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Biochemistry

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Descriviamo un metodo per la caratterizzazione dei trasportatori a membrana protonica in preparati a vescicolo a membrana prodotti dall'espressione etesologa in E. coli e lisi di cellule che utilizzano una pressa francese.

Abstract

Sono stati sviluppati diversi metodi per caratterizzare funzionalmente nuovi trasportatori a membrana. Le poliamine sono onnipresenti in tutti gli organismi, ma gli scambiatori di poliamina nelle piante non sono stati identificati. Qui, dedichiamo un metodo per caratterizzare gli antiportatori di poliammina utilizzando vesciche di membrana generate dalla lisi delle cellule di Escherichia coli eterologicamente esprimendo un antiportatore vegetale. In primo luogo, abbiamo espresso etelogusly AtBAT1 in un ceppo E. coli carente in poliamina e trasportatori di scambio di arginina. Le vesciche sono state prodotte utilizzando una pressa francese, purificata dall'ultracentrifugazione e utilizzata in un saggio di filtrazione a membrana di substrati etichettati per dimostrare la specificità del substrato del trasportatore. Questi saggi hanno dimostrato che AtBAT1 è un trasportatore mediato da protoni di arginina, acido z-aminobutyrico (GABA), putrescina e spermide. Il ceppo mutante sviluppato per il saggio di AtBAT1 può essere utile per l'analisi funzionale di altre famiglie di scambiatori di poliammina vegetale e animale. Ipotizziamo anche che questo approccio possa essere utilizzato per caratterizzare molti altri tipi di antiportatori, purché queste proteine possano essere espresse nella membrana cellulare batterica. E. coli è un buon sistema per la caratterizzazione di nuovi trasportatori, dal momento che ci sono diversi metodi che possono essere impiegati per mutagenizzare i trasportatori nativi.

Introduction

Le proteine coinvolte nel traffico di metaboliti costituiscono un livello essenziale di regolazione fisiologica, ma la stragrande maggioranza dei trasportatori di membrana vegetale non è ancora stata caratterizzata funzionalmente. Sono state implementate diverse strategie per caratterizzare nuove proteine da trasporto. Espressione etetologa in organismi modello come E. coli e cellule eucariotiche come lievito, Enopus oocyte, cellule di mammiferi, cellule di insetti e cellule vegetali sono stati tutti utilizzati per determinare la loro attività di trasporto1. Le cellule eucariotiche sono favorite per l'espressione di proteine eucariotiche, perché la composizione cellulare di base, i percorsi transducivi del segnale, la trascrizione e la traduzione di macchine automatiche sono compatibili con le condizioni native.

Il lievito è stato un importante organismo modello per la caratterizzazione di nuove proteine di trasporto nelle piante. La prima proteina per il trasporto vegetale che è stata espressa con successo nel lievito (Saccharomyces pombe) è stata il trasportatore esososo HUP1 da Chlorella2. Da allora, molte proteine del trasporto vegetale sono state caratterizzate funzionalmente utilizzando un sistema di espressione del lievito. Questi includono, trasportatori di zucchero vegetale (SUC1 e SUC23, VfSUT1 e VfSTP14) e i trasportatori di auxina (AUX1 e PIN5). Svantaggi di utilizzare il lievito per esprimere le proteine vegetali possono includere l'attività alterata delle proteine plastidi-localizzate perché il lievito manca di questo organello, mistargeting6, e la formazione di aggregati piegati male e l'attivazione delle risposte allo stress nel lievito a causa della sovraespressione delle proteine della membrana7,8,9.

L'espressione etetologa delle proteine da trasporto negli evociti Xenopus è stata ampiamente utilizzata per la caratterizzazione elettrofisiologica dei trasportatori10. Le prime proteine del trasporto vegetale caratterizzate dall'espressione eteologa negli ovociti di Xenopus sono state il canale di potassio arabidopsis KAT110 e il trasportatore esaso dell'Arabidopsis STP111. Da allora, gli evociti Xenopus sono stati impiegati per caratterizzare molte proteine del trasporto vegetale come trasportatori di membrana plasmatica12, trasportatore di saccarosio vacuolare SUT413 e trasportatore vacuolar malate ALMT914. Un'importante limitazione degli evociti Xenopus per i saggi di trasporto è che la concentrazione di metaboliti intracellulari non può essere manipolata1. Inoltre, le conoscenze professionali sono necessarie per preparare gli evociti Xenopus e la variabilità dei lotti di ovociti è difficile da controllare.

L'espressione eterologa nell'organismo modello E. coli è un sistema ideale in termini di caratterizzazione di nuove proteine di trasporto vegetale. Con un genoma completamente sequenziato15, le caratteristiche molecolari e fisiologiche di E. coli sono ben note. Gli strumenti e le tecniche molecolari sono ben definiti16. Inoltre, diversi vettori di espressione, ceppi non patogeni e mutanti sono disponibili17,18,19. Inoltre, E. coli ha un alto tasso di crescita e può essere facilmente coltivato in condizioni di laboratorio. Molte proteine possono essere facilmente espresse e purificate a elevate quantità in E. coli9. Quando le proteine non possono essere analisi direttamente nei sistemi cellulari, la ricostituzione delle proteine in liposomi è stata anche un'innovazione di successo, anche se impegnativa, per la caratterizzazione delle proteine della membrana purificate. Caratterizzazione funzionale delle proteine di trasporto mitocondriali vegetali tra cui trasportatori soluti come trasportatori di fosfati in soia, mais, riso e arabidopsis, vettore dicarboxylate-tricarboxylate in Arabidopsis sono stati realizzati utilizzando questo sistema modello20,21. Tuttavia, le proteine ricombinanti della proteina pomodoro SICAT9 sono risultate non funzionali negli esperimenti di ricostituzione, e altri membri della famiglia dei trasportatori CAT sono stati trovati non funzionali nei saggi di Xenopus oocyte22. Pertanto, sono necessari ulteriori strumenti molecolari per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana.

Cinque sistemi di trasporto della poliammina si trovano in E. coli23. Essi comprendono due trasportatori ABC che mediano l'assorbimento di spermidina e putrescina, uno scambiatore putrescina/ornitina, uno scambiatore di cadaverina/lisina, un esportatore di spermidine e un importatore di putrescina. Lo scambiatore putrescine PotE è stato originariamente caratterizzato utilizzando un saggio vescino, dove vescicoli all'interno verso l'esterno sono stati preparati da cellule liscicon con una pressa francese e misurando l'assorbimento di putrescina radioetichettata nelle vesciche in cambio di ornina24. I saggi vescicoli sono stati utilizzati anche per caratterizzare un trasportatore di calcio, che mediava il trasporto di calcio in risposta a un gradiente protonico25. Questi esperimenti ci hanno spinto a sviluppare una strategia per la caratterizzazione di altri scambiatori di poliamina. Per prima cosa abbiamo creato un ceppo di Scambiatori Di E. coli carenti in Scambiatori PotE e CadB. Qui, dimostriamo la caratterizzazione funzionale di un antiportatore di poliammina vegetale per espressione eteloga nel ceppo E. coli modificato, generazione di vesciche a membrana utilizzando una pressa francese e saggi radioetichettati.

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Protocol

1. Generazione dell'E. coli Double Knock Out Mutant con Trasduzione P1

  1. Ottenere i ceppi mutanti E. coli a singolo urlo , che sono stati eliminati con il centro di riservagenetica (http://cgsc.biology.yale.edu)e
    NOT: Il ceppo di zPotE è resistente alla kanamycin26 e la deformazione di zCadB è resistente alla tetraciclina27.
  2. Costruire la ceppo PotE/CadB doppio knockout (DKO) utilizzando il protocollo di trasduzione P128.
    1. Preparazione del lisato
      1. Diluire una coltura notturna di zPotE in LB fresco (1:100) integrato con 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2e 0,1-0,2% di glucosio.
      2. Coltivare a 37 gradi centigradi per 1-2 h.
      3. Aggiungete 40 lunisi di fago P1 alla coltura e continuate a crescere a 37 gradi centigradi. Monitorare per 1-3 h fino a quando la coltura ha lised
        NOTA: Quando la coltura è lised, detriti cellulari saranno visibili nel tubo e la coltura avrà una perdita significativa di torbidità.
      4. Aggiungere diverse gocce di cloroformio (50-100 ) al lisa e al vortice. Centrifuga a 12.000 x g per 2 min per rimuovere i detriti cellulari e trasferire il supernatante in un tubo fresco.
    2. Trasduzione del
      1. Crescere con deformazione CadB durante la notte nel mezzo LB.
      2. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 4.000 x g per 2 min e rispendere in 1/5-1/3 il volume di coltura raccolto in LB fresco integrato con 100 mM MgSO4 e 5 mM CaCl2.
      3. Aggiungete la sospensione della cella al tubo con il fago dal punto 1.2.1.4 e mescolate rapidamente.
      4. Aggiungete 200 -L di 1 M Na-Citrate (pH5.5), quindi aggiungete 1 mL di LB. Incubare a 37 gradi per 1 h per consentire l'espressione del marcatore resistente agli antibiotici.
      5. Girare le celle a 4000 x g per 5 min.
      6. Risospendere in 100 LB con 100 mM Na-Citrate (pH 5,5) e vortice bene per disperdere le cellule.
      7. Selezionare i ceppi ricombinanti su piastre di agar LB con 50 g/mL di kanamycin e 10 tetraciclina di g/mL, quindi confermare con Polymerase Chain Reaction (PCR) con primer appropriati26,27.
      8. Verificare i frammenti PCR mediante sequenza.

2. Espressione del gene bersaglio (AtBAT1) in E. coli Mutant

  1. Amplificala sequenza completa del gene bersaglio da PCR e inseriscila nel vettore di ingresso gateway pENTR/D-TOPO29.
    NOT: In questo caso ATBAT1.1 è stato amplificato utilizzando primer in avanti 5'CGGCGATCAATCCTTGTT e primer inverso 5'GCTAGAGAGTTGGAGGGG, una denaturazione iniziale a 98 gradi centigradi per 2 min e poi 30 cicli di denaturazione a 98 gradi centigradi per 0,1 min, annealanda a 59 gradi centigradi per 0,3 min, estensione a 72 gradi centigradi per 0,40 min e estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min. Il prodotto PCR è stato purificato utilizzando un kit di pulizia PCR, quantificato utilizzando uno spettrometro. L'inserimento del prodotto PCR nel vettore Gateway è stato effettuato seguendo le indicazioni dei manufactrurers.
    1. Trasforma il vettore di ingresso in competenti cellule Top10 E. coli per scosse di calore e selezionalo per ricombinanti di successo su supporti LB con 50 kanamycin che seguono i protocolli standard di clonazione molecolare30.
    2. Estrarre il DNA del plasmide utilizzando un kit di estrazione plasmide, seguendo le indicazioni del produttore, e la sequenza per confermare il corretto inserimento.
  2. Trasferire il gene bersaglio nel vettore di destinazione E. coli, pBAD-DEST49 dal gateway LR clonazione per creare un vettore di espressione29.
    1. Trasforma il vettore di espressione in celle Top10 E. coli competenti per scossa di calore per 30 s e seleziona ricombinanti riusciti su supporti LB con 100 ampicillin a g/mL30.
    2. Estrarre il plasmide DEL DNA30 e la sequenza per confermare il corretto inserimento.
  3. Trasformare il vettore di espressione in E. coli -potE740(del)::kan, scadB2231::Tn10 e selezionare su piastre LB con ampicillina, kanamycin e tetraciclina30.
  4. Al fine di determinare la concentrazione ottimale di arabinose per l'induzione, esprimere il gene bersaglio sotto il controllo del promotore araBAD nei media LB con concentrazioni di gradiente di arabono come descritto29.
  5. Raccogliere i pellet cellulari e valutare l'espressione proteica da SDS-PAGE e la visualizzazione delle bande proteiche come descritto nel manuale del prodotto29.
    NOT: L'E. coli -potE740(del)::kan, scadB2231::Tn10 è stato utilizzato come campione di controllo senza espressione BAT1. E.coli doppio knock out cellule mutanti con il vettore vuoto pBAD-DEST49 non è stato utilizzato come un controllo a causa della presenza del gene ccdB nel vettore.

3. Generazione di vescicoli membrana all'interno dell'esterno

  1. Coltura le cellule mutanti E. coli che esprimono la proteina bersaglio coltivando una singola colonia durante la notte in 5 mL di supporti senza poliammina (2% glicerolo, 6 g di K2HPO4, 3 g di KH2PO4, 0,5 g di NaCl, NH4Cl, 50 mg di tiamina, 0,79 g lievito completo supporto sintetico amisulfato (10 mg/L), L-Arginina (50 mg/L), acido L-aspartico (80 mg/L), L-Histi cloridrato cloridrato di dine (20 mg/L), L-Leucina (100 mg/L), L-Lysine cloridrato (50 mg/L), L-Mesionina (20 mg/L), L-Phenylalanine (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Trasferire questa coltura a 500 mL di media senza poliammina integrati con 0.0002% arabino e crescere fino a quando la coltura cellulare raggiunge un OD600 di 0,6-0,8 (di solito 5 h).
  2. Raccogliere il pellet cellulare con centricazione a 2.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Risospendere il pellet e lavare tre volte con buffer di fosfato di potassio da 0,1 M, pH 6,6, contenente 10 mM EDTA (Buffer 1). Il volume finale delle celle nel buffer 1 dopo la terza rotazione deve essere 10 mL.
  3. Generare vesciche a membrana all'interno e fuori dal trattamento della French Press (10,000 p.s.i.) delle cellule intatte utilizzando una cella a pressione francese da 35 mL.
  4. Prima di caricare il campione nella cella di pressione francese standard, lubrificare il pistone e gli anelli O per renderlo più facile da inserire nella cella.
    Nota:Queste istruzioni sono specifiche per l'uso della cella di pressione standard31.
    1. Avvitare con attenzione il tappo di chiusura all'estremità inferiore della cella. Assicurarsi che la cella sia a destra verso l'alto in base ai caratteri sul lato della cella. Inserire il pistone nella cella e spostarlo nella cella, fino a quando la linea di riempimento massima sul pistone raggiunge la parte superiore del pistone. Capovolgere l'unità sopra e posizionare sul supporto fornito tra i tre posti.
    2. Versare la sospensione cellulare nel corpo della cella.
      NOT: Abbiamo usato solo 10 mL, quindi ci sarà molto spazio nella camera cellulare a pressione francese, che ha una capacità di 35 mL.
    3. Montare la cella di pressione standard sull'unità cellulare a pressione francese.
      1. Verificare innanzitutto che l'alimentazione sia disattivata. Sul lato sinistro del pannello c'è l'interruttore Selettore rapporto. Ha tre posizioni: Giù alla fine della corsa, Basso per l'utilizzo di una cella di pressione più piccola e Alta per l'uso con la cella di pressione francese standard. Se la stampa francese è stata utilizzata in precedenza con la cella più piccola, il pistone potrebbe non essere completamente ritrattato. Impostare questa opzione su Giù.
    4. Accendere la macchina con l'interruttore del RHS sul retro dell'unità e attivare l'interruttore Pause-Run nella posizione Di corsa. Ciò comporterà che il pistone venga completamente ritratto. Riportare l'interruttore su Pausae spegnere la macchina.
    5. Allenta le viti del pollice e sposta il morsetto di sicurezza che si estende su due colonne in acciaio inox di lato. Si snoda a destra. Con una mano che tiene la base del tappo di chiusura in posizione, scegliere la cella di pressione francese con entrambe le mani, e ruotarla di 180 gradi, quindi il pistone è ora in posizione verticale. Impostarlo sulla piattaforma, e spostare il morsetto di sicurezza in posizione in modo che questo morsetto tiene la cella di pressione francese in posizione.
    6. Si noti che l'assieme della valvola di flusso sulla spina di chiusura deve essere accessibile all'azionatore e posizionato in modo che la valvola possa essere ruotata liberamente. Aprire l'assieme della valvola di flusso con alcune curve in senso antiorario. Posizionare le braccia del pistone in modo che siano orientate in una posizione a ore due e otto. Stringere le viti dei pollici in modo che la cella di pressione standard sia tenuta in posizione.
    7. Inserire il tubo di uscita del campione nel tappo di chiusura e collegare un breve pezzo di tubo flessibile in modo che i detriti delle cellule rotte possano essere raccolti in un tubo falco. Di solito usiamo un becher pieno di ghiaccio da 300 mL per tenere il tubo del falco in posizione verticale e per mantenere i detriti cellulari refrigerati.
    8. Assicurarsi che l'opzione Pausa-Esegui sia impostata su Pausae che l'assieme della valvola sia nella posizione aperta. Riaccendere la macchina, adust l'interruttore Selettore rapporto su Alta, e girare la valvola di aumento di pressione sul pannello anteriore a destra circa mezzo giro.
    9. Il pistone inizierà a salire dalla base per passare l'aria in camera. Dirigere l'aria che esce dal tubo Tygon attaccato al tubo di uscita del campione al tubo nel becher.
    10. Quando escono le prime gocce di liquido, chiudere l'assieme della valvola di flusso ruotandolo in senso orario. Questo crea un metallo alla guarnigiorazione metallica, con la cella di pressione, in modo da non stringere eccessivamente.
    11. La parte anteriore della stampa francese ha un grafico sul pannello anteriore per generare la giusta pressione sulle cellule biologiche all'interno della cella di pressione. In questo caso, aumentare la pressione ruotando la valvola di aumento della pressione in senso orario, fino a quando il misuratore raggiunge 640 psi. Questo creerà una pressione interna di 10.000 psi.
    12. Una volta che la cella ha raggiunto la pressione di destinazione aprire leggermente l'assieme valvola di flusso ruotandolo in senso antiorario. Regolare l'apertura della valvola per consentire una portata di sole 10 gocce al min.
    13. Quando la linea di arresto sul corpo del pistone raggiunge la parte superiore della cella di flusso. Impostare l'opzione Pausa-Corsa su Pausa. Questo è fondamentale perché avere il pistone inserito più lontano nella cella danneggerà l'unità. Aprire l'assieme della valvola di flusso e raccogliere le gocce rimanenti.
    14. Impostare l'opzione Cambia Selettore rapporto su Giù, quindi impostare l'opzione Pausa esecuzione su Esegui. Quando la piastra inferiore è completamente ritratta, impostare l'interruttore Esegui su Pausae spegnere la macchina.
    15. Rimuovere la cella di pressione francese dalla pressa francese e smontare per la pulizia. Conservare tutte le parti a secco con un leggero rivestimento di glicerolo. Rimuovere e sostituire eventuali guarnizioni o guarnizioni con segni di usura.
  5. Rimuovere le cellule ininterrotte e i detriti cellulari della stampa francese eluente con la centrifugazione a 10.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Scartare il pellet e trasferire il supernatante ai tubi di ultracentrifuga.
  6. Le vesciche della membrana di pellet dal soldante risultante da ultracentrifugation a 150.000 g per 1 h a 4 gradi centigradi.
  7. Lavare le vesciche a membrana una volta, senza resuspension, in 1 mM Tris-maleate, pH 5.2 contenente 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoetanolo e 10% glicerolo e resodare nello stesso buffer (Buffer 2)23 utilizzando un grinder di tessuto Dounce. Tipicamente la frazione di membrana da 500 mL di coltura sarebbe sospesa in 5 mL di tampone, e una concentrazione di 5-10 mg di proteina/mL della membrana utilizzando il saggio di acido biochinico32.
  8. In tubi di microcentrifuga da 1,5 ml di spazio, conservare 100 aliquote di preparazione della membrana a -80 gradi centigradi.

4. Western Blot e orientamento del Trasporto di Saggio

  1. Lavare e risospendere le vesciche del passaggio 3.7 in 30 mM Tris pH 7.8 - 0,1 mM CoCl2.
  2. Aggiungere i campioni di 100 l, aggiungere 1 L di 2 mg/mL carboxypeptidase A in 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Intenere per 20 min a 20 gradi centigradi. Interrompere la digestione aggiungendo 5 , 5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoetanolo pH 7,5.
  4. Per disattivare completamente l'enzima, incubare la soluzione per 1 h a temperatura ambiente.
    NOT: Vescicolas senza il catboxypeptidase A trattamento sono stati utilizzati come un controllo.
  5. Analizzare i campioni per elettroforesi in presenza di solfato di dodecyl al litio. Aggiungere 5-10 luna di 150 mg/mL di solfato di litio dodecyl, 450 mg/mL glicerolo, 0,1 mg/mL di blu bromofenolo, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 - L di campione.
  6. Eseguire l'immunoblomentazione posando un filtro di nitrocellulosa inumidito con 25 mM di sodio-idrogeno fosfato pH 7.5 sul gel di poliacrilammide. Posizionarli tra due filtri di cellulosa inumidita e infine tra due cuscinetti di plastica inumiditi. Posizionare questo assemblaggio tra gli elettrodi di una camera contenente 25 mM di sodio-idrogeno fosfato pH 7,5 a 2-4 gradi centigradi.
  7. Consentire all'elettrotrasferimento delle proteine di procedere per 3 h a 20 V e 2-3 A.
  8. Bloccare la membrana di nitrocellulosa durante la notte a 2 gradi centigradi in un buffer di blocco di 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 e 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Incubare il filtro di nitrocellulosa per 2 h con una diluizione di 1:5000 anti-glian (terminale C)-HRP nel buffer di bloccante (20 mL) e lavare due volte con 50 mL di tampone per un totale di 60 min.
  10. Per visualizzare l'immunoblot, sciogliere 6 mg di 4-cloro-1-naftolo in 20 mL di alcol denaturato e aggiungere 80 mL di 15 mM Tris pH 7,5 e 50 -L del 30% H2O2. Bagnare la carta da filtro nella soluzione di substrato per 20 min. Il reagente reagirà con l'anticorpo per formare un precipitato blu sulla membrana di nitrocellulosa. Quando si è sviluppato un colore sufficiente, sciacquare la membrana con acqua e lasciare asciugare.

5. Saggio dei trasporti

  1. Incubare 100 aliquote di vescicle di membrana a 12 gradi centigradi per 5 min.
  2. Avviare il trasporto aggiungendo poliamine radioetichettate alle vesciche della membrana ad una concentrazione finale di 50 M (se non diversamente specificato). Fare 3soluzioni H-substrate (spermide o putrescine) in un buffer di aspirato costituito da 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosfato di potassio, pH 8.0 e 0.14 M KCl23 (Buffer 3) con modifiche a seconda del saggio.
  3. Condurre i saggi di trasporto per 1 min a 12 s in tubi di microfuge da 1,5 ml.
  4. Dopo 1 min, trasferire le miscele di reazione al collettore filtrazione e filtrare attraverso un filtro a membrana di nitrocellulosa 0,45 m.
    1. Aggiungere 3 mL di buffer di assaggio ghiacciato contenente una concentrazione superiore di 10 volte di poliammine senza etichetta seguita da 3 mL di tampone di analisi senza i poliamine per ridurre l'attacco non specifico.
    2. Trasferire i filtri lavati a 20 mL di scintillio usa e getta contenenti 10 mL di liquido scintillio e determinare la radioattività utilizzando un contatore di scintillazione liquida. Il contatore di scintillazione misura la radioattività nel campione e la segnala come disintegrazione per min (dpm).
  5. Calcolare l'assorbimento netto della poliamina come differenza tra l'assorbimento a 1 min da vescicoli incubati a 12 gradi centigradi e l'assorbimento a 0 min da vescicoli incubati sul ghiaccio.
    NOT: La massa del substrato importata nelle vesciche viene calcolata come segue. Se il volume del campione nel tubo di microfuge è di 0,2 l e la concentrazione iniziale del substrato è di 100 M, la massa totale del substrato nel tubo di microfuge è 20 x 10-12 M. A causa dell'altissima attività specifica dei substrati etichettati commercialmente (spesso 2,22 x 109 dpm/mM) la massa dell'isotopo aggiunto può essere ignorata nel calcolo. Quindi, se la quantità totale di isotopo che è stato aggiunto al tubo di microfuge era 100 x 106 dpm e le vesciche avevano un assorbimento netto di 1.000 dpm, allora la massa totale di substrato assorbita dalle vescicoli era l'1% del numero totale di talpe di substrato o 2 x 10-13 M.
    1. Determinare Km per il substrato misurando l'assorbimento di 10, 25, 50, 250 e 500 m di substrato radioetichettato in vescicoli che esprimono la proteina bersaglio. Calcolare la cinetica Michaelis-Menten utilizzando un metodo di regressione non lineare utilizzando il modello Michaelis Menton del pacchetto software statistico34.
  6. Per gli esperimenti di competizione, aggiungere il substrato agonistico non etichettato di 100 ml, 500 m, 1 mM, 1,5 mM o 2 mM nel buffer di analisi, al tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente 100 l'l di vesciccoli a 12 m.
    1. Aggiungere contemporaneamente la poliammina radioetichettata (50 m) al tubo di microcentrifuga.
    2. Misurare la radioattività intrappolata all'interno delle vesciche come accennato in precedenza ripetendo i passaggi da 5 a 5.4.2.
    3. Determinare l'apparente Km (Km,app) per i substrati competitivi misurando l'assorbimento di 10, 25, 50, 250 e 500 m di poliammina radioetichettata in presenza di 100 sottostrato non etichettato m o superiore e utilizzando un metodo di regressione non lineare per tracciare la curva.

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Representative Results

I passaggi principali in questo protocollo sono riepilogati in cifritàin Figura 1 . In breve, le cellule E. coli carenti in tutti gli scambiatori di poliammina ed esprimono AtBAT1 sono coltivate, centrifuse, lavate con un tampone e sottoposte a lisi cellulare utilizzando una pressa francese. La lisi tende a produrre vesciche che sono per lo più dentro e fuori e intrappolare il buffer al di fuori delle cellule. I detriti cellulari vengono rimossi dalla centrifugazione e una seconda fase di ultracentifugazione viene utilizzata per raccogliere un pellet di membrana. Il pellet a membrana viene risospeso nel pH buffer Tris-Maleate 5.2 e conservato a -80 gradi centigradi. I saggi di trasporto sono effettuati a 12 gradi centigradi, che si è rivelato ottimale per mantenere la stabilità della membrana. I saggi sono avviati dall'aggiunta di substrato radioetichettato e da uno spostamento nel pH della sospensione tampone delle vesciche a pH 8.0. Dopo 1 min, viene aggiunto un buffer di assaggio ghiacciato con substrati non etichettati per fermare l'assorbimento dell'etichetta radio nelle vesciche. Le vesciche radioetichettate sono intrappolate dalla filtrazione attraverso le membrane di nitrocellulosa. Le membrane vengono trasferite alle fiale scintillanti e la radioetichetta sulle membrane è determinata dal conteggio della liquidazione.

Una macchia occidentale viene utilizzata per verificare che AtBAT1 sia traslocato in vescicoli (Figura 2). Sondare la macchia con un anticorpo anti-terminale C ha rivelato una proteina di costruzione di fusione di circa 72,3 kDa(Figura 2, Corsia 2). La digestione delle vesciche prima di SDS-PAGE ha provocato una dimmunizioni, ma non una perdita completa del segnale della sonda (Figura 2, corsia 3). La diminuzione del segnale sonda come conseguenza di carboxypeptidase A suggerisce che la maggior parte dei residui del terminale C si trovano all'esterno delle vesciche.

In questo sistema di analisi, le vesciche sono sospese in un tampone a pH 5.2 in modo che il pH all'interno delle vescle equilichi con il buffer. Il trasporto del substrato radioetichettato nelle vesciche a pH 5.2 viene avviato sospendendo le vesciche in un buffer pH 8.0, creando così un gradiente di pH di pH 2.8 attraverso la membrana. A 12 gradi centigradi, l'assorbimento di spermidine radioetichettate dalle vesciche era più alto a 1 min, ed è rimasto lineare oltre 3 min (Figura 3A). Pertanto, il tempo di incubazione per il saggio di trasporto è stato fissato a 1 min. Per tenere conto dell'associazione non specifica della radioetichetta, le vesciche sono state incubate a 0 gradi centigradi in presenza di substrato radioetichettato per un minuto, e questi conteggi sono stati sottratti dall'assorbimento di ladiolabel a temperature più elevate.

La figura 3B mostra l'assorbimento dello spermidine radioetichettato nelle vescicoli dopo un minuto. Non c'era assorbimento netto di isotopo da parte delle vesciche della membrana che sono state preparate e conservate al pH 8.0, in quanto non esisteva alcun gradiente di protoni attraverso la membrana vescicante. Per dimostrare l'effetto della dissipazione del gradiente protone artificiale, le vesciche della membrana sono state incubate nel buffer di pH 8.0 per 10 minuti prima dell'aggiunta del substrato etichettato25. In queste condizioni, è stato mostrato un assorbimento minimo di substrato radioetichettato. L'assorbimento di spermidina radioetichettata era anche minimo nelle vesciche preparate con cellule E. coli carenti negli scambiatori di poliammina CadB e PotE. Nel loro insieme, questi risultati indicano che l'assorbimento di spermide da parte dei protoni era dovuto alla proteina BAT1 (Figura 3A,B).

Per determinare la specificità del substrato della proteina, i valori di Km sono stati calcolati misurando l'assorbimento del substrato radioetichettato a 10, 25, 50, 100, 250 e 500 m di concentrazioni. I Km per spermimina, putrescina e arginina erano rispettivamente 55 , 12 , m e 1,4 mM, indicando che questa proteina è una poliammina ad alta affinità e uno scambiatore di arginina ( Figura4).

L'affinità del trasportatore per un particolare substrato può anche essere determinata indirettamente utilizzando saggi di concorrenza. Qui, abbiamo utilizzato due metodi per valutare la concorrenza tra due substrati. Nel primo metodo, l'assorbimento di 50 spermide radioetichettate di 50 M è stato misurato in presenza di crescenti concentrazioni del substrato concorrente non etichettato (Figura 5A). Nel secondo metodo, l'apparente Km per lo spermide è stato calcolato misurando l'assorbimento di crescenti concentrazioni di spermidina radioetichettata in presenza di 100 M di substrato concorrente non etichettato ( Figura5B). I saggi della concorrenza hanno rivelato che il GABA è un inibitore competitivo dello spermide con un Km,app di 164 x 15 M (Figura 5A,B). Inoltre, misurando l'assorbimento di 50 spermidine radioetichettate m in presenza di concentrazioni variabili di diversi amminoacidi ha rivelato che AtBAT1 è anche in grado di trasportare il glutammato e l'alanina a concentrazioni mM(Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo. (A) Rappresentazione schematica che delinea i passaggi chiave nella preparazione e purificazione delle vesciche della membrana da E. coli. (B) Rappresentazione schematica che illustra i passaggi chiave nella saggia di trasporto dei preparati a vescicolo a membrana utilizzando substrati radioetichettati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: macchia occidentale che mostra l'espressione di AtBAt1 in vescicoli purificati. Le bande sono state visualizzate usando anticorpi perossidi di rafano coniugato anti-His (C-termine)-HRP. Corsia 1, Scala proteica pre-stained. Corsia 2, vesciche purificate che esprimono AtBAT1.1 mostrando una fascia delle dimensioni previste della proteina di fusione. La corsia 3, vesciche purificate che esprimevano AtBAT1.1 sono state pretrattate con carboxypeptidase A prima dell'elettroforesi SDS e del gonfiore occidentale. Quantità equivalenti di vesciche (proteine) sono state aggiunte ad ogni corsia. La diminuzione della colorazione indica che il terminale C della proteina nella maggior parte delle vesciche è degradato dalla digestione proteasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Attività di trasporto delle vesciche che mostrano l'effetto dell'espressione della proteina BAT1 e l'importanza di un gradiente di pH. (A) Assorbimento dipendente dal tempo di 3H di spermide in vescicoli che esprimono BAT1 con un pH interno di 5,2 e introdotto in un tampone a pH 8.0. Nel saggio di controllo, le vesciche sono state aggiunte al buffer di analisi a pH 8,0, 10 minuti prima dell'aggiunta di 3H di spermidina etichettata per consentire la dissipazione del gradiente del protone. Poi l'assorbimento della radioetichetta nelle vesciche è stato valutato su un intervallo di 1 min. (B) Assorbimento di 3H etichettato spermidine in presenza di un gradiente di protone (pH interno di 5.2), in assenza di un gradiente di protone (pH interno di 8), in vesciche aggiunte alla soluzione di analisi 10 minuti prima dell'aggiunta di spermide radioetichettate e in vescicoli provenienti da cellule E. mutanti coli che non esprimono BAT1. L'assorbimento nelle vesciche è stato monitorato per 1 min. Tutti i valori sono presentati come media : SE di cinque repliche. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il test t di uno studente e , indica una differenza significativa rispetto al controllo ( valorep < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Saggi in vitro dell'attività di trasporto della poliamina e dell'arginina di BAT1. (A) I valori Km per l'assorbimento di spermide e putrescina sono rispettivamente di 55 e 12 M e 85 m e 32 M. (B) Il Km per l'assorbimento di arginina è 1,4 - 0,5 mm. Tutti i valori sono presentati come media : SE di cinque repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: GABA è un inibitore competitivo del trasporto Spermidine da BAT1. (A) L'assorbimento di 3H di spermide con etichetta da vesciche che esprimono AtBAT1.1 è stato significativamente ridotto in presenza di 100 o 500 GABA. (B) L'assorbimentoapparente Km per l'assorbimento dello spermide da parte di BAT1,1 è stato aumentato a 164 x 20 M in presenza di 100 m di GABA. Tutti i valori sono presentati come media : SE di cinque repliche. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il test t di uno studente e , indica una differenza significativa rispetto al controllo ( valorep < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Glutammato e alanina sono inibitori competitivi del trasporto di spermide BAT1. L'assorbimento di spermide è stato significativamente ridotto in presenza di 1 mM di glutammato non etichettato e 1,5 mM di alanina non etichettata. Tutti i valori sono presentati come media : SE di cinque repliche. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il test t di uno studente e , indica una differenza significativa rispetto al controllo ( valorep < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Nel presente studio, illustreremo un metodo per la caratterizzazione di un antiportatore esprimendo prima la proteina in E. coli e poi generando vescicle a membrana, in modo che la proteina eterologamente espressa possa essere presentata in un sistema privo di cellule. Oltre alle attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare, questa strategia richiede l'uso di una stampa francese, un ultracentrifuga e l'accesso a una struttura per condurre saggi radioisotopi.

Un requisito fondamentale di questa tecnica è che la proteina eterologa sia correttamente mirata alla membrana plasmatica di E. coli. Questa strategia può anche essere utile per l'analisi funzionale dei trasportatori di organitari poiché il trasportatore di glucosio ADP plastid è stato localizzato con successo nella membrana cellulare E. coli e funzionalmente caratterizzato35. Il vettore (pBAD-DEST49) utilizzato in questi esperimenti contiene una proteina di tioredossina N-terminale per aumentare la solubilità del prodotto tradotto. Sono state trovate fusioni a N terminali di una piccola proteina B. subtilus, che consentono un targeting più efficiente dei trasportatori a membrana alla membrana citoplasmatica36. Tuttavia, gli eventi di piegatura errata e il fallimento delle proteine per essere correttamente integrati nella membrana citoplasmatica sono potenziali problemi che impediscono l'uso di sistemi di espressione batterica per molti tipi di trasportatori1.

Vesciche membrana sono stati utilizzati anche per caratterizzare i trasportatori di piante37,38. Poiché le vesciche non hanno le fonti energetiche essenziali come ATP ed enzimi, l'interferenza dei trasportatori attivi e di altre attività metaboliche è minima. Pertanto, questo sistema è ideale per l'analisi di traslocazioni passive come gli scambiatori di metaboliti. Le vesciche della membrana everse, in particolare, possono essere applicate alla caratterizzazione di esportatori e antiportatori poiché la composizione della soluzione interna può essere manipolata modificando la composizione del tampone 1. Inoltre, l'utilizzo della stampa francese o della sonicazione a ultrasuoni è abbastanza efficiente nel generare vesciboli della membrana dentro e fuori da cellule E. coli intatte. 95% delle vesciche generate dalla sonicazione a ultrasuoni o stampa francese hanno eversi membrane39,40. PotE, l'antiportatore E. coli di putrescina e ornithina, è stato il primo antiportatore di poliamina che è stato caratterizzato utilizzando vescicle di membrana dentro-fuori23. Abbiamo usato la trasduzione P1 per creare un ceppo mutante specifico per la caratterizzazione di un antiportatore di poliamina, e questo ceppo può essere utile per la caratterizzazione di altri scambiatori di poliamina animale, fungino o vegetale. Immaginiamo anche che altri ceppi di E. coli con due o più delezioni geniche potrebbero essere utili per la caratterizzazione di altri trasportatori di scambio di piante e animali utilizzando vesciche di membrana.

Il passo più critico in questo protocollo è l'espressione della proteina nel sistema mutante E. coli. Un vettore di espressione E. coli con un promotore inducibile viene utilizzato per promuovere una regolazione stretta e dipendente dalla dose dell'espressione genica eterologa. La presenza di tag terminali N e terminali C come His-patch Thioredoxin, V5 epitopo o 6xHis nel vettore è utile per il rilevamento e la purificazione della proteina. Inoltre, la presenza di una proteina di fusione di tioredossina che è un componente del vettore pBAD49, può aumentare l'efficienza di traduzione e, in alcuni casi, la solubilità delle proteine eucariotiche espresse in E. coli41. Le diverse scelte di codone nell'Arabidopsis e nell'E. coli potrebbero sfidare l'espressione proteica in E. coli. È noto che l'ottimizzazione del codone può aumentare in modo impressionante l'espressione delle proteine eterozie in E. coli42. Nell'analisi vescicante, il codone ottimizzato AtBAT1.2 ha mostrato un'attività di scambio più elevata rispetto a AtBAT1.1 ottimizzata non-codon nelle cellule E. coli (dati non mostrati), dimostrando che l'ottimizzazione del codone è stata utile per migliorare l'espressione e la funzione delle proteine espresse eterolologamente nelle cellule batteriche. La produzione di vesciche a membrana mediante un'attenta regolazione della valvola per mantenere una goccia lenta e uniforme delle cellule lised è anche un passo fondamentale nella procedura. Dopo l'ultracentrifuga, abbiamo scoperto che la sospensione delle vesciche della membrana in un omogeneizzatore Dounce riduce al minimo la variazione del campione per campionare la variazione tra le variazioni delle vesciche della membrana che vengono preparate e successivamente conservate a -80 gradi centigradi.

Una limitazione dei sistemi di espressione E. coli è che non sono in grado di apportare modifiche post-traduzionali come N-glicosilation o acetilazione. L'assenza di queste modifiche proteiche potrebbe avere un impatto sull'attività proteica1. Tuttavia, sono stati identificati mutanti in grado di eseguire queste modifiche e possono essere utilizzati come strumento per esprimere proteine che richiedono tali modifiche43. La generazione di quantità sufficienti di proteine espresse potrebbe essere una sfida a causa dello sviluppo e dell'aggregazione come corpi di inclusione, del fallimento della proteina per essere correttamente integrata nella membrana citoplasmica, del mistargeting e della cattiva regolazione a causa della mancanza di modifiche post-traduzionali.

Una piccola limitazione di questa tecnica è che non fornisce prove per l'orientamento naturale del trasportatore. Questo può essere fatto sfruttando i tag terminali N o C e i metodi immunologici. L'accessibilità di un particolare capolinea della proteina nelle vesciche può essere ottenuta con la digestione di tutti i termini accessibili, e quindi presumibilmente esterni del vettore, l'elettroforesi della proteina in presenza di solfato di dodecyl di sodio, il trasferimento ai filtri di nitrocellulosa e il rilevamento dei restanti termini interni con anticorpi40.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il sostegno a questo progetto è stato fornito dal BGSU Graduate College e dall'Ufficio BGSU dei programmi sponsorizzati e della ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

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References

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

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