Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Vi beskriver en metod för karakterisering av protondrivna membran transportörer i membran blåsor preparat som produceras av heterologt uttryck i E. coli och lys av celler med hjälp av en fransk press.

Abstract

Flera metoder har utvecklats för att funktionellt karakterisera nya membran transportörer. Polyaminer är allestädiga i alla organismer, men polyaminvärmeväxlare i växter har inte identifierats. Här, vi beskriver en metod för att karakterisera Polyamin antiporters med membran blåsor genereras från Lys av Escherichia coli celler heterologously uttrycker en växt antiporter. Först, vi heterologously uttryckte AtBAT1 i en E. coli stam bristfällig i Polyamin och arginin utbyte transportörer. Vesikler producerades med hjälp av en fransk press, renas genom ultracentrifugering och utnyttjas i en membranfiltrering test av märkta substrat för att demonstrera substratet specificitet av transportören. Dessa analyser visade att AtBAT1 är en Proton-medierad transportör av arginin, γ-aminosmörsyra (GABA), monomer och Spermidin. Den muterade stammen som utvecklades för bestämning av AtBAT1 kan vara användbar för funktionell analys av andra familjer av växt-och djur polyaminvärmeväxlare. Vi har också en hypotes om att denna metod kan användas för att karakterisera många andra typer av antiporters, så länge dessa proteiner kan uttryckas i bakteriecell membranet. E. coli är ett bra system för karakterisering av nya transportörer, eftersom det finns flera metoder som kan användas för att mutagenisera inhemska transportörer.

Introduction

Proteiner som är involverade i handeln med metaboliter utgör en essentiell nivå av fysiologisk reglering, men de allra flesta växt membran transportörer har ännu inte funktionellt karakteriserats. Flera strategier har implementerats för att karakterisera nya transportproteiner. Heterologt uttryck i modellorganismer som E. coli och eukaryota celler som jäst, Xenopus oocyter, däggdjursceller, insekts celler och växtceller har alla använts för att bestämma deras transport aktivitet1. Eukaryotiska celler gynnas för uttrycket av eukaryotiska proteiner, eftersom den grundläggande cellulära sammansättningen, signaltransducing vägar, transkription och översättningar maskiner är förenliga med de inhemska villkoren.

Jäst har varit en viktig modellorganism för karakterisering av nya transportproteiner i växter. Den första anläggningen transport protein som framgångsrikt uttrycktes i jäst (Saccharomyces pombe) var hexos transporter HUP1 från Chlorella2. Sedan dess har många växt transportproteiner funktionellt karakteriserats med hjälp av ett jästuttryckssystem. Dessa inkluderar, växt socker transportörer (SUC1 och SUC23, VfSUT1 och VfSTP14) och AUXIN transportörer (AUX1 och stift5). Nackdelar med att använda jäst för att uttrycka växtproteiner kan inkludera försämrad aktivitet av plastid-lokaliserade proteiner eftersom jäst saknar denna organell, mistargeting6, och bildandet av felvikt aggregat och aktivering av stress svar i jäst på grund av överuttryck av membranproteiner7,8,9.

Heterologt uttryck för transportproteiner i Xenopus oocyter har använts i stor utsträckning för Elektrofysiologisk karakterisering av transportörer10. De första växt transportproteiner som kännetecknas av heterologt uttryck i Xenopus oocyter var Arabidopsis kalium kanal KAT110 och Arabidopsis hexos transporter STP111. Sedan dess har Xenopus oocyter använts för att karakterisera många växt transportproteiner såsom plasmamembran transportörer12, vakuolär sackaros transporter SUT413 och vakuolär malat transporter ALMT914. En viktig begränsning av Xenopus oocyter för transportanalyser är att koncentrationen av intracellulära metaboliter inte kan manipuleras1. Dessutom krävs yrkeskunskap för att förbereda Xenopus oocyter och variationen i äggcell partierna är svår att kontrollera.

Heterologt uttryck i modellorganismen E. coli är ett idealiskt system när det gäller karakterisering av nya växt transportproteiner. Med ett fullständigt sekvenserat arvsmassa15är de molekylära och fysiologiska egenskaperna hos E. coli välkända. Molekylära verktyg och tekniker är väl etablerade16. Dessutom finns olika uttrycks vektorer, icke-patogena stammar och mutanter tillgängliga17,18,19. Dessutom har E. coli en hög tillväxttakt och kan lätt odlas under laboratorieförhållanden. Många proteiner kan lätt uttryckas och renas vid höga halter i E. coli9. När proteiner inte kan analyseras direkt i cellulära system har rekonstituering av proteiner till liposomer också varit en framgångsrik, om än utmanande innovation för karakterisering av renade membranproteiner. Funktionell karakterisering av växternas mitokondriella transportproteiner, inklusive lösningstransportörer som fosfat transportörer i sojabönor, majs, ris och Arabidopsis, dikarboxylattrikarboxylatbärare i Arabidopsis har åstadkommits med hjälp av detta modellsystem20,21. Emellertid, rekombinanta proteiner av tomat protein SICAT9 befanns vara fungerar inte i beredning experiment, och andra medlemmar av Cat transportör familjen konstaterades vara fungerar inte i Xenopus äggcell analyser22. Således behövs ytterligare molekylära verktyg för karakterisering av membran transportörer.

Fem Polyamin transportsystem finns i E. coli23. De omfattar två ABC transportörer förmedlar upptaget av Spermidin och monomer, en monomer/Ornithine Exchanger, en cadaverin/lysin Exchanger, en spermidine exportör och en monomer importör. Den monomer Exchanger Pote kännetecknades ursprungligen med hjälp av en vesikel analys, där insidan ut blåsor utarbetades av lyseringslösning celler med en fransk press och mäta upptaget av radioaktivt märkt monomer i vesikler i utbyte mot ornitin24. Vesikelanalyser användes också för att karakterisera en kalcium transportör, som förmedlade transporten av kalcium som svar på en protongradient25. Dessa experiment föranledde oss att utveckla en strategi för karakterisering av andra polyaminvärmeväxlare. Vi skapade först en stam av E. coli bristfällig i Pote och cadb värmeväxlare. Här visar vi funktionell karakterisering av en växt Polyamin antiporter av heterlogous uttryck i den modifierade E. coli stam, generering av membran blåsor med hjälp av en fransk press, och radiomärkade analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generering av E. coli dubbel knock out Mutant med P1-transduktion

  1. Erhåll e. coli Single-knockout Mutant-stammar Δpote och δcadb från den genetiska lager centralen e. coli (http://cgsc.Biology.Yale.edu).
    Anmärkning: Δpote -stammen är kanamycinresistent26 och δcadb -stammen är tetracyklinresistent27.
  2. Konstruera DKO-stammen ( Pote/CadB Double knockout) med hjälp av P1-transduktionprotokollet28.
    1. Lysate förberedelse
      1. Späd en över natten kultur av Δpote i färskt LB (1:100) kompletteras med 10-25 mm Mgcl2,5mm CaCl2, och 0,1-0,2% glukos.
      2. Växa vid 37 ° c för 1-2 h.
      3. Tillsätt 40 μL av P1 faglysat till kulturen och fortsätt växa vid 37 ° c. Monitor för 1-3 h tills kulturen har lyserat
        Obs: när kulturen är lysed, cellulära skräp kommer att synas i röret och kulturen kommer att ha en betydande förlust av grumlighet.
      4. Tillsätt flera droppar kloroform (50-100 μL) till lysat och Vortex. Centrifugera vid 12 000 x g i 2 minuter för att ta bort cellulär skräp och överföra supernatanten till ett nytt rör.
    2. Transduktion
      1. Odla Δcadb stam över natten i lb-medium.
      2. Skörda cellerna genom centrifugering vid 4 000 x g för 2 min och Omsuspendera i 1/5-1/3 den skördade kulturen volym i Fresh lb kompletteras med 100 mm MgSO4 och 5 mm CaCl2.
      3. Tillsätt Δcadb cellsuspensionen till röret med phage från steg 1.2.1.4 och blanda snabbt.
      4. Tillsätt 200 μL 1 M na-citrat (pH 5.5), tillsätt sedan 1 mL LB. Inkubera vid 37 ° c i 1 h för att möjliggöra uttrycket av den antibiotikaresistenta markören.
      5. Spinn celler vid 4000 x g i 5 min.
      6. Omsuspenderade i 100 μL LB komplettmed 100 mM na-citrat (pH 5,5) och Vortex väl för att skingra celler.
      7. Välj de rekombinanta stammarna på lb-agarplattor med 50 μg/ml Kanamycin och 10 μg/ml tetracyklin och bekräfta sedan genom Polymerase kedjereaktion (PCR) med lämpliga primers26,27.
      8. Kontrollera PCR-fragment genom sekvensering.

2. uttryck för målgenen (AtBAT1) i E. coli Mutant

  1. Förstärka den fullängdssekvens av målgenen genom PCR och sätt in i Gateway posten Vector pENTR/D-TOPO29.
    Anmärkning: I detta fall var ATBAT 1,1 förstärks med hjälp av Forward primer 5 ' CGGCGATCAATCCTTTGTT och omvänd primer 5 ' GCTAAGAATGTTGGAGATGG, en initial denaturering vid 98 ° c i 2 min och sedan 30 cykler av denaturering vid 98 ° c för 0,1 min, glödgning vid 59 ° c för 0,3 min, förlängning vid 72 ° c för 0,40 min och slutlig förlängning vid 72 ° c i 10 min. PCR-produkten renades med en PCR-rengöringssats som kvantifierades med hjälp av en spektrometer. Införandet av PCR-produkten i Gateway-vektorn gjordes efter manufactrurers riktningar.
    1. Omvandla inmatnings vektorn till behöriga topp-topp -celler av heatshock och välj för lyckad REKOMBINANTER på lb-media med 50 μg/ml kanamycin efter standard molekylära klonings protokoll30.
    2. Extrahera plasmid DNA med hjälp av en Plasmid extraktion kit, enligt tillverkarens anvisningar, och sekvens för att bekräfta korrekt insättning.
  2. Överför målet genen till E. coli destinations vektorn, pbad-DEST49 av Gateway LR kloning för att skapa ett uttryck vektor29.
    1. Omvandla uttrycks vektorn till kompetenta topp- E. coli -celler med heatshock i 30 s och välj framgångsrik REKOMBINANTER på lb-media med 100 μg/ml ampicillin30.
    2. Extrahera plasmid DNA30 och sekvens för att bekräfta korrekt insättning.
  3. Omvandla uttrycks vektor till E. coli δpote740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 och välj på lb-plattor med ampicillin, Kanamycin och tetracyklin30.
  4. För att bestämma den optimala koncentrationen av arabinos för induktion, uttrycka målgenen under kontroll av arabad promotorn i lb media med gradientkoncentrationer av arabinos som beskrivs29.
  5. Samla in cell pellets och bedöma proteinuttryck genom SDS-sida och visualisering av protein band som beskrivs i produktens manual29.
    Anmärkning: E. coli δpote740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 användes som kontrollprov utan BAT1 uttryck. E. coli dubbel knock out Mutant celler med den tomma pbad-DEST49 vektorn användes inte som en kontroll på grund av närvaron av CCDB genen i vektorn.

3. generering av Inside-Out membran blåsor

  1. Kultur E. coli -muterade celler som uttrycker målproteinet genom att odla en enda koloni över natten i 5 ml polyaminfria medier (2% glycerol, 6 g K2HPO4, 3 g KH2Po4, 0,5 g NaCl, NH4cl, 50 mg tiamin, 0,79 g jäst komplett syntetiskt Mediadeninhemisulfat (10 mg/L), l-arginin (50 mg/L), L-asparaginsyra (80 mg/l), l-histidinhydrokloridmonohydrat (20 mg/l), l-leucin (100 mg/l), l-lysin hydroklorid (50 mg/L), l-metionin (20 mg/l), L-fenylalanin (50 mg/L), L-treonin (100 mg/L), L-tryptofan (50 mg/L), L-Tyrosin (50 mg/L), L-valin (140 mg/L), uracil (20 mg/l)). Överför denna kultur till 500 ml Polyamin-fria medier kompletteras med 0,0002% arabinos och växa tills cellkulturen når en OD600 av 0,6-0,8 (vanligtvis ~ 5 h).
  2. Samla cellpelleten genom centrifugering vid 2 000 x g i 15 min vid 4 ° c. Omsuspendera pelleten och tvätta tre gånger med 0,1 M kaliumfosfatbuffert, pH 6,6, innehållande 10 mM EDTA (buffert 1). Den slutliga volymen celler i buffert 1 efter det tredje snurrandet ska vara 10 mL.
  3. Generera Inside-Out membran blåsor genom fransk press behandling (10 000 p.s.i.) av intakt celler med en 35 mL fransk tryck cell.
  4. Före lastning provet i den vanliga franska tryck cellen, smörj kolven och O-ringar för att göra det lättare att sätta in i cellen.
    Observera:Dessa instruktioner är specifika för användning av standardtryck cellen31.
    1. Skruva försiktigt in stängnings pluggen i den nedre änden av cellen. Se till att cellen är rätt sida upp baserat på bokstäverna på sidan av cellen. Sätt in kolven i cellen och flytta den in i cellen, tills Max fyllningslinjen på kolven når toppen av kolven. Vänd enheten över och placera på den medföljande stativet mellan de tre inläggen.
    2. Häll cellsuspensionen i kroppen av cellen.
      Anmärkning: Vi har använt endast 10 mL, så det kommer att finnas gott om utrymme kvar i den franska tryck cells kammaren, som har en kapacitet på 35 mL.
    3. Montera standardtryck cellen på den franska tryck cells enheten.
      1. Kontrollera först att strömmen är avstängd. På vänster sida av panelen är förhållandet Selector switch. Den har tre positioner: nere i slutet av loppet, låg för att använda en mindre tryck cell, och hög för användning med den vanliga franska tryck cellen. Om den franska pressen tidigare användes med den mindre cellen får kolven inte vara helt tillbakadragen. Ställ in den här omkopplaren på Down.
    4. Slå på maskinen med strömbrytaren på RHS på bak av enheten och vrid på PAUSE-Run- omkopplaren till körnings positionen. Detta kommer att resultera i att kolven är helt tillbakadragen. Flytta reglaget tillbaka till PAUSEoch Stäng av enheten.
    5. Lossa tumskruvarna och flytta säkerhetsklämman som sträcker sig till två rostfria kolonner till sidan. Det kommer att svänga ut till höger. Med ena handen håller basen av stängningen kontakten på plats, plocka den franska tryck cellen upp med båda händerna, och rotera den 180 °, så kolven är nu i upprätt läge. Ställ in den på plattformen, och flytta säkerhetsklämman tillbaka på plats så att denna klämma håller den franska tryck cellen i läge.
    6. Observera att flödes ventilens montering på stängnings pluggen måste vara åtkomlig för som och placerad så att ventilen kan vändas fritt. Öppna flödes ventilens montering med några motsols varv. Placera armarna på kolven så att de är orienterade i en klockan två och åtta klockan position. Dra åt tumskruvarna så att standardtryck cellen hålls på plats.
    7. Sätt in provet utloppsröret i förslutnings plugg, och Anslut en kort bit av flexibla slangar så att det trasiga Cellrester kan samlas i en Falcon Tube. Vi använder vanligtvis en 300 mL ifylld bägare för att hålla Falcon röret upprätt, och för att hålla Cellrester kyld.
    8. Kontrollera att PAUSE-Run- omkopplaren är inställd på PAUSEoch att ventilenheten är i öppet läge. Vänd maskinen tillbaka till på, adust förhållandet väljaren växla till hög, och vrid trycket öka ventilen på frontpanelen till höger om en halv sväng.
    9. Kolven kommer att börja stiga från basen för att tränga undan luften i kammaren. Rikta luften som kommer ut ur Tygon slangen som är kopplad till prov utloppet röret till röret i bägaren.
    10. När de första dropparna av vätska kommer ut, Stäng flödes ventilen enheten genom att vrida den medurs. Detta skapar en metall till metall tätning, med tryck cellen, så inte för hårt.
    11. Framsidan av den franska pressen har ett diagram på frontpanelen för att generera rätt tryck på de biologiska cellerna inuti tryck cellen. I detta fall, öka trycket genom att vrida trycket öka ventilen medurs, tills mätaren når 640 psi. Detta kommer att skapa ett inre tryck på 10 000 PSI.
    12. När cellen har nått mål trycket öppna flödes ventilen församlingen något genom att vrida den moturs. Justera öppningen av ventilen för att tillåta en flödeshastighet på endast ca 10 droppar per minut.
    13. När stopplinjen på kolven kroppen når toppen av cellen flöde. Växla paus-Run-omkopplaren för att pausa. Detta är avgörande eftersom att ha kolven infogas längre in i cellen kommer att skada enheten. Öppna flödes ventilens montering och samla resterande droppar.
    14. Vrid ratio Selector växla till ned, och sedan ställa in paus kör switch för att köra. När bottenplattan är helt infällt Ställ in Run -omkopplaren på PAUSEoch Stäng av maskinen.
    15. Ta bort den franska tryck cellen från den franska pressen och demontera för rengöring. Förvara alla delar torra med en lätt beläggning av glycerol. Ta bort och Byt ut packningar eller tätningar med tecken på slitage.
  5. Avlägsna obrutna celler och fragment av den franska presseluenten genom centrifugering vid 10 000 x g i 15 min vid 4 ° c. Kassera pelleten och överför supernatanten till första rör.
  6. Pellets membran blåsor från den resulterande supernatanten av ultracentrifugationat 150 000 g för 1 h vid 4 ° c.
  7. Tvätta membran vesiklarna en gång, utan resuspension, i 1 mM Tris-malat, pH 5,2 innehållande 0,14 M KCl, 2 mM 2-merkaptoetanol och 10% glycerol och Omsuspendera i samma buffert (buffert 2)23 med hjälp av en dounce Tissue Grinder. Typiskt membran fraktionen från 500 mL kultur skulle avbrytas i 5 mL buffert, och en koncentration av 5-10 mg membranprotein/mL med hjälp av Biochinic Acid assay32.
  8. Förvara 100 μL alikvoter av membran preparat vid-80 ° c i 1,5 mL mikrocentrifugrör.

4. Western blot och orientering av transporter analys

  1. Tvätta och Omsuspendera blåsor från steg 3,7 i 30 mM Tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl2.
  2. Till 100 μL-prover, tillsätt 1 μL 2 mg/mL karboxypeptidas A i 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Inokulera i 20 minuter vid 20 ° c. Stoppa matsmältningen genom att tillsätta 5 μL 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-merkaptoetanol pH 7,5.
  4. För att helt inaktivera enzymet, inkubera lösningen för 1 h vid rumstemperatur.
    Anmärkning: Vesikler utan katboxypeptidasen användes en behandling som kontroll.
  5. Analysera prover genom elektrofores i närvaro av litium dodecylsulfat. Tillsätt 5-10 μL av 150 mg/mL litiumdodecylsulfat, 450 mg/mL glycerol, 0,1 mg/mL bromofenol blå, 0,4 M Tris pH 7,5 till 100 μL prov.
  6. Utför Immunoblotting genom att lägga ett nitrocellulosa filter fuktat med 25 mM natrium-vätefosfat pH 7,5 på Polyakrylamidgelen. Placera dessa mellan två fuktade cellulosa filter och slutligen mellan två fuktade plast skursvamp. Placera detta assemblage mellan elektroderna i en kammare som innehåller 25 mM natrium-vätefosfat pH 7,5 vid 2-4 ° c.
  7. Tillåt elektroöverföring av proteiner att fortsätta för 3 h vid 20 V och 2-3 A.
  8. Blockera nitrocellulosa membranet över natten vid 2 ° c i en blockerande buffert på 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 och 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Inkubera nitrocellulosa filtret i 2 timmar med en 1:5000 utspädning av anti-his (C Terminal)-HRP antikropp i blockerande buffert (20 mL) och tvätta två gånger med 50 mL buffert för sammanlagt 60 min.
  10. För att visualisera immunoblot, lös 6 mg 4-klor-1-naftol i 20 mL denaturerad alkohol och tillsätt 80 mL 15 mM Tris pH 7,5 och 50 μL av 30% H2O2. Skölj filterpapperet i substratlösningen i 20 minuter. Reagensen reagerar med antikroppen för att bilda en blå fällling på nitrocellulosamembranet. När tillräcklig färg har utvecklats, skölj membranet med vatten, och låt torka.

5. transport analys

  1. Inkubera 100 μL alikvoter av membranvesiklar vid 12 ° c i 5 min.
  2. Initiera transporten genom att tillsätta radioaktivt märkta polyaminer till membranvesiklarna vid en slutkoncentration på 50 μM (om inte annat anges). Gör 3H-substrat (Spermidin eller putrescine) lösningar i en analysbuffert som består av 10 mm Tris-HCl, 10 mm kalium fosfat, pH 8,0 och 0,14 M KCL23 (buffert 3) med modifieringar beroende på analysen.
  3. Genomför transportanalyser i 1 min vid 12 ° c i 1,5 ml mikrofugrör rör.
  4. Efter 1 min, överföra reaktionsblandningar till filtrering grenrör och filtrera genom ett 0,45 μm nitrocellulosa membranfilter.
    1. Tillsätt 3 mL iskall analysbuffert som innehåller en 10-faldig högre koncentration av omärkta polyaminer följt av 3 mL analysbuffert utan polyaminer för att minska icke-specifik bindning.
    2. Överför de tvättade filtren till 20 mL engångsscintillationskampor som innehåller 10 mL scintillationsvätska och bestäm radioaktivitet med hjälp av en vätske scintillationsräknare. Scintillationräknaren mäter radioaktiviteten i provet och rapporterar den som sönderfall per minut (DPM).
  5. Beräkna nettopolyaminupptaget som skillnaden mellan upptaget vid 1 min genom vesikler som inkuberats vid 12 ° c och upptag vid 0 min av vesikler som inkuberats på is.
    Anmärkning: Massan av substrat som importeras till vesiklarna beräknas på följande sätt. Om provvolymen i mikrofugrör-röret är 0,2 μl och utgångs koncentrationen av substrat är 100 μm, är den totala massan av substrat i mikrofugeröret 20 x 10-12 M. På grund av den mycket höga specifika aktiviteten hos kommersiellt märkta substrat (ofta 2,22 x 109 DPM/mm) kan massan av den tillförde isotopen ignoreras i beräkningen. Så om den totala mängden isotop som lades till mikrofugrör röret var 100 x 106 DPM och vesiklarna hade en nettoupptag av 1 000 DPM, då den totala massan av substrat som tas upp av vesiklarna var 1% av det totala antalet mol av substrat eller 2 x 10-13 M.
    1. Bestäm Km för underlaget genom att mäta upptaget av 10, 25, 50, 250 och 500 μm radioaktivt märkt substrat i vesikler som uttrycker målproteinet. Beräkna Michaelis-menten kinetik med hjälp av en ickelinjär regressionsmetod med hjälp av Michaelis Menton-modellen av det statistiska mjukvarupaketet34.
  6. För tävlings försöken, tillsätt 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM eller 2 mM icke-märkt konkurrerande substrat gjort i analysbufferten till 1,5 mL microcentrifug tub som innehåller 100 μL av vesiklarna vid 12 ° c.
    1. Tillsätt radioaktivt märkt Polyamin (50 μm) till microcentrifugeröret samtidigt.
    2. Mät radioaktiviteten instängd i vesikler som nämnts ovan genom att upprepa steg 5 till 5.4.2.
    3. Bestäm skenbar km (km, app) för de konkurrerande substrat genom att mäta upptaget av 10, 25, 50, 250 och 500 μm radiomärkta polyaminer i närvaro av 100 μm eller högre icke-märkt substrat och med hjälp av en ickelinjär regressionsmetod för att Rita kurvan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De viktigaste stegen i detta protokoll sammanfattas bildmässig i figur 1. Kortfattat, E. coli celler bristfällig i alla Polyamin värmeväxlare och uttrycker AtBAT1 är odlade, centrifugeras, tvättas med en buffert och utsätts för cell Lys med hjälp av en fransk press. Lys tenderar att producera blåsor som är mest inne-out och fälla bufferten utanför cellerna. Cellrester avlägsnas genom centrifugering, och en andra ultracentifugation steg används för att samla in en membran pellet. Membranpelleten återsuspenderas i Tris-Malatbuffert pH 5,2 och förvaras vid-80 ° c. Transport analyser görs vid 12 ° c, vilket konstaterades vara optimalt för att bibehålla membran stabiliteten. Analyser initieras genom tillsats av radioaktivt märkt substrat och en förskjutning i pH-värdet för buffertsus pensionen av vesikler till pH 8,0. Efter 1 min tillsätts iskall analysbuffert med omärkta substrat för att stoppa upptaget av radiomärkas i vesiklarna. Radioaktivt märkta blåsor fångas upp genom filtrering genom nitrocellulosa membran. Membran överförs till scintillationsflaskor och radiomärkas på membranen bestäms av vätske scintillationsräkning.

En Western blot används för att kontrollera att AtBAT1 är transplacerad till vesikler (figur 2). Att sondera blot med en anti-his C-Terminal antikropp avslöjade en fusion konstruera protein av cirka 72,3 kDa (figur 2, Lane 2). Nedbrytning av vesiklarna före SDS-PAGE resulterade i en dimunition, men inte en fullständig förlust av sonden signalen (figur 2, Lane 3). Minskningen av sond signalen till följd av karboxypeptidas A antyder att de flesta av C-terminsrester finns på utsidan av vesiklarna.

I detta analyssystem suspenderas vesikler i en buffert vid pH 5,2 så att pH inuti vesiklarna jämmer med bufferten. Transporten av radioaktivt märkt substrat in i blåsor vid pH 5,2 initieras genom att avbryta vesiklarna i en pH 8,0 buffert, vilket skapar en pH-gradient på pH 2,8 över membranet. Vid 12 ° c var upptaget av radioaktivt märkt Spermidin vid vesiklarna högst 1 min, och förblev linjärt över 3 min (figur 3A). Därför fastställdes inkubationstiden för transport analysen till 1 min. För att ta hänsyn till icke-specifik bindning av radiolabel inkuberades vesiklarna vid 0 ° c i närvaro av radioaktivt märkt substrat i en minut, och dessa värden subtraperades från upptaget av ladiolabel vid högre temperaturer.

Figur 3B visar upptaget av radioaktivt märkt Spermidin i vesiklarna efter en minut. Det fanns ingen nettoupptag av isotop av membran blåsor som var preparerade och lagrade vid pH 8,0, eftersom det inte fanns någon protongradient över vesikelmembranet. För att påvisa effekten av att den konstgjorda protongradienten skingras, inkuberades membran vesiklarna i pH 8,0-buffert i 10 min före tillsatsen av märkt substrat25. Under dessa förhållanden visades ett minimalt upptag av radioaktivt märkt substrat. Upptaget av radioaktivt märkt Spermidin var också minimal i blåsor som utarbetats med E. coli celler bristfällig i Polyamin värmeväxlare CAdB och Pote. Sammantaget tyder dessa resultat på att protondriven användning av Spermidin berodde på proteinet BAT1 (figur 3A, B).

För att bestämma substratets specificitet hos proteinet beräknades Km -värdena genom mätning av upptaget av radioaktivt märkt substrat vid 10, 25, 50, 100, 250 och 500 μm-koncentrationer. Km för Spermidin, monomer och arginin var 55 ± 12 μm, 85 ± 20 μm respektive 1,4 ± 0,5 mm, vilket indikerar att detta protein är en hög affinitet Polyamin och arginin-växlare (figur 4).

Affiniteten hos transportören för ett visst substrat kan också bestämmas indirekt med hjälp av konkurrensanalyser. Här har vi utnyttjat två metoder för att utvärdera konkurrensen mellan två substrat. I den första metoden mättes upptaget av 50 μM radiomärkt Spermidin i närvaro av ökande koncentrationer av det icke-märkta konkurrerande substratet (figur 5a). I den andra metoden beräknades det skenbara Km för Spermidin genom att mäta upptaget av ökande koncentrationer av radioaktivt märkt Spermidin i närvaro av 100 μm icke-märkt konkurrerande substrat (figur 5B). Konkurrensanalyser visade att GABA är en konkurrenskraftig hämmare av Spermidin med en Km, app på 164 ± 15 μm (figur 5a, B). Dessutom visade mätningen av upptaget av 50 μM radioaktivt märkt Spermidin i närvaro av varierande koncentrationer av olika aminosyror att AtBAT1 också kan transportera glutamat och alanin vid mM-koncentrationer (figur 6).

Figure 1
Figur 1: metodens schematiska representation. (A) schematisk representation som beskriver viktiga steg vid beredning och rening av membran blåsor från E. coli. Bschematisk representation som beskriver viktiga steg i transport analysen av membran vesikelpreparat med hjälp av radioaktivt märkt substrat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Western blot visar uttrycket av AtBAt1 i renade blåsor. Banden visualiserades med pepparrotperoxidas konjugerade anti-his (C-term)-HRP antikropp. Lane 1, prestained protein stege. Lane 2, renade blåsor uttrycker atbat 1,1 visar ett band av den förväntade storleken på fusionsproteinet. Lane 3, renade blåsor som uttrycker atbat 1,1 förbehandlades med karboxypeptidas A före SDS elektrofores och Western blotting. Motsvarande mängder blåsor (protein) lades till varje körfält. Minskad färgning indikerar att C-terminalen av proteinet i de flesta blåsor bryts ned av genom proteas matsmältning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: vesikler som visar effekten av BAT1 proteinuttryck och vikten av en pH-gradient. A) tidsberoende upptag av 3H märkt Spermidin i VESIKLER som uttrycker BAT1 med ett internt pH på 5,2 och som tillförs en buffert vid pH 8,0. I kontrollanalysen lades vesiklarna till analysbufferten vid pH 8,0, 10 min före tillsatsen av 3H märkt Spermidin för att möjliggöra försvinnande av protongradienten. Sedan utvärderades upptaget av radiomärkas i vesiklarna under en 1 min intervall. B) upptaget av 3H märkt Spermidin i närvaro av en Protongradient (internt pH-värdet 5,2), i avsaknad av en Protongradient (internt pH-värdet 8), i blåsor som tillsätts i analyslösningen 10 min före tillsats av radioaktivt märkt Spermidin och i vesikler gjorda av E. coli -MUTERADE celler som inte uttrycker BAT1. Upptag i vesikler övervakades under 1 min. Alla värden presenteras som medelvärde ± SE av fem replikat. Data analys utfördes med hjälp av en students t-test och * indikerar en signifikant skillnad från kontrollen (p -värde < 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: in vitro-analyser av Polyamin och arginin transport aktivitet av BAT1. A Km -värdena för Spermidin-och putrescinupptag är 55 ± 12 μm respektive 85 ± 32 μm. (B) Km för arginin-upptag är 1,4 ± 0,5 mm. Alla värden presenteras som medelvärde ± SE av fem replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: GABA är en konkurrenskraftig hämmare av Spermidine transport av BAT1. (A) upptag av 3H märkt Spermidin av vesikler som uttrycker atbat 1.1 reducerades signifikant i närvaro av 100 ΜM eller 500 μm GABA. B) skenbar Km för spermidinupptag av BAT 1.1 ökades till 164 ± 20 ΜM i närvaro av 100 μm GABA. Alla värden presenteras som medelvärde ± SE av fem replikat. Data analys utfördes med hjälp av en students t-test och * indikerar en signifikant skillnad från kontrollen (p -värde < 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: glutamat och alanin är konkurrenskraftiga hämmare av spermidine transport av BAT1. Spermidinupptag reducerades signifikant i närvaro av 1 mM icke-märkt glutamat och 1,5 mM icke-märkt alanin. Alla värden presenteras som medelvärde ± SE av fem replikat. Data analys utfördes med hjälp av en students t-test och * indikerar en signifikant skillnad från kontrollen (p -värde < 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den nuvarande studien beskriver vi en metod för karakterisering av en antiporter genom att först uttrycka proteinet i E. coli och sedan generera membran blåsor, så att heterologously-uttryckt protein kan analyseras i ett cellfritt system. Förutom utrustning som finns i de flesta molekylärbiologi laboratorier, kräver denna strategi att använda en fransk press, en ultracentrifuge, och tillgång till en anläggning för att bedriva radio Isotope analyser.

Ett grundläggande krav på denna teknik är att det heterologösa proteinet är korrekt riktat till plasmamembranet av E. coli. Denna strategi kan också vara användbar för funktionell analys av organellar transportörer eftersom plastida ADP glukos transportör framgångsrikt lokaliserades till E. coli cellmembranet och funktionellt kännetecknas35. Vektorn (pBAD-DEST49) som används i dessa experiment innehåller en N-Terminal tioredoxin protein för att öka lösligheten av den översatta produkten. N-Terminal fusioner av en liten B. subtilus protein Mystic, har visat sig möjliggöra effektivare inriktning av membran transportörer till cytoplasmiska membranet36. Det är dock potentiellt problem som hindrar användningen av bakteriella uttrycks system för många typer av transportörer1, vilket gör att det inte går att lösa upp händelser och att proteinerna är ordentligt integrerade i cytoplasmiska membran.

Membran blåsor har också använts för att karakterisera växternas transportörer37,38. Eftersom vesiklarna saknar viktiga energikällor som ATP och enzymer, är interferensen från aktiva transportörer och annan metabolisk aktivitet minimal. Sålunda, detta system är perfekt för analys av passiva translokationer såsom metabolit värmeväxlare. De vrängs membran vesikler, i synnerhet, kan tillämpas på karakterisering av exportörer och antiporters eftersom sammansättningen av den inre lösningen kan manipuleras genom att ändra sammansättningen av buffert 1. Dessutom, med hjälp av franska pressen eller ultraljud ultraljudsbehandling är ganska effektivt för att generera Inside-Out membran blåsor från intakt E. coli celler. 95% av vesikler som genereras av ultraljud ultraljudsbehandling eller franska pressen har vrängs membran39,40. Pote, E. coli antiporter av monomer och Ornithine, var den första Polyamin antiporter som karaktäriserades med Inside-Out membran blåsor23. Vi använde P1 signaltransduktion för att skapa en specifik Mutant stam för karakterisering av en Polyamin antiporter, och denna stam kan vara användbart för karakterisering av andra djur, svamp eller växt Polyamin värmeväxlare. Vi ser också att andra E. coli -stammar med två eller flera genborttagningar kan vara användbara för karakterisering av andra växt-och djur utbytes transportörer som använder membran blåsor.

Det mest kritiska steget i detta protokoll är uttrycket av proteinet i E. coli Mutant systemet. En E. coli -uttrycksvektor med en inducerbar promotor utnyttjas för att främja stram, dosberoende reglering av det heterologa genuttrycket. Närvaron av N Terminal och C Terminal taggar såsom hans-patch thioredoxin, V5 epitop eller 6xhis i vektorn är användbart för detektering och rening av proteinet. Dessutom, närvaron av en thioredoxin fusion protein som är en del av pBAD49 vektorn, kan öka översättningen effektivitet och, i vissa fall, löslighet av eukaryotiska proteiner uttryckt i E. coli41. De olika kodon val i Arabidopsis och E. coli kan utmana proteinuttryck i e. coli. Det är känt att kodon optimering kan imponerande öka heterozygot proteiner uttryck i E. coli42. I vesikelanalysen visade kodon optimerad atbat 1.2 en högre utbytes aktivitet än icke-kodon optimerad atbat 1.1 i E. coli -celler (data visas inte), vilket visar att kodon optimering var till hjälp för att förbättra uttrycket och funktionen av heterologously uttryckt proteiner i bakterieceller. Produktionen av membran blåsor genom noggrann justering av ventilen för att bibehålla en långsam jämn dropp av lyserade celler är också ett centralt steg i förfarandet. Efter ultracentrifugation har vi funnit att resuspension av membran blåsor i en Dounce Homogenisatorer minimerar provet för att provet variation mellan alikvoter av membran blåsor som bereds och därefter lagras vid-80 ° c.

En begränsning av E. coli uttrycks system är att de är oförmögna att post-translationella modifieringar såsom N-glykosylering eller acetylering. Avsaknad av dessa proteinmodifieringar kan påverka protein aktivitet1. Dock har mutanter som kan utföra dessa modifieringar identifierats och kan användas som ett verktyg för att uttrycka proteiner som kräver sådana modifieringar43. Generering av tillräckliga mängder av det uttryckta proteinet kan vara en utmaning på grund av utfällning och aggregering som inkludering organ, misslyckande av proteinet för att vara ordentligt integrerat i cytoplasmiska membranet, mistargeting och mis-reglering på grund av brist på post translationella modifieringar.

En mindre begränsning av denna teknik är att den inte ger belägg för transportörens naturliga orientering. Detta kan åstadkommas genom att dra nytta av N eller C terminaltaggar och immunologiska metoder. Tillgängligheten av en viss ändstationen av proteinet i blåsor kan uppnås genom nedbrytning av alla tillgängliga, och därför förmodligen extern Termini av bäraren, elektrofores av proteinet i närvaro av natriumdodecylsulfat, överföring till nitrocellulosa filter och detektering av resterande, inre Termini med antikroppar40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Stöd för detta projekt kom från BGSU Graduate College, och BGSU kontoret för sponsrade program och forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Tags

Biokemi membran transportör antiporter Polyamin transport Polyamin Exchanger membran blåsor fransk press Kinetic analys radio Isotope transportanalyser GABA
Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i <em>E. coli</em> och produktion av membran blåsor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P.… More

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter