Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Nous décrivons une méthode pour la caractérisation des transporteurs de membrane proton-conduits dans les préparations de vésicule de membrane produites par l'expression hétérologue dans E. coli et lysis des cellules utilisant une presse Français.

Abstract

Plusieurs méthodes ont été développées pour caractériser fonctionnellement les nouveaux transporteurs de membrane. Les polyamines sont omniprésentes dans tous les organismes, mais les échangeurs de polyamines dans les plantes n'ont pas été identifiés. Ici, nous dénoncons une méthode pour caractériser les antiporteurs de polyamine utilisant des vésicules membranaires générées par la lyse des cellules escherichia coli exprimant hétérolifèrement un antiporteur de plante. Tout d'abord, nous avons exprimé hétérossablement AtBAT1 dans une souche E. coli déficiente dans les transporteurs d'échange de polyamine et d'arginine. Les vésicules ont été produites à l'aide d'une presse Français, purifiée par ultracentrifugation et utilisée dans un procédé de filtration membranaire de substrats étiquetés pour démontrer la spécificité du substrat du transporteur. Ces essais ont démontré qu'AtBAT1 est un transporteur à médiation proton de l'arginine, de l'acide aminobutyrique (GABA), de la putrescine et de la spermidine. La souche mutante qui a été développée pour l'analyse d'AtBAT1 peut être utile pour l'analyse fonctionnelle d'autres familles d'échangeurs de polyamine végétale et animale. Nous émettons également l'hypothèse que cette approche peut être utilisée pour caractériser de nombreux autres types d'antiporteurs, tant que ces protéines peuvent être exprimées dans la membrane cellulaire bactérienne. E. coli est un bon système pour la caractérisation des nouveaux transporteurs, car il existe plusieurs méthodes qui peuvent être utilisées pour mutiler les transporteurs indigènes.

Introduction

Les protéines impliquées dans le trafic de métabolites constituent un niveau essentiel de régulation physiologique, mais la grande majorité des transporteurs de membranes végétales n'ont pas encore été caractérisés fonctionnellement. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre pour caractériser les nouvelles protéines de transport. L'expression hétérologue dans les organismes modèles tels que E. coli et les cellules eucaryotes telles que la levure, les ovocytes Xenopus, les cellules de mammifères, les cellules d'insectes et les cellules végétales ont tous été utilisés pour déterminer leur activité de transport1. Les cellules eucaryotes sont favorisées pour l'expression des protéines eucaryotes, parce que la composition cellulaire de base, les voies de transduire de signal, la transcription et les machines de traduction sont compatibles avec les conditions indigènes.

La levure a été un organisme modèle important pour la caractérisation de nouvelles protéines de transport chez les plantes. La première protéine de transport de plantes qui a été exprimée avec succès dans la levure (Saccharomyces pombe) était le transporteur de hexose HUP1 de Chlorella2. Depuis lors, de nombreuses protéines de transport de plantes ont été fonctionnellement caractérisées à l'aide d'un système d'expression de levure. Il s'agit notamment des transporteurs de sucre végétal (SUC1 et SUC23, VfSUT1 et VfSTP14) et les transporteurs d'auxin (AUX1 et PIN5). Les inconvénients de l'utilisation de levure pour exprimer les protéines végétales peuvent inclure l'activité altérée des protéines plastides localisées parce que la levure manque de cette organelle, mal cibler6, et la formation d'agrégats mal repliés et l'activation des réponses de stress dans la levure en raison de la surexpression des protéines membranaires7,8,9.

L'expression hétérologue des protéines de transport dans les ovocytes Xenopus a été largement utilisée pour la caractérisation électrophysiologique des transporteurs10. Les premières protéines de transport de plantes caractérisées à l'aide d'une expression hétérologue dans les ovocytes Xenopus étaient le canal de potassium D'Arabidopsis KAT110 et le transporteur d'hexose Arabidopsis STP111. Depuis lors, les ovocytes Xenopus ont été utilisés pour caractériser de nombreuses protéines de transport de plantes telles que les transporteurs de membrane splamine12, transporteur de saccharose vacuolaire SUT413 et transporteur de malate vacuolaire ALMT914. Une limitation importante des ovocytes Xenopus pour les essais de transport est que la concentration de métabolites intracellulaires ne peut pas être manipulée1. En outre, des connaissances professionnelles sont nécessaires pour préparer les ovocytes Xenopus et la variabilité des lots d'ovocytes est difficile à contrôler.

L'expression hétérologue dans l'organisme modèle E. coli est un système idéal en termes de caractérisation des nouvelles protéines de transport des plantes. Avec un génome entièrement séquencé15, les caractéristiques moléculaires et physiologiques d'E. coli sont bien connues. Les outils et les techniques moléculaires sont bien établis16. En outre, différents vecteurs d'expression, souches non pathogènes et mutants sont disponibles17,18,19. En outre, E. coli a un taux de croissance élevé et peut être facilement cultivé dans des conditions de laboratoire. De nombreuses protéines peuvent être facilement exprimées et purifiées en grandes quantités dans E. coli9. Lorsque les protéines ne peuvent pas être astorquées directement dans les systèmes cellulaires, la reconstitution des protéines en liposomes a également été une innovation réussie, bien que difficile pour la caractérisation des protéines membranaires purifiées. La caractérisation fonctionnelle des protéines de transport mitochondrial des plantes, y compris les transporteurs de solutés tels que les transporteurs de phosphate dans le soja, le maïs, le riz et l'arabidopsis, le transporteur de dicarboxylate-tricarboxylate dans Arabidopsis ont été accomplies en utilisant ce système modèle20,21. Cependant, les protéines recombinantes de la protéine de tomate SICAT9 se sont avérées non fonctionnelles dans les expériences de reconstitution, et d'autres membres de la famille de transporteur de CAT se sont avérés non fonctionnels dans Xenopus oocyte s'indique22. Ainsi, des outils moléculaires supplémentaires sont nécessaires pour la caractérisation des transporteurs de membranes.

Cinq systèmes de transport de polyamine se trouvent dans E. coli23. Il s'agit de deux transporteurs ABC médiateurs de l'apport de spermidine et de putrescine, d'un échangeur de putrescine/ornithine, d'un échangeur de cadaverine/lysine, d'un exportateur de spermidine et d'un importateur de putrescine. L'échangeur de putrescine PotE a été caractérisé à l'origine à l'aide d'un étosay vésicule, où l'intérieur des vésicules ont été préparés en lysing cellules avec une presse Français et de mesurer l'utilisation de putrescine radiolabeled dans les vésicules en échange de l'ornithine24. Des essais de vésicule ont également été utilisés pour caractériser un transporteur de calcium, qui a négocié le transport du calcium en réponse à un gradient de proton25. Ces expériences nous ont incités à développer une stratégie pour la caractérisation d'autres échangeurs de polyamines. Nous avons d'abord créé une souche de E. coli déficiente chez les échangeurs de PotE et de CadB. Ici, nous démontrons la caractérisation fonctionnelle d'un antiporteur de polyamine de plante par l'expression hétérologue dans la souche modifiée d'E. coli, la génération des vésicules de membrane utilisant une presse Français, et les essais radiolabeled.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Génération de l'E. coli Double Knock Out Mutant avec Transduction P1

  1. Obtenir les souches mutantes E. coli à un seul KO , PotE et CadB, du E. coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu).
    REMARQUE: La souche 'PotE est résistante à la kanamycine26 et la souche 'CadB' est résistante à la tétracycline27.
  2. Construire la souche PotE/CadB double knock-out (DKO) en utilisant le protocole de transduction P128.
    1. Préparation lysate
      1. Diluer une culture de nuit de 'PotE en LB frais (1:100) complétée par 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, et 0,1-0,2% de glucose.
      2. Cultivez à 37 oC pendant 1-2 h.
      3. Ajouter 40 ll de lysate phage P1 à la culture, et continuer à croître à 37 oC. Surveiller pendant 1-3 h jusqu'à ce que la culture ait lysé
        REMARQUE : Lorsque la culture est lysée, les débris cellulaires seront visibles dans le tube et la culture aura une perte significative de turbidité.
      4. Ajouter plusieurs gouttes de chloroforme (50-100 l) au lysate et au vortex. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 2 min pour enlever les débris cellulaires et transférer le supernatant dans un tube frais.
    2. Transduction
      1. Cultivez la souche CadB pendant la nuit dans le milieu LB.
      2. Récoltez les cellules par centrifugation à 4 000 x g pendant 2 min et suspendez en 1/5-1/3 le volume de culture récolté en LB frais complété de 100 mM MgSO4 et 5 mM CaCl2.
      3. Ajouter la suspension de la cellule de CadB au tube avec le phage de l'étape 1.2.1.4 et mélanger rapidement.
      4. Ajouter 200 oL de 1 M Na-Citrate (pH5.5), puis ajouter 1 ml de LB. Incubate à 37 oC pendant 1 h pour permettre l'expression du marqueur résistant aux antibiotiques.
      5. Spin cellules à 4000 x g pendant 5 min.
      6. Resuspendre dans 100 Lb ll supplémé avec 100 mM Na-Citrate (pH 5.5) et vortex bien pour disperser les cellules.
      7. Sélectionnez les souches recombinantes sur les plaques d'agar LB avec une kanamycine de 50 g/mL et une tétracycline de 10 g/mL, puis confirmez par Polymerase Chain Reaction (PCR) avec des amorces appropriées26,27.
      8. Vérifier les fragments de PCR par séquençage.

2. Expression du gène cible (AtBAT1) dans E. coli Mutant

  1. Amplifiez la séquence intégrale du gène cible par PCR et insérez dans le vecteur d'entrée de la passerelle pENTR/D-TOPO29.
    REMARQUE: Dans ce cas ATBAT1.1 a été amplifié à l'aide de l'amorce avant 5'CGGCGATCAATCCTTTTTGTT et amorce inverse 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, une dénaturation initiale à 98 oC pendant 2 min, puis 30 cycles de dénaturation à 98 oC pour 0,1 min, annealing à 59 oC pour 0,3 min, extension à 72 oC pour 0,40 min et extension finale à 72 oC pour 10 min. Le produit PCR a été purifié à l'aide d'un kit de nettoyage PCR, quantifié à l'aide d'un spectromètre. L'insertion du produit PCR dans le vecteur Gateway a été effectuée en suivant les instructions des manufactrurers.
    1. Transformez le vecteur d'entrée en cellules E. coli Top10 compétentes par choc thermique et sélectionnez pour des recombinants réussis sur les supports LB avec une kanamycine de 50 g/mL suivant les protocoles de clonage moléculaire standard30.
    2. Extraire l'ADN plasmide à l'aide d'un kit d'extraction de plasmide, en suivant les instructions du fabricant, et la séquence pour confirmer l'insertion correcte.
  2. Transférer le gène cible dans le vecteur de destination E. coli, pBAD-DEST49 par le clonage Gateway LR pour créer un vecteur d'expression29.
    1. Transformez le vecteur d'expression en cellules Compétentes Top10 E. coli par choc thermique pendant 30 s et sélectionnez des recombinants réussis sur les supports LB avec une ampicilline de 100 g/mL30.
    2. Extraire l'ADN plasmide30 et la séquence pour confirmer l'insertion correcte.
  3. Transformez le vecteur d'expression en E. coli 'potE740(del)::kan, 'cadB2231::Tn10 et sélectionnez sur les plaques LB avec ampicilline, kanamycine, et tétracycline30.
  4. Afin de déterminer la concentration optimale d'arabinose pour l'induction, exprimez le gène cible sous le contrôle du promoteur araBAD dans les médias LB avec des concentrations de gradient d'arabinose comme décrit29.
  5. Recueillir les granulés cellulaires et évaluer l'expression des protéines par SDS-PAGE et la visualisation des bandes protéiques telles que décrites dans le manuel du produit29.
    REMARQUE: L'E. coli 'potE740(del)::kan, 'cadB2231::Tn10 a été utilisé comme échantillon témoin sans expression BAT1. E. coli double knock out cellules mutantes avec le vecteur vide pBAD-DEST49 n'a pas été utilisé comme un contrôle en raison de la présence du gène ccdB dans le vecteur.

3. Génération de vésicules membranes intérieures

  1. Culture les cellules mutantes E. coli exprimant la protéine cible en cultivant une seule colonie du jour au lendemain dans 5 ml de médias sans polyamine (2 % de glycérol, 6 g de K2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, NH4Cl, 50 mg de thiamine, 0,79 g de levure complète adénite synthétique adenine hémisulfate (10 mg/L), L-Arginine (50 mg/L), L-Aspartic acid (80 mg/L), L-His monohydrate d'hydrochlorure (20 mg/L), L-Leucine (100 mg/L), hydrochlorure de L-Lysine (50 mg/L), L-Méthionine (20 mg/L), L-Phenylalanine (50 mg/L), L-Thréonine (100 mg/L), L-Tryptophane (50 mg/L), L-Tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Transférer cette culture à 500 ml de médias sans polyamine complétés par 0,0002% arabinose et de croître jusqu'à ce que la culture cellulaire atteint un OD600 de 0,6-0,8 (généralement 5 h).
  2. Recueillir le granule cellulaire par centrifugation à 2 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Resuspendre la pastille et laver trois fois avec 0,1 M tampon de phosphate de potassium, pH 6,6, contenant 10 mM EDTA (Buffer 1). Le volume final des cellules dans le tampon 1 après la troisième rotation doit être de 10 ml.
  3. Générez des vésicules de membrane à l'intérieur par Français traitement pressisme (10 000 p.s.i.) des cellules intactes à l'aide d'une cellule de pression Français de 35 ml.
  4. Avant de charger l'échantillon dans la cellule de pression Français standard, lubrifiez le piston et les anneaux O pour faciliter l'insertion dans la cellule.
    Note:Ces instructions sont spécifiques à l'utilisation de la cellule de pression standard31.
    1. Vissez soigneusement le bouchon de fermeture dans l'extrémité inférieure de la cellule. Assurez-vous que la cellule est à droite vers le haut en fonction du lettrage sur le côté de la cellule. Insérez le piston dans la cellule et déplacez-le dans la cellule, jusqu'à ce que la ligne de remplissage maximale sur le piston atteigne le sommet du piston. Retournez l'unité et placez-la sur le stand fourni entre les trois poteaux.
    2. Verser la suspension cellulaire dans le corps de la cellule.
      REMARQUE: Nous avons utilisé seulement 10 mL, donc il y aura beaucoup de place à gauche dans la chambre de cellules de pression Français, qui a une capacité de 35 ml.
    3. Montez la cellule de pression standard sur l'unité de cellule de pression Français.
      1. Vérifiez d'abord que le courant est coupé. Sur le côté gauche du panneau se trouve le commutateur Ratio Selector. Il a trois positions: Vers le bas à la fin de la course, faible pour l'utilisation d'une cellule de pression plus petite, et élevé pour une utilisation avec la cellule de pression standard Français. Si la presse Français a déjà été utilisée avec la cellule plus petite, le piston peut ne pas être entièrement rétracté. Définir ce commutateur vers le bas.
    4. Allumez la machine avec l'interrupteur sur le RHS à l'arrière de l'appareil et tournez l'interrupteur Pause-Run en position Run. Cela se traduira par le piston étant entièrement rétracté. Déplacez l'interrupteur vers Pauseet éteignez la machine.
    5. Desserrer les vis de pouce et déplacer la pince de sécurité qui s'étend à deux colonnes en acier inoxydable sur le côté. Il va se balancer vers la droite. Avec une main tenant la base de la prise de fermeture en place, choisissez la cellule de pression Français avec les deux mains, et tournez-la 180 degrés, de sorte que le piston est maintenant en position verticale. Placez-le sur la plate-forme et déplacez la pince de sécurité en place afin que cette pince tienne la cellule de pression Français en position.
    6. Notez que l'assemblage de la soupape de débit sur le bouchon de fermeture doit être accessible à l'urotant et positionné de façon à ce que la vanne puisse être tournée librement. Ouvrez l'assemblage de la soupape d'écoulement avec quelques virages dans le sens des aiguilles d'une montre. Placez les bras du piston de sorte qu'ils soient orientés dans une position de deux heures et huit heures. Serrez les vis des pouces de sorte que la cellule de pression standard est maintenue en place.
    7. Insérez le tube de sortie de l'échantillon dans le bouchon de fermeture et connectez un court morceau de tube flexible afin que les débris cellulaires brisés puissent être recueillis dans un tube de faucon. Nous utilisons habituellement un bécher rempli de glace de 300 ml pour tenir le tube de faucon à la verticale, et pour garder les débris cellulaires au frais.
    8. Assurez-vous que l'interrupteur Pause-Run est réglé sur Pause, et l'assemblage de la soupape est en position ouverte. Retournez la machine sur, adust le commutateur de sélecteur de ratio à haut,et tournez la valve d'augmentation de pression sur le panneau avant vers la droite environ un demi-tour.
    9. Le piston va commencer à s'élever de la base pour déplacer l'air dans la chambre. Dirigez l'air sortant du tube Tygon attaché au tube de sortie de l'échantillon vers le tube du bécher.
    10. Lorsque les premières gouttes de liquide sortent, fermez l'assemblage de la soupape d'écoulement en le tournant dans le sens des aiguilles d'une montre. Cela crée un joint métallique à métal, avec la cellule de pression, alors ne pas trop serrer.
    11. L'avant de la presse Français a un tableau sur le panneau avant pour générer la pression appropriée sur les cellules biologiques à l'intérieur de la cellule de pression. Dans ce cas, augmenter la pression en tournant la valve d'augmentation de pression dans le sens des aiguilles d'une montre, jusqu'à ce que la jauge atteigne 640 psi. Cela créera une pression interne de 10.000 psi.
    12. Une fois que la cellule a atteint la pression cible, ouvrez légèrement l'assemblage de la soupape d'écoulement en la tournant dans le sens inverse des aiguilles d'une montre. Ajuster l'ouverture de la vanne pour permettre un débit d'environ 10 gouttes par min.
    13. Lorsque la ligne d'arrêt sur le corps de piston atteint le sommet de la cellule d'écoulement. Passez le commutateur Pause-Run à Pause. Ceci est essentiel parce que le fait d'avoir le piston inséré plus loin dans la cellule endommagera l'unité. Ouvrez l'assemblage de la soupape d'écoulement et recueillez les gouttes restantes.
    14. Tournez Le commutateur de sélecteur de ratio vers le bas,puis configurez le commutateur pause run pour exécuter. Lorsque la plaque inférieure est entièrement rétractée définir le commutateur De course à pause, et éteindre la machine.
    15. Retirer la cellule de pression Français de la Français presser, et démonter pour le nettoyage. Conserver toutes les pièces sèches avec une légère couche de glycérol. Retirez et remplacez les joints ou les joints par des signes d'usure.
  5. Enlever les cellules ininterrompues et les débris cellulaires de la Français appuyez sur l'élude par centrifugation à 10 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Jeter la pastille et transférer le supernatant dans des tubes à ultracentrifuge.
  6. Vésicules de membrane pelletdueuses du supernatant résultant par ultracentrifugationat 150.000 g pour 1 h à 4 oC.
  7. Laver les vésicules membranaires une fois, sans résuspension, dans 1 mM Tris-maleate, pH 5,2 contenant 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoethanol et 10% de glycérol et resuspendre dans le même tampon (Buffer 2)23 à l'aide d'un broyeur de tissu Dounce. Typiquement, la fraction de membrane de 500 ml de culture serait suspendue dans 5 ml de tampon, et une concentration de 5-10 mg de protéine membranaire / mL en utilisant l'analyse d'acide biochinique32.
  8. Entreposer 100 aliquots ll de préparations membranaires à -80 oC dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml.

4. Western Blot et orientation de l'assay de transporteur

  1. Laver et resuspendre les vésicules de l'étape 3.7 dans 30 mM Tris pH 7,8 - 0,1 mM CoCl2.
  2. Pour 100 échantillons ll, ajouter 1 an l de 2 mg/mL de carboxypeptidase A en 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Inculer pendant 20 min à 20 oC. Arrêter la digestion en ajoutant 5 'L de 0.5 M NaEDTA, 0.5 M 2-mercaptoethanol pH 7.5.
  4. Pour inactiver complètement l'enzyme, incuber la solution pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE: Les vésicules sans le traitement catboxypeptidase A ont été employées comme contrôle.
  5. Analyser des échantillons par électrophoresis en présence de sulfate de dodecyl au lithium. Ajouter 5-10 'L de 150 mg/mL de sulfate de dodecyl de lithium, 450 mg/mL de glycérol, 0,1 mg/mL bleu bromophenol, 0,4 M Tris pH 7,5 à 100 l d'échantillon.
  6. Effectuer l'immunoblotting en posant un filtre de nitrocellulose humidifié avec 25 mM de sodium-hydrogène phosphate pH 7.5 sur le gel de polyacrylamide. Placez-les entre deux filtres de cellulose humidifiés et enfin entre deux tampons d'affouillement en plastique humidifiés. Placez cet assemblage entre les électrodes d'une chambre contenant 25 mM de phosphate de sodium-hydrogène pH 7,5 à 2-4 oC.
  7. Laisser l'électrotransfert des protéines se poursuivre pendant 3 h à 20 V et 2-3 A.
  8. Bloquer la membrane de nitrocellulose pendant la nuit à 2 oC dans un tampon de blocage de 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 et 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Incuber le filtre à nitrocellulose pendant 2 h avec une dilution de 1:5000 d'anticorps Anti-His (terminal C) -HRP dans le tampon de blocage (20 ml) et laver deux fois avec 50 ml de tampon pour un total de 60 min.
  10. Pour visualiser l'immunoblot, dissoudre 6 mg de 4-chloro-1-naphthol dans 20 ml d'alcool dénaturé et ajouter 80 ml de 15 mM Tris pH 7,5 et 50 'L de 30% H2O2. Baigner le papier filtre dans la solution de substrat pendant 20 min. Le réactif réagira avec l'anticorps pour former un précipité bleu sur la membrane de nitrocellulose. Lorsque la couleur est suffisante, rincez la membrane avec de l'eau et laissez sécher.

5. Etoiles de transport

  1. Incuber 100 aliquots ll de vésicules membranaires à 12 oC pendant 5 min.
  2. Initier le transport en ajoutant des polyamines radio-étiquetées aux vésicules membranaires à une concentration finale de 50 M (sauf indication contraire). Faire 3solutions H-substrate (spermidine ou putrescine) dans un tampon d'assiducomposé de 10 mM Tris-HCl, 10 mM de phosphate de potassium, pH 8,0 et 0,14 M KCl23 (Buffer 3) avec modifications selon le titre.
  3. Effectuer des tests de transport pendant 1 min à 12 oC dans des tubes de microfuge de 1,5 ml.
  4. Après 1 min, transférer les mélanges de réaction dans le collecteur de filtration et filtrer à travers un filtre à membrane de nitrocellulose de 0,45 m.
    1. Ajouter 3 ml de tampon d'assay glacé contenant une concentration 10 fois plus élevée de polyamines non étiquetées suivie de 3 ml de tampon d'assay sans polyamines pour réduire la liaison non spécifique.
    2. Transférer les filtres lavés dans des flacons de scintillation jetables de 20 ml contenant 10 ml de liquide de scintillation et déterminer la radioactivité à l'aide d'un compteur de scintillation liquide. Le compteur de scintillation mesure la radioactivité dans l'échantillon et la signale comme des désintégrations par min (dpm).
  5. Calculer l'apport net en polyamine comme la différence entre l'apport à 1 min par les vésicules incubées à 12 oC et l'apport à 0 min par les vésicules incubées sur la glace.
    REMARQUE: La masse de substrat importée dans les vésicules est calculée comme suit. Si le volume de l'échantillon dans le tube de microfuge est de 0,2 L et que la concentration de départ du substrat est de 100 M, la masse totale du substrat dans le tube de microfuge est de 20 x 10-12 M. En raison de l'activité spécifique très élevée des substrats étiquetés commercialement (souvent 2,22 x 109 dpm/mM), la masse de l'isotope ajouté peut être ignorée dans le calcul. Donc, si la quantité totale d'isotopes qui a été ajouté au tube de microfuge était de 100 x 106 dpm et que les vésicules avaient une consommation nette de 1 000 dpm, alors la masse totale de substrat prise par les vésicules était de 1 % du nombre total de grains de beauté ou de 2 x 10-13 M.
    1. Déterminer le km pour le substrat en mesurant l'apport de 10, 25, 50, 250 et 500 m de substrat radio-étiqueté en vésicules exprimant la protéine cible. Calculez la cinétique Michaelis-Menten à l'aide d'une méthode de régression non linéaire à l'aide du modèle Michaelis Menton du logiciel statistique34.
  6. Pour les expériences de compétition, ajoutez 100 M, 500 M, 1 mM, 1,5 mM ou 2 mM de substrat concurrentiel non étiqueté fabriqué dans le tampon d'essai au tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 100 degrés L de vésicules à 12 oC.
    1. Ajouter simultanément la polyamine radiolabeled (50 'M) au tube de microcentrifuge.
    2. Mesurez la radioactivité emprisonnée à l'intérieur des vésicules mentionnée susmentionnées en répétant les étapes 5 à 5.4.2.
    3. Déterminer les polyamines radio-étiquetées k m( Km,app)apparentes pour les substrats concurrentiels en mesurant l'utilisation de 10, 25, 50, 250 et 500 polyamines radio-étiquetées en présence de 100 m ou plus de substrat non étiqueté et en utilisant une méthode de régression non linéaire pour tracer la courbe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les principales étapes de ce protocole sont résumées de façon picturale à la figure 1. En bref, les cellules E. coli déficientes chez tous les échangeurs de polyamines et exprimant AtBAT1 sont cultivées, centrifugeuses, lavées à l'aide d'un tampon et soumises à la lyse cellulaire à l'aide d'une presse Français. La lyse a tendance à produire des vésicules qui sont la plupart du temps à l'intérieur-extérieur et piéger le tampon à l'extérieur des cellules. Les débris cellulaires sont enlevés par centrifugation, et une deuxième étape d'ultracentifugation est utilisée pour recueillir une pastille membranaire. La pastille membranaire est remise en suspension dans le pH tampon De Tris-Maleate 5.2 et stockée à -80 oC. Les essais de transport se font à 12 oC, ce qui s'est avéré optimal pour maintenir la stabilité de la membrane. Les essais sont initiés par l'ajout de substrat scénarisé radioet et un déplacement du pH de la suspension tampon des vésicules au pH 8.0. Après 1 min, un tampon d'ascompte d'assay glacé avec des substrats non étiquetés est ajouté pour arrêter l'entrée de la radiolabel dans les vésicules. Les vésicules radio-étiquetées sont piégées par filtration par les membranes de nitrocellulose. Les membranes sont transférées aux flacons de scintillation et l'étiquette radio sur les membranes est déterminée par le comptage de scintillation liquide.

Une tache occidentale est utilisée pour vérifier qu'AtBAT1 est translovété e dans des vésicules (figure 2). Sonder la tache avec un anticorps Anti-His C-terminal a révélé une protéine de fusion de construction d'environ 72,3 kDa (Figure 2, Lane 2). La digestion des vésicules avant SDS-PAGE a entraîné une dimunition, mais pas une perte complète du signal de la sonde (Figure 2, voie 3). La diminution du signal de la sonde à la suite de carboxypeptidase A suggère que la plupart des résidus C-terminal sont à l'extérieur des vésicules.

Dans ce système d'essais, les vésicules sont suspendues dans un tampon au pH 5.2 de sorte que le pH à l'intérieur des vésicules équilibre avec le tampon. Le transport du substrat radio-étiqueté dans les vésicules au pH 5.2 est amorcé en suspendant les vésicules dans un tampon pH 8.0, créant ainsi un gradient de pH de pH 2,8 à travers la membrane. À 12 oC, l'apport en spermidine radio-étiqueté par les vésicules était le plus élevé à 1 min, et est resté linéaire au-dessus de 3 min (figure 3A). Par conséquent, le temps d'incubation pour l'arrêt de transport a été fixé à 1 min. Pour tenir compte de la liaison non spécifique de la radiolabel, les vésicules ont été incubées à 0 oC en présence de substrat radio-étiqueté pendant une minute, et ces dénombrements ont été soustraits de l'utilisation de ladiolabel à des températures plus élevées.

La figure 3B montre l'apport de spermidine radio-étiquetée dans les vésicules au bout d'une minute. Il n'y avait pas d'apport net d'isotopes par les vésicules membranaires qui ont été préparées et stockées au pH 8,0, car il n'y avait pas de gradient de proton s'étendant sur la membrane vésiculeuse. Pour démontrer l'effet de la dissipation du gradient artificiel de proton, les vésicules de membrane ont été incubées dans le tampon de pH 8.0 pendant 10 min avant l'addition du substrat étiqueté25. Dans ces conditions, une prise minimale de substrat radiolabeled a été montrée. L'utilisation de spermidine radio-étiquetée était également minime dans les vésicules préparées avec des cellules E. coli déficientes chez les échangeurs de polyamine CadB et PotE. Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'apport en protons de spermidine était dû à la protéine BAT1 (Figure 3A,B).

Pour déterminer la spécificité du substrat de la protéine, les valeurs de Km ont été calculées en mesurant l'apport du substrat radio-étiqueté à des concentrations de 10, 25, 50, 100, 250 et 500 m. Les Km pour la spermidine, la putréscine et l'arginine étaient de 55 à 12 M, 85 à 20 M et 1,4 à 0,5 mm, respectivement, ce qui indique que cette protéine est un échangeur de polyamine et d'arginine à forte affinité ( figure4).

L'affinité du transporteur pour un substrat particulier peut également être déterminée indirectement en utilisant des tests de concurrence. Ici, nous avons utilisé deux méthodes pour évaluer la concurrence entre deux substrats. Dans la première méthode, l'utilisation de 50 m de spermidine radio-étiquetée a été mesurée en présence de concentrations croissantes du substrat concurrent non étiqueté(figure 5A). Dans la deuxième méthode, le Km apparent pour la spermidine a été calculé en mesurant l'utilisation de concentrations croissantes de spermidine radio-étiquetée en présence de 100 m de substrat concurrent non étiqueté(figure 5B). Les tests de concurrence ont révélé que le GABA est un inhibiteur concurrentiel de la spermidine avec un Km,app de 164 à 15 m(figure 5A,B). De plus, la mesure de l'apport de 50 m de spermidine radio-étiquetée en présence de différentes concentrations d'acides aminés différents a révélé qu'AtBAT1 est également capable de transporter le glutamate et l'alanine à des concentrations de mM (figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la méthode. (A) Représentation schématique décrivant les étapes clés de la préparation et de la purification des vésicules membranaires de E. coli. (B) Représentation schématique décrivant les étapes clés de l'action de transport des préparations de vésicules membranaires à l'aide de substrats radio-étiquetés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : tache occidentale montrant l'expression d'AtBAt1 dans les vésicules purifiées. Des bandes ont été visualisées utilisant l'anticorps conjugué de peroxidase de raifort anti-Son (C-term)-HRP. Lane 1, échelle de protéines présaisées. Lane 2, Vésicules purifiées exprimant AtBAT1.1 montrant une bande de la taille prévue de la protéine de fusion. La voie 3, vésicules purifiées exprimant AtBAT1.1 ont été prétraitées avec la carboxypeptidase A avant l'électrophorèse de SDS et le ballonnement occidental. Des quantités équivalentes de vésicules (protéines) ont été ajoutées à chaque voie. Une diminution de la coloration indique que le c-terminal de la protéine dans la plupart des vésicules est dégradé par la digestion de la protéase. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Activité de transport des vésicules montrant l'effet de l'expression des protéines BAT1 et l'importance d'un gradient de pH. (A) L'adoption dépendante du temps de 3H étiqueté spermidine dans les vésicules exprimant BAT1 avec un pH interne de 5,2 et introduit à un tampon au pH 8.0. Dans l'assidu, les vésicules ont été ajoutées au tampon d'assay au pH 8,0, 10 min avant l'ajout de 3H étiquetés spermidine pour permettre la dissipation du gradient de proton. Ensuite, l'apaisement de l'étiquette radio dans les vésicules a été évalué sur un intervalle de 1 min. (B) Prise de 3H étiquetée spermidine en présence d'un gradient de proton (pH interne de 5,2), en l'absence d'un gradient de proton (pH interne de 8), dans les vésicules ajoutées à la solution d'assay 10 min avant l'ajout de spermidine radio-étiquetée et dans les vésicules fabriquées à partir de cellules mutantes E. coli n'exprimant pas BAT1. L'apport en vésicules a été surveillé pendant 1 min. Toutes les valeurs sont présentées comme moyennes et SE de cinq répliques. L'analyse des données a été effectuée à l'aide du test t de l'élève et indique une différence significative par rapport au contrôle (valeurp lt; 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Essais in vitro de l'activité de transport de polyamine et d'arginine de BAT1. (A) Les valeurs De Km pour l'uptake de spermidine et de putrescine sont respectivement de 55 à 12 m et de 85 à 32 m. (B) Le Km pour l'apport en arginine est de 1,4 à 0,5 mM. Toutes les valeurs sont présentées comme moyennes et SE de cinq répliques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : LE GABA est un inhibiteur concurrentiel du transport de Spermidine par BAT1. (A) La prise de 3H étiquetée spermidine par les vésicules exprimant AtBAT1.1 a été considérablement réduite en présence de 100 M ou 500 M GABA. (B) Le Km apparent pour l'utilisation de spermidine par BAT1.1 a été augmenté à 164 - 20 M en présence de 100 M GABA. Toutes les valeurs sont présentées comme moyennes et SE de cinq répliques. L'analyse des données a été effectuée à l'aide du test t de l'élève et indique une différence significative par rapport au contrôle (valeurp lt; 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Le glutamate et l'alanine sont des inhibiteurs concurrentiels du transport de spermidine par BAT1. L'utilisation de Spermidine a été sensiblement réduite en présence du glutamate non étiqueté de 1 mm et de l'alanine non étiqueté de 1 mm et de 1,5 mM non étiqueté. Toutes les valeurs sont présentées comme moyennes et SE de cinq répliques. L'analyse des données a été effectuée à l'aide du test t de l'élève et indique une différence significative par rapport au contrôle (valeurp lt; 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans la présente étude, nous dénoncions une méthode pour la caractérisation d'un antiporteur en exprimant d'abord la protéine dans E. coli, puis en générant des vésicules membranaires, de sorte que la protéine hétérogène peut être astoyée dans un système sans cellules. En plus de l'équipement trouvé dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire, cette stratégie nécessite l'utilisation d'une presse Français, d'un ultracentrifuge et de l'accès à une installation pour effectuer des essais radio-isotopes.

Une exigence de base de cette technique est que la protéine hétérologue est correctement ciblée sur la membrane plasmatique de E. coli. Cette stratégie peut également être utile pour l'analyse fonctionnelle des transporteurs organellar puisque le transporteur de glucose plastide ADP a été localisé avec succès à la membrane de cellules d'E. coli et fonctionnellement caractérisé35. Le vecteur (pBAD-DEST49) utilisé dans ces expériences contient une protéine de thioredoxine N-terminale pour augmenter la solubilité du produit traduit. Des fusions N-terminal es d'une petite protéine De. subtilus mystique, ont été trouvées pour permettre un ciblage plus efficace des transporteurs de membrane à la membrane cytoplasmique36. Cependant, les événements de mauvais pliage, et l'échec des protéines à être correctement intégrées dans la membrane cytoplasmique sont des problèmes potentiels qui empêchent l'utilisation de systèmes d'expression bactérienne pour de nombreux types de transporteurs1.

Les vésicules membranaires ont également été utilisées pour caractériser les transporteurs végétaux37,38. Comme les vésicules n'ont pas les sources d'énergie essentielles telles que l'ATP et les enzymes, l'interférence des transporteurs actifs et d'autres activités métaboliques est minime. Ainsi, ce système est idéal pour l'analyse des translocations passives telles que les échangeurs de métabolites. Les vésicules membranaires, en particulier, peuvent être appliquées à la caractérisation des exportateurs et des antiporteurs puisque la composition de la solution interne peut être manipulée en modifiant la composition du tampon 1. De plus, l'utilisation de Français presse ou de sonication par ultrasons est assez efficace pour générer des vésicules membranes à l'intérieur à partir de cellules E. coli intactes. 95% des vésicules générées par la sonication par ultrasons ou Français presse ont des membraneseverted 39,40. PotE, l'antiporteur E. coli de la putréscine et de l'ornithine, a été le premier antiporteur de polyamine qui a été caractérisé à l'aide de vésicules à membrane intérieure23. Nous avons utilisé la transduction P1 pour créer une souche mutante spécifique pour la caractérisation d'un antiporteur de polyamine, et cette souche peut être utile pour la caractérisation d'autres échangeurs de polyamine animale, fongique ou végétale. Nous envisageons également que d'autres souches d'E. coli avec deux suppressions de gènes ou plus pourraient être utiles pour la caractérisation d'autres transporteurs d'échange de plantes et d'animaux utilisant des vésicules membranaires.

L'étape la plus critique de ce protocole est l'expression de la protéine dans le système mutant E. coli. Un vecteur d'expression E. coli avec un promoteur inductible est utilisé pour promouvoir une régulation serrée et dépendante de la dose de l'expression hétérologue du gène. La présence d'étiquettes terminales N et C telles que sa thioredoxine, l'épitopie V5 ou 6xHis dans le vecteur est utile pour la détection et la purification de la protéine. En outre, la présence d'une protéine de fusion de thioredoxinquine qui est un composant du vecteur pBAD49, peut augmenter l'efficacité de la traduction et, dans certains cas, la solubilité des protéines eucaryotes exprimées dans E. coli41. Les différents choix de codon dans Arabidopsis et E. coli pourraient remettre en question l'expression des protéines chez E. coli. On sait que l'optimisation du codon peut augmenter de façon impressionnante l'expression des protéines hétérozygotes chez E. coli42. Dans l'analyse de vésicule, le codon optimisé AtBAT1.2 a montré une activité d'échange plus élevée que le non-codon optimisé AtBAT1.1 dans les cellules d'E. coli (données non montrées), démontrant que l'optimisation de codon a été utile pour augmenter l'expression et la fonction des protéines hétérologiquement exprimées dans les cellules bactériennes. La production de vésicules membranaires par un ajustement soigneux de la valve pour maintenir un lent, même goutte à goutte de cellules lysées est également une étape clé dans la procédure. Après l'ultracentrifugation, nous avons constaté que la suspension des vésicules membranaires dans un homogénéisateur Dounce minimise la variation de l'échantillon entre les aliquots des vésicules membranaires qui sont préparées et stockées par la suite à -80 oC.

Une limitation des systèmes d'expression E. coli est qu'ils sont incapables de modifications post-traductionnelles telles que N-glycosylation ou acetylation. L'absence de ces modifications protéiques pourrait avoir un impact sur l'activité protéique1. Cependant, les mutants capables d'effectuer ces modifications ont été identifiés et peuvent être utilisés comme un outil pour exprimer les protéines qui nécessitent de telles modifications43. La production de quantités suffisantes de la protéine exprimée pourrait être un défi en raison du déroulement et de l'agrégation en tant qu'organismes d'inclusion, de l'incapacité de la protéine à être correctement intégrée à la membrane cytoplasmique, du ciblage erroné et de la mauvaise réglementation en raison de l'absence de modifications post-traductionnelles.

Une limitation mineure de cette technique est qu'elle ne fournit pas de preuve de l'orientation naturelle du transporteur. Pour ce faire, il faut tirer parti des étiquettes terminales N ou C et des méthodes immunologiques. L'accessibilité d'un terminus particulier de la protéine dans les vésicules peut être obtenue par la digestion de tous les accessibles, et donc, sans doute termini externe du transporteur, électrophorésis de la protéine en présence de sulfate dodécyl de sodium, transfert à des filtres à nitrocellulose et la détection du reste, termini interne avec des anticorps40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Le BGSU Graduate College et le BGSU Office of Sponsored Programs and Research ont appuyé ce projet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Tags

Biochimie Numéro 154 Transporteur de membrane antiporteur transport de polyamine échangeur de polyamine vésicules membranaires presse Français analyse cinétique essais de transport radio-isotopes GABA
Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans <em>E. coli</em> et la production de vésicules membranaires
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P.… More

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter