Summary
这里介绍的一个协议，通过酶消化制备单个细胞悬浮液，从人类和小鼠心肌中分离出巨噬细胞和其他非免疫细胞的各种子集。提出了基于流细胞学的识别与分离巨噬细胞表征的门控方案。
Abstract
巨噬细胞代表了心脏中最异质和丰富的免疫细胞群，是心脏损伤后推动炎症和治疗反应的中心。巨噬细胞的各种子集如何协调心脏损伤后的免疫反应是一个活跃的研究领域。这里介绍的是一个简单的协议，我们的实验室执行常规，从小鼠和人类心肌标本从健康和患病个体提取巨噬细胞。简单地说，该协议涉及心脏组织的酶消化，以产生单个细胞悬浮液，然后是抗体染色和流动细胞测定。该技术适用于对已分拣的细胞进行的功能性检测以及散装和单细胞RNA测序。该协议的一个主要优点是其简单性、最小日常变化和广泛的适用性，允许研究各种小鼠模型和人类疾病实体的巨噬菌体异质性。
Introduction
巨噬细胞是心脏中最丰富的免疫细胞类型，在心脏损伤1、2、3、4后产生强健的炎症和复原反应方面起着重要作用。此前，我们小组确定了从不同发育起源5、6的鼠心中产生的两个主要巨噬细胞子集。从广义上讲，根据CCR2（C-C型化学受体2）的细胞表面表达，可以识别组织驻留心脏巨噬细胞子集的不同群体。CCR2-巨噬细胞（细胞表面表达：CCR2-MHCII低和CCR2-MHCII高）是胚胎起源（原始和红霉素血统），能够自我更新，并代表在静息条件下占主导地位的种群。居民CCR2–巨噬细胞具有明确的造血原源，通过从循环单核细胞招募来维持，并在静息条件下代表一个未成年人群。功能上，CCR2-巨噬细胞产生最小的炎症，对冠状动脉发育新生儿心脏再生5，7至关重要。相反，CCR2–巨噬细胞在心脏侮辱后启动强健的炎症反应，并造成辅助性心肌细胞损伤、左心室的不良重塑和心力衰竭进展8、9。
最近，我们已经表明，人类心肌还包含两个不同的巨噬细胞子集，被类似地识别为CCR2-或CCR2=8。基因表达和功能分析表明，人类CCR2-和CCR2+巨噬细胞代表功能不同的子集，在功能上类似于CCR2-和CCR2–在小鼠心脏中发现的巨噬细胞。人类CCR2-巨噬细胞表达生长因子的稳健水平，包括IGF1、PDGF、Cyr61和HB-EGF。CCR2–巨噬细胞在促进炎症的化学素和细胞因子中富集，如IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7和TNF-a。刺激的CCR2–巨噬细胞分泌明显升高的炎症细胞因子白细胞因子-1+（IL-1+）在培养中。这些子集如何差异地促进组织修复和左心室 （LV） 在心脏损伤背景下的重塑仍然是一个积极研究的领域。
基于流细胞学对小鼠和人心脏的巨噬细胞异质性的分析需要消化心脏组织并产生单个细胞悬浮液，然后进行流式细胞测量分析或细胞分拣，以便进一步进行下游过程，如散装RNA测序/单细胞RNA测序或培养细胞进行功能化检测。纳伦多夫等人2007年10日首次报道了从鼠心中分离单个细胞悬浮的最初协议。我们的实验室已经调整和修改了协议，从人类心肌中提取巨噬细胞。使用相同的协议，但在染色和门控方案略有修改，CD45-从人类心肌的基质细胞也可以收获。这里介绍，在文本和视频中，是一个协议，这是例行执行从人类心肌提取巨噬细胞或基质。
心脏组织标本从成人患者扩张性心肌病（DCM：特发性或家族性）或缺血性心肌病（ICM）接受左心室辅助装置（LVAD）植入或心脏移植。在开始消化程序之前，被切除的心脏或LVAD核心在血管内注入冷盐水。需要注意的是，根据疤痕或脂肪组织渗透程度确定的组织标本的"质量"可以极大地影响巨噬细胞的产量。大面积疤痕的心脏标本的细胞产量会低得多，当所需的下游分析方法需要体外细胞培养时，可能会造成严重的技术限制。
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Protocol
提出的议定书已得到圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（#201305086）的批准。所有受试者在采集样品前提供知情同意，实验按照批准的研究规程进行。提出的协议是在华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准下执行的，并遵循NIH《实验室动物护理和使用指南》中描述的准则。
1. 人类心脏组织标本的制备
- 通过排泄左右冠状动脉骨质，并注入200 mL的冷盐水，冲洗心脏。
- 冲洗LVAD表皮核心组织，通过罐解表血管和注入50 mL的冷盐水。
- 使用无菌剪刀从冷盐水或 HBSS 中左心室的阴室或侧壁解剖组织标本。
- 用精细剪刀仔细解剖标本上的脂肪和和弦肌腱。
- 在无菌刀片或剪刀的帮助下，将组织块切成重约 200 mg 的块状。
2. 老鼠心的准备
- 通过CO2窒息或宫颈脱位使小鼠安乐死。
- 用锋利的剪刀打开胸腔。使用钝性坐其中将心脏向上抬起。使用连接到 5 mL 注射器的 25 G 针头将心脏注入冷 PBS。注入，直到心脏出现发白的颜色。
- 取出心脏，放在冰上无菌的培养皿中。
3. 制备单细胞悬架
- 将人类心脏组织块（+200毫克）或鼠心放入无菌培养皿中。用无菌刀片或剪刀精细切碎组织。
- 设置消化：
- 使用每人心脏组织块（200mg）或每只鼠心脏3mL的最终消化量。最终酶浓度如下：胶原酶1（450 U/mL）、DNase1（60 U/mL）、透明龙酶（60 U/mL）。
- 对于每个消化反应，将DMEM和所有酶加入15 mL锥形管中。在干净的钳子的帮助下，将精细切碎的组织放入每个反应管中。通过柔和的涡旋混合好。
- 在摇动的培养箱中，在37°C下消化1小时，以低至中搅拌速度。
- 消化1小时后，将管子从培养箱中拿出来，放在冰上。设置 50 mL 锥形管，顶部有 40 μm 细胞过滤器。用2 mL的酶停用（ED）缓冲液润湿过滤器。
- 通过在每个消化管中加入8 mL的ED缓冲液来停用消化酶。然后，通过40μm细胞滤网将产生的13 mL总混合物倒入50 mL锥形管中。将样品放回新鲜的15 mL锥形管中。这可实现最佳的细胞造粒，并最大限度地减少离心过程中的细胞损失。
- 以 400 x g旋转样品 6 分钟（在 4 °C 时设置）。丢弃离开 0.5 mL 介质的上清液。通过温和的移液重新悬浮细胞颗粒，并加入1 mL的ACK赖沙缓冲液。轻轻旋转管并在室温下孵育5分钟，以进行红血球（RBC）解压。
- 在 ACK 缓冲液中加入 5 分钟后，向样品中添加 9 mL 的 DMEM。将盖子放回管子上，轻轻倒置管以混合，然后过滤40μm的细胞过滤器。在 15 mL 锥形管中收集滤液。
- 将管在 400 x g下离心 6 分钟，然后丢弃上清液。
- 加入 1 mL 的 FACS 缓冲液并重新悬浮颗粒。然后在FACS缓冲液中的细胞中转移到1.5 mL微离心管中。在400 x g下再次离心5分钟，丢弃上清液，在100 μL的FACS缓冲液中重新悬浮颗粒。单个细胞悬浮液现已准备好进行抗体染色。
4. 抗体染色
- 典型的人体抗体面板由以下抗体组成：CD45-PercpCy5.5、CD14-PE、CD64-FITC、HLA-DR-APC/Cy7、CCR2-APC。请参阅表1。在1：50稀释时将所有抗体加入心脏样本，在黑暗中4°C下孵育+30-40分钟。继续执行下面的步骤 4.4。
- 对于基质细胞（内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞），添加DRAQ5（1μM最终浓度）和CD45-percpCy5.5。请参阅表1。在黑暗中4°C孵育30分钟。继续执行下面的步骤 4.4。
- 对于鼠心巨噬细胞，添加以下抗体：CD45-PercpCy5.5、CD64-APC、MHCII-APC/Cy7、CCR2-BV421和Ly6G-FITC。请参阅表2。在1：100稀释时将所有抗体加入心脏样本，在黑暗中4°C下孵育+30-40分钟。继续执行下面的步骤 4.4。
- 在 FACS 缓冲器中清洗样品两次。每次洗涤时，加入1 mL的FACS缓冲液，轻轻涡旋，并在400 x g下离心5分钟，重新悬浮在350 μL的FACS缓冲液中，并加入DAPI（1 μM，最终浓度）。示例现已准备好进行 FACS 分析/排序。
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Representative Results
所述协议允许从小鼠和人类心肌分离巨噬细胞。使用相同的协议，但使用不同的染色和门控策略，基质细胞也可以从人类心肌收获。此处介绍的 FACS 结果是在 BD LSRII 或 BD FACS ARIA III 平台上获得的。补偿控制是从彩色血囊的单色控制样本生成的。图 1显示了未处理和处理的人类 LVAD 内核。图2显示了CCR2-CCR2+人巨噬细胞流量分选的浇注方案。图 3A显示了 CD45 的浇注方案-来自人类心肌的基质细胞，图 3B显示了 Wright 染色 FACS 排序 CD45和CD45-细胞的图像。图 4描述了从小鼠心脏对巨噬细胞进行排序的浇注方案。
图1：人体LVAD组织核心加工前后。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：用于识别和描述扩张性心肌病（DCM）或缺血性心肌病（ICM）标本中心脏巨噬细胞群的流式细胞测量门控方案。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：流式细胞测量门控方案，从人体样本中分离CD45-和CD45+基质细胞。 （A） 流式细胞测量门控方案用于从人类缺血性心肌病 （ICM） 或扩张性心肌病 （DCM） 标本中分离 CD45-基质细胞。（B） 赖特染色FACS分类CD45-和CD45+细胞。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：流细胞学门控方案，从小鼠心脏分离出各种巨噬细胞子集。请点击此处查看此图的较大版本。
| 抗原 | 荧光 | 克隆 | 制造商 |
| CD45 | PercpCy5.5 | 2D1 | 生物传奇 |
| CD64 | FITC | 10.1 | 生物传奇 |
| CD14 | 体育 | M5E2 | 生物传奇 |
| CCR2 | APC 或 BV421 | K036C2 | 生物传奇 |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | 生物传奇 |
| 德拉Q5 | 热赛费舍尔 | ||
| 达皮 | 热赛费舍尔 |
表1：人体心肌标本的抗体面板。
| 抗原 | 荧光 | 克隆 | 制造商 |
| CD45 | PercpCy5.5 | 30-F11 | 生物传奇 |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | 生物传奇 |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | 生物传奇 |
| Ly6C | FITC | HK1.4 | 生物传奇 |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | 生物传奇 |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | 生物传奇 |
| 德拉Q5 | 热赛费舍尔 | ||
| 达皮 | 热赛费舍尔 |
表2：小鼠心脏标本的抗体面板。
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Discussion
该协议允许从人类心肌中提取各种巨噬菌体子集。该协议很简单，需要 3 到 4 小时准备单细胞悬浮液，为 FACS 分析做好准备。尽管该协议执行起来相对简单，但需要考虑某些技术方面，这将最大程度地降低可变性。首先，及时与人体组织合作是最佳细胞生存能力所必需的。保持组织在冷盐水/HBSS中，以尽量减少细胞死亡是很重要的。还需要从心肌标本中去除表皮脂肪和其他结缔组织。一致的组织切碎和消化时间将减少样品到样本变异。
组织消化和随后的细胞产量有测定内和测定间变异性。这是从组织中制备单个细胞悬浮液的局限性之一。减少这一点的最重要方法是确保酶相对较新、适当、储存在-80°C。等分应只使用一次，不应再次保存或冻结。使用的酶对冷冻解冻周期很敏感。另一个考虑因素是消化和晃动速度的温度。使用恒温器控制的摇床均匀分配热量，有助于最大限度地减少消化变异性，提高细胞活力。
值得一提的是，人类心肌的巨噬细胞的绝对产量一般不是很高。通常细胞产量从每1，200-1，500毫克组织20，000至50，000总巨噬细胞不等。当所需的下游分析方法涉及细胞培养测定时，这变得具有挑战性。法戈细胞化、化学素/细胞因子生成、细胞刺激、活动学和基因表达分析（微阵列、大容量RNA测序和单细胞RNA测序）都可以轻松完成。组织的质量也决定了消化的简便性和随后的细胞产量。如果组织是纤维和疤痕，消化效率是次优的，并且巨噬细胞的产量可能非常低。
另一个需要考虑的方面是心肌组织消化导致显着的碎片形成。这会导致颗粒出现松动。因此，在洗涤步骤时，必须小心，不要通过简单的掉除丢弃上清液。建议使用带巴斯德移液器的吸/真空废物收集瓶收集上清液。此外，将离心机保持在4°C将有助于最大限度地减少细胞死亡和样品损失。
尽管此协议描述了一种从人类心肌组织样本中提取巨噬细胞的方法，但也可以成功地从小鼠心脏分离巨噬细胞子集，而无需显著更改或修改。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由华盛顿大学儿童探索研究所和圣路易斯儿童医院（CH-II-2015-462，CH-II-2017-628）、巴恩斯犹太医院基金会（8038-88）和NHLBI（R01）提供资金，使该项目得以实施。HL138466，R01 HL139714）。K.J.L.由NIH K08 HL123519和伯罗斯欢迎基金（1014782）提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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