehrer, C., Frey, L., Petersen, S., Ryssel, H. Limitations of focused ion beam nanomachining. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures Processing, Measurement, and Phenomena. 19 (6), 2533-2538 (2001).
- Watkins, R., Rockett, P., Thoms, S., Clampitt, R., Syms, R. Focused ion beam milling. Vacuum. 36 (11-12), 961-967 (1986).
- Veerman, J., Otter, A., Kuipers, L., Van Hulst, N. High definition aperture probes for near-field optical microscopy fabricated by focused ion beam milling. Applied Physics Letters. 72 (24), 3115-3117 (1998).
- Lanyon, Y. H., Arrigan, D. W. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. Sensors and Actuators B: Chemical. 121 (1), 341-347 (2007).
- Menard, L. D., Ramsey, J. M. Fabrication of sub-5 nm nanochannels in insulating substrates using focused ion beam milling. Nano Letters. 11 (2), 512-517 (2010).
- Ziberi, B., Cornejo, M., Frost, F., Rauschenbach, B. Highly ordered nanopatterns on Ge and Si surfaces by ion beam sputtering. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (22), 224003 (2009).
- Reyntjens, S., Puers, R. A review of focused ion beam applications in microsystem technology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 11 (4), 287 (2001).
- Heyderman, L., David, C., Kläui, M., Vaz, C., Bland, J. Nanoscale ferromagnetic rings fabricated by electron-beam lithography. Journal of Applied Physics. 93 (12), 10011-10013 (2003).
- Baquedano, E., Martinez, R. V., Llorens, J. M., Postigo, P. A. Fabrication of Silicon Nanobelts and Nanopillars by Soft Lithography for Hydrophobic and Hydrophilic Photonic Surfaces. Nanomaterials. 7 (5), 109 (2017).
- Eom, H., et al. Nanotextured polymer substrate for flexible and mechanically robust metal electrodes by nanoimprint lithography. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (45), 25171-25179 (2015).
- Li, K., Morton, K., Veres, T., Cui, B. 5.11 Nanoimprint Lithography and Its Application in Tissue Engineering and Biosensing. Comprehensive Biotechnology. , 125-139 (2011).
- Dong, B., Zhong, D., Chi, L., Fuchs, H. Patterning of conducting polymers based on a random copolymer strategy: Toward the facile fabrication of nanosensors exclusively based on polymers. Advanced Materials. 17 (22), 2736-2741 (2005).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Wilkinson, C. D. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (4), 973-979 (2008).
- Tseng, A. A., Chen, K., Chen, C. D., Ma, K. J. Electron beam lithography in nanoscale fabrication: recent development. IEEE Transactions on Electronics Packaging Manufacturing. 26 (2), 141-149 (2003).
- Yang, Y., Leong, K. W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 478-495 (2010).
- Vermeij, T., Plancher, E., Tasan, C. Preventing damage and redeposition during focused ion beam milling: The "umbrella" method. Ultramicroscopy. 186, 35-41 (2018).
