Summary
Apresentado aqui é um protocolo para isolar vários subconjuntos de macrófagos e outras células não imunes do miocátrio humano e do rato, preparando uma única suspensão celular através da digestão enzimática. Também são apresentados esquemas de gating para identificação baseada em citometria de fluxo e caracterização de macrófagos isolados.
Abstract
Macrófagos representam as populações de células imunes mais heterogêneas e abundantes no coração e são centrais na condução de inflamação e respostas reparadoras após lesão cardíaca. Como vários subconjuntos de macrófagos orquestram as respostas imunes após lesão cardíaca é uma área ativa de pesquisa. Apresentado aqui é um protocolo simples que nosso laboratório executa rotineiramente, para a extração de macrófagos de espécimes de miocánio humano e camundongos obtidos de indivíduos saudáveis e doentes. Resumidamente, este protocolo envolve digestão enzimática de tecido cardíaco para gerar uma única suspensão celular, seguido de coloração de anticorpos e citometria de fluxo. Esta técnica é adequada para ensaios funcionais realizados em células classificadas, bem como sequenciamento de RNA em massa e célula única. Uma grande vantagem deste protocolo é a sua simplicidade, variação mínima do dia a dia e ampla aplicabilidade que permite a investigação da heterogeneidade do macrófago em vários modelos de camundongos e entidades de doenças humanas.
Introduction
Os macrófagos representam o tipo de célula imune mais abundante no coração, e desempenham papéis significativos na geração de respostas inflamatórias e reparadoras robustas após lesão cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nosso grupo identificou dois grandes subconjuntos de macrófagos no coração de urina derivados de origens distintas do desenvolvimento5,6. Em termos gerais, populações distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes em tecidos podem ser identificadas com base na expressão da superfície celular do CCR2 (receptor de quimiocina 2 do motivo C-C). CCR2- macrófagos (expressão da superfície celular: CCR2-MHCIIbaixa e CCR2-MHCIIalta)são de origem embrionária (linhagens primitivas e erittroóides), capazes de auto-renovar, e representam uma população dominante em condições homeostáticas. Os CCR2+ macrófagos residentes são de origem hematopoiética definitiva, são mantidos através do recrutamento de monócitos circulantes e representam uma população menor em condições homeostáticas. Funcionalmente, CCR2- macrófagos geram inflamação mínima e são fundamentais para o desenvolvimento coronariano regeneração cardíaca neonatal5,7. Em contraste, CCR2+ macrófagos iniciam respostas inflamatórias robustas após insultos cardíacos e contribuem para a lesão por cardiomiócito colateral, remodelação adversa do ventrículo esquerdo e progressão da insuficiência cardíaca8,9.
Recentemente, mostramos que o miocásio humano também contém dois subconjuntos distintos de macrófagos identificados de forma semelhante como CCR2- ou CCR2+8. A expressão gênica e as análises funcionais revelaram que os CCR2 humanos- e os macrófagos CCR2+ representam subconjuntos funcionalmente divergentes e são funcionalmente análogos à CCR2- e CCR2+ macrófagos encontrados no coração do rato. CCR2 humano- macrófagos expressam níveis robustos de fatores de crescimento, incluindo IGF1, PDGF, Cyr61 e HB-EGF. CCR2+ macrófagos são enriquecidos em quimiocinas e citocinas que promovem inflamação, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 e TNF-a. Estimulados CCR2+ macrófagos secretam níveis marcadamente mais altos da citocina inflamatória interleucina-1β (IL-1β) na cultura. Como esses subconjuntos contribuem diferencialmente para a reparação de tecidos e a remodelação ventricular esquerda (LV) no contexto da lesão cardíaca continua a ser uma área de pesquisa ativa.
A análise baseada em citometria flow-ofuscar a heterogeneidade do macrófago no camundongo e no coração humano requer digerir o tecido cardíaco e gerar uma única suspensão celular seguida de análise citométrica de fluxo ou classificação celular para processos a jusante, como sequenciamento de RNA em massa/sequenciamento de RNA de célula única ou cultivo das células para ensaios funcionais. O protocolo original para fazer uma única suspensão celular de corações de urina foram relatados pela primeira vez pelo grupo Nahrendorf em Nahrendorf et al. 200710. Nosso laboratório adaptou e modificou o protocolo para extrair macrófagos do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com ligeira modificação no esquema de coloração e gating, CD45- células estromais do miocátrio humano também podem ser colhidas. Apresentado aqui, em texto e vídeo, é um protocolo que é realizado rotineiramente para a extração de macrófagos ou estromal do miocátrio humano.
Espécimes de tecido cardíaco são obtidos de pacientes adultos com cardiomiopatia dilatada (DCM: idiopática ou familiar) ou cardiomiopatia isquêmica (ICM) submetidos à implantação ou transplante cardíaco do dispositivo de assistência ventricular esquerda (LVAD). Os corações explantados ou os núcleos de LVAD são perfundidos intravascular com soro frio antes de começar o procedimento da digestão. É importante notar que a "qualidade" do espécime de tecido determinado em termos de grau de cicatrização ou infiltração de tecido adiposo pode afetar muito o rendimento dos macrófagos. Espécimes cardíacos com grandes áreas de cicatrizes terão rendimento celular muito menor e podem representar séria limitação técnica quando os métodos de análise a jusante desejados requerem cultivo de células in vitro.
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Protocol
O protocolo apresentado foi aprovado pela Washington University em St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos os sujeitos fornecem consentimento informado antes da coleta de amostras e os experimentos são realizados de acordo com o protocolo de estudo aprovado. O protocolo apresentado é realizado com a aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee da Washington University School of Medicine e segue as diretrizes descritas no Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Preparação de espécimes de tecido cardíaco humano
- Nivele corações explantados por cânulando a ostia da artéria coronária esquerda e direita e perfusique com 200 mL de soro fisiológico frio.
- Flush LVAD apical tecidos cored por cânulando um vaso epicardial e perfundir com 50 mL de soro de soro frio.
- Dissecar o espécime do tecido da parede apical ou lateral do ventrículo esquerdo no soro fisiológico frio ou em HBSS usando uma tesoura estéril.
- Dissecar cuidadosamente a gordura epicardial e tendineae de acordes do espécime usando uma tesoura fina.
- Dissecar pedaços de tecido em pedaços pesando aproximadamente 200 mg com a ajuda de uma lâmina estéril ou tesoura.
2. Preparação do coração do rato
- Eutanásia do rato por asfixia de CO2 ou deslocamento cervical.
- Abra a cavidade torácica com a ajuda de tesouras afiadas. Use hemostats sem corte para levantar o coração para cima. Perfuse o coração com PBS frio usando uma agulha de 25 G unida a uma seringa de 5 mL. Perfuse até que o coração aparece decorado na cor.
- Retire o coração e coloque em uma placa de Petri estéril no gelo.
3. Preparação da suspensão de célula única
- Coloque pedaços de tecido cardíaco humano (~ 200 mg) ou coração de urina em uma placa de Petri estéril. Pique finamente o tecido usando uma lâmina estéril ou tesoura.
- Configure as digestões:
- Use um volume final de digestão de 3 mL por pedaço de tecido cardíaco humano (200 mg) ou por um coração de urina. As concentrações de enzimas finais são as seguintes: Colagem (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hialuronidase (60 U/mL).
- Para cada reação de digestão adicione DMEM e todas as enzimas a um tubo cônico de 15 mL. Com a ajuda de fórceps limpos, coloque o tecido finamente picado em cada tubo de reação. Misture bem por vórtice suave.
- Digere para 1 h em 37 °C em uma incubadora de agitação ajustada a uma baixa a média velocidade da agitação.
- Depois de 1 h de digestão, retire os tubos da incubadora e coloque no gelo. Configure 50 tubos cônicos mL com um filtro de células de 40 μm em cima. Molhe os filtros com 2 mL de enzima desativação (ED) buffer.
- Desativar as enzimas de digestão, adicionando 8 mL de buffer DE para cada tubo de digestão. Em seguida, despeje a mistura total resultante de 13 mL através do filtro de célula de 40 μm nos tubos cônicos de 50 mL. Transfira as amostras de volta no tubo cônico fresco de 15 mL. Isso permite a ordileção de células ideais e minimiza a perda celular durante a centrífuga.
- Gire as amostras a 400 x g por 6 min (Centrífuga situada em 4 °C). Descarte o supernatant deixando 0,5 mL de mídia. Resuspenda a pelota celular por tubulação suave e adicione 1 mL de amortecimento de lse da ACK. Delicadamente redemoinho do tubo e incubar à temperatura ambiente por 5 min para realizar glóbulo vermelho (RBC) lyse.
- Após 5 min no buffer ACK, adicione 9 mL de DMEM à amostra. Coloque a tampa de volta para os tubos e gentilmente inverter os tubos para misturar, e filtrar através de um filtro de células de 40 μm. Colete a filtragem em tubos cônicos de 15 mL.
- Centrífuga os tubos em 400 x g por 6 min e descartar o supernatant.
- Adicione 1 mL de buffer FACS e resuspender a pelota. Em seguida, transfira nas células do tampão FACS para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífuga novamente a 400 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspender a pelota em 100 μL de FACS Buffer. Uma única suspensão da pilha está agora pronta para a coloração do anticorpo.
4. Mancha de anticorpos
- Um painel típico de anticorpos humanos consiste nos seguintes anticorpos: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Por favor, consulte a Tabela 1. Adicione todos os anticorpos às amostras do coração em 1:50 diluição e incubação para ~30-40 min em 4 °C na obscuridade. Avance para o passo 4.4 abaixo.
- Para células estromais (células endotélias, fibroblasto, células musculares lisas), adicione DRAQ5 (1 μM concentração final) e CD45-percpCy5.5. Por favor, consulte a Tabela 1. Incubar por 30 min a 4 °C no escuro. Avance para o passo 4.4 abaixo.
- Para macrófagos cardíacos de urina adicione os seguintes anticorpos: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 e Ly6G-FITC. Por favor, consulte a Tabela 2. Adicione todos os anticorpos às amostras do coração em 1:100 diluição e incubar para ~30-40 min em 4 °C na obscuridade. Avance para o passo 4.4 abaixo.
- Lave as amostras duas vezes no tampão FACS. Para cada lavagem, adicione 1 mL de tampão FACS, vórtice suave e centrífuga a 400 x g por 5 min, resuspenda em 350 μL de tampão FACS e adicione DAPI (1 μM, concentração final). As amostras estão agora prontas para a análise/classificação facs.
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Representative Results
O protocolo descrito permite o isolamento de macrófagos do mouse e do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com uma estratégia diferente de coloração e marcha, as células estromais também podem ser colhidas do miocánio humano. Os resultados da FACS aqui apresentados foram adquiridos na plataforma BD LSRII ou BD FACS ARIA III. Os controles de compensação foram gerados a partir de amostras de controle de cores únicas de splenocytes manchados. A Figura 1 mostra o núcleo lvad humano não processado e processado. A figura 2 mostra o esquema de gating para a classificação do fluxo de CCR2- e CCR2+ macrófagos humanos. Figura 3A mostra o esquema gating para CD45- células estromais de miocátrio humano e Figura 3B mostra imagens de Wright manchado FACS classificados CD45+ e CD45- células. Figura 4 descreve o esquema gating para classificar macrófagos de um coração do rato.
Figura 1: O núcleo humano do tecido de LVAD antes e depois do processamento. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Esquema de gating de citometria de fluxo utilizado para identificar e caracterizar populações de macrófagos cardíacos em cardiomiopatia dilatada (DCM) ou cardiomiopatia isquêmica (ICM) espécimes. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Esquema de cravação de citometria de fluxo para isolar CD45- e Células estromais CD45+ de amostras humanas. (A) Esquema de gating de citometria de fluxo utilizado para isolar CD45- células estromais da cardiomiopatia isquêmica humana (ICM) ou cardiomiopatia dilatada (DCM) espécimes. (B) Wright manchado FACS classificados CD45- e CD45+ células. Barras de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Esquema de gating da citometria do fluxo para isolar vários subconjuntos do macrófago do coração do rato. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Antígeno | Fluorofóbico | Clone | Fabricante |
| CD45 CD45 | PercpCy5.5 PercpCy5.5 | 2D1 2D1 | Biolegend Biolegend |
| CD64 CD64 | FITC FITC | 10.1 | Biolegend Biolegend |
| CD14 CD14 | Pe | M5E2 M5E2 | Biolegend Biolegend |
| CCR2 CCR2 | APC ou BV421 | K036C2 K036C2 | Biolegend Biolegend |
| MHCII MHCII | APC/Cy7 APC / Cy7 | L243 L243 | Biolegend Biolegend |
| DRAQ5 DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI DAPI | Thermo Fisher |
Tabela 1: Painel de anticorpos para espécime de miocámio humano.
| Antígeno | Fluorofóbico | Clone | Fabricante |
| CD45 CD45 | PercpCy5.5 PercpCy5.5 | 30-F11 30-F11 | Biolegend Biolegend |
| CD64 CD64 | Apc | X54-5/7.1 X54-5/7.1 | Biolegend Biolegend |
| Ly6G Ly6G | PE/Cy7 Pe/Cy7 | 1A8 1A8 | Biolegend Biolegend |
| Ly6C Ly6C | FITC FITC | HK1.4 HK1.4 HK1.4 | Biolegend Biolegend |
| CCR2 CCR2 | BV421 BV421 | SA203G11 SA203G11 | Biolegend Biolegend |
| MHCII MHCII | APC/Cy7 APC / Cy7 | M5/114.15.2 M5/114.15.2 | Biolegend Biolegend |
| DRAQ5 DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI DAPI | Thermo Fisher |
Tabela 2: Painel de anticorpos para espécime de coração de rato.
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Discussion
O protocolo permite a extração de vários subconjuntos de macrófagos do miocátrio humano. O protocolo é simples e leva de 3 a 4 horas para preparar a suspensão de célula única pronta para a análise facs. Embora o protocolo seja relativamente simples de executar, há certos aspectos técnicos que precisam ser considerados que minimizarão a variabilidade. Em primeiro lugar, trabalhar em tempo hábil com o tecido humano é necessário para a viabilidade celular ideal. É importante manter o tecido em saline frio / HBSS para minimizar a morte celular. Também é necessário remover a gordura epicardial e outros tecidos conjuntivos do espécime do miocárdio. Tempos consistentes de afinação e digestão do tecido reduzirão a variação da amostra para a mostra.
Há tanto intra-ensaio e inter-ensaio variabilidade nas digestões de tecidos e rendimentos celulares subseqüentes. Esta é uma das limitações na preparação de uma única suspensão celular dos tecidos. A maneira mais importante de minimizar isso é certificando-se de enzimas são relativamente novas, devidamente aliquoted, e armazenados em -80 °C. Os alíquotas devem ser usados apenas uma vez e não devem ser salvos ou congelados novamente. Enzimas utilizadas são sensíveis para congelar ciclos de degelo. Outra consideração é a temperatura da digestão e agitação velocidade. Usar um agitador termostato-controlado que distribua uniformemente o calor ajuda a minimizar a variabilidade da digestão e a melhorar a viabilidade da pilha.
É importante mencionar que o rendimento absoluto dos macrófagos do miocásio humano geralmente não é muito alto. Normalmente, o rendimento celular varia de ~ 20.000 a 50.000 macrófagos totais por 1.200-1.500 mg de tecido. Isso se torna um desafio quando o método desejado de análise a jusante envolve ensaios de cultura celular. As análises da fagocitose, quimiocina/citocina, estimulação celular, morfometria e análises de expressão gênica (microarray, sequenciamento de RNA em massa e sequenciamento de RNA de célula única) podem ser facilmente realizadas. A qualidade do tecido também determina a facilidade de digestão e subsequente produtividade celular. Se o tecido é fibroso e marcado, a eficiência da digestão é suboptimal, e o rendimento do macrófago é provável ser muito baixo.
Outro aspecto a considerar é que a digestão do tecido miocárdio leva à formação significativa de detritos. Isso faz com que a pelota pareça solta. Assim, deve-se ter cuidado para não descartar o supernatant durante passos de lavagem por simples decantação. Usar uma garrafa da coleção do desperdício da sucção/vácuo com uma pipeta de Pasteur para coletar o supernatant é aconselhável. Além disso, manter a centrífuga a 4 °C ajudará a minimizar a morte celular e a perda da amostra.
Embora este protocolo descreva uma maneira de extrair macrófagos de amostras humanas do tecido do myocardial, a isolação bem sucedida de subsets do macrófago pode igualmente ser conseguida dos corações do rato sem mudanças ou modificações significativas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este projeto foi possível graças ao financiamento fornecido pelo Children's Discovery Institute da Universidade de Washington e pelo St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Fundação do Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e pelo NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. é apoiado pelo NIH K08 HL123519 e burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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