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Biochemistry

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

Abstract

새로운 멤브레인 수송기를 기능적으로 특성화하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 폴리 아민은 모든 유기체에서 유비쿼터스이지만 식물의 폴리 아민 교환기는 확인되지 않았습니다. 여기서, 우리는 대장균 세포의 용해로부터 생성된 막 소포를 이용하여 폴리아민 항균제를 이종적으로 발현하는 식물 항균제를 특성화하는 방법을 간략하게 설명한다. 첫째, 우리는 이질적으로 폴리아민 및 아르기닌 교환 수송기결핍된 대장균 균주에서 AtBAT1을 표현하였다. 소포는 프랑스 프레스를 사용하여 제조되었고, 초원심분리에 의해 정제되고, 수송기의 기질 특이성을 입증하기 위해 표지된 기판의 멤브레인 여과 분석에서 활용하였다. 이 검역은 AtBAT1이 아르기닌, γ-아미노부티르산(GABA), 푸레신 및 스페르미딘의 양성자 매개 수송기임을 입증했습니다. AtBAT1의 분석을 위해 개발된 돌연변이 균주는 식물 및 동물 폴리아민 교환기의 다른 패밀리의 기능 분석에 유용할 수 있다. 우리는 또한 이 단백질이 세균성 세포막에서 표현될 수 있는 한, 이 접근이 antiporters의 많은 그밖 모형을 특성화하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 가설합니다. 대장균은 토착 수송기를 돌연변이시키는 데 사용할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 새로운 운송업자의 특성화에 좋은 시스템입니다.

Introduction

대사 산물의 인신 매매에 관여하는 단백질은 생리적 조절의 필수적인 수준을 구성하지만, 식물 막 수송자의 대부분은 아직 기능적으로 특성화되지 않았습니다. 새로운 수송 단백질을 특성화하기 위해 몇 가지 전략이 구현되었습니다. 대장균 및 효모, 제노푸스 난소, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포와 같은 모델 유기체에서의 이종 발현은 모두 그들의 수송 활성을 결정하는 데 사용되어 왔다1. 진핵 세포는 진핵 단백질의 발현을 위해 선호되는데, 왜냐하면 기본 세포 조성, 신호 변환 경로, 전사 및 번역 기계는 기본 조건과 호환되기 때문이다.

효모는 식물에서 새로운 수송 단백질의 특성화를 위한 중요한 모델 유기체였습니다. 효모(Saccharomyces pombe)에서성공적으로 발현된 최초의 식물 수송 단백질은 클로렐라2에서헥소스 수송기 HUP1이었다. 그 이후, 많은 식물 수송 단백질은 효모 발현 시스템을 사용하여 기능적으로 특징지어졌다. 여기에는 식물 성 당 수송기 (SUC1 및 SUC23,VfSUT1 및 VfSTP14)및 보조 수송기 (AUX1 및 PIN5)가포함됩니다. 효모를 식물 성 단백질을 발현하기 위해 활용하는 단점은 효모가 이 소기관이 부족하기 때문에 석고 국소화 단백질의 활성이 손상될 수 있으며, 잘못접힌응집체의 형성 및 막 단백질의 과발현으로 인한 효모의 응집력 의 활성화7,8,9.

제노푸스 난모세포에서 의 수송 단백질의 이종발현은수송기(10)의전기생리학적 특성화에 널리 사용되어 왔다. 제노푸스 난소에서 이종발현을 이용한 제1 식물 수송 단백질은 애기장대 칼륨 채널 KAT110 및 애기장대 헥소스 수송기 STP111이었다. 그 이후, 제노푸스 난모세포는 혈장막 수송기12,공병수크로오스 수송기 SUT413 및 백공말레이 수송기 ALMT914와같은 많은 식물 수송 단백질을 특성화하기 위해 사용되어 왔다. 수송 측정을 위한 제노푸스 난모세포의 중요한 제한은 세포내 대사산물의 농도가 조작될 수 없다는 것입니다1. 더욱이, 제노푸스 난모세포를 준비하기 위해서는 전문적인 지식이 필요하며, 난모세포 배치의 가변성은 제어하기 어렵다.

모델 유기체 인 대장균에서의 이종 발현은 새로운 식물 수송 단백질의 특성화 측면에서 이상적인 시스템입니다. 완전히 서열화된 게놈15를사용하면 대장균의 분자 및 생리학적 특성이 잘 알려져 있다. 분자 도구와 기술은 잘 설립16. 또한, 상이한 발현 벡터, 비병원성 균주 및 돌연변이체는17,18,19. 또한, 대장균은 높은 성장속도를 가지고 있으며 실험실 조건하에서 쉽게 재배할 수 있습니다. 많은 단백질은 대장균9에서다량으로 쉽게 발현 및 정제될 수 있다. 세포 시스템에서 단백질을 직접 분석할 수 없을 때, 단백질을 리포솜으로 재구성하는 것은 또한 성공적이었습니다, 정제된 막 단백질의 특성화를 위한 도전적인 혁신이기는 하지만. 대두, 옥수수, 쌀 및 애기장대의 인산수송기, 디카르복실레이트-트리카르복실레이트 캐리어 등의 용질 수송기를 포함하는 식물 미토콘드리아 수송 단백질의 기능적 특성은 이 모델 시스템20,21을사용하여 달성되었다. 그러나, 토마토 단백질 SICAT9의 재조합 단백질은 재구성 실험에서 비기능성 인 것으로 나타났으며, CAT 수송기 패밀리의 다른 구성원은 제노푸스 난모세포 검소22에서비기능성인 것으로 나타났다. 따라서 멤브레인 수송기의 특성화를 위해 추가적인 분자 도구가 필요합니다.

5 개의 폴리 아민 수송 시스템은 대장균23에서발견된다. 그들은 정자와 퍼트린의 섭취를 중재 두 ABC 수송을 포함, 퍼트린 / 오르니틴 교환기, 시체 / 리신 교환기, 정자 수출 및 퍼트린 수입. 상기 푸트르신 교환기 PotE는 원래 소포 분석을 사용하여 특징지어졌으며, 여기서 내부 소포는 프랑스 프레스로 세포를 포하하고 오르니틴24에대한 대가로 소포내로 방사성 발염된 푸트르신의 섭취를 측정함으로써 제조되었다. 소포 분석또한 양성자 구배25에응하여 칼슘의 수송을 중재한 칼슘 수송기를 특성화하기 위하여 이용되었습니다. 이 실험은 우리가 다른 폴리 아민 교환기의 특성화를위한 전략을 개발하도록 자극했다. 우리는 먼저 PotE 및 CadB 교환기에서 대장균 결핍의 변형을 만들었습니다. 여기서, 우리는 변형된 대장균 균주에서 이질적인 발현에 의한 식물 폴리아민 항균제의 기능적 특성화, 프랑스 프레스를 이용한 막 소포의 생성, 및 방사성 표지된 세포사이다.

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Protocol

1. P1 전이로 돌연변이를 두 배로 노크하는 대장균의 생성

  1. 대장균 단일 녹아웃 돌연변이 균주 인 대장균 유전 스톡 센터(http://cgsc.biology.yale.edu)로부터 ΔPotE 및 ΔCadB를 획득합니다.
    참고: ΔPotE 균주는 카나마이신 내성26이고 ΔCadB 균주는 테트라사이클린 내성27입니다.
  2. P1 변환프로토콜(28)을사용하여 PotE/CadB 이중 녹아웃(DKO) 변형을 구성합니다.
    1. 리세이트 준비
      1. 신선한 LB (1:100)에 ΔPotE의 하룻밤 배양을 10-25 mM MgCl2,5 mM CaCl2,및 0.1-0.2 % 포도당으로 보충하였다.
      2. 1-2 시간 동안 37 °C에서 자랍니다.
      3. 40 μL의 P1 파지 를 배양에 첨가하고, 37°C에서 계속 성장한다. 문화가 용해 될 때까지 1-3 시간 동안 모니터
        참고 : 문화가 lysed 되면, 세포 파편은 튜브에서 볼 수 있으며, 배양은 탁도의 상당한 손실을 해야합니다.
      4. 용해염과 소용돌이에 클로로폼 (50-100 μL)을 여러 방울 떨어뜨립니다. 12,000 x g의 원심분리기를 2분 간 사용하여 세포 이물질을 제거하고 상급물질을 신선한 튜브로 옮긴다.
    2. 변환
      1. LB 배지에서 하룻밤 동안 ΔCadB 변형을 성장시다.
      2. 4,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확하고 1/5-1/3에서 수확 된 배양량을 100 mM MgSO4 및 5 mM CaCl2로보충하여 신선한 LB에서 다시 중단합니다.
      3. 1.2.1.4 단계에서 파지와 함께 튜브에 ΔCadB 셀 현탁액을 추가하고 빠르게 혼합하십시오.
      4. 1 M Na-감산염(pH5.5)의 200 μL을 추가한 다음, 항생제 내성 마커의 발현을 허용하기 위해 37°C에서 37°C에서 인큐베이트1 mL을 첨가한다.
      5. 4000 x g에서 5 분 동안 세포를 돌루.
      6. 100 μL LB에서 100 mM Na-Citrate (pH 5.5)와 와류를 잘 사용하여 세포를 분산시다.
      7. LB 한천 플레이트에서 50 μg/mL 카나마이신 및 10 μg/mL 테트라사이클린이 있는 재조합 균주를 선택한 다음, 적절한 프라이머26,27로폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 확인합니다.
      8. 시퀀싱을 통해 PCR 조각을 확인합니다.

2. 대장균 돌연변이의 표적 유전자 (AtBAT1)의 발현

  1. PCR에 의해 표적 유전자의 전체 길이 서열을 증폭하고 게이트웨이 엔트리 벡터 pENTR/D-TOPO29에삽입합니다.
    참고: 이 경우 ATBAT1.1은 전진 프라이머 5'CGGCGATATCAATTGTT 및 역프라이머 5'GCTAGAATGTGGAGATGG를 사용하여 증폭되었다, 98°C에서 2분 동안 초기 변성 및 0.1분 동안 98°C에서 30사이클의 변성, 0.3분 동안 59°C에서 어닐링, 72°C에서 0.40분, 72°C에서 10분 동안 최종 연장. PCR 제품은 분광계를 사용하여 정량화된 PCR 정리 키트를 사용하여 정제되었습니다. 게이트웨이 벡터에 PCR 제품을 삽입한 후 제조자 지시에 따라 수행하였다.
    1. 열 충격에 의해 유능한 Top10 대장균 세포로 입력 벡터를 변환하고 표준 분자 클로닝 프로토콜30에따라 50 μg / mL 카나마이신으로 LB 미디어에서 성공적인 재조합제를 선택하십시오.
    2. 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 제조사의 지시에 따라, 그리고 서열로 정확한 삽입을 확인한다.
  2. 표적 유전자를 E. coli 대상 벡터로 전송하여, pBAD-DEST49에 의해 게이트웨이 LR 클로닝에 의해 발현벡터(29)를생성한다.
    1. 발현 벡터를 30초 동안 히트쇼크로 유능한 Top10 E. 대장균 세포로 변환하고 100 μg/mL ampicillin30으로LB 미디어에서 성공적인 재조합제를 선택한다.
    2. 플라스미드DNA(30)를 추출하고 서열은 정확한 삽입을 확인한다.
  3. 식 벡터를 대장균 ΔpotE740(del):kan, ΔcadB2231::Tn10으로 변환하고 암피실린, 카나마이신 및 테트라사이클린30이있는 LB 플레이트에서 선택합니다.
  4. 유도를 위한 아라비노스의 최적 농도를 결정하기 위해, 설명된 바와 같이 아라비노스의 그라데이션 농도를 LB 매체에서 아라바드 프로모터의 제어하에 표적 유전자를발현한다.
  5. 세포 펠릿을 수집하고 제품 매뉴얼29에기재된 바와 같이 SDS-PAGE 및 단백질 밴드의 시각화에 의한 단백질 발현을 평가한다.
    참고: 대장균 ΔpotE740(del):kan, ΔcadB2231:Tn10은 BAT1 발현 없이 대조군 샘플로 사용하였다. E.coli 이중 녹아웃 돌연변이 세포를 빈 pBAD-DEST49 벡터로 녹아웃하는 벡터 내의 ccdB 유전자의 존재로 인해 대조군으로 사용되지 않았다.

3. 인사이드 아웃 멤브레인 소포 생성

  1. 대장균 돌연변이 세포를 배양하여 단일 콜로니를 밤새 5 mL의 폴리아민 무염배지(글리세롤 2%,K2HPO 4g,KH2PO4,NaCl 0.5 g) 3g에서 하룻밤 동안 성장시킴으로써 표적 단백질을 배양하고, NH4Cl, 티아민 50 mg, 0.79 g 효모 완전 합성 배지 아데닌 헤미술페이트 (10 mg/L), L-아르기닌 (50 mg/L), L-아스파르트산 (80 mg/L), L-히스티딘 하이드로 염화물 모노 하이드레이트 (20 mg / L), L-류신 (100 mg / L), L-리신 염산염 (50 mg / L), L-메티오닌 (20 mg / L), L-페닐알라닌 (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-트립토판 (50 mg/L), L-티로신 (50 mg/L), L-발 린 (140 mg/L), 우라실 (20 mg/L)). 이 배양을 0.0002% 아라비노스로 보충한 폴리아민 프리 배지의 500 mL로 옮기고 세포 배양이 0.6-0.8의 OD600에 도달할 때까지 성장한다(보통~5시간).
  2. 4°C에서 15분 동안 2,000 x g에서 원심분리에 의해 세포 펠릿을 수집합니다. 펠릿을 다시 일시 중단하고 0.1 M 칼륨 인산완충액, pH 6.6, 10 mM EDTA (Buffer 1)를 함유하여 세 번 세척한다. 세 번째 스핀 후 버퍼 1의 셀의 최종 부피는 10 mL이어야 합니다.
  3. 35 mL 프렌치 압력 셀을 사용하여 손상되지 않은 세포의 프렌치 프레스 처리 (10,000 p.s.i.)에 의해 내부 아웃 막 소포를 생성합니다.
  4. 샘플을 표준 프렌치 압력 셀에 로딩하기 전에 피스톤과 O-링을 윤활하여 셀에 쉽게 삽입할 수 있도록 합니다.
    참고:이 지침은 표준 압력 셀의 사용에 따라 다릅니다.31.
    1. 셀의 아래쪽 끝에 클로저 플러그를 조심스럽게 나사로 조입니다. 셀의 측면에 있는 글자위에 따라 셀이 오른쪽 위로 올라오도록 합니다. 피스톤을 셀에 삽입하고 피스톤의 최대 충진 선이 피스톤 의 상단에 도달할 때까지 셀로 이동합니다. 장치를 뒤집고 제공된 스탠드에 세 개의 기둥 사이에 놓습니다.
    2. 셀 현탁액을 세포의 몸에 붓습니다.
      참고: 우리는 단지 10 mL를 사용하고 있다, 그래서 35 mL의 용량을 가진 프랑스 압력 셀 챔버에 남아있는 충분한 공간이있을 것입니다.
    3. 표준 압력 셀을 프랑스 압력 셀 장치에 장착합니다.
      1. 먼저 전원이 꺼져 있는지 확인합니다. 패널의 왼쪽에는 비율 선택기 스위치가 있습니다. 그것은 세 가지 위치가 있습니다 : 실행의 끝에 아래로, 더 작은 압력 셀을 사용하기위한 낮은, 표준 프랑스어 압력 셀과 함께 사용하기 위해 높음. 프랑스 프레스가 이전에 더 작은 셀과 함께 사용된 경우 피스톤은 완전히 후퇴되지 않을 수 있습니다. 이 스위치를 아래로 설정합니다.
    4. 장치 뒷면의 RHS 스위치를 사용하여 기기를 켜고 일시 중지 실행 스위치를 실행 위치로 돌립니다. 이렇게 하면 피스톤이 완전히 후퇴됩니다. 스위치를 일시 중지로다시 이동하고 기기를 끕지 로 끕을 끕지 입니다.
    5. 엄지 나사를 풀고 스테인리스 스틸 컬럼 두 개에 이르는 안전 클램프를 옆으로 이동합니다. 그것은 오른쪽으로 스윙합니다. 한 손으로 클로저 플러그의 베이스를 제자리에 놓고 양손으로 프랑스 압력 셀을 선택하고 180 °로 회전하면 피스톤이 똑바로 서 있습니다. 플랫폼에 놓고 안전 클램프를 제자리에 다시 이동하여 이 클램프가 프랑스 압력 셀을 제자리에 고정하도록 합니다.
    6. 밸브를 자유롭게 돌수 있도록 클로저 플러그의 흐름 밸브 어셈블리를 작동기및 위치에 두어야 합니다. 시계 반대 방향으로 몇 번 회전하여 유량 밸브 어셈블리를 엽니다. 피스톤의 팔을 2시 방향과 8시 위치에서 향하도록 배치합니다. 표준 압력 셀이 제자리에 고정되도록 엄지 나사를 조입니다.
    7. 샘플 콘센트 튜브를 클로저 플러그에 삽입하고 유연한 튜브의 짧은 조각을 연결하여 깨진 셀 파편을 매 튜브에서 수집 할 수 있습니다. 우리는 보통 300 mL 의 얼음으로 채워진 비커를 사용하여 팔콘 튜브를 똑바로 잡고 세포 파편을 차갑게 유지합니다.
    8. 일시 중지 실행 스위치가 일시 중지로설정되어 있고 밸브 어셈블리가 열린 위치에있는지 확인합니다. 기기를 다시 켜고 비율 선택기 스위치를 높음으로바꿔 서 전면 패널의 압력 증가 밸브를 반 회전쯤 오른쪽으로 돌립니다.
    9. 피스톤은 챔버의 공기를 대체하기 위해 기지에서 상승하기 시작합니다. 샘플 출구 튜브에 부착된 타이곤 튜브에서 나오는 공기를 비커의 튜브로 직접 연결합니다.
    10. 액체의 첫 번째 방울이 나올 때 시계 방향으로 돌려 흐름 밸브 어셈블리를 닫습니다. 이것은 압력 셀과 함께 금속 밀봉에 금속을 생성하므로 과도하게 조이지 마십시오.
    11. 프랑스 프레스의 전면은 압력 셀 내부의 생물학적 세포에 적절한 압력을 생성하는 전면 패널에 차트가 있습니다. 이 경우 게이지가 640 psi에 도달할 때까지 압력 증가 밸브를 시계 방향으로 돌려 압력을 높입니다. 이것은 10,000 psi의 내부 압력을 만들 것입니다.
    12. 셀이 목표 압력에 도달하면 시계 반대 방향으로 회전하여 유량 밸브 어셈블리를 약간 엽니다. 밸브의 개구부를 조정하여 분당 약 10방울의 유량을 허용합니다.
    13. 피스톤 본체의 정지선이 유동 셀의 상단에 도달하면. 일시 중지 실행 스위치를 일시 중지로전환합니다. 이는 피스톤을 셀에 더 멀리 삽입하면 장치가 손상될 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 유량 밸브 어셈블리를 열고 나머지 방울을 수집합니다.
    14. 비율 선택기를 아래로전환한 다음 일시 중지 실행 스위치를 실행으로설정합니다. 바닥 판이 완전히 리트랙팅되면 실행 스위치를 일시 중지로설정하고 기기를 끕니다.
    15. 프렌치 프레스에서 프렌치 압력 셀을 제거하고 청소를 위해 분해합니다. 글리세롤의 가벼운 덮개로 모든 부품을 건조 보관하십시오. 개스킷이나 씰을 제거하고 마모 징후로 교체하십시오.
  5. 4 °C에서 15 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리에 의해 프랑스 프레스 용리액의 끊어지지 않은 세포 및 세포 파편을 제거하십시오. 펠릿을 버리고 초원심분리관으로 상급체를 옮김시 옮김을 옮김시 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 버린다.
  6. 펠릿 멤브레인 소포는 4°C에서 1시간 동안 150,000 g의 초원심분리에 의해 생성된 상급체로부터의 소포를 생성한다.
  7. 1mMM 트리스-말레산염, pH 5.2에서 0.14 M KCl, 2 mM2-메르카페탄올 및 10% 글리세롤을 함유하고, Dounce 조직 분쇄기를 사용하여 동일한 완충제(Buffer2)에서 재중단하여 멤브레인 소포를 재서스펜션 없이 한 번 세척한다. 전형적으로 배양500 mL로부터의 막 분획은 5 mL의 완충액에서 현탁될 것이고, 바이오친산분석(32)을이용하여 막 단백질/mL의 5-10 mg의 농도이다.
  8. 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 -80°C에서 멤브레인 제제의 100 μL aliquots를 저장합니다.

4. 서부 블롯 과 수송 분석의 방향

  1. 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2에서3.7 단계에서 소포를 세척하고 다시 일시 중단하십시오.
  2. 100 μL 샘플에 0.1 M NaCl, 30 mM Tris, 0.2 mM CoCl2 pH 7.8에 2 mg/mL 카르복시펩티다아제 A 1 μL을 추가합니다.
  3. 20°C에서 20분 간 인큐포밍합니다. 0.5 M NaEDTA, 0.5 M 2-메르카포에탄올 pH 7.5의 5 μL을 첨가하여 소화를 중지합니다.
  4. 효소를 완전히 비활성화하려면 실온에서 1 시간 동안 용액을 배양하십시오.
    참고: catboxypeptidase A 처리가 없는 소포는 대조군으로 사용되었습니다.
  5. 리튬 도데실 황산염이 있는 경우 전기 영동에 의한 시료를 분석합니다. 5-10 μL의 150 mg/mL 리튬 도데실 황산염, 450 mg/mL 글리세롤, 0.1 mg/mL 브로모페놀 블루, 0.4 M Tris pH 7.5 ~ 100 μL의 시료를 추가합니다.
  6. 폴리아크릴아미드 겔상에 25 mM 나트륨-수소 인산염 pH 7.5로 적신 니트로셀룰로오스 필터를 놓음으로써 면역블롯을 수행한다. 두 개의 축축한 셀룰로오스 필터 사이에 이 필터를 놓고 마지막으로 두 개의 축축한 플라스틱 수세미 사이에 놓습니다. 25 mM 나트륨-수소 인산염 pH 7.5를 함유하는 챔버의 전극 사이에 2-4°C에 이 조립체를 놓는다.
  7. 단백질의 전기 전달이 20 V 및 2-3 A에서 3 시간 동안 진행되도록 하십시오.
  8. 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 및 0.5 mg/mL 트웬 2033의차단 완충액에서 2°C에서 밤새 니트로셀룰로오스 멤브레인을 차단한다.
  9. 니트로셀룰로오스 필터를 2시간 동안 인큐베이션하여 안티-히(C 단말)-HRP 항체를 차단 완충제(20 mL)에서 1:5000 희석하고 총 60분 동안 50 mL의 완충제로 2회 세척한다.
  10. 면역 블롯을 시각화하려면 변성 알코올 20 mL에 4 클로로-1-나프톨 6 mg을 용해시키고 15 mM Tris pH 7.5 및 30 % H2O2의80 mL을 추가하십시오. 20 분 동안 기판 용액에 여과지를 목욕. 시약은 니트로셀룰로오스 막상에 청색 침전제를 형성하기 위해 항체와 반응할 것이다. 충분한 색상이 발생하면 멤브레인을 물로 헹구고 건조시키십시오.

5. 교통 분석

  1. 12°C에서 막 소포의 100 μL aliquots를 5분 동안 배양한다.
  2. 50 μM의 최종 농도에서 막 소포에 방사성 라벨폴리아민을 첨가하여 수송을 시작합니다 (달리 명시되지 않는 한). 10 mM Tris-HCl, 10 mM MM 칼륨 인산염, pH 8.0 및 0.14 M KCl23 (버퍼 3)으로 구성된 분석 버퍼에서 3개의 H 기판 (스페르미딘 또는 퍼크레시네) 용액을 분석에 따라 변형합니다.
  3. 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브에서 12 °C에서 1 분 동안 수송 검정을 실시하십시오.
  4. 1분 후, 반응 혼합물을 여과 매니폴드로 옮기고 0.45 μm 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 통해 여과한다.
    1. 라벨이 지정되지 않은 폴리아민의 10배 높은 농도를 함유하는 얼음-차가운 분석 버퍼 3 mL를 추가하고 폴리아민없이 3 mL의 분석 버퍼를 추가하여 비특이적 결합을 줄입니다.
    2. 세척된 필터를 10 mL의 송신액을 함유하는 일회용 송광 바이알로 옮기고 액체 침전 카운터를 사용하여 방사능을 결정합니다. 진미 카운터는 샘플의 방사능을 측정하고 분당 붕괴 (dpm)로보고합니다.
  5. 순 폴리아민 섭취량을 12°C에서 배양한 소포에 의해 1분에서 의 섭취량과 얼음 에 배양된 소포에 의해 0분에서 의 한 반차의 차이로 계산한다.
    참고: 소포내로 수입되는 기판의 질량은 다음과 같이 계산된다. 마이크로퍼지 튜브내의 시료 부피가 0.2 μL이고 기판의 시작 농도가 100 μM이면, 마이크로퍼지 튜브내의 기판의 총 질량은 20 x10-12 M이다. 상업적으로 표지된 기판의 매우 높은 특이적 활성(종종 2.22 x 109 dpm/mM)으로 인해 추가된 동위원소의 질량은 계산에서 무시될 수 있다. 따라서 마이크로퍼지튜브에 첨가된 동위원소의 총량이 100 x 106 dpm이고 소포가 1,000 dpm의 순 섭취량을 가졌다면, 소포에 의해 채택된 기판의 총 질량은 기판의 총 두더지 수의 1% 또는 2 x10-13 M이었다.
    1. 표적 단백질을 발현하는 소포내로 10, 25, 50, 250 및 500 μM의 기판을 측정하여 기판에 대한 Km을 결정한다. 통계소프트웨어패키지(34)의마이클리스 멘톤 모델을 이용한 비선형 회귀 방법을 사용하여 마이클리스-멘텐 역학을 계산한다.
  6. 경쟁 실험을 위해, 12°C에서 소포100 μL을 함유하는 1.5 mL 마이크로센트리퓨지 튜브에 분석 버퍼로 만든 100 μM, 500 μM, 1mMMM, 1.5 mMM 또는 2 mMM 비라벨경쟁기판을 첨가한다.
    1. 방사성 표지폴리아민(50 μM)을 미세원심지 튜브에 동시에 추가합니다.
    2. 5단계부터 5.4.2단계까지 반복하여 위에서 언급한 소포 내부에 갇힌 방사능을 측정합니다.
    3. 100 μM 이상의 비표지 기판이 있는 경우 10, 25, 50, 250 및 500 μM의 전파표지 폴리아민의 섭취량을 측정하고 비선형 회귀 방법을 사용하여 곡선을 플롯하여 경쟁기판에 대해 명백한 Km(K m,app)을결정한다.

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Representative Results

이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에그림으로 요약되어 있습니다. 간략하게, 대장균 세포는 모든 폴리아민 교환기에서 결핍되고 AtBAT1을 발현하여 배양되고, 원심분리되고, 완충액으로 세척하고, 프랑스 프레스를 사용하여 세포 용해를 행하였다. 용해는 주로 내부 아웃소포를 생성하고 세포 외부의 버퍼를 트랩하는 경향이있다. 세포 파편은 원심 분리에 의해 제거되고, 제 2 초원환 단계는 막 펠렛을 수집하는 데 사용된다. 멤브레인 펠릿은 트리스-말레아테 완충액 pH 5.2에서 재중단되고 -80°C에서 저장된다. 수송 성 애세포는 12°C에서 이루어지며, 이는 멤브레인 안정성을 유지하기에 최적인 것으로 밝혀졌다. 공산학은 방사성 표지기의 첨가 및 소포의 완충현탁액의 pH의 pH의 변화에 의해 pH 8.0으로 개시된다. 1 분 후, 표지되지 않은 기판을 가진 얼음 차가운 분석 버퍼는 소포로 방사성 라벨의 섭취를 막기 위해 첨가됩니다. 방사성 표지된 소포는 니트로셀룰로오스 막을 통해 여과에 의해 갇혀 있습니다. 멤브레인은 액상 진미 계수에 의해 결정되는 멤브레인에 있는 진미 바이알 및 방사성 라벨로 옮겨지다.

서쪽 얼룩은 AtBAT1이 소포로 전이되는지 확인하는 데 사용됩니다(그림2). 항-그의 C 말단 항체로 블롯을 조사하여 약 72.3 kDa의 융합 구성 단백질을 밝혀냈다(도2,레인 2). SDS-PAGE 이전에 소포의 소화는 감소로 이어졌지만 프로브 신호의 완전한 손실은 아니었다(도2,레인 3). carboxypeptidase A의 결과로 프로브 신호의 감소는 C 말단 잔류물의 대부분이 소포의 외부에 있다는 것을 건의합니다.

이 분석 시스템에서 소포는 pH 5.2에서 버퍼에 매달려 소포 내부의 pH가 버퍼와 균형을 이수합니다. pH 5.2에서 소포로 방사성 표지된 기판을 수송하는 것은 pH 8.0 버퍼에서 소포를 현탁시킴으로써 개시되어, 따라서 멤브레인을 가로질러 pH 2.8의 pH 구배를 생성한다. 12°C에서, 소포에 의한 방사성 표지된 정자의 섭취는 1분에서 가장 높았고, 3분 이상 선형으로 유지하였다(도3A). 따라서, 수송 분석의 인큐베이션 시간은 1분에 고정되었다. 방사성 라벨의 비특이적 결합을 설명하기 위해, 소포는 1분 동안 방사성 표지기의 존재 에서 0°C에서 배양되었고, 이들 카운트는 더 높은 온도에서 ladiolabel의 섭취로부터 빼게 되었다.

도 3B는 1분 후에 소포내로 방사성 표지된 스페르미딘의 섭취를 나타낸다. 소포 막에 걸쳐 양성자 구배가 없었기 때문에 pH 8.0에서 제조되고 저장된 막 소포에 의한 동위원소의 순 섭취량은 없었다. 인공 양성자 구배의 소산 효과를 입증하기 위해, 막 소포는 표지된기질(25)을첨가하기 전에 10분 동안 pH 8.0 버퍼로 배양하였다. 이러한 조건하에서, 방사성 표지된 기판의 최소한의 섭취가 도시되었다. 방사성 표지된 스페르미딘의 섭취는 또한 폴리아민 교환기 CadB 및 PotE에서결핍된 대장균 세포로 제조된 소포에서 최소한으로 하였다. 종합하면, 이들 결과는 스페르미딘의 양성자 구동 섭취가 BAT1 단백질에 의한 것임을나타낸다(도 3A,B).

단백질의 기질 특이성을 결정하기 위해, Km 값은 10, 25, 50, 100, 250 및 500 μM 농도에서 방사성 표지기의 섭취를 측정하여 계산되었다. 상기 Km의 스페르미딘, 푸크레신 및 아르기닌은 각각 55±12 μM, 85±20 μM 및 1.4±0.5 mM이었으며, 이는 이 단백질이 높은 친화도 폴리아민 및 아르기닌 교환기임을 나타낸다(그림4).

특정 기질에 대한 수송기의 친화성은 또한 경쟁 적 공소사를 사용하여 간접적으로 결정될 수 있다. 여기서, 우리는 두 기판 사이의 경쟁을 평가하기 위해 두 가지 방법을 활용했다. 제1 방법에서, 50 μM의 전파표지된 스페르미딘의 섭취는 비표지된 경쟁 기판의 증가농도의 존재 내에서 측정되었다(도5A). 제2 방법에서, 스페르미딘에 대한 명백한 Km은 100 μM 비표지 경쟁 기판의 존재 에서 방사성 표지된 스페르미딘의 증가 농도의 섭취를 측정함으로써 계산하였다(도5B). 경쟁 적인 아세액은 GABA가 Km, 164 ±15 μM의 응용 프로그램과 함께 정자의 경쟁 억제제임을 밝혔다(그림 5A, B). 더욱이, 다른 아미노산의 다양한 농도의 존재에서 50 μM 방사성 표지된 스페르미딘의 섭취량을 측정하는 것은 AtBAT1이 또한 mM 농도에서 글루타민과 알라닌을 수송할 수 있다는 것을 밝혔다(그림 6).

Figure 1
그림 1: 메서드의 개략적 표현. (A) 대장균에서막 소포의 제조 및 정제의 주요 단계를 설명하는 도식 표현. (B)방사성 표지기판을 이용한 멤브레인 소포 제제의 수송 분석의 주요 단계를 설명하는 도식적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 정제된 소포에서 AtBAt1의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯. 밴드는 고추냉이 과산화아제 공액을 사용하여 그의(C-term)-HRP 항체를 구비하였다. 레인 1,미리 염색 된 단백질 사다리. 레인 2,융합 단백질의 예상 크기의 대역을 나타내는 AtBAT1.1을 발현하는 정제소포. 레인 3,AtBAT1.1을 발현하는 정제소포는 SDS 전기동동및 서부 블로팅 이전에 카르복시펩티다아제 A로 전처리하였다. 동등한 양의 소포(단백질)를 각 레인에 첨가하였다. 감소된 염색은 대부분의 소포에서 단백질의 C-말단이 프로테아제 소화에 의해 저하된다는 것을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: BAT1 단백질 발현의 효과 및 pH 구배의 중요성을 나타내는 소포의 수송 활성. (A)5.2의 내부 pH로 BAT1을 발현하는 소포에서 3H표지된 스페르미딘의 시간 의존적 인 섭취는 pH 8.0에서 완충액을 도입하였다. 대조군 분석법에서, 소포는 양성자 구이의 소실을 가능하게 하기 위해 3H표지된 스페르미딘을 첨가하기 10분 전에 pH 8.0, 10분전에 분석 버퍼에 첨가되었다. 이어서 소포내로 방사성 라벨의 섭취를 1 분 간격으로 평가했다. (B)양성자 구배 (5.2의 내부 pH)의 존재 상태에서 3H 표지 된 정자의 섭취, 양성자 구이의 부재 (8의 내부 pH), 분석 용액에 첨가 된 소포에서 10 분 전에 방사성 표지 된 스모티딘을 첨가하고 대장균 돌연변이 세포로 만든 소포에서 BAT1을 발현하지 않는다. 소포로의 섭취는 1 분 동안 모니터링되었다. 모든 값은 5개의 복제물의 평균 ± SE로 표시됩니다. 데이터 분석은 학생의 t-검정을 사용하여 수행되었고*대조군(p 값 < 0.05)과 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: BAT1의 폴리아민 및 아르기닌 수송 활성의 시험관내 어학시험. (a)스페르미딘 및 퍼크레신 섭취량에 대한 Km 값은 각각 55±12 μM 및 85±32 μM이다. (B) 아르기닌 섭취량에 대한 Km은 1.4 ±0.5 mM이다. 모든 값은 5개의 복제물의 평균 ± SE로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: GABA는 BAT1에 의해 스페르미딘 수송의 경쟁 억제제이다. (A)AtBAT1.1을 발현하는 소포에 의한 3H표지 된 스페르미딘의 섭취는 100 μM 또는 500 μM GABA의 존재 내에서 현저히 감소하였다. (B)BAT1.1에 의한 스페르미딘 섭취량에 대한 명백한Km은 100 μM GABA의 존재에서 164±20 μM으로 증가하였다. 모든 값은 5개의 복제물의 평균 ± SE로 표시됩니다. 데이터 분석은 학생의 t-검정을 사용하여 수행되었고*대조군(p 값 < 0.05)과 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 글루타민산염과 알라닌은 BAT1에 의한 스페르미딘 수송의 경쟁억제제이다. 스페르미딘 섭취량은 1 mM비표지 글루타민산염 및 1.5 mM 비표지 알라닌의 존재 내에서 현저히 감소되었다. 모든 값은 5개의 복제물의 평균 ± SE로 표시됩니다. 데이터 분석은 학생의 t-검정을 사용하여 수행되었고*대조군(p 값 < 0.05)과 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

본 연구에서, 우리는 먼저 대장균에서 단백질을 발현한 다음 막 소포를 생성하여 항균제의 특성화를 위한 방법을 개략적으로 설명하여 이종발 단백질을 무세포 시스템에서 분석할 수 있도록 한다. 대부분의 분자 생물학 실험실에서 발견되는 장비 이외에, 이 전략은 프랑스 언론, 초원심분리기 및 방사성 동위 원소 검소를 실시하는 시설에 대한 액세스를 필요로합니다.

이 기술의 기본적인 요구 사항은 이종 단백질이 대장균의혈장 막을 올바르게 표적으로 한다는 것입니다. 이러한 전략은 또한 대장균 운반체가 대장균 세포막에 성공적으로 국한되고 기능적으로 특징화된35이기때문에 오르간선 기 수송기의 기능적 분석에 유용할 수 있다. 이러한 실험에 사용된 벡터(pBAD-DEST49)는 번역된 생성물의 용해도를 증가시키기 위해 N-말단 티오레독신 단백질을 함유한다. 작은 B. subtilus 단백질 신비의 N 말단 융합은, 세포질 막(36)에막 수송제의 보다 효율적인 표적화가능하게 하기 위하여 발견되었다. 그러나, 잘못 접는 사건, 세포질 막에 제대로 통합되는 단백질의 실패는 수송기의 많은 모형을 위한 세균발현의 사용을 배제하는 잠재적인 문제점이다1.

막 소포는 또한 식물 수송기37,38을특성화하기 위하여 이용되었습니다. 소포는 ATP와 효소와 같은 필수 에너지원이 부족하기 때문에 활성 수송기 및 기타 대사 활동의 간섭이 최소화됩니다. 따라서,이 시스템은 대사 산물 교환기와 같은 수동 전좌의 분석에 이상적입니다. 상적 막 소포, 특히, 내부 용액의 조성은 버퍼 1의 조성을 변경하여 조작 될 수 있기 때문에, 수출 및 안티 포터의 특성화에 적용 될 수있다. 또한, 프렌치 프레스 또는 초음파 초음파 를 사용하는 것은 손상되지 않은 대장균 세포에서 내부 아웃 막 소포를 생성하는 데 매우 효율적입니다. 초음파 초음파 또는 프랑스 언론에 의해 생성 된 소포의 95 %가 멤브레인39,40을적재했습니다. 푸트르신과 오르니틴의 대장균 항균제인 PotE는, 인사이드 아웃 멤브레인소포(23)를이용한 특징이 었던 최초의 폴리아민 항균체였다. 우리는 P1 전착을 사용하여 폴리아민 항균제의 특성화를 위한 특정 돌연변이 균주를 생성했으며, 이 균주는 다른 동물, 곰팡이 또는 식물 폴리아민 교환기의 특성화에 유용할 수 있습니다. 우리는 또한 2개 이상의 유전자 삭제를 가진 그밖 대장균 긴장이 막 소포를 사용하여 그밖 식물 및 동물 교환 수송기의 특성화를 위해 유용할 지도 모른다는 것을 구상합니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 대장균 돌연변이 계통에서 단백질의 발현이다. 유도성 프로모터를 가진 대장균 발현 벡터는 이종 유전자 발현의 타이트하고, 투여량 의존적 조절을 촉진하기 위해 이용된다. 그의 패치 티오레독신, V5 에피토프 또는 6xHis와 같은 N 단말 및 C 단말 태그의 존재는 단백질의 검출 및 정제에 유용하다. 또한, pBAD49 벡터의 성분인 티오레독신 융합 단백질의 존재는, 번역 효율을 증가시킬 수 있고, 경우에 따라 대장균(41)에서발현되는 진핵 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 애기장대와 대장균의 다른 코돈 선택은 대장균에서 단백질 발현에 도전할 수 있습니다. 코돈 최적화는대장균(42)에서이종 단백질 발현을 인상적으로 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 소포 분석에서, AtBAT1.2에 최적화된 코돈은 대장균 세포에서 AtBAT1.1에 최적화된 비코돈보다 더 높은 교환 활성을 보였으며(데이터는 나타내지 않은 데이터), 코돈 최적화가 세균 세포에서 이종적으로 발현된 단백질의 발현 및 기능을 향상시키는 데 도움이 되었다는 것을 입증하였다. 리시브 세포의 느린 물방울을 유지하기 위해 밸브를 주의 깊게 조정하여 막 소포를 제조하는 것도 절차의 핵심 단계입니다. 초원심분리 후, 우리는 Dounce 균질화제에서 막 소포의 재박탁이 -80 °C에서 제조되고 이어서 저장되는 막 소포의 aliquots 사이 견본 변이를 견본을 극소화한다는 것을 것을을 발견했습니다.

대장균 발현 시스템의 한계는 N-글리코실화 또는 아세틸화와 같은 번역 후 변형이 불가능하다는 것입니다. 이러한 단백질 변형의 부재는 단백질 활성에 영향을 미칠 수 있습니다1.. . 그러나, 이러한 변형을 수행할 수 있는 돌연변이체가 확인되었으며, 이러한 변형을 필요로 하는 단백질을 발현하는 도구로사용될 수있다(43). 발현된 단백질의 충분한 양의 생성은 포함 체로서의 전개 및 응집, 세포질 막에 적절하게 통합되는 단백질의 실패, 잘못된 표적화 및 사후 번역 수정의 부족으로 인한 잘못된 조절로 인해 도전이 될 수 있다.

이 기술의 사소한 제한은 수송기의 자연스러운 방향에 대한 증거를 제공하지 않는다는 것입니다. 이는 N 또는 C 말단 태그 및 면역학적 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 소포에서 단백질의 특정 말단의 접근성은 모든 접근 가능한 소화에 의해 달성될 수 있으며, 따라서 아마도 담체의 외부 종단, 나트륨 도데실 황산염의 존재 시 단백질의 전기 영동, 니트로셀룰로오스 필터로의 전달 및항체(40)를가진 잔류, 내부 테르미니의 검출에 의해 달성될 수 있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트에 대한 지원은 BGSU 대학원, 후원 프로그램 및 연구의 BGSU 사무실에서 왔다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

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Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P.… More

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).

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