Summary
Præsenteret her er en protokol til at isolere forskellige undergrupper af makrofager og andre ikke-immunceller fra menneske og mus myokardiet ved at forberede en enkelt cellesuspension gennem enzymatisk fordøjelse. Gating ordninger for flow cytometri baseret identifikation og karakterisering af isolerede makrofager er også præsenteret.
Abstract
Makrofager repræsenterer de mest heterogene og rigelige immuncelle populationer i hjertet og er centrale i kørsel betændelse og reparative reaktioner efter hjerte skade. Hvordan forskellige undergrupper af makrofager orkestrat immunresponser efter hjerte skade er et aktivt område af forskning. Præsenteret her er en simpel protokol, som vores laboratorium udfører rutinemæssigt, til udvinding af makrofager fra mus og humant myokardiet prøver opnået fra raske og syge individer. Kort, denne protokol indebærer enzymatisk fordøjelse af hjernevæv til at generere en enkelt cellesuspension, efterfulgt af antistof farvning, og flow cytometry. Denne teknik er velegnet til funktionelle assays udført på sorterede celler samt bulk og enkelt celle RNA Sequencing. En stor fordel ved denne protokol er dens enkelhed, minimal dag til dag variation og bred anvendelighed tillader undersøgelse af makrofag heterogenitet på tværs af forskellige musemodeller og menneskelige sygdoms enheder.
Introduction
Makrofager repræsenterer den mest udbredte immuncelle type i hjertet, og de spiller en betydelig rolle i at generere robuste inflammatoriske og reparative reaktioner efter hjerte skade1,2,3,4. Tidligere identificerede vores gruppe to store undergrupper af makrofager i murine hjertet afledt af distinkte udviklingsmæssige oprindelser5,6. Bredt, forskellige populationer af væv residente hjerte makrofag undergrupper kan identificeres baseret på cellens overflade ekspression af CCR2 (C-C Motif chemokine receptor 2). CCR2- makrofager (celleoverflade udtryk: CCR2-MHCIIlav og CCR2-mhciihøj) er af embryonale oprindelse (primitive og erythromyeloid lineages), i stand til at selv forny, og repræsentere en dominerende befolkning under homeostatiske forhold. Residente CCR2+ makrofager er af endelig hæmatopoietisk oprindelse, opretholdes gennem rekruttering fra cirkulerende monocytter, og repræsenterer en mindre population under homeostatiske forhold. Funktionelt, CCR2- makrofager genererer minimal inflammation og er afgørende for koronar udvikling neonatal hjerte regenerering5,7. I modsætning hertil initierer CCR2+ makrofager robuste inflammatoriske reaktioner efter hjertets fornærmelser og bidrager til sikkerhedsstillelse kardiomyocyt skade, negativ remodeling af venstre ventrikel, og hjertesvigt progression8,9.
For nylig har vi vist, at det menneskelige myokardiet også indeholder to særskilte undergrupper af makrofager, der er identificeret på samme måde som enten CCR2- eller CCR2+8. Genekspression og funktionelle analyser afslørede, at humane CCR2- og CCR2+ makrofager repræsenterer funktionelt divergerende delsæt og er funktionelt analoge med CCR2- og CCR2+ makrofager, der findes i muse hjertet. Humane CCR2- makrofager udtrykker robuste niveauer af vækstfaktorer, herunder IGF1, PDGF, CYR61 og HB-EGF. CCR2+ makrofager er beriget med kemo okiner og cytokiner, der fremmer inflammation, såsom Il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 og TNF-a. Stimuleret CCR2+ makrofager udskiller markant højere niveauer af den inflammatoriske cytokin interleukin-1β (Il-1β) i kulturen. Hvordan disse undergrupper differentielt bidrage til vævsreparation og venstre ventrikel (LV) remodeling i forbindelse med hjerte skade er fortsat et område med aktiv forskning.
Flow-cytometri-baseret analyse af makrofag heterogenitet i mus og menneskelige hjerte kræver at fordøje hjertevæv og generere en enkelt cellesuspension efterfulgt af flow cytometrisk analyse eller celle sortering for yderligere downstream processer såsom bulk RNA sekventering/enkelt celle RNA sekventering eller dyrkning cellerne for funktionelle assays. Den oprindelige protokol for at gøre en enkelt cellesuspension fra murine hjerter blev først rapporteret af Nahrendorf gruppe i Nahrendorf et al. 200710. Vores laboratorium har tilpasset og modificeret protokollen til at udtrække makrofager fra den menneskelige myokardiet. Ved hjælp af samme protokol, men med mindre modifikation i farvning og gating ordning, kan CD45- stromale celler fra det menneskelige myokardiet også høstes. Præsenteret her, i tekst og video, er en protokol, der udføres rutinemæssigt til udvinding af makrofager eller stromale fra det menneskelige myokardiet.
Kardiale vævsprøver fås hos voksne patienter med dilateret kardiomyopati (DCM: idiopatisk eller familiær) eller iskæmisk kardiomyopati (ICM), der gennemgår implantation af venstre ventrikel assistent (LVAD) eller hjertetransplantation. Forklarende hjerter eller LVAD-kerner er Intravaskulært perfekteret med koldt saltvand, før fordøjelses proceduren påbegyndes. Det er vigtigt at bemærke, at "kvalitet" af væv prøve bestemt i form af ardannelse eller fedtvæv infiltration kan i høj grad påvirke udbyttet af makrofager. Hjerte prøver med store områder af ardannelse vil have meget lavere celle udbytte og kan udgøre en alvorlig teknisk begrænsning, når det ønskes downstream analysemetoder kræver in vitro-celledyrkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den forelagte protokol er blevet godkendt af Washington University i St. Louis institutionel revisions bestyrelse (#201305086). Alle forsøgspersoner giver informeret samtykke før prøveindsamlingen, og forsøgene udføres i overensstemmelse med den godkendte forsøgsprotokol. Den præsenterede protokol er udført med godkendelse af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg på Washington University School of Medicine og følger de retningslinjer, der er beskrevet i NIH guide til pleje og brug af forsøgsdyr.
1. klargøring af humane hjertevæv prøver
- Skyl det forklarende hjerte ved at kanyle den venstre og højre koronararterie Ostia og perfuse med 200 mL koldt saltvand.
- Skyl lvad apikale uden kernehus-vævet ved at kanyle et epicarurkar og perfuse med 50 ml koldt saltvand.
- Dissekere vævsprøven fra den apiske eller laterale væg af venstre ventrikel i koldt saltvand eller HBSS ved hjælp af en steril saks.
- Omhyggeligt dissekere epicardial fedt og chordae tendineae fra præparatet ved hjælp af fine saks.
- Dissect væv bidder i stykker vejer ca 200 mg med hjælp af en steril klinge eller saks.
2. forberedelse af muse hjerte
- Euthanize musen ved CO2 kvælning eller livmoderhals dislokation.
- Åbn brysthulen ved hjælp af skarp saks. Brug sløv produkter at løfte hjertet opad. Perfuse hjertet med kold PBS ved hjælp af en 25 G nål fastgjort til en 5 mL sprøjte. Perfuse indtil hjertet vises blankt i farve.
- Fjern hjertet og Placer den i en steril Petri skål på is.
3. klargøring af enkelt celle suspension
- Placer humane hjertevæv klumper (~ 200 mg) eller murine hjerte i en steril Petri skål. Fint hakkede vævet ved hjælp af en steril klinge eller saks.
- Konfigurer digestions:
- Brug en endelig fordøjelsesvolumen på 3 mL pr. humant hjertekarvæv (200 mg) eller per et murinhjerte. De endelige enzym koncentrationer er som følger: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), hyaluronidase (60 U/ml).
- For hver fordøjelses reaktion tilsættes DMEM og alle enzymer til et 15 mL konisk rør. Ved hjælp af rene pincet placeres det fint hakkede væv i hvert reaktions slange. Bland godt ved blid vortexing.
- Fordamper for 1 t ved 37 °C i en ryste inkubator indstillet til en lav til medium agitation hastighed.
- Efter 1 time af fordøjelsen, tage rørene ud fra inkubator og sted på is. Indstil 50 mL koniske rør med et 40 μm cellefilter foroven. Filtrene våd med 2 mL enzym deaktiverende (ED) buffer.
- Deaktivér fordøjelsesenzymerne ved at tilsætte 8 mL ED-buffer til hvert fordøjelses slange. Hæld derefter den resulterende 13 mL total blanding gennem 40 μm-celle sien i de 50 mL koniske rør. Prøverne føres tilbage i et frisk 15 mL konisk rør. Dette muliggør optimal celle pelletering og minimerer celle tabet under centrifugering.
- Prøverne centrifugeres ved 400 x g i 6 minutter (centrifuge ringen er ved 4 °c). Den supernatanten, som forlader 0,5 mL af mediet, kasseres. Resuspender celle pellet ved skånsom pipettering og tilsæt 1 mL ACK lysis-buffer. Drej forsigtigt røret og Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter for at udføre røde blodlegemer (RBC) lysis.
- Efter 5 min i ACK buffer tilsættes 9 mL DMEM til prøven. Sæt låget på rørene igen, og vend forsigtigt rørene om for at blande, og Filtrer gennem en 40 μm-celle-Strainer. Filtratet opsamles i 15 mL koniske rør.
- Centrifuger rørene ved 400 x g i 6 min. og kassér supernatanten.
- Tilsæt 1 mL FACS-buffer, og genopsæt pellet. Derefter overføres i cellerne i FACS-bufferen til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Centrifugeres igen ved 400 x g i 5 min. kassér supernatanten, og resuspender pellet i 100 ΜL FACS-buffer. En enkelt cellesuspension er nu klar til antistof farvning.
4. antistof farvning
- Et typisk humant antistof panel består af følgende antistoffer: CD45-PercpCy 5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Se venligst tabel 1. Tilsæt alle antistoffer til hjerte prøverne ved 1:50 fortynding og Inkuber for ~ 30-40 min ved 4 °C i mørke. Fortsæt til trin 4,4 nedenfor.
- For stromale celler (endotelceller, fibroblast, glatte muskelceller) tilsættes DRAQ5 (1 μM endelig koncentration) og CD45-percpCy 5.5. Se venligst tabel 1. Inkuber i 30 minutter ved 4 °C i mørke. Fortsæt til trin 4,4 nedenfor.
- For murine hjerte makrofager tilføje følgende antistoffer: CD45-PercpCy 5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, og Ly6G-FITC. Se venligst tabel 2. Tilsæt alle antistoffer til hjerte prøverne ved 1:100 fortynding og Inkuber for ~ 30-40 min ved 4 °C i mørke. Fortsæt til trin 4,4 nedenfor.
- Prøverne vaskes to gange i FACS-buffer. For hver vask tilsættes 1 mL FACS-buffer, forsigtigt vortex, og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter, gensuspenderes i 350 ΜL af FACS-buffer og tilsættes dapi (1 μM, endelig koncentration). Prøverne er nu klar til FACS analyse/sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokol tillader isolering af makrofager fra mus og humant myokardiet. Ved hjælp af den samme protokol, men med en anden farvning og gating strategi, kan stromale celler også høstes fra den menneskelige myokardiet. FACS resultater præsenteret her blev erhvervet enten på BD LSRII eller BD FACS ARIA III platform. Kompensations kontrol blev genereret fra enkelt farve kontrolprøver fra farvede splenocytter. Figur 1 viser ubehandlet og forarbejdet humant lvad-kerne. Figur 2 viser gating-ordningen for flow sortering af CCR2- og CCR2+ humane makrofager. Figur 3A viser gating-ordningen for CD45- stromale celler fra humant myokardiet og figur 3B viser billeder af Wright farvede FACS sorteret CD45+ og CD45- celler. Figur 4 beskriver gating-ordningen for at sortere makrofager fra et muse hjerte.
Figur 1: den humane LVAD-vævs kerne før og efter forarbejdningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: flow cytometri gating-ordningen anvendes til at identificere og karakterisere kardielle makrofag populationer i dilaterede kardiomyopati (DCM) eller iskæmisk kardiomyopati (ICM) prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: strømnings cytometri-gating-ordning til isolering af CD45- og CD45+ stromale celler fra humane prøver. A) flow cytometri-gating-ordningen anvendes til at isolere CD45- stromale celler fra humane iskæmiske KARDIOMYOPATI (ICM) eller dilaterede KARDIOMYOPATI (DCM) prøver. (B) Wright farvede FACS sorteret CD45- og CD45+ celler. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: strømnings cytometri-gating-ordning til isolering af forskellige makrofag-undergrupper fra muse hjertet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antigen | Fluoroforet | Klon | Producent |
| CD45 | PercpCy 5.5 | 2D1 | Biolegend |
| CD64 | FITC | 10,1 | Biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Biolegend |
| CCR2 | APC eller BV421 | K036C2 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabel 1: antistof panel til humant myokardium-præparat.
| Antigen | Fluoroforet | Klon | Producent |
| CD45 | PercpCy 5.5 | 30-F11 | Biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Biolegend |
| Ly6C | FITC | HK 1.4 | Biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabel 2: antistof panel for mus hjerte prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen giver mulighed for udvinding af forskellige makrofag undergrupper fra humant myokardiet. Protokollen er enkel og tager 3 til 4 timer til at forberede enkelt cellesuspension klar til FACS analyse. Selv om protokollen er relativt enkel at udføre, er der visse tekniske aspekter, der skal overvejes, som vil minimere variabilitet. For det første er det nødvendigt at arbejde rettidigt med humant væv for at opnå optimal cellelevedygtighed. Det er vigtigt at holde vævet i koldt saltvand/HBSS for at minimere celledød. Det er også nødvendigt at fjerne epicardial fedt og andre bindevæv fra Myokardie præparat. Konsekvent vævs hakning og fordøjelsestid vil reducere prøven til prøve variation.
Der er både intra-assay og Inter-assay variabilitet i vævs digestions og efterfølgende celle udbytter. Dette er en af begrænsningerne i at forberede en enkelt cellesuspension fra væv. Den vigtigste måde at minimere dette på er ved at sikre, at enzymer er relativt nye, korrekt aliciteret, og opbevares ved-80 °C. Aliquoter bør kun anvendes én gang og bør ikke gemmes eller fryses igen. Anvendte enzymer er følsomme over for fryse tø-cyklusser. En anden overvejelse er temperaturen af fordøjelsen og ryste hastigheden. Brug af en Termostatstyret Shaker, der fordeler varmen jævnt, hjælper med at minimere fordøjelsesvariabiliteten og forbedrer cellernes levedygtighed.
Det er vigtigt at nævne, at det absolutte udbytte af makrofager fra humant myokardiet generelt ikke er særlig højt. Normalt varierer celle udbyttet fra ~ 20.000 til 50.000 samlede makrofager pr. 1200-1500 mg væv. Dette bliver udfordrende, når den ønskede downstream-analysemetode involverer cellekultur analyser. Fagocytose, chemokine/cytokin produktion, celle stimulation, morphometry, og genekspression analyser (microarray, bulk RNA sekvensering, og enkelt celle RNA Sequencing) kan let udføres. Kvaliteten af vævet bestemmer også den lethed af fordøjelsen og efterfølgende celle udbytte. Hvis vævet er fibrøst og arret, fordøjelsen effektivitet er suboptimal, og makrofag udbytte er sandsynligvis meget lav.
Et andet aspekt at overveje, er, at Myokardie væv fordøjelsen fører til betydelig snavs dannelse. Dette får pellet til at fremstå løs. Således skal man være omhyggelig med ikke at kassere supernatanten under vask trin ved simpel decanting. Det tilrådes at anvende en opsamlings kolbe til sugning/vakuum affald med en Pasteur-pipette til opsamling af supernatanten. Vedligeholdelse af centrifugen ved 4 °C vil også medvirke til at minimere celledød og prøve tab.
Selv om denne protokol beskriver en måde at udtrække makrofager fra humane myokarvæv prøver, vellykket isolering af makrofag undergrupper kan også opnås fra mus hjerter uden væsentlige ændringer eller modifikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev muliggjort ved finansiering fra children's Discovery Institute of Washington University og St. Louis children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Foundation of Barnes-Jewish Hospital (8038-88), og NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. understøttes af NIH K08 HL123519 og Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
