Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши

Published: December 17, 2019 doi: 10.3791/60015

Summary

Представлен протокол для изоляции различных подмножеств макрофагов и других неиммунных клеток от миокарда человека и мыши путем подготовки одной клеточной подвески через ферментативное пищеварение. Также представлены схемы идентификации цитометрии потока и характеристики изолированных макрофагов.

Abstract

Макрофаги представляют собой наиболее неоднородные и обильные популяции иммунных клеток в сердце и занимают центральное место в воспалении и репаративных реакциях после сердечной травмы. Как различные подмножества макрофагов организовать иммунные реакции после сердечной травмы является активной областью исследований. Представлен простой протокол, который наша лаборатория выполняет регулярно, для извлечения макрофагов из мыши и человеческих образцов миокарда, полученных от здоровых и больных людей. Кратко, этот протокол включает в себя ферментативное пищеварение сердечной ткани для создания одной подвески клеток, а затем окрашивая антитела, и поток цитометрии. Этот метод подходит для функциональных анализов, выполняемых на отсортированных клетках, а также для секвенирования РНК навалом и одноклеточной РНК. Основным преимуществом этого протокола является его простота, минимальная повседневная вариация и широкая применимость, позволяющая исследует неоднородность макрофагов в различных моделях мыши и человеческих заболеваниях.

Introduction

Макрофаги представляют собой наиболее распространенный тип иммунных клеток в сердце, и они играют важную роль в генерации надежных воспалительных и репаративных реакций после сердечной травмы1,2,3,4. Ранее наша группа определила два основных подмножества макрофагов в сердце мурина, полученных из различных происхождения развития5,6. В целом, различные популяции тканей резидентов сердечных макрофагов подмножества могут быть определены на основе экспрессии поверхности клетки CCR2 (C-C мотив хемокин рецептор 2). CCR2- макрофаги (выражение поверхности клетки: CCR2-MHCIIнизкий и CCR2-MHCIIhigh) имеют эмбриональное происхождение (примитивные и эритромиелоидные линии), способные к самообновлению и представляют доминирующую популяцию в гомеостатичных условиях. Резидент CCR2и макрофаги имеют окончательное гематопоиетическое происхождение, поддерживаются путем набора из циркулирующих моноцитов, и представляют незначительную популяцию в гомеостатических условиях. Функционально, CCR2- макрофаги генерировать минимальное воспаление и имеют решающее значение для коронарного развития неонатальной регенерации сердца5,7. В отличие от этого, CCR2и макрофаги инициировать надежные воспалительные реакции после сердечных оскорблений и способствовать залога травмы кардиомиоцитов, неблагоприятное ремоделирование левого желудочка, и сердечная недостаточность прогрессии8,9.

Недавно мы показали, что миокард человека также содержит два различных подмножества макрофагов, идентифицированных аналогичным образом как CCR2- или CCR2No8. Экспрессия генов и функциональный анализ показали, что макрофаги CCR2человека и CCR2 представляют функционально расходящиеся подмножества и функционально аналогичны CCR2- имакрофагам CCR2, найденным в сердце мыши. Человеческий CCR2- макрофаги выражают устойчивые уровни факторов роста, включая IGF1, PDGF, Cyr61 и HB-EGF. Макрофаги CCR2и обогащаются в химокинах и цитокинах, которые способствуют воспалению, таким как IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 и TNF-a. Стимулированные CCR2- макрофаги выделяют заметно более высокие уровни воспалительного цитокина интерлейкина-1 " (IL-1") в культуре. Как эти подмножества дифференарно способствуют восстановлению тканей и ремоделирования левого желудочка (LV) в контексте сердечной травмы остается областью активных исследований.

Поток-цитометрия на основе анализа макрофаг неоднородности в мыши и человеческого сердца требует переваривания сердечной ткани и генерации одной клеточной подвески с последующим циклометрическим анализом потока или сортировкой клеток для дальнейших процессов вниз по течению, таких как массовое секвенирование РНК/одноклеточная РНК секвенирования или культивирование клеток для функциональной анализа. Первоначальный протокол для принятия одной ячейки подвески из сердца murine были впервые сообщили nahrendorf группы в Nahrendorf и др. 200710. Наша лаборатория адаптировала и модифицировала протокол для извлечения макрофагов из миокарда человека. Используя тот же протокол, но с небольшимизменением в схеме окрашивания и gating, CD45- стромальные клетки из миокарда человека также могут быть собраны. Представленный здесь, в тексте и видео, протокол, который выполняется регулярно для извлечения макрофагов или стромальный из человеческой миокарда.

Образцы сердечной ткани получают сяритогецы у взрослых пациентов с расширенной кардиомиопатией (DCM: идиопатической или семейной) или ишемической кардиомиопатией (ИКМ), проходящими левожелудочковой вспомогательной помощью (LVAD) имплантации или трансплантации сердца. Выслаженные сердца или сердечники LVAD внутриваскулярно пронизаны холодным сольнием до начала процедуры пищеварения. Важно отметить, что «качество» образца ткани, определяемые с точки зрения степени образования рубцов или инфильтрации жировой ткани, может значительно повлиять на урожайность макрофагов. Образцы сердца с большими областями рубцов будут иметь гораздо более низкую урожайность клеток и могут представлять серьезные технические ограничения, когда желаемые методы анализа вниз по течению требуют культивирования клеток in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Представленный протокол был одобрен Вашингтонским университетом в Сент-Луисе (#201305086). Все испытуемые предоставляют информированное согласие перед сбором проб, и эксперименты проводятся в соответствии с утвержденным протоколом исследования. Представленный протокол выполняется с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных в Медицинской школе Вашингтонского университета и соответствует руководящим принципам, описанным в руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка человека сердечных тканей Specimens

  1. Флеш высаживал сердца, консервируя левую и правую коронарную артерию ostia и надоеть с 200 мл холодного солевого раствора.
  2. Промыть LVAD апикальных корированных тканей, cannulating эпикардиального сосуда и пронзать с 50 мл холодного сольника.
  3. Вскрыть образец ткани из апкальной или боковой стенки левого желудочка в холодном солевом растворе или HBSS с помощью стерильных ножниц.
  4. Тщательно вскрыть эпикардиальный жир и акдиновые тендины из образца с помощью тонких ножниц.
  5. Рассекать куски ткани на куски весом около 200 мг с помощью стерильного лезвия или ножниц.

2. Подготовка мышиного сердца

  1. Эвтанизировать мышь путем удушья CO2 или вывихшей шейки матки.
  2. Откройте грудную полость с помощью острых ножниц. Используйте тупые гемостаты, чтобы поднять сердце вверх. Пронизыруйте сердце холодным PBS, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 5 мл. Perfuse, пока сердце появляется бланшированный в цвете.
  3. Снимите сердце и поместите в стерильную чашку Петри на льду.

3. Подготовка одноклеточной подвески

  1. Поместите части сердечной ткани человека (200 мг) или сердце мурин в стерильное блюдо Петри. Мелко фарш ткани с помощью стерильного лезвия или ножницы.
  2. Настройка пищеварений:
    1. Используйте окончательный объем пищеварения 3 мл на кусок сердечной ткани человека (200 мг) или на одно сердце мурина. Окончательные концентрации ферментов следующие: Коллагеназе1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
    2. Для каждой реакции пищеварения добавляйте DMEM и все ферменты в коническую трубку 15 мл. С помощью чистых щипцов, поместите мелко рубленые ткани в каждой реакционной трубки. Хорошо перемешайте нежным вихрем.
  3. Дайджест для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в тряся инкубаторе установлен на низкой и средней скорости возбуждения.
  4. После 1 ч пищеварения, вынуть трубки из инкубатора и поместить на лед. Установите 50 мл конических труб с 40 мкм ячейки ситечко на вершине. Влажные фильтры с 2 мл фермента деактивацивирования (ED) буфера.
  5. Деактивируйте ферменты пищеварения, добавив 8 мл буфера ЭД в каждую трубку пищеварения. Затем залить в результате 13 мл общей смеси через 40 мкм ячейки ситечко в 50 мл конических труб. Перенесите образцы обратно в свежую коническую трубку 15 мл. Это обеспечивает оптимальную пеллетирование клеток и сводит к минимуму потерю клеток во время центрифугирования.
  6. Спин образцы на 400 х г в течение 6 мин (Центрифуга установлен при 4 кв С). Откажитесь от супернатанта, оставляя 0,5 мл носителей. Отрежируйте клеточные гранулы нежным пайпетированием и добавьте 1 мл буфера асис-лисиса. Аккуратно закружайте трубку и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для выполнения красная кровь (РБК) лиза.
  7. После 5 минут в буфере ACK добавьте 9 мл DMEM в образец. Положите крышку обратно на трубки и осторожно инвертировать трубки, чтобы смешать, и фильтр через 40 мкм ячейки ситечко. Соберите фильтрат в 15 мл конических труб.
  8. Центрифуга труб на 400 х г в течение 6 мин и отбросить супернатант.
  9. Добавьте 1 мл буфера FACS и приостановите гранулы. Затем перенесите в клетки в буфере FACS в микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Центрифуга снова на 400 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и отбросите гранулы в 100 л буфера FACS. Одноклеточная подвеска теперь готова к окрашиванию антител.

4. Запятнание антител

  1. Типичная панель антител человека состоит из следующих антител: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Добавьте все антитела к образцам сердца в 1:50 разбавления и инкубировать в течение 30-40 мин при 4 градусах По цельсию в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
  2. Для стромальных клеток (эндотелиальных клеток, фибробластов, гладких мышечных клеток) добавьте DRA-5 (1 ММ конечная концентрация) и CD45-percpCy5.5. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
  3. Для макрофагов сердца мурин добавляются следующие антитела: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 и Ly6G-FITC. Пожалуйста, обратитесь к таблице 2. Добавьте все антитела к образцам сердца в 1:100 разбавления и инкубировать в течение 30-40 мин при 4 градусах Цельсия в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
  4. Дважды вымойте образцы в буфере FACS. Для каждой стирки добавьте 1 мл буфера FACS, аккуратно вихрь, и центрифуга на 400 х г в течение 5 минут, resuspend в 350 л буфера FACS и добавить DAPI (1 ММ, окончательная концентрация). Образцы теперь готовы для анализа/сортировки FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Описанный протокол позволяет отделять макрофаги от мыши и миокарда человека. Используя тот же протокол, но с другой стратегией окрашивания и гатинга, стромальные клетки также могут быть собраны из миокарда человека. Результаты FACS, представленные здесь, были приобретены либо на платформе BD LSRII, либо на платформе BD FACS ARIA III. Компенсационный контроль был сформирован из одного цветоконтроля образцов из окрашенных спленоцитов. На рисунке 1 показано необработанное и обработанное ядро LVAD человека. На рисунке 2 показана схема gating для сортировки потока CCR2- и CCR2- человеческих макрофагов. На рисунке 3А показана схема gating для CD45- стромальных клеток из человеческого миокарда, а на рисунке 3B показаны изображения окрашенных ВСУ Райта, отсортированных CD45и CD45- клеток. Рисунок 4 описывает схему gating для сортировки макрофагов из сердца мыши.

Figure 1
Рисунок 1: Ядро ткани LVAD человека до и после обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Схема цитометрии потока, используемая для выявления и характеристики популяций сердечного макрофага в расширенной кардиомиопатии (DCM) или ишемической кардиомиопатии (ICM) образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Схема цитометрии потока, чтобы изолировать CD45- и CD45и стромальные клетки из образцов человека. (A) Поток цитометрии gating схема используется для изоляции CD45- стромальные клетки из человека ишемической кардиомиопатии (ICM) или расширенной кардиомиопатии (DCM) образцов. (B) Райт окрашенных FACS отсортированы CD45- и CD45- клетки. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Схема цитометрии потока, чтобы изолировать различные подмножества макрофагов от сердца мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Антигена Флюрофор Клон Производителя
CD45 PercpCy5.5 2D1 Биолегенда
CD64 FITC 10.1 Биолегенда
CD14 Pe M5E2 Биолегенда
CCR2 БТР или BV421 K036C2 Биолегенда
MHCII APC/Cy7 L243 Биолегенда
ДРАЗ5 Термо Фишер
ДАПИ Термо Фишер

Таблица 1: Панель антител для образца миокарда человека.

Антигена Флюрофор Клон Производителя
CD45 PercpCy5.5 30-F11 Биолегенда
CD64 Apc X54-5/7.1 Биолегенда
Ly6G PE/Cy7 1A8 Биолегенда
Ly6C FITC HK1.4 Биолегенда
CCR2 BV421 SA203G11 Биолегенда
MHCII APC/Cy7 M5/114.15.2 Биолегенда
ДРАЗ5 Термо Фишер
ДАПИ Термо Фишер

Таблица 2: Панель антител для образца сердца мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол позволяет извлечения различных подмножеств макрофагов из миокарда человека. Протокол прост и занимает от 3 до 4 часов, чтобы подготовить одноклеточную подвеску, готовую к анализу FACS. Хотя протокол относительно прост в исполнении, есть определенные технические аспекты, которые необходимо учитывать, что позволит свести к минимуму изменчивость. Во-первых, для оптимальной жизнеспособности клеток необходима своевременная работа с человеческими тканями. Важно держать ткань в холодном сольном/HBSS для того чтобы свести к минимуму смерть клетки. Также необходимо удалить эпикардиальный жир и другие соединительные ткани из образца миокарда. Последовательное измельчение тканей и время пищеварения уменьшит образец для изменения образца.

Существует как внутрианализ, так и межанализовая изменчивость в пищеварении тканей и последующих клеточных урожаев. Это одно из ограничений при подготовке одноклеточной подвески из тканей. Наиболее важным способом свести к минимуму это является обеспечение того, чтобы ферменты были относительно новыми, правильно алицитированными и хранились при -80 градусах Цельсия. Aliquots следует использовать только один раз и не должны быть сохранены или заморожены снова. Ферменты, используемые чувствительны к замораживанию циклов оттепели. Другим соображением является температура пищеварения и скорость встряхивания. Использование термостата-управляемого шейкера, который равномерно распределяет тепло, помогает свести к минимуму изменчивость пищеварения и повысить жизнеспособность клеток.

Важно отметить, что абсолютный выход макрофагов из миокарда человека, как правило, не очень высок. Обычно выход клеток колеблется от 20 000 до 50 000 евро на 1200-1500 мг ткани. Это становится сложной задачей, когда желаемый метод анализа ниже по течению включает анализы клеточной культуры. Фагоцитоз, производство хемокина/цитокина, стимуляция клеток, морфометрия и анализ экспрессии генов (микроаррей, секвенирование РНК и секвенирование одноклеточной РНК) могут быть легко выполнены. Качество ткани также определяет легкость пищеварения и последующий выход клеток. Если ткань волокнистая и рубцовая, эффективность пищеварения является неоптимальной, и выход макрофагов, вероятно, будет очень низким.

Другим аспектом, чтобы рассмотреть, что пищеварение тканей миокарда приводит к значительному образованию мусора. Это приводит к тому, что гранулы кажутся свободными. Таким образом, нужно быть осторожным, чтобы не отказаться от супернатанта во время мытья шаги простым декантированием. Использование всасывания / вакуумных отходов сбора колбы с пастерной пипеткой для сбора супернатанта рекомендуется. Кроме того, поддержание центрифуги при 4 градусах по Цельсию поможет свести к минимуму гибель клеток и потерю образца.

Хотя этот протокол описывает способ извлечения макрофагов из образцов тканей миокарда человека, успешная изоляция подмножеств макрофагов также может быть достигнута из сердца мышей без значительных изменений или изменений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Этот проект стал возможным благодаря финансированию, предоставленному Детским институтом открытий Вашингтонского университета и Детской больницей Сент-Луиса (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Фондом Барнс-Еврейской больницы (8038-88) и NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. поддерживается NIH K08 HL123519 и Берроуз Добро пожаловать фонда (1014782).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conocal Tubes Thermo Fisher 14-959-53A
40 µm Cell Strainers Thermo Fisher 50-828-736
50 mL Conical Tubes Thermo Fisher 352098
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Bovine Serum Albumin Sigma A2058
Collagenase 1 Sigma C0130-1G
DAPI Thermo Fisher D1306
DMEM 1x Gibco 11965-084
DNAse 1 Sigma D4527-20KU
DRAQ5 Thermo Fisher 62251
EDTA 0.5 M pH 8 Corning 46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M)
Fetal Bovine Serum Gibco A3840201
Forceps VWR 82027-406
HBSS 1x Gibco 14175-079
Hemostats VWR 63042-052
Hyaluronidase type 1-s Sigma H3506-500MG
PBS 1x Gibco 14190-136
Petri dishes Thermo Fisher 172931
Razor Blade VWR 55411-050
Scissors VWR 82027-578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
  2. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  3. Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
  4. Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  5. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  6. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  7. Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
  8. Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
  9. Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
  10. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 154 макрофаги человеческое сердце цитометрия потока сердечная недостаточность стромальные клетки сердце мыши
Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bajpai, G., Lavine, K. J. IsolationMore

Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens. J. Vis. Exp. (154), e60015, doi:10.3791/60015 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter