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Biochemistry

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Descrevemos um método para a caracterização de transportadores de membrana sufrágio movidos a prótons em preparações de vesículas de membrana produzidas pela expressão heterologous em E. coli e lise de células usando uma imprensa francesa.

Abstract

Vários métodos foram desenvolvidos para caracterizar funcionalmente novos transportadores de membrana. Poliaminas são onipresentes em todos os organismos, mas trocadores de poliamina em plantas não foram identificados. Aqui, descrevemos um método para caracterizar anticarregadores de poliamina usando vesículas de membrana geradaa a partir da lise das células escherichia coli expressando heterologously um antiporter vegetal. Primeiro, nós heterologously expressou AtBAT1 em uma cepa E. coli deficiente em poliamina e transportadores de câmbio arginina. Vesículas foram produzidas usando uma imprensa francesa, purificada pela ultracentrífugae e utilizadas em um ensaio de filtragem de membrana de substratos rotulados para demonstrar a especificidade do substrato do transportador. Estes ensaios demonstraram que atbat1 é um transportador proton-mediado de arginina, γ-aminobutírico ácido (GABA), putrescine e espermidina. A cepa mutante que foi desenvolvida para o ensaio do AtBAT1 pode ser útil para a análise funcional de outras famílias de trocadores de poliamina vegetal e animal. Nós também supor que esta abordagem pode ser usada para caracterizar muitos outros tipos de antiporters, desde que essas proteínas podem ser expressas na membrana celular bacteriana. E. coli é um bom sistema para a caracterização de novos transportadores, uma vez que existem vários métodos que podem ser empregados para mutgenizar os transportadores nativos.

Introduction

As proteínas envolvidas no tráfico de metabólitos constituem um nível essencial de regulação fisiológica, mas a grande maioria dos transportadores de membranas vegetais ainda não foi funcionalmente caracterizada. Várias estratégias foram implementadas para caracterizar novas proteínas de transporte. Expressão heterologous em organismos modelo como E. coli e células eucarióticas, como levedura, oócitos xenopus, células de mamíferos, células de insetos e células vegetais têm sido usados para determinar sua atividade de transporte1. As células eucarióticas são favorecidas pela expressão de proteínas eucarióticas, pois a composição celular básica, as vias de transdução de sinal, transcrição e máquinas de tradução são compatíveis com as condições nativas.

O fermento tem sido um organismo modelo importante para a caracterização de novas proteínas de transporte em plantas. A primeira proteína de transporte vegetal que foi expressa com sucesso em levedura(Saccharomyces pombe)foi o transportador hexose HUP1 de Chlorella2. Desde então, muitas proteínas de transporte de plantas têm sido funcionalmente caracterizadas usando um sistema de expressão de levedura. Estes incluem, transportadores de açúcar de plantas (SUC1 e SUC23,VfSUT1 e VfSTP14)e os transportadores de auxina (AUX1 e PIN5). As desvantagens de utilizar levedura para expressar proteínas vegetais podem incluir atividade prejudicada de proteínas localizadas com plastide, pois o fermento não tem essa organela, a segmentação inativa6,e a formação de agregados mal dobrados e a ativação de respostas ao estresse em levedura devido à superexpressão das proteínas da membrana7,8,9.

A expressão heterologous de proteínas do transporte em oocytes de Xenopus foi amplamente utilizada para a caracterização electrophysiological dos transportadores10. As primeiras proteínas de transporte de plantas caracterizadas usando expressão heterologous em oócitos Xenopus foram o canal Arabidopsis potassium KAT110 e o transportador de hexose Arabidopsis STP111. Desde então, os oócitos Xenopus têm sido empregados para caracterizar muitas proteínas de transporte de plantas, como transportadores de membrana plasmática12,transporte de surose vacuolar SUT413 e transportador de malado vacuolar ALMT914. Uma importante limitação dos oócitos Xenopus para ensaios de transporte é que a concentração de metabólitos intracelulares não pode ser manipulada1. Além disso, o conhecimento profissional é necessário para preparar os oócitos Xenopus e a variabilidade dos lotes de oócito é difícil de controlar.

A expressão heterologous no organismo modelo E. coli é um sistema ideal nos termos da caracterização de proteínas novas do transporte da planta. Com um genoma totalmente sequenciado15,as características moleculares e fisiológicas de E. coli são bem conhecidas. Ferramentas e técnicas moleculares estão bem estabelecidas16. Além disso, vetores de expressão diferentes, cepas não patogênicas e mutantes estão disponíveis17,18,19. Além disso, E. coli tem uma alta taxa de crescimento e pode ser facilmente cultivada em condições de laboratório. Muitas proteínas podem ser facilmente expressas e purificadas em quantidades elevadas em E. coli9. Quando as proteínas não podem ser amenizadas diretamente nos sistemas celulares, a reconstituição de proteínas em lipossomos também tem sido uma inovação bem sucedida, embora desafiadora, para a caracterização de proteínas de membrana purificadas. Caracterização funcional das proteínas de transporte mitocondrial de plantas, incluindo transportadores solute, como transportadores de fosfato em soja, milho, arroz e arabidopsia, portador de dicarboxil-tricarboxilato em Arabidopsis foram realizadas usando este sistema modelo20,21. No entanto, proteínas recombinantes da proteína de tomate SICAT9 foram encontradas não funcionais em experimentos de reconstituição, e outros membros da família cat transportador foram encontrados para ser não funcional em xenopus oocyte ensaios22. Assim, são necessárias ferramentas moleculares adicionais para a caracterização dos transportadores de membrana.

Cinco sistemas de transporte de poliamina são encontrados em E. coli23. Eles incluem dois transportadores ABC mediando a captação de espermidina e putrescine, um trocador putrescine/ornithine, um trocador de cadaverina/lysine, um exportador de espermidina e um importador putrescine. O trocador de putrescine PotE foi originalmente caracterizado usando um ensaio vesícula, onde de dentro para fora vesículas foram preparadas por células de lise com uma imprensa francesa e medindo a captação de putrescina radiografada nas vesículas em troca de orníntes24. Os ensaios da vesícula também foram usados para caracterizar um transportador de cálcio, que mediava o transporte de cálcio em resposta a um gradiente de prótons25. Esses experimentos nos levaram a desenvolver uma estratégia para a caracterização de outros trocadores de poliamina. Primeiro criamos uma cepa de e. coli deficiente em trocadores de PotE e CadB. Aqui, demonstramos a caracterização funcional de um antiporter de poliamina vegetal por expressão heterlogous na cepa e. coli modificada, geração de vesículas de membrana usando uma imprensa francesa e ensaios radiografados.

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Protocol

1. Geração do E. coli Double Knock Out Mutant com Transdução P1

  1. Obter o E. coli single-knockout mutantes cepas ΔPotE e ΔCadB do E. coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu).
    Nota: A cepa ΔPotE é resistente à kanamicina26 e a cepa ΔCadB é resistente à tetraciclina27.
  2. Construa a cepa de nocaute duplo PotE/CadB (DKO) usando o protocolo de transdução P128.
    1. Preparação de lysate
      1. Diluir uma cultura durante a noite de ΔPotE em LB fresco (1:100) complementada com 10-25 mM MgCl2,5 mM CaCl2, e 0,1-0,2% de glicose.
      2. Crescer a 37 °C para 1-2 h.
      3. Adicione 40 μL de lysate de fago P1 à cultura e continue crescendo a 37 °C. Monitorpara 1-3 h até que a cultura tenha lysed
        NOTA: Quando a cultura é lysed, detritos celulares serão visíveis no tubo e a cultura terá uma perda significativa de turbidez.
      4. Adicione várias gotas de clorofórmio (50-100 μL) ao lysate e vórtice. Centrífuga a 12.000 x g para 2 min para remover detritos celulares e transferir o supernatant para um tubo fresco.
    2. Transdução
      1. Crescer cepa ΔCadB durante a noite no meio LB.
      2. Colher as células por centrífuga a 4.000 x g para 2 min e resuspender em 1/5-1/3 o volume de cultura colhida em LB fresco complementado com 100 mM MgSO4 e 5 mM CaCl2.
      3. Adicione a suspensão celular ΔCadB ao tubo com fago do passo 1.2.1.4 e misture rapidamente.
      4. Adicione 200 μL de 1 M Na-Citrate (pH5.5), em seguida, adicione 1 mL de LB. Incubate em 37 °C para 1 h para permitir a expressão do marcador resistente aos antibióticos.
      5. Células de rotação a 4000 x g por 5 min.
      6. Resuspenda em 100 μL LB supplemeted com 100 mM Na-Citrate (pH 5.5) e vórtice bem para dispersar as células.
      7. Selecione as cepas recombinantes em placas de ágar LB com 50 μg/mL kanamicinina e 10 μg/mL tetraciclina e, em seguida, confirmar por Polymerase Reação Em Cadeia (PCR) com primers apropriados26,27.
      8. Verifique os fragmentos de PCR por sequenciamento.

2. Expressão do Gene alvo (AtBAT1) em E. coli Mutant

  1. Amplificar a sequência completa do gene alvo por PCR e inserir no vetor de entrada Gateway pENTR/D-TOPO29.
    Nota: Neste caso, atbat1.1 foi amplificado usando primer para a frente 5'CGGCGATCAATTTTGTT e primer reverso 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, uma desnaturação inicial a 98 °C por 2 min e, em seguida, 30 ciclos de desnaturação a 98 °C por 0,1 min, annealing em 59 °C por 0,3 min, extensão de 72 °C por 0,40 min e extensão final em 72 °C por 10 min. O produto PCR foi purificado usando um kit de limpeza PCR, quantificado usando um espectrômetro. A inserção do produto PCR no vetor Gateway foi feita seguindo as instruções dos manufactrurers.
    1. Transforme o vetor de entrada em células Top10 E. coli competentes por heatshock e selecione para recombinantes bem-sucedidos na mídia LB com 50 μg/mL kanamicinseguindo protocolos de clonagem molecular padrão30.
    2. Extraia dna de plasmídeo usando um kit de extração de plasmídeos, seguindo as instruções do fabricante, e seqüência para confirmar a inserção correta.
  2. Transfira o gene alvo para o vetor de destino E. coli, pBAD-DEST49 pela clonagem Gateway LR para criar um vetor de expressão29.
    1. Transforme o vetor de expressão em células Top10 E. coli competentes por heatshock para 30 s e selecione recombinantes bem-sucedidos na mídia LB com 100 μg/mL ampicilina30.
    2. Extraia dna plasmid30 e seqüência para confirmar a inserção correta.
  3. Transforme o vetor de expressão em E. coli ΔpotE740 (del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 e selecione em placas LB com ampicilina, kanamicina e tetraciclina30.
  4. A fim de determinar a concentração ideal de arabinose para a indução, expressar o gene alvo o controle do promotor araBAD na mídia LB com concentrações de gradiente de arabinose como descrito29.
  5. Coletar as pelotas celulares e avaliar a expressão de proteína por SDS-PAGE e visualização de bandas de proteína, conforme descrito no manual do produto29.
    Nota: O E. coli ΔpotE740 (del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 foi usado como a amostra de controle sem expressão BAT1. E.coli dupla derrubar células mutantes com o vetor pBAD-DEST49 vazio não foi usado como um controle devido à presença do gene ccdB no vetor.

3. Geração de vesículas de membrana de dentro para fora

  1. Cultura as células mutantes E. coli expressando a proteína alvo, crescendo uma única colônia durante a noite em 5 mL de mídia livre de poliamina (2% glicerol, 6 g de K2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, NH4Cl, 50 mg de tiamina, 0,79 g de fermento completa mídia sintética adenina hemisulfate (10 mg/L), L-Arginine (50 mg/L), L-Aspartic ácido (80 mg/L), L-Histi Monohidrato de cloridrato de águaimorda (20 mg/L), L-Leucine (100 mg/L), cloridrato de L-Lysine (50 mg/L), L-Methionine (20 mg/L), L-Fenilalanina (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Transfira esta cultura para 500 mL de mídia livre de poliamina complementada com 0,0002% arabinose e crescer até que a cultura celular atinja um OD600 de 0,6-0,8 (geralmente ~ 5 h).
  2. Colete a pelota celular por centrífuga a 2.000 x g por 15 min a 4 °C. Resuspenda a pelota e lave três vezes com 0,1 M tampão de fosfato de potássio, pH 6.6, contendo 10 mM EDTA (Buffer 1). O volume final de células em Buffer 1 após a terceira rotação deve ser de 10 mL.
  3. Gerar vesículas de membrana de dentro para fora pelo tratamento da imprensa francesa (10.000 p.s.i.) das células intactas usando uma célula de pressão francesa de 35 mL.
  4. Antes de carregar a amostra na célula de pressão francesa padrão, lubrifique o pistão e os anéis O para facilitar a inserção na célula.
    Nota:Estas instruções são específicas para o uso da célula de pressão padrão31.
    1. Cuidadosamente parafuso o plug de encerramento na extremidade inferior da célula. Certifique-se de que a célula está do lado direito para cima com base nas letras do lado da célula. Insira o pistão na célula e mova-o para a célula, até que a linha máxima de preenchimento no pistão atinja o topo do pistão. Vire a unidade e coloque no estande fornecido entre os três postes.
    2. Despeje a suspensão celular no corpo da célula.
      Nota: Temos vindo a utilizar apenas 10 mL, por isso haverá muito espaço deixado na câmara de células de pressão francesa, que tem uma capacidade de 35 mL.
    3. Monte a célula de pressão padrão na unidade de células de pressão francesa.
      1. Primeiro verifique se a energia está desligada. No lado esquerdo do painel está o interruptor do seletor da relação. Tem três posições: Para baixo no fim do funcionamento, baixo para usar uma pilha menor da pressão, e elevado para o uso com a pilha francesa padrão da pressão. Se a imprensa francesa foi usada previamente com a pilha menor o pistão não pode inteiramente ser retraído. Definir este interruptor para baixo.
    4. Ligue a máquina com o interruptor no RHS na parte de trás da unidade e ligue o interruptor Pause-Run para a posição de corrida. Isso resultará no pistão sendo totalmente retraído. Mova o interruptor de volta para pausa,e desligue a máquina.
    5. Solte os parafusos do polegar e mova a braçadeira de segurança que se estende para duas colunas de aço inoxidável para o lado. Ele vai balançar para a direita. Com uma mão segurando a base do plugue de fechamento no lugar, pegar a célula de pressão francesa com as duas mãos, e girá-lo 180 °, de modo que o pistão está agora na posição vertical. Coloque-o na plataforma, e mover a segurança de volta no lugar para que esta braçadeira mantém a célula de pressão francesa na posição.
    6. Observe que a montagem da Válvula flow no plugue de fechamento precisa ser acessível ao operador e posicionada para que a válvula possa ser girada livremente. Abra a montagem da válvula de fluxo com algumas voltas no sentido horário. Posicione os braços do pistão para que eles sejam orientados em uma posição de duas horas e oito horas. Aperte os parafusos polegares para que a célula de pressão padrão é realizada no lugar.
    7. Insira o tubo de saída da amostra no plugue de fechamento e conecte um pequeno pedaço de tubulação flexível para que os detritos celulares quebrados possam ser coletados em um tubo de falcão. Costumamos usar um copo cheio de gelo de 300 mL para segurar o tubo de falcão na posição vertical, e para manter os detritos da célula refrigerados.
    8. Certifique-se de que o interruptor Pause-Run está definido para pausar,e a montagem da válvula está em posição aberta. Ligue a máquina de volta para, adust o interruptor Ratio Selector para alta,e vire a válvula de aumento de pressão no painel frontal para a direita cerca de meia volta.
    9. O pistão começará a subir a partir da base para deslocar o ar na câmara. Dirijar o ar que sai da tubulação Tygon ligado ao tubo de saída de amostra para o tubo no copo.
    10. Quando as primeiras gotas de líquido saem, feche a montagem da válvula de fluxo, transformando-o no sentido horário. Isso cria um selo de metal para metal, com a célula de pressão, por isso não apertar demais.
    11. A frente da imprensa francesa tem um gráfico no painel frontal para gerar a pressão adequada sobre as células biológicas dentro da célula de pressão. Neste caso, aumentar a pressão, transformando a válvula de aumento de pressão no sentido horário, até que o calibre atinge 640 psi. Isso criará uma pressão interna de 10.000 psi.
    12. Uma vez que a célula atingiu a pressão alvo abrir a montagem da válvula de fluxo ligeiramente, transformando-o no sentido horário. Ajuste a abertura da válvula para permitir uma taxa de fluxo de apenas cerca de 10 gotas por minuto.
    13. Quando a linha de parada no corpo pistão atinge o topo da célula de fluxo. Mude o interruptor pausado para pausar. Isso é fundamental porque ter o pistão inserido mais longe na célula irá danificar a unidade. Abra a montagem da válvula de fluxo e recolher as quedas restantes.
    14. Ligue o seletor de proporção para baixoe, em seguida, defina o interruptor pause run para executar. Quando a placa inferior estiver totalmente retraída, defina o interruptor run para pausare desligue a máquina.
    15. Retire a célula de pressão francesa da imprensa francesa, e desmontar para a limpeza. Armazenar todas as partes secas com uma leve cobertura de glicerol. Retire e substitua quaisquer juntas ou selos com sinais de desgaste.
  5. Remover células ininterruptas e detritos celulares da imprensa francesa eluent por centrífuga a 10.000 x g para 15 min a 4 °C. Descarte a pelota e transfira tubos supernatant para tubos ultracentrífugas.
  6. Vesículas de membrana de pelota do supernatant resultante por ultracentrífugationat 150,000 g para 1 h a 4 °C.
  7. Lave as vesículas de membrana uma vez, sem resuspensão, em 1 mM Tris-maleate, pH 5.2 contendo 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoethanol e 10% glicerol e resuspender no mesmo buffer (Buffer 2)23 usando um moedor de tecido Dounce. Normalmente, a fração de membrana de 500 mL de cultura seria suspensa em 5 mL de buffer, e uma concentração de 5-10 mg de proteína de membrana / mL usando o ensaio ácido biochinic32.
  8. Armazenar 100 μL alíquotas de preparação de membrana em -80 °C em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.

4. Blot ocidental e orientação do ensaio do transportador

  1. Lave e resuspenda vesículas do passo 3.7 em 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2.
  2. Para 100 amostras μL, adicionar 1 μL de 2 mg/mL carboxypeptidase A em 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Inscular por 20 min a 20 °C. Pare a digestão adicionando 5 μL de 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoethanol pH 7.5.
  4. Para inativar totalmente a enzima, incubar a solução para 1 h à temperatura ambiente.
    Nota: Vesículas sem o tratamento catboxypeptidase A foram utilizados como controle.
  5. Analise amostras por eletroforese na presença de sulfato dodócia de lítio. Adicionar 5-10 μL de 150 mg/mL de lítio dodecyl sulfato, 450 mg/mL glicerol, 0,1 mg/mL bromehenol azul, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 μL de amostra.
  6. Realize imunobofinos colocando um filtro nitrocelulose umedecido com 25 mM de sódio-hidrogênio fosfato pSH 7.5 sobre o gel de poliacrilamida. Coloque estes entre dois filtros de celulose umedecido e, finalmente, entre duas almofadas de lavagem de plástico umedecido. Coloque esta montagem entre os eletrodos de uma câmara contendo 25 mM de sódio-hidrogênio fosfato pS7.5 a 2-4 °C.
  7. Permitir que a eletrotransferência de proteínas prossiga para 3 h a 20 V e 2-3 A.
  8. Bloqueie a membrana nitrocelulose durante a noite a 2 °C em um buffer de bloqueio de 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 e 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Incubar o filtro nitrocelulose por 2 h com uma diluição de 1:5000 de anticorpo anti-seu (terminal C)-HRP no tampão de bloqueio (20 mL) e lave duas vezes com 50 mL de buffer para um total de 60 min.
  10. Para visualizar a imunoblota, dissolva 6 mg de 4-cloro-1-naphthol em 20 mL de álcool desnaturado e adicione 80 mL de 15 mM Tris pH 7,5 e 50 μL de 30% H2O2. Banhe o papel de filtro na solução de substrato por 20 min. O reagente reagirá com o anticorpo para formar um precipitado azul na membrana nitrocelulose. Quando a cor suficiente se desenvolveu, lave a membrana com água, e deixe secar.

5. Ensaio de transporte

  1. Incubar 100 μL alíquotas de vesículas de membrana a 12 °C por 5 min.
  2. Inicie o transporte adicionando poliaminas radioetiquetadas às vesículas da membrana em uma concentração final de 50 μM (salvo indicação de outra maneira). Faça 3soluções de substrato H (espermidina ou putrescine) em um amortecedor de ensaio consistindo de 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosfato de potássio, pH 8.0 e 0,14 M KCl23 (Buffer 3) com modificações dependendo do ensaio.
  3. Realizar ensaios de transporte para 1 min a 12 °C em tubos de microfúgios de 1,5 mL.
  4. Após 1 min, transfira as misturas de reação para filtragem de filtragem e filtre através de um filtro de membrana nitrocelulose de 0,45 μm.
    1. Adicione 3 mL de buffer de ensaio gelado contendo uma concentração 10 vezes maior de poliaminas não rotuladas, seguida por 3 mL de amortecedor de ensaio sem as poliaminas para reduzir a ligação inespecífica.
    2. Transfira os filtros lavados para frascos de cintilação descartáveis de 20 mL contendo 10 mL de líquido de cintilação e determine a radioatividade usando um contador de cintilação líquida. O contador de cintilação mede a radioatividade na amostra e relata-a como desintegrações por min (dpm).
  5. Calcule a captação líquida de poliamina como a diferença entre a captação de 1 min por vesículas incubadas a 12 °C e captação de 0 min por vesículas incubadas no gelo.
    Nota: A massa de substrato importado para as vesículas é calculada da seguinte forma. Se o volume da amostra no tubo de microfúgio é de 0,2 μL e a concentração inicial de substrato é de 100 μM, então a massa total de substrato no tubo de microfúgio é de 20 x 10-12 M. Devido à atividade específica muito alta de substratos rotulados comercialmente (muitas vezes 2,22 x 109 dpm/mM) a massa do isótopo adicionado pode ser ignorada no cálculo. Então, se a quantidade total de isótopoque foi adicionado ao tubo de microfúgio foi de 100 x 106 dpm e as vesículas tiveram uma captação líquida de 1.000 dpm, então a massa total de substrato supérfluo foi de 1% do número total de toupeiras de substrato ou 2 x 10-13 M.
    1. Determine Km para o substrato medindo a captação de 10, 25, 50, 250 e 500 μM substrato radioetiquetado em vesículas expressando a proteína alvo. Calcule a cinética Michaelis-Menten usando um método de regressão não linear usando o modelo Michaelis Menton do pacote de software estatístico34.
  6. Para os experimentos de competição, adicione 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM ou 2 mM substrato competitivo não rotulado feito no buffer de ensaio para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 100 μL de vesículas a 12 °C.
    1. Adicione poliamina com rótulo de rádio (50 μM) ao tubo de microcentrífuga simultaneamente.
    2. Medir a radioatividade presa dentro das vesículas, como mencionado acima, repetindo passos 5 a 5,4,2.
    3. Determine a aparente Km (Km,app)para os substratos competitivos medindo a captação de 10, 25, 50, 250 e 500 μM poliaminas radiorotuladas na presença de 100 μM ou substratos não rotulados superiores e usando um método de regressão não linear para traçar a curva.

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Representative Results

Os principais passos neste protocolo são resumidos pictoally na Figura 1. Resumidamente, as células De E. coli deficientes em todos os trocadores de poliamina e expressando AtBAT1 são cultivadas, centrífugas, lavadas com um tampão e submetidas a lise celular usando uma imprensa francesa. Lise tende a produzir vesículas que são na sua maioria de dentro para fora e prender o tampão fora das células. Os detritos celulares são removidos por centrífuga, e um segundo passo de ultracentifugação é usado para coletar uma pelota de membrana. A pelota da membrana é resuspendida no pH 5.2 do amortecedor de Tris-Maleate e armazenada em -80 °C. Os ensaios de transporte são feitos a 12 °C, o que foi encontrado para ser ideal para manter a estabilidade da membrana. Os ensaios são iniciados pela adição de substrato radiografado e uma mudança no pH da suspensão tampão das vesículas para pH 8.0. Após 1 min, o amortecedor gelado do ensaio com substratos não etiquetados é adicionado para parar a captação da etiqueta de rádio nas vesículas. Vesículas com rótulo de rádio são presas pela filtragem através de membranas de nitrocelulose. As membranas são transferidas para frascos de cintilação e a etiqueta de rádio nas membranas é determinada pela contagem de cintilação líquida.

Uma mancha ocidental é usada para verificar se o AtBAT1 é translocado para vesículas(Figura 2). Sondando a mancha com um anticorpo anti-seu terminal C revelou uma proteína de construção de fusão de aproximadamente 72,3 kDa (Figura 2, Pista 2). Digestão das vesículas antes de SDS-PAGE resultou em uma dimunição, mas não uma perda completa do sinal de sonda (Figura 2, pista 3). A diminuição do sinal da sonda como consequência do carboxypeptidase A sugere que a maioria dos resíduos do terminal C estão do lado de fora das vesículas.

Neste sistema de ensaio, as vesículas são suspensas em um amortecedor no pH 5.2 para que o pH dentro das vesículas equilibra com o buffer. O transporte do substrato radioetiquetado para as vesículas no pH 5.2 é iniciado suspendendo as vesículas em um tampão de pH 8.0, criando assim um gradiente de pH de pH 2.8 através da membrana. Em 12 °C, a captação de espermidina com rótulo de rádio pelas vesículas foi maior em 1 min, e permaneceu linear mais de 3 min (Figura 3A). Portanto, o tempo de incubação para o ensaio de transporte foi fixado em 1 min. Para dar conta da ligação não específica do rótulo de rádio, as vesículas foram incubadas a 0 °C na presença de substrato radiografado por um minuto, e essas contagens foram subtraídas da captação de ladiolabel a temperaturas mais altas.

Figura 3B mostra a captação de espermidina com rótulo de rádio nas vesículas após um minuto. Não houve captação líquida de isótopos por vesículas de membrana que foram preparadas e armazenadas no pH 8.0, pois não havia gradiente de prótons na membrana vesícula. Para demonstrar o efeito da dissipação do gradiente de prótons artificiais, as vesículas da membrana foram incubadas no tampão de pH 8,0 por 10 minutos antes da adição do substrato rotulado25. Nessas condições, uma captação mínima de substrato radiografado foi mostrada. A captação de espermidina radiolabelada também foi mínima em vesículas preparadas com células E. coli deficientes nos trocadores de poliamina CadB e PotE. Em conjunto, estes resultados indicam que a captação de espermidina impulsionada por prótons deveu-se à proteína BAT1 (Figura 3A,B).

Para determinar a especificidade do substrato da proteína, os valores de Km foram calculados medindo a captação de substrato radioetiquetado em 10, 25, 50, 100, 250 e 500 μM concentrações. O Km para espermidina, putésci e arginina foram 55 ± 12 μM, 85 ± 20 μM e 1,4 ± 0,5 mM, respectivamente, indicando que esta proteína é uma alta afinidade polimina e arginina trocador (Figura 4).

A afinidade do transportador para um substrato específico também pode ser determinada indiretamente usando ensaios de concorrência. Aqui, utilizamos dois métodos para avaliar a competição entre dois substratos. No primeiro método, a captação de 50 μM de espermidina radiolabelada foi medida na presença de concentrações crescentes do substrato concorrente sem rótulo (Figura 5A). No segundo método, o aparente Km para espermidina foi calculado medindo a captação de concentrações crescentes de espermidina radiolabelada na presença de 100 μM substrato concorrente não rotulado (Figura 5B). Ensaios da competição revelaram que gaba é um inibidor competitivo de espermidina com um Km,app de 164 ± 15 μM (Figura 5A,B). Além disso, medir a captação de 50 μM de spermidina radiolabeled na presença de concentrações variáveis de diferentes aminoácidos revelou que atbat1 também é capaz de transportar glutamato e alanina em concentrações mM (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do método. (A)Representação esquemática delineando passos-chave na preparação e purificação das vesículas de membrana de E. coli. (B) Representação esquemática delineando passos-chave no ensaio de transporte de preparações de vesículas de membrana usando substratos radiografados. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Mancha ocidental que mostra a expressão de AtBAt1 em vesículas purificadas. As bandas foram visualizadas usando anticorpo sarlávia conoxidase conjugado de rábano anti-His (C-term)-HRP. Pista 1, escada de proteína prestained. Pista 2, vesículas purificadas expressando AtBAT1.1 mostrando uma faixa do tamanho esperado da proteína de fusão. Pista 3, vesículas purificadas expressando AtBAT1.1 foram pré-tratadas com carboxypeptidase A antes da eletroforese SDS e borrão ocidental. Quantidades equivalentes de vesículas (proteína) foram adicionadas a cada pista. A diminuição da coloração indica que o terminal C da proteína na maioria das vesículas é degradado pela digestão protease. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Atividade de transporte de vesículas mostrando o efeito da expressão de proteína BAT1 e a importância de um gradiente de pH. (A)Time absorção dependente de 3H rotulado spermidine em vesículas expressando BAT1 com um pH interno de 5,2 e introduzido a um buffer em pH 8.0. No ensaio de controle, as vesículas foram adicionadas ao buffer de ensaio em pH 8.0, 10 min antes da adição de 3H rotulado spermidine para permitir a dissipação do gradiente de prótons. Em seguida, a captação de radiolabel nas vesículas foi avaliada ao longo de um intervalo de 1 minuto. (B) Captação de 3H rotulado spermidina na presença de um gradiente de prótons (pH interno de 5,2), na ausência de um gradiente de prótons (pH interno de 8), em vesículas adicionadas à solução de ensaio 10 min antes da adição de espermidina com rótulo de rádio e em vesículas feitas a partir de células de cólicas mutantes e não expressando BAT1. A captação em vesículas foi monitorada por 1 min. Todos os valores são apresentados como média ± SE de cinco réplicas. A análise de dados foi realizada usando o t-test de um aluno e * indica uma diferença significativa em relação ao controle (p valor < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Ensaios in vitro de atividade de transporte de polimina e arginina de BAT1. (A) Os valores de Km para a captação de spermidina e putrescine são 55 ± 12 μM e 85 ± 32 μM, respectivamente. (B) O Km para captação de arginina é de 1,4 ± 0,5 mM. Todos os valores são apresentados como média ± SE de cinco réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Gaba é um inibidor competitivo do transporte Spermidine por BAT1. (A) A captação de 3H rotulado spermidine por vesículas expressando AtBAT1.1 foi significativamente reduzida na presença de 100 μM ou 500 μM GABA. (B) Aparente Km para captação de spermidina por BAT1.1 foi aumentado para 164 ± 20 μM na presença de 100 μM GABA. Todos os valores são apresentados como média ± SE de cinco réplicas. A análise de dados foi realizada usando o t-test de um aluno e * indica uma diferença significativa em relação ao controle (p valor < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Glutamato e alanina são inibidores competitivos do transporte de espermidina por BAT1. A captação de Spermidine foi significativamente reduzida na presença de um mm de glutamato não rotulado e 1,5 mM de alanina não rotulada. Todos os valores são apresentados como média ± SE de cinco réplicas. A análise de dados foi realizada usando o t-test de um aluno e * indica uma diferença significativa em relação ao controle (p valor < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

No presente estudo, descrevemos um método para a caracterização de um antiporter, primeiro expressando a proteína em E. coli e, em seguida, gerando vesículas de membrana, de modo que a proteína expressa heterologously pode ser amenizado em um sistema livre de células. Além de equipamentos encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular, esta estratégia requer o uso de uma imprensa francesa, uma ultracentrífuga e acesso a uma instalação para realizar ensaios de radioisótopos.

Uma exigência básica desta técnica é que a proteína heterologous está alvejada corretamente à membrana do plasma de E. coli. Essa estratégia também pode ser útil para análise funcional de transportadores organellar, uma vez que o transportador de glicose Plastid ADP foi localizado com sucesso na membrana celular de E. coli e funcionalmente caracterizado35. O vetor (pBAD-DEST49) usado nestes experimentos contém uma proteína de tiaedoxina terminal N para aumentar a solubilidade do produto traduzido. As fusões n-terminal de um místico pequeno da proteína do subtilus de B., foram encontradas para permitir uma segmentação mais eficiente de transportadores da membrana à membrana citoplasmal36. No entanto, eventos de dobramento indevido, ea falha das proteínas para ser devidamente integrado na membrana citoplasmana são problemas potenciais que impedem o uso de sistemas de expressão bacteriana para muitos tipos de transportadores1.

Vesículas de membrana também têm sido usadas para caracterizar transportadores de plantas37,38. Como as vesículas não possuem as fontes de energia essenciais, como ATP e enzimas, a interferência de transportadores ativos e outras atividades metabólicas é mínima. Assim, esse sistema é ideal para a análise de translocações passivas, como trocadores de metabólitos. As vesículas de membrana sempre-ted, em particular, podem ser aplicadas à caracterização de exportadores e antiporters, uma vez que a composição da solução interna pode ser manipulada alterando a composição do buffer 1. Além disso, o uso da imprensa francesa ou somsonoração ultra-som é bastante eficiente na geração de visicles de membrana de dentro para fora a partir de células intactas de E. coli. 95% das vesículas geradas pela sonoridade ultra-som ou imprensa francesa têm membranas everted39,40. PotE, o antiporter E. coli de putrescina e ornithine, foi o primeiro antiporter poliamina que foi caracterizada usando vesículas de membrana de dentro parafora 23. Usamos a transdução p1 para criar uma cepa mutante específica para a caracterização de um antiporter de poliamina, e essa cepa pode ser útil para a caracterização de outros trocadores de poliamina animal, fúngico ou vegetal. Também prevemos que outras cepas de E. coli com duas ou mais exclusões gênicas podem ser úteis para a caracterização de outros transportadores de troca de plantas e animais usando vesículas de membrana.

O passo mais crítico neste protocolo é a expressão da proteína no sistema mutante E. coli. Um vetor de expressão de E. coli com um promotor indutor é utilizado para promover uma regulação rigorosa e dependente da dose da expressão heterologous do gene. A presença de tags terminais n terminal e C, como sua patch Thioredoxin, epitope V5 ou 6xHis no vetor é útil para detecção e purificação da proteína. Além disso, a presença de uma proteína de fusão de tiaoredoxina que é um componente do vetor pBAD49, pode aumentar a eficiência da tradução e, em alguns casos, a solubilidade das proteínas eucarióticas expressas em E. coli41. As diferentes escolhas de codon em Arabidopsis e E. coli poderiam desafiar a expressão proteica em E. coli. Sabe-se que a otimização de codon pode aumentar de forma impressionante a expressão de proteínas heteroziggous em E. coli42. No ensaio vesículo, o codon otimizado AtBAT1.2 mostrou uma atividade de troca maior do que o não-codon otimizado AtBAT1.1 em células De. coli (dados não mostrados), demonstrando que a otimização de codon foi útil para melhorar a expressão e função das proteínas heterologously expressas em células bacterianas. A produção de vesículas de membrana por ajuste cuidadoso da válvula para manter um gotejamento lento, mesmo de células lised também é um passo fundamental no procedimento. Após a ultracentrífugação, descobrimos que a resuspensão das vesículas de membrana em um homogeneizador Dounce minimiza a variação da amostra entre alíquotas de vesículas de membrana que são preparadas e posteriormente armazenadas a -80 °C.

Uma limitação dos sistemas de expressão de E. coli é que eles são incapazes de modificações pós-translacionais, como n-glicosilação ou acetilação. Ausência dessas modificações proteicas pode afetar a atividade proteica1. No entanto, mutantes capazes de realizar essas modificações foram identificados e podem ser usados como uma ferramenta para expressar proteínas que exigem tais modificações43. A geração de quantidades suficientes da proteína expressa pode ser um desafio devido ao desdobramento e agregação como corpos de inclusão, falha da proteína a ser devidamente integrada à membrana citoplasmática, má segmentação e má regulação devido à falta de modificações pós-translacionais.

Uma limitação menor desta técnica é que não fornece a evidência para a orientação natural do transportador. Isso pode ser feito aproveitando as tags terminais N ou C e métodos imunológicos. A acessibilidade de um terminal particular da proteína nas vesículas pode ser alcançada pela digestão de todos os termini acessíveis e, portanto, presumivelmente externos do portador, eletroforese da proteína na presença de sulfato dodócial de sódio, transferência para filtros de nitrocelulose e detecção dos termini internos restantes com anticorpos40.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

O suporte para este projeto veio da FACULDADE de Pós-Graduação BGSU e do Escritório de Programas e Pesquisapatrocinados da BGSU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

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Bioquímica Edição 154 Transportador de membrana antiporter transporte de poliamina trocador de poliamina vesículas de membrana imprensa francesa análise cinética ensaios de transporte de radioisótopos GABA
Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em <em>E. coli</em> e produção de vesículas de membrana
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