Summary
Burada sunulan enzimatik sindirim yoluyla tek bir hücre süspansiyon hazırlayarak makrofajlar ve diğer bağışıklık dışı hücrelerin çeşitli alt kümeleri insan ve fare miyokardiyum izole etmek için bir protokoldür. Akış sitometrisine dayalı tanımlama ve izole makrofajların karakterizasyonu için gating şemaları da sunulmuştur.
Abstract
Makrofajlar kalpteki en heterojen ve bol immün hücre popülasyonlarını temsil eder ve kardiyak yaralanma sonrası inflamasyon ve reparative yanıtları yönlendirmede merkezi dir. Makrofajların çeşitli alt kümelerinin kardiyak yaralanma sonrası bağışıklık yanıtlarını nasıl düzenlediği aktif bir araştırma alanıdır. Burada sunulan basit bir protokol bizim laboratuvar rutin olarak gerçekleştirir, fare ve insan miyokard örnekleri sağlıklı ve hastalıklı bireylerden elde makrofajların çıkarılması için. Kısaca, bu protokol tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için kardiyak doku enzimatik sindirim içerir, antikor boyama takip, ve akış sitometri. Bu teknik, sıralanmış hücrelerde yapılan fonksiyonel tahlillerin yanı sıra toplu ve tek hücreli RNA dizilimi için uygundur. Bu protokolün en büyük avantajı, sadeliği, günlük değişim ve çeşitli fare modelleri ve insan hastalığı varlıklar arasında makrofaj heterojenite sinin araştırılmasına olanak sağlayan geniş uygulanabilirliktir.
Introduction
Makrofajlar kalpte en bol bağışıklık hücre tipi temsil, ve onlarkardiyak yaralanma1,2,3,4aşağıdaki sağlam inflamatuar ve reparative yanıtlar üreten önemli rol oynamaktadır. Daha önce, grubumuz farklı gelişimsel kökenlerden elde edilen murin kalp makrofajlar iki büyük alt kümesi tespit5,6. Genel olarak, doku yerleşik kardiyak makrofaj alt kümelerinin farklı popülasyonları CCR2'nin hücre yüzey ekspresyonuna göre tanımlanabilir (C-C motifli kemokin reseptörü 2). CCR2- makrofajlar (hücre yüzey ekspresyonu: CCR2-MHCIIdüşük ve CCR2-MHCIIyüksek)embriyonik kökenlidir (ilkel ve eritromiyeloid soylar), kendini yenilemek mümkün, ve homeostatik koşullar altında baskın bir popülasyon temsil. Resident CCR2+ makrofajlar kesin hematopoetik kökenlidir, dolaşan monositlerden işe alım yoluyla korunur ve homeostatik koşullar altında küçük bir popülasyonu temsil eder. Fonksiyonel olarak, CCR2- makrofajlar minimal inflamasyon oluşturmak ve koroner gelişim neonatal kalp rejenerasyonu için kritikolan 5,7. Buna karşılık, CCR2+ makrofajlar kardiyak hakaret ler aşağıdaki sağlam inflamatuar yanıtlar başlatmak ve teminat kardiyomiyosit yaralanmasıkatkıda, sol ventrikül olumsuz remodeling, ve kalp yetmezliği ilerlemesi8,9.
Son zamanlarda, insan miyokardiyum da makrofajlar iki farklı alt kümesi ya CCR2olarak tanımlanan - ya da CCR2+8içerdiğini göstermiştir. Gen ekspresyonu ve fonksiyonel analizler, insan CCR2- ve CCR2+ makrofajlar fonksiyonel olarak farklı alt kümeleri temsil ve fonksiyonel CCR2 benzer olduğunu ortaya- ve CCR2+ makrofajlar fare kalp bulundu. İnsan CCR2- makrofajlar IGF1, PDGF, Cyr61 ve HB-EGF gibi güçlü büyüme faktörleri düzeylerini ifade eder. CCR2+ makrofajlar il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 ve TNF-a gibi iltihabı teşvik kemokinler ve sitokinler zenginleştirilmiştir. Uyarılmış CCR2+ makrofajlar kültürde inflamatuar sitokin interlökin-1β (IL-1β) belirgin olarak daha yüksek seviyelerde salgılarlar. Bu alt kümelerin doku onarımına nasıl farklı katkıda bulunduğu ve kardiyak yaralanma bağlamında sol ventrikül (LV) remodeling'in aktif bir araştırma alanı olduğu durmaktadır.
Fare ve insan kalbinde makrofaj heterojenite akış-sitometri tabanlı analizi kardiyak doku sindirerek ve akış sitometrik analiz veya hücre sıralama gibi toplu RNA sıralama / tek hücreli RNA sıralama veya fonksiyonel tahliller için hücreleri kültüre gibi daha fazla aşağı süreçleri için takip tek bir hücre süspansiyon oluşturma gerektirir. Murine kalplerden tek bir hücre süspansiyon yapmak için orijinal protokol ilk Nahrendorf grup tarafından Nahrendorf ve ark 200710 bildirilmiştir. Laboratuarımız protokolü insan miyokardiyumundan makrofajları çıkarmak için uyarladı ve değiştirdi. Aynı protokolü kullanarak ancak boyama ve gating düzeni hafif değişiklik ile, CD45- insan miyokardinden stromal hücreleri de hasat edilebilir. Burada sunulan, metin ve video, insan miyokardinden makrofajveya stromal çıkarılması için rutin olarak yapılan bir protokoldür.
Kardiyak doku örnekleri dilate kardiyomiyopati (DCM: idiyopatik veya ailesel) veya iskemik kardiyomiyopati (ICM) sol ventrikül yardımcı cihaz (LVAD) implantasyonu veya kardiyak transplantasyon geçiren erişkin hastalardan elde edilir. Ekskedeki kalpler veya LVAD çekirdekleri sindirim işlemine başlamadan önce intravasküler olarak soğuk tuzlu ile perfüzyonlanır. Yara izi veya yağ dokusu infiltrasyonu derecesi açısından belirlenen doku örneğinin "kalitesi"nin makrofajların verimini büyük ölçüde etkileyebileceği unutulmaması gerekir. Büyük yara izi alanlarına sahip kalp örnekleri çok daha düşük hücre verime sahip olacak ve istenilen downstream analiz yöntemleri in vitro hücre culturing gerektirdiğinde ciddi teknik sınırlama lar oluşturabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sunulan protokol Washington Üniversitesi tarafından St. Louis Kurumsal İnceleme Kurulu (#201305086) tarafından onaylanmıştır. Tüm denekler numune toplamadan önce bilgilendirilmiş onay sağlar ve deneyler onaylı çalışma protokolüne uygun olarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilir ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklanan yönergelere uyar.
1. İnsan Kardiyak Doku Örneklerinin Hazırlanması
- Flush sol ve sağ koroner arter ostia cannulating tarafından kalpleri explanted ve soğuk tuzlu 200 mL ile perfüzyon.
- Floş LVAD apikal korse dokular bir epikardiyal damar cannulating ve soğuk tuzlu 50 mL ile perfuse.
- Steril bir makas kullanarak soğuk tuzlu veya HBSS sol ventrikül apikal veya lateral duvardan doku örneği diseksiyon.
- Dikkatle epikardiyal yağ ve kordateniye ince makas kullanarak örnekten dışarı incelemek.
- Steril bir bıçak veya makas yardımıyla yaklaşık 200 mg ağırlığında parçalar halinde doku parçaları diseksiyon.
2. Fare Kalp Hazırlanması
- CO2 boğulma veya servikal çıkış ile fare ötenazi.
- Keskin makas yardımı ile göğüs boşluğu açın. Kalbi yukarı kaldırmak için künt hemostatlar kullanın. 5 mL şırıngaya bağlı 25 G iğne kullanarak kalbi soğuk PBS ile donatürün. Kalp renkli görünene kadar perfuse.
- Buz üzerinde steril bir Petri kabında kalp ve yer çıkarın.
3. Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması
- Steril petri kabına insan kardiyak doku parçaları (~200 mg) veya murin kalbi yerleştirin. Steril bir bıçak veya makas kullanarak dokuyu ince ince doğrama.
- Sindirim ayarlayın:
- İnsan kardiyak doku parçası başına 3 mL (200 mg) veya bir murine kalp başına son sindirim hacmi kullanın. Son enzim konsantrasyonları şunlardır: Kollajenaz1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidaz (60 U/mL).
- Her sindirim reaksiyonu için 15 mL konik tüp dmem ve tüm enzimleri ekleyin. Temiz forceps yardımıyla, her reaksiyon tüpü içine ince kıyılmış doku yerleştirin. Nazik girdap ile iyice karıştırın.
- 37 °C'de 1 saat boyunca, düşük ve orta ajitasyon hızına ayarlanmış bir titreyen kuvözde 1 saat boyunca sindirin.
- Sindirim 1 saat sonra, kuvöz tüpleri almak ve buz üzerinde yerleştirin. 50 mL konik tüpleri ve üzeri 40 μm hücreli süzgeç ayarlayın. Filtreleri 2 mL enzim devre dışı (ED) tamponu ile ısla.
- Her sindirim tüpüne 8 mL ED tampon ekleyerek sindirim enzimlerini etkisiz hale getirin. Daha sonra elde edilen 13 mL toplam karışımı 40 m hücreli süzgeçten 50 mL konik tüplere dökün. Numuneleri taze 15 mL konik tüpe aktarın. Bu, en uygun hücre peletleme sağlar ve santrifüj sırasında hücre kaybını en aza indirir.
- Örnekleri 400 x g'de 6 dk (Santrifüj 4 °C olarak ayarlanır) döndürün. 0,5 mL ortam bırakarak supernatant atın. Hücre peletini hafif pipetleme ile yeniden askıya alın ve 1 mL ACK lysis tamponu ekleyin. Yavaşça tüp girdap ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kırmızı kan hücresi (RBC) lysis gerçekleştirmek için kuluçka.
- ACK tamponunda 5 dk sonra örneğe 9 mL DMEM ekleyin. Kapağı tüplere geri koyun ve tüpleri karıştırmak için yavaşça ters çevirin ve 40 μm hücreli bir süzgeçten süzün. 15 mL konik tüpler de filtrat toplamak.
- Tüpleri 400 x g'de 6 dk için santrifüj edin ve süpernatantatın.
- 1 mL FACS arabelleği ekleyin ve peleti yeniden askıya alın. Daha sonra FACS tamponundaki hücrelerde 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 5 dk. 400 x g'da tekrar santrifüj edin. Tek hücreli süspansiyon antikor boyama için hazır.
4. Antikor Boyama
- Tipik bir insan antikor paneli aşağıdaki antikorlardan oluşur: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Lütfen Tablo 1'ebakın. 1:50 seyreltme de kalp örneklerine tüm antikorları ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de ~30-40 dk kuluçkaya yatırın. Aşağıdaki adım 4.4'e geçin.
- Stromal hücreler (endotel hücreleri, fibroblast, düz kas hücreleri) için DRAQ5 (1 μM son konsantrasyon) ve CD45-percpCy5.5 ekleyin. Lütfen Tablo 1'ebakın. Karanlıkta 4 °C'de 30 dk kuluçka. Aşağıdaki adım 4.4'e geçin.
- Murine kalp makrofajları için aşağıdaki antikorları ekleyin: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 ve Ly6G-FITC. Lütfen Tablo 2'yebakın. 1:100 seyreltme ve karanlıkta 4 ° C ~30-40 dakika kuluçka kalp örneklerine tüm antikorlar ekleyin. Aşağıdaki adım 4.4'e geçin.
- Örnekleri FACS arabelleğinde iki kez yıkayın. Her yıkama için, 5 dakika için 400 x g'de 1 mL FACS tampon, hafifçe girdap ve santrifüj ekleyin, 350 μL FACS arabelleği nde yeniden askıya alın ve DAPI ekleyin (1 μM, son konsantrasyon). Örnekler artık FACS analizi/sıralaması için hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan protokol, makrofajların fare ve insan miyokardyumundan izole edilmesine olanak sağlar. Aynı protokolü kullanarak, ancak farklı bir boyama ve gating stratejisi ile, stromal hücreleri de insan miyokardiyum dan hasat edilebilir. Burada sunulan FACS sonuçları BD LSRII veya BD FACS ARIA III platformunda elde edilmiş. Lekeli splenositlerden alınan tek renk kontrol örneklerinden kompansasyon kontrolleri oluşturuldu. Şekil 1 işlenmemiş ve işlenmiş insan LVAD çekirdeğini gösterir. Şekil 2 CCR2 akış sıralama için gating düzeni gösterir- ve CCR2+ insan makrofajlar. Şekil 3A CD45 için gating şeması gösterir- insan miyokard ve Şekil 3B stromal hücreleri Wright lekeli FACS cd45+ ve CD45- hücrelerin görüntüleri gösterir. Şekil 4, makrofajları fare kalbinden sıralamak için gating şemasını açıklar.
Şekil 1: İşlem öncesi ve sonrasında insan LVAD doku çekirdeği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dilate kardiyomiyopati (DCM) veya iskemik kardiyomiyopati (ICM) örneklerinde kardiyak makrofaj popülasyonlarını tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan akış sitometri gating şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CD45ve CD45+ stromal hücreleri insan örneklerinden izole etmek için akış sitometri gating şeması. (A) Cd45 izole etmek için kullanılan akış sitometri gating şeması- insan iskemik kardiyomiyopati stromal hücreleri (ICM) veya dilate kardiyomiyopati (DCM) örnekleri. (B) Wright lekeli FACS cd45 sıralanmış- ve CD45+ hücreleri. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fare kalbinden çeşitli makrofaj alt kümelerini yalıtmak için akış sitometri gating şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antijen | Florofor | Klon | Üretici |
| CD45 | PercpCy5.5 | 2D1 | Biolegend |
| CD64 | FITC | 10.1 | Biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Biolegend |
| CCR2 | APC veya BV421 | K036C2 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | Biolegend |
| DRAQ5 | Termo Balıkçı | ||
| Demir | Termo Balıkçı |
Tablo 1: İnsan miyokardiyum örneği için antikor paneli.
| Antijen | Florofor | Klon | Üretici |
| CD45 | PercpCy5.5 | 30-F11 | Biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Biolegend |
| Ly6C | FITC | HK1.4 | Biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend |
| DRAQ5 | Termo Balıkçı | ||
| Demir | Termo Balıkçı |
Tablo 2: Fare kalp örneği için antikor paneli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol insan miyokardinden çeşitli makrofaj alt kümelerinin çıkarılmasına izin verir. Protokol basittir ve TEK hücreli süspansiyonun FACS analizine hazır hazırlanması 3 ila 4 saat sürer. Protokolün gerçekleÅ tirilmesi nispeten basit olsa da, değişkenliÄ i en aza indirecek bazı teknik yÃ1/4rÃ1/4tÃ1/4ler de vardır. Öncelikle, insan dokusu ile zamanında çalışma optimal hücre canlılığı için gereklidir. Hücre ölümünü en aza indirmek için dokuyu soğuk tuzlu/HBSS'de tutmak önemlidir. Ayrıca miyokardiyal örnek epikardiyal yağ ve diğer bağ dokusu kaldırmak için gereklidir. Tutarlı doku kıyma ve sindirim süreleri örnek varyasyon örnek azaltacaktır.
Doku sindirimlerinde ve sonraki hücre verimlerinde hem intra-dosay hem de inter-assay değişkenliği vardır. Bu dokulardan tek bir hücre süspansiyon hazırlanmasında sınırlamalar biridir. Bunu en aza indirmenin en önemli yolu enzimlerin nispeten yeni, düzgün bir şekilde aliquoted ve -80 °C'de depolanmış olduğundan emin olmaktır. Aliquots tek seferlik kullanılmalı ve tekrar kaydedilmemeli veya dondurulmamalıdır. Kullanılan enzimler çözülme döngülerini dondurmaya duyarlıdır. Başka bir husus sindirim sıcaklığı ve titreme hızıdır. Eşit ısı dağıtır bir termostat kontrollü shaker kullanarak sindirim değişkenliğini en aza indirmek ve hücre canlılığını artırmak için yardımcı olur.
İnsan miyokardlarından makrofajların mutlak veriminin genellikle çok yüksek olmadığını belirtmek önemlidir. Genellikle hücre verimi doku 1.200-1.500 mg başına ~ 20.000 ila 50.000 toplam makrofajlar arasında değişir. İstenilen downstream analiz yöntemi hücre kültürü tahlillerini içerdiğinde bu zorlaşır. Fagositoz, kemokin/sitokin üretimi, hücre stimülasyonu, morfometri ve gen ekspresyonu analizleri (mikrodizi, toplu RNA dizilemesi ve tek hücreli RNA dizilemesi) kolayca yapılabilir. Doku kalitesi de sindirim ve sonraki hücre verimi kolaylığını belirler. Doku fibröz ve yaralı ise, sindirim verimliliği suboptimal, ve makrofaj verimi çok düşük olması muhtemeldir.
Göz önünde bulundurulması gereken bir diğer yönü miyokard doku sindirimi önemli enkaz oluşumuna yol açar. Bu pelet gevşek görünmesine neden olur. Bu nedenle, basit dekanting tarafından yıkama adımları sırasında supernatant atmak için dikkatli olmak gerekir. Supernatant toplamak için bir Pasteur pipet ile bir emme / vakum atık toplama şişesi kullanılması tavsiye edilir. Ayrıca, 4 °C'de santrifüjün bakımı hücre ölümünü ve örnek kaybını en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
Bu protokol insan miyokarddoku örneklerinden makrofajları çıkarmanın bir yolunu tanımlasa da, makrofaj alt kümelerinin başarılı bir şekilde izolasyonu fare kalplerinden önemli değişiklikler veya değişiklikler yapılmadan da sağlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu proje, Washington Üniversitesi Çocuk Keşif Enstitüsü ve St. Louis Çocuk Hastanesi (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Barnes-Jewish Hastanesi Vakfı (8038-88) ve NHLBI (R01) tarafından sağlanan finansmanla mümkün olmuştur. HL138466, R01 HL139714). K.J.L. NIH K08 HL123519 ve Burroughs Karşılama Fonu (1014782) tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
