Summary
यहां प्रस्तुत एंजाइमैटिक पाचन के माध्यम से एक एकल सेल निलंबन तैयार करके मानव और माउस मायोकार्डियम से मैक्रोफेज और अन्य गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट ों को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रवाह साइटोमेट्री आधारित पहचान और इक्का-दुक्का मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन के लिए गेटिंग योजनाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं।
Abstract
मैक्रोफेज दिल में सबसे विषम और प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं और हृदय की चोट के बाद सूजन और पुनः ात्मक प्रतिक्रियाओं को चलाने में केंद्रीय हैं। हृदय की चोट के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कैसे आर्केस्ट्रा करते हैं, मैक्रोफेज के विभिन्न सबसेट अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है। यहां प्रस्तुत एक सरल प्रोटोकॉल है कि हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से प्रदर्शन करती है, माउस और स्वस्थ और रोगग्रस्त व्यक्तियों से प्राप्त मानव मायोकार्डियम नमूनों से मैक्रोफेज की निकासी के लिए। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में एक सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए हृदय ऊतक का एंजाइमैटिक पाचन शामिल है, जिसके बाद एंटीबॉडी धुंधला होता है, और साइटोमेट्री प्रवाह होता है। यह तकनीक हल कोशिकाओं के साथ-साथ थोक और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण पर किए गए कार्यात्मक परखों के लिए उपयुक्त है। इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ इसकी सादगी, दिन-प्रतिदिन की भिन्नता और व्यापक प्रयोज्यता है जो विभिन्न माउस मॉडल और मानव रोग संस्थाओं में मैक्रोफेज विषमता की जांच की अनुमति देती है।
Introduction
मैक्रोफेज दिल में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं, और वे हृदय की चोट1,2,3,4के बाद मजबूत भड़काऊ और पुनः ात्मक प्रतिक्रियाएं पैदा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इससे पहले, हमारे समूह ने अलग-अलग विकासात्मक मूल5,6से प्राप्त मूत्र हृदय में मैक्रोफेज के दो प्रमुख सबसेट ों की पहचान की। मोटे तौर पर, ऊतक निवासी कार्डियक मैक्रोफेज सबसेट की अलग आबादी सीसीआर 2 (सी-सी आकृति केमोकिन रिसेप्टर 2) की सेल सतह अभिव्यक्ति के आधार पर पहचानकी जा सकती है। CCR2- मैक्रोफेज (सेल सतह अभिव्यक्ति: CCR2-MHCIIकम और CCR2-MHCIIउच्च)भ्रूणमूल (आदिम और एरिथ्रोमाइलॉयड वंश) के हैं, जो आत्म-नवीनीकृत करने में सक्षम हैं, और होम्योपैथिक स्थितियों के तहत एक प्रमुख आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। निवासी CCR2+ मैक्रोफेज निश्चित हेमेटोपोइटिक मूल के हैं, मोनोसाइट्स परिसंचारी से भर्ती के माध्यम से बनाए रखा जाता है, और होमोस्टैटिक स्थितियों के तहत एक छोटी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कार्यात्मक रूप से, CCR2- मैक्रोफेज न्यूनतम सूजन उत्पन्न करते हैं और कोरोनरी विकास नवजात हृदय पुनर्जनन5,7के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, CCR2+ मैक्रोफेज हृदय अपमान के बाद मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रियाएं शुरू करते हैं और कोलैटरल कार्डियोमायोसाइट चोट, बाएं वेंट्रिकल के प्रतिकूल पुनर्मॉडलिंग और दिल की विफलता प्रगति8,9में योगदान देते हैं।
हाल ही में, हमने दिखाया है कि मानव मायोकार्डियम में मैक्रोफेज के दो अलग-अलग सबसेट भी होते हैं, जिन्हें सीसीआर 2- या सीसीआर 2+8के रूप में पहचाना जाता है। जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक विश्लेषणों से पता चला है कि मानव CCR2-और CCR2+ मैक्रोफेज कार्यात्मक रूप से अलग सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं और कार्यात्मक रूप से सीसीआर 2 के अनुरूप हैं- और माउस दिल में पाए जाने वाले CCR2+ मैक्रोफेज। मानव CCR2- मैक्रोफेज आईजीएफ 1, पीडीजीएफ, साइर61 और एचबी-ईजीएफ सहित विकास कारकों के मजबूत स्तर को व्यक्त करते हैं। सीसीआर2+ मैक्रोफेज केमोकिन्स और साइटोकिन्स में समृद्ध होते हैं जो सूजन को बढ़ावा देते हैं, जैसे आईएल-1बी, आईएल-6, सीसीएल-2, सीसीएल-7, और टीएनएफ-ए। उत्तेजित CCR2+ मैक्रोफेज संस्कृति में भड़काऊ साइटोकिन इंटरल्यूकिन-1ए (आईएल-1ए) के स्पष्ट रूप से उच्च स्तर को स्रावित करते हैं। कैसे इन सबसेट अंतर ऊतक की मरंमत के लिए योगदान और कार्डियक चोट के संदर्भ में छोड़ दिया वेंट्रिकुलर (LV) remodeling सक्रिय अनुसंधान का एक क्षेत्र बना हुआ है ।
माउस और मानव हृदय में मैक्रोफेज विषमता के प्रवाह-साइटोमेट्री आधारित विश्लेषण के लिए हृदय ऊतक को पचाने और एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है जिसके बाद प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण या सेल छंटाई के बाद आगे डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं जैसे बल्क आरएनए अनुक्रमण/एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण या कार्यात्मक रूपों के लिए कोशिकाओं को संजोना । मूत्र दिलों से एक सेल निलंबन करने के लिए मूल प्रोटोकॉल पहली बार Nahrendorf एट अल 200710में Nahrendorf समूह द्वारा सूचित किया गया. हमारी प्रयोगशाला ने मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज निकालने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित और संशोधित किया है। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करना लेकिन धुंधला और गेटिंग योजना में मामूली संशोधन के साथ, सीडी 45- मानव मायोकार्डियम से स्ट्रोमल कोशिकाओं को भी काटा जा सकता है। यहां प्रस्तुत, पाठ और वीडियो में, एक प्रोटोकॉल है कि मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज या स्ट्रोमल की निकासी के लिए नियमित रूप से किया जाता है ।
कार्डियक ऊतक नमूने वयस्क रोगियों से प्राप्त किए जाते हैं, जिनमें वयस्क रोगियों को फैलाया गया कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम: इडियोपैथिक या पारिवारिक) या इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी (आईसीएम) बाएं वेंट्रिकुलर असिस्ट डिवाइस (एलवीएडी) प्रत्यारोपण या हृदय प्रत्यारोपण से गुजर रहा है। दिल या एलवीएडी कोर को पाचन प्रक्रिया शुरू करने से पहले ठंडे खारे के साथ इंट्रावास्कुलर रूप से छिद्रित किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऊतक के नमूने की "गुणवत्ता" जख्म या एडीपोज ऊतक घुसपैठ की डिग्री के संदर्भ में निर्धारित मैक्रोफेज की उपज को बहुत प्रभावित कर सकती है। जख्म के बड़े क्षेत्रों के साथ दिल के नमूनों में बहुत कम सेल यील्ड होगी और वांछित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण विधियों के विट्रो सेल पुलिया की आवश्यकता होने पर गंभीर तकनीकी सीमा पैदा कर सकती है।
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Protocol
प्रस्तुत प्रोटोकॉल को वाशिंगटन विश्वविद्यालय ने सेंट लुइस इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (#201305086) में मंजूरी दे दी है। सभी विषय नमूना संग्रह से पहले सूचित सहमति प्रदान करते हैं और प्रयोग अनुमोदित अध्ययन प्रोटोकॉल के अनुसार किए जाते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के साथ किया जाता है और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड में वर्णित दिशा निर्देशों का पालन करता है ।
1. मानव हृदय ऊतक नमूनों की तैयारी
- फ्लश बाएं और दाएं कोरोनरी धमनी ओस्टिया को कैन्युलकर करके दिलों को निकाल दिया और ठंडे खारे के 200 मिलील के साथ परफ्यूज किया।
- फ्लश एलवीडी एपिकल ने एक एपिकार्डियल पोत को कैन्युलेट करके और 50 मिलीआर ठंडे खारे के साथ परफ्यूज करके ऊतकों को फ्लश किया।
- एक बाँझ कैंची का उपयोग कर ठंडे खारे या एचबीएसएस में बाएं वेंट्रिकल की एपिकल या पार्श्व दीवार से ऊतक नमूना विच्छेदन करें।
- ध्यान से ठीक कैंची का उपयोग कर नमूने से एपिडियल वसा और chordae टेंडेन बाहर विच्छेदन।
- एक बाँझ ब्लेड या कैंची की मदद से लगभग 200 मिलीग्राम वजनी टुकड़ों में ऊतक का हिस्सा विच्छेदन।
2. माउस हार्ट की तैयारी
- सीओ2 एस्फिक्सेशन या सर्वाइकल अव्यवस्था से माउस को इच्छामृत्यु दें।
- तेज कैंची की मदद से छाती गुहा खोलें। दिल को ऊपर की ओर उठाने के लिए कुंद हेमोस्टट्स का उपयोग करें। 5 मिलीग्राम सिरिंज से जुड़ी 25 जी सुई का उपयोग करके ठंडे पीबीएस के साथ दिल को पर्फ्यूज करें। जब तक दिल रंग में ब्लैंच्ड दिखाई देता है तब तक परफ्यूज।
- दिल को हटादें और बर्फ पर बाँझ पेट्री डिश में रखें।
3. सिंगल सेल निलंबन की तैयारी
- एक बाँझ पेट्री डिश में मानव हृदय ऊतक हिस्सा (~ 200 मिलीग्राम) या मूत्र दिल रखें। पतले एक बाँझ ब्लेड या कैंची का उपयोग कर ऊतक कीमा।
- पाचन स्थापित करें:
- मानव हृदय ऊतक हिस्सा (200 मिलीग्राम) या प्रति एक मूत्र हृदय प्रति 3 मिलीग्राम की अंतिम पाचन मात्रा का उपयोग करें। अंतिम एंजाइम सांद्रता इस प्रकार है: कोलेजेनेस1 (४५० यू/एमएल), DNase1 (६० U/mL), Hyaluronidase (६० U/mL) ।
- प्रत्येक पाचन प्रतिक्रिया के लिए डीएमईएम और सभी एंजाइमों को 15 मिलीग्राम शंकुपूर्ण ट्यूब में जोड़ें। साफ संदंश की मदद से, प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब में पतले कीमा बनाया हुआ ऊतक रखें। कोमल भंवर से अच्छी तरह मिलाएं।
- एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए डाइजेस्ट एक कम से मध्यम आंदोलन की गति के लिए सेट।
- पाचन के 1 घंटे बाद, ट्यूबों को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और बर्फ पर रखें। शीर्ष पर एक 40 माइक्रोन सेल छलनी के साथ 50 मीटर शंकु ट्यूब स्थापित करें। एंजाइम निष्क्रिय करने (ईडी) बफर के 2 मिलील के साथ फिल्टर गीला करें।
- प्रत्येक पाचन ट्यूब में ईडी बफर के 8 मिलील जोड़कर पाचन एंजाइमों को निष्क्रिय करें। फिर 50 मीटर शंकुट्यूब में 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से परिणामस्वरूप 13 mL कुल मिश्रण डालना। नमूनों को ताजा 15 मीटर शंकुई ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें। यह इष्टतम सेल पेलेटिंग को सक्षम बनाता है और सेंट्रलाइज्ड के दौरान सेल हानि को कम करता है।
- 6 मिन के लिए 400 x ग्राम पर नमूनों को स्पिन करें (4 डिग्री सेल्सियस पर सेट सेंट्रलाइज)। मीडिया के 0.5 mL छोड़ने के सुपरनेटेंट को त्यागें। कोमल पाइपिंग द्वारा सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और ACK lysis बफर के 1 mL जोड़ें। लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लिसिस करने के लिए 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब और इनक्यूबेट को धीरे से घूमता है।
- ACK बफर में 5 मिन के बाद, नमूने में DMEM के 9 mL जोड़ें। ढक्कन को वापस ट्यूबों पर रखें और धीरे-धीरे ट्यूबों को मिलाने के लिए उलटा करें, और 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। 15 mL शंकुट्यूब में छानने का सामान लीजिए।
- 6 मिन के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित करें और सुपरनेटेंट को त्याग दें।
- FACS बफर के 1 mL जोड़ें और गोली को फिर से निलंबित करें। फिर FACS बफर में कोशिकाओं में एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरित करें। 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र। सुपरनेटेंट को त्यागें और एफएसीएस बफर के 100 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए अब सिंगल सेल सस्पेंशन तैयार है।
4. एंटीबॉडी धुंधला
- एक ठेठ मानव एंटीबॉडी पैनल निम्नलिखित एंटीबॉडी के होते हैं: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC । कृपया तालिका 1का उल्लेख करें । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 30-40 टिन के लिए 1:50 कमजोर पड़ने और इनक्यूबेट पर दिल के नमूनों में सभी एंटीबॉडी जोड़ें। नीचे 4.4 कदम के लिए आगे बढ़ें।
- स्ट्रोमल कोशिकाओं (एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं) के लिए, DRAQ5 (1 μM अंतिम एकाग्रता) और CD45-percpCy5.5 जोड़ें । कृपया तालिका 1का उल्लेख करें । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट। नीचे 4.4 कदम के लिए आगे बढ़ें।
- मूत्र हृदय मैक्रोफेज के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी जोड़ें: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, और Ly6G-FITC । कृपया तालिका 2का उल्लेख करें । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 30-40 टिन के लिए 1:100 कमजोर पड़ने और इनक्यूबेट पर दिल के नमूनों में सभी एंटीबॉडी जोड़ें। नीचे 4.4 कदम के लिए आगे बढ़ें।
- सैंपल ों को दो बार एफएसीएस बफर में धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर 1 एलएल, धीरे भंवर, और अपकेंद्री जोड़ें, FACS बफर के 350 μL में फिर से निलंबित करें और DAPI (1 μM, अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। अब नमूने एफएसीएस विश्लेषण/छंटाई के लिए तैयार हैं ।
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Representative Results
वर्णित प्रोटोकॉल माउस और मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज के अलगाव की अनुमति देता है। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करना, लेकिन एक अलग धुंधला और गेटिंग रणनीति के साथ, स्ट्रोमल कोशिकाओं को मानव मायोकार्डियम से भी काटा जा सकता है। यहां प्रस्तुत FACS परिणाम या तो बीडी LSRII या बीडी FACS ARIA III मंच पर प्राप्त किए गए थे । दाग ित स्प्लोसाइट्स से एकल रंग नियंत्रण नमूनों से मुआवजा नियंत्रण उत्पन्न किया गया था। चित्रा 1 असंसाधित और संसाधित मानव LVAD कोर से पता चलता है । चित्रा 2 CCR2 के प्रवाह छंटाई के लिए गेटिंग योजना से पता चलताहै-और CCR2+ मानव मैक्रोफेज । चित्रा 3ए सीडी 45 के लिए गेटिंग योजना दिखाता है- मानव मायोकार्डियम और चित्रा 3बी से स्ट्रोमल कोशिकाओं राइट दाग FACS हल CD45+ और CD45 की छवियों से पता चलता है- कोशिकाओं। चित्रा 4 एक माउस दिल से मैक्रोफेज सॉर्ट करने के लिए गेटिंग योजना का वर्णन करता है ।
चित्रा 1: मानव LVAD ऊतक कोर से पहले और प्रसंस्करण के बाद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग योजना का उपयोग डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम) या इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी (आईसीएम) नमूनों में हृदय स्थूल आबादी की पहचान करने और विशेषता के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: मानव नमूनों से CD45- और CD45+ स्ट्रोमल कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग योजना। (A)फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग योजना का उपयोग सीडी45 को अलग करने के लिए किया जाता है- मानव इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी (आईसीएम) या फैली हुई कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम) नमूनों से स्ट्रोमल कोशिकाएं। (ख)राइट दाग FACS हल CD45-और CD45+ कोशिकाओं । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: माउस दिल से विभिन्न मैक्रोफेज सबसेट को अलग करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग योजना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| Antigen | फ्लोरोफोर | क्लोन | निर्माता |
| सीडी45 | पर्ससाइक्ल5.5 | 2D1 | बायोलीजेंड |
| सीडी64 | फिटेसी | 10.1 | बायोलीजेंड |
| सीडी14 | पीई | M5E2 | बायोलीजेंड |
| सीसीआर2 | एपीसी या BV421 | K036C2 | बायोलीजेंड |
| एमएचसीआईआई | एपीसी/Cy7 | L243 | बायोलीजेंड |
| ड्रेक5 | थर्मो फिशर | ||
| डीपीआई | थर्मो फिशर |
तालिका 1: मानव मायोकार्डियम नमूने के लिए एंटीबॉडी पैनल।
| Antigen | फ्लोरोफोर | क्लोन | निर्माता |
| सीडी45 | पर्ससाइक्ल5.5 | 30-F11 | बायोलीजेंड |
| सीडी64 | Apc | X54-5/7.1 | बायोलीजेंड |
| Ly6G | पीई/Cy7 | 1A8 | बायोलीजेंड |
| Ly6C | फिटेसी | एचके1.4 | बायोलीजेंड |
| सीसीआर2 | BV421 | SA203G11 | बायोलीजेंड |
| एमएचसीआईआई | एपीसी/Cy7 | M5/114.15.2 | बायोलीजेंड |
| ड्रेक5 | थर्मो फिशर | ||
| डीपीआई | थर्मो फिशर |
तालिका 2: माउस दिल के नमूने के लिए एंटीबॉडी पैनल।
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Discussion
प्रोटोकॉल मानव मायोकार्डियम से विभिन्न मैक्रोफेज सबसेट को निकालने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल सरल है और FACS विश्लेषण के लिए तैयार एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए 3 से 4 घंटे लगते हैं। हालांकि प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है, कुछ तकनीकी पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है जो परिवर्तनशीलता को कम करेगा। सबसे पहले, इष्टतम सेल व्यवहार्यता के लिए मानव ऊतक के साथ समय पर फैशन में काम करना आवश्यक है। कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए ऊतक को ठंडे खारे/एचबीएसमें रखना महत्वपूर्ण है। मायोकार्डियल नमूने से एपिकार्डियल फैट और अन्य कनेक्टिव ऊतक को हटाना भी आवश्यक है। लगातार ऊतक कीमा और पाचन समय नमूना भिन्नता के लिए नमूना कम हो जाएगा।
ऊतक पाचन और बाद में कोशिका पैदावार में अंतर-परख और अंतर-परख परिवर्तनशीलता दोनों है। यह ऊतकों से एक सेल निलंबन तैयार करने में सीमाओं में से एक है। इसे कम करने का सबसे महत्वपूर्ण तरीका यह सुनिश्चित करना है कि एंजाइम अपेक्षाकृत नए हैं, ठीक से अलीकोट किए गए हैं, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत हैं। Aliquots केवल एक बार इस्तेमाल किया जाना चाहिए और बचाया या फिर से जमे हुए नहीं किया जाना चाहिए । उपयोग किए जाने वाले एंजाइम गल चक्रों को फ्रीज करने के लिए संवेदनशील होते हैं। एक और विचार पाचन और मिलाते हुए गति का तापमान है। एक थर्मोस्टेट नियंत्रित शेखर का उपयोग करना जो समान रूप से गर्मी वितरित करता है पाचन परिवर्तनशीलता को कम करने और सेल व्यवहार्यता में सुधार करने में मदद करता है।
यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज की पूर्ण उपज आम तौर पर बहुत अधिक नहीं होती है। आमतौर पर कोशिका उपज ~ 20,000 से 50,000 कुल मैक्रोफेज प्रति 1,200-1,500 मिलीग्राम ऊतक तक भिन्न होती है। यह चुनौतीपूर्ण हो जाता है जब विश्लेषण के वांछित डाउनस्ट्रीम विधि सेल संस्कृति परख शामिल है । फागोसाइटोसिस, केमोकिन/साइटोकिन उत्पादन, सेल उत्तेजना, मॉर्पोमेट्री, और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (माइक्रोऐरे, बल्क आरएनए अनुक्रमण, और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण) को आसानी से किया जा सकता है। ऊतक की गुणवत्ता पाचन और बाद में कोशिका उपज की आसानी को भी निर्धारित करती है। यदि ऊतक रेशेदार और जख्महै, तो पाचन दक्षता उप-इष्टतम है, और मैक्रोफेज यील्ड बहुत कम होने की संभावना है।
विचार करने के लिए एक और पहलू यह है कि मायोकार्डियल ऊतक पाचन महत्वपूर्ण मलबे गठन की ओर जाता है। इस कारण गोली ढीली दिखाई देती है। इस प्रकार, किसी को सावधान रहना चाहिए कि वह सरल विकेनिंग द्वारा धोने के चरणों के दौरान अधिनेत को त्यागन न करे। अधिष्ठान को एकत्र करने के लिए पाश्चर पिपेट के साथ एक सक्शन/वैक्यूम अपशिष्ट संग्रह फ्लास्क का उपयोग करना उचित है । इसके अलावा, 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री बनाए रखने से सेल मौत और नमूना हानि को कम करने में मदद मिलेगी।
यद्यपि यह प्रोटोकॉल मानव मायोकार्डियल ऊतक नमूनों से मैक्रोफेज निकालने का एक तरीका बताता है, लेकिन महत्वपूर्ण परिवर्तन ों या संशोधनों के बिना माउस दिलों से मैक्रोफेज सबसेट का सफल अलगाव भी प्राप्त किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है ।
Acknowledgments
इस परियोजना को वाशिंगटन विश्वविद्यालय के चिल्ड्रन डिस्कवरी संस्थान और सेंट लुइस चिल्ड्रन अस्पताल (सीएच-II-2015-462, CH-II-2017-628), बार्न्स-यहूदी अस्पताल (8038-88) की नींव और NHLBI (R01) से प्रदान की गई फंडिंग से संभव बनाया गया था । एचएल138466, आर01 एचएल139714) । केजेएल को एनआईएच के08 एचएल123519 और बुर्के वेलकम फंड (1014782) द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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