Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om verschillende subgroepen van macrofagen en andere niet-immuuncellen van mens en muis myocardium te isoleren door het voorbereiden van een enkelvoudige celsuspensie door enzymatische spijsvertering. Gating schema's voor flow cytometrie gebaseerde identificatie en karakterisering van geïsoleerde macrofagen worden ook gepresenteerd.
Abstract
Macrofagen vertegenwoordigen de meest heterogene en overvloedige immuuncelpopulaties in het hart en zijn centraal in het aansturen van ontstekingen en reparatieve reacties na hart letsel. Hoe verschillende subgroepen van macrofagen de immuunresponsen na hart letsel indelen is een actief gebied van onderzoek. Hier gepresenteerd is een eenvoudig protocol dat ons lab routinematig uitvoert, voor de extractie van macrofagen uit muizen en menselijke myocardium specimens verkregen uit gezonde en zieke individuen. Kort, dit protocol omvat enzymatische vertering van hartweefsel voor het genereren van een enkelvoudige cel suspensie, gevolgd door antilichaam kleuring, en flow cytometrie. Deze techniek is geschikt voor functionele assays uitgevoerd op gesorteerde cellen, evenals bulk en single cell RNA sequencing. Een groot voordeel van dit protocol is de eenvoud, de minimale variatie van de dag tot de dag en de brede toepasbaarheid, waardoor macrofaag heterogeniteit kan worden onderzocht in verschillende Muismodellen en menselijke ziekte-entiteiten.
Introduction
Macrofagen vertegenwoordigen het meest overvloedige immuunceltype in het hart, en ze spelen een belangrijke rol bij het genereren van robuuste inflammatoire en reparatieve reacties na hart letsel1,2,3,4. Voorheen identificeerde onze groep twee belangrijke deelverzamelingen van macrofagen in het muriene hart, afgeleid van de verschillende ontwikkelings oorsprong5,6. In het algemeen kunnen verschillende populaties van weefsel Resident cardiale macrofaag subgroepen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van het celoppervlak van CCR2 (C-C motief Chemokine receptor 2). CCR2- macrofagen (celoppervlak expressie: CCR2-mhciilaag en CCR2-mhciihoog) zijn van embryonale oorsprong (primitieve en erytromyeloïde lijnen), in staat om zichzelf te verlengen, en vertegenwoordigen een dominante populatie onder homeostatische voorwaarden. Resident CCR2+ macrofagen zijn van definitieve hematopoietische oorsprong, worden onderhouden door werving van circulerende monocyten, en vertegenwoordigen een kleine populatie onder homeostatische voorwaarden. Functioneel, CCR2- macrofagen genereren minimale ontsteking en zijn van cruciaal belang voor coronaire ontwikkeling neonatale hart regeneratie5,7. Daarentegen, CCR2+ macrofagen initiëren robuuste inflammatoire reacties na cardiale beledigingen en bijdragen tot onderpand hartspier letsel, nadelige renovatie van de linker ventrikel, en hartfalen progressie8,9.
Onlangs hebben we aangetoond dat het menselijk myocardium ook twee afzonderlijke subsets van macrofagen bevat die op dezelfde manier worden geïdentificeerd als CCR2- of CCR2+8. Genexpressie en functionele analyses toonden aan dat humane CCR2- en CCR2+ macrofagen functioneel uiteenlopende deelverzamelingen vertegenwoordigen en FUNCTIONEEL analoog zijn aan CCR2- en CCR2+ macrofagen die in het hart van de muis worden aangetroffen. Human CCR2- macrofagen Express robuuste niveaus van groeifactoren, waaronder IGF1, Pdgf, CYR61 en HB-EGF. CCR2+ macrofagen zijn verrijkt in chemokines en cytokinen die ontstekingen bevorderen, zoals Il-1B, Il-6, CCL-2, CCL-7 en TNF-a. Gestimuleerd CCR2+ macrofagen afscheiden duidelijk hogere niveaus van de inflammatoire cytokine Interleukine-1β (Il-1β) in cultuur. Hoe deze subsets differentieel bijdragen aan weefselherstel en linker ventriculaire (LV) remodellering in het kader van hart letsel blijft een gebied van actief onderzoek.
Flow-cytometrie gebaseerde analyse van macrofaag heterogeniteit in de muis en menselijk hart vereist het verteren van het hartweefsel en het genereren van een enkelvoudige celsuspensie gevolgd door flowcytometrische analyse of celsortering voor verdere downstream processen zoals bulk RNA sequencing/single cell RNA sequencing of kweek de cellen voor functionele assays. Het oorspronkelijke protocol voor het maken van een eencellige suspensie van Murine Hearts werd voor het eerst gerapporteerd door Nahrendorf Group in Nahrendorf et al. 200710. Ons lab heeft het protocol aangepast en aangepast om macrofagen uit het menselijk myocardium te halen. Met behulp van hetzelfde protocol, maar met een kleine wijziging in kleuring en gating schema, kunnen CD45- stromale cellen uit het menselijk myocardium ook worden geoogst. Hier gepresenteerd, in tekst en video, is een protocol dat routinematig wordt uitgevoerd voor de extractie van macrofagen of stromale uit het menselijk myocardium.
Monsters van het hartweefsel worden verkregen van volwassen patiënten met gedilateerde cardiomyopathie (DCM: idiopathische of familiaire) of ischemische cardiomyopathie (ICM) die een linker ventriculaire hulpinrichting (LVAD) implantatie of harttransplantatie ondergaan. Explanted Hearts of LVAD cores zijn intravasculair geperfundeerd met koude zoutoplossing voorafgaand aan het starten van de spijsvertering procedure. Het is belangrijk op te merken dat "kwaliteit" van weefsel specimen bepaald in termen van de mate van littekenvorming of vetweefsel infiltratie kan grote invloed hebben op de opbrengst van macrofagen. Hart specimens met grote gebieden van littekens zullen veel lagere celopbrengst hebben en kunnen ernstige technische beperkingen inhouden wanneer gewenst downstream analysemethoden in vitro celculturing vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gepresenteerde protocol is goedgekeurd door de Washington University in de St. Louis institutioneel Review Board (#201305086). Alle proefpersonen bieden geïnformeerde toestemming vóór de monsterverzameling en de experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde studie protocol. Het gepresenteerde protocol wordt uitgevoerd met de goedkeuring van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité aan de Washington University School of Medicine en volgt de richtlijnen die zijn beschreven in de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. bereiding van menselijke hartweefsel specimens
- Spoel de explanted harten door het cannuleren van de linker en rechter coronaire slagader Ostia en Parfumerende met 200 mL koude zoutoplossing.
- Spoel LVAD apicale gecored weefsels door een epicarbel vat te cannuleren en Parfumerende met 50 mL koude zoutoplossing.
- Dissect tissue specimen van de apicale of laterale wand van de linker ventrikel in koude zoutoplossing of HBSS met behulp van een steriele schaar.
- Zorgvuldig ontleden epicardial vet en tendineae tendineae uit het preparaat met behulp van fijne schaar.
- Ontleden weefsel stukjes in stukken met een gewicht van ongeveer 200 mg met behulp van een steriel mes of een schaar.
2. voorbereiding van de muis hart
- Euthanaseren de muis door co2 verstikking of cervicale dislocatie.
- Open de borstholte met behulp van een scherpe schaar. Gebruik botte hemostatica om het hart omhoog te tillen. Parfumeer het hart met koude PBS met een 25 G naald bevestigd aan een 5 mL spuit. Parfuseren totdat het hart wordt geblancheerde in kleur.
- Verwijder het hart en plaats in een steriele Petri schaal op ijs.
3. voorbereiding van eencellige suspensie
- Plaats menselijke hartweefsel brokken (~ 200 mg) of muriene hart in een steriele Petri schaal. Het weefsel fijnmaken met een steriel mes of een schaar.
- De digestonen instellen:
- Gebruik een laatste digestie volume van 3 mL per menselijk hartweefsel Brok (200 mg) of per één Murine hart. De uiteindelijke enzym concentraties zijn als volgt: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), hyaluronidase (60 U/mL).
- Voeg voor elke digestie reactie DMEM en alle enzymen toe aan een conische buis van 15 mL. Plaats het fijngehakte weefsel met behulp van een schone Tang in elke reactie buis. Meng goed door het zacht vortexeren.
- Verteren voor 1 uur bij 37 °C in een schud incubator die is ingesteld op een lage tot gemiddelde roersnelheid.
- Na 1 uur van de spijsvertering, neem de buizen uit de incubator en plaats op ijs. Instellen van 50 mL conische buizen met een 40 μm cel zeef bovenop. Bevochtig de filters met 2 mL enzym deactiveringsbuffer (ED).
- Deactiveer de verteringsenzymen door 8 mL ED-buffer toe te voegen aan elke vergistings buis. Giet vervolgens het resulterende 13 mL totaal mengsel door de 40 μm celzeef in de conische buizen van 50 mL. Breng de monsters terug in verse 15 mL conische buis. Dit maakt optimale celpelleting mogelijk en minimaliseert celverlies tijdens het centrifugeren.
- Draai de monsters bij 400 x g gedurende 6 minuten (centrifuge set bij 4 °c). Gooi de supernatant weg die 0,5 mL media verlaat. Rebreng de celpellet door voorzichtig pipetteren en voeg 1 mL ACK lysisbuffer toe. Zwenk de buis voorzichtig en inbroed gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcel (RBC) lysis uit te voeren.
- Na 5 min in ACK buffer, voeg 9 mL van DMEM aan het monster. Zet het deksel weer op de buizen en keer de buizen voorzichtig om door te mengen en filtreer door een 40 μm celzeef. Verzamel het filtraat in conische buisjes van 15 mL.
- Centrifugeer de buisjes op 400 x g gedurende 6 minuten en gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 mL FACS buffer toe en regeef de pellet. Breng vervolgens de cellen in de FACS buffer over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer opnieuw bij 400 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en revoer de pellet in 100 ΜL FACS buffer. Een eencellige suspensie is nu klaar voor antilichaam kleuring.
4. antilichaam kleuring
- Een typisch humaan antilichaam paneel bestaat uit de volgende antilichamen: CD45-PercpCy 5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Zie tabel 1. Voeg alle antilichamen toe aan de hart monsters bij 1:50 verdunning en inincuberen voor ~ 30-40 min bij 4 °C in het donker. Ga verder naar stap 4,4 hieronder.
- Voor stromale cellen (endotheel cellen, fibroblast, gladde spiercellen), voeg DRAQ5 (1 μM eindconcentratie) en CD45-percpCy 5.5. Zie tabel 1. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Ga verder naar stap 4,4 hieronder.
- Voor muriene hart macrofagen voegen de volgende antilichamen: CD45-PercpCy 5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, en Ly6G-FITC. Zie tabel 2. Voeg alle antilichamen toe aan de hart monsters bij 1:100 verdunning en inincuberen voor ~ 30-40 min bij 4 °C in het donker. Ga verder naar stap 4,4 hieronder.
- Was de monsters tweemaal in de FACS buffer. Voeg voor elke wasbeurt 1 mL FACS buffer toe, zachtjes Vortex, en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten, respendeer in 350 ΜL FACS buffer en voeg DAPI toe (1 μM, uiteindelijke concentratie). Samples zijn nu klaar voor FACS analyse/sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschreven protocol maakt isolatie van macrofagen van muis en humaan myocardium mogelijk. Met behulp van hetzelfde protocol, maar met een andere kleuring en gating strategie, kunnen stromale cellen ook worden geoogst uit het menselijk myocardium. FACS resultaten gepresenteerd hier werden verkregen ofwel op BD LSRII of BD FACS ARIA III platform. Compensatie controles werden gegenereerd uit enkele kleur controlemonsters van gekleurd splenocyten. Afbeelding 1 toont onbewerkte en verwerkte menselijke LVAD core. Figuur 2 toont het gating-schema voor de stroom sortering van CCR2- en CCR2+ menselijke macrofagen. Figuur 3A toont het gating-schema voor CD45- stromale cellen uit humaan myocardium en figuur 3B toont beelden van door Wright gebeitste FACS gesorteerd CD45+ en CD45- cellen. Figuur 4 beschrijft het gating-schema om macrofagen van een muis hart te sorteren.
Figuur 1: de menselijke LVAD weefsel kern voor en na de verwerking. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Flowcytometrie gating schema gebruikt om te identificeren en karakteriseren cardiale macrofaag populaties in verwijde cardiomyopathie (DCM) of ischemische cardiomyopathie (ICM) specimens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: flow cytometrie gating schema te isoleren vanCD45- en CD45+ stromale cellen van menselijke monsters. (A) Flowcytometrie gating schema gebruikt om CD45- stromale cellen te isoleren van menselijke ischemische cardiomyopathie (ICM) of verwijde cardiomyopathie (DCM) specimens. B) Wright gekleurd FACS GESORTEERDE CD45- en CD45+ cellen. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: flowcytometry gating schema om verschillende macrofaag subsets te isoleren van het hart van de muis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Antigeen | De | Kloon | Fabrikant |
| CD45 | PercpCy 5.5 | 2D1 | Baan biolegend |
| CD64 | Fitc | 10,1 | Baan biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Baan biolegend |
| CCR2 | APC of BV421 | K036C2 | Baan biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | Baan biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabel 1: antilichaam paneel voor humaan myocardium specimen.
| Antigeen | De | Kloon | Fabrikant |
| CD45 | PercpCy 5.5 | 30-F11 | Baan biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Baan biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Baan biolegend |
| Ly6C | Fitc | HK 1.4 | Baan biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Baan biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Baan biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabel 2: antilichaam panel voor muis hart specimen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol maakt de extractie mogelijk van verschillende macrofaag subgroepen van humaan myocardium. Het protocol is eenvoudig en duurt 3 tot 4 uur om de eencellige suspensie klaar te maken voor FACS-analyse. Hoewel het protocol relatief eenvoudig is uit te voeren, zijn er bepaalde technische aspecten die moeten worden overwogen, waardoor de variabiliteit wordt beperkt. Ten eerste, werken in tijdige mode met menselijk weefsel is noodzakelijk voor een optimale levensvatbaarheid van de cel. Het is belangrijk om te houden van het weefsel in koude zoutoplossing/HBSS om celdood te minimaliseren. Het is ook noodzakelijk om epicardial vet en ander bindweefsel uit het myocardiale specimen te verwijderen. Consistente weefsel gehakt-en verterings tijden verminderen de monster variatie.
Er is zowel intra-assay als interassay variabiliteit in weefsel digestons en daaropvolgende celopbrengsten. Dit is een van de beperkingen in de voorbereiding van een enkele cel schorsing van weefsels. De belangrijkste manier om dit te minimaliseren is door ervoor te zorgen dat enzymen relatief nieuw zijn, correct worden geciteerd en worden opgeslagen bij-80 °C. Aliquots mogen slechts één keer worden gebruikt en mogen niet opnieuw worden opgeslagen of bevroren. Gebruikte enzymen zijn gevoelig voor Vries ontdooien cycli. Een andere overweging is de temperatuur van de spijsvertering en trillende snelheid. Het gebruik van een thermostaat gestuurde Shaker die warmte gelijkmatig verdeelt, helpt de spijsvertering variabiliteit te minimaliseren en de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren.
Het is belangrijk om te vermelden dat de absolute opbrengst van macrofagen uit menselijk myocardium over het algemeen niet erg hoog is. Meestal varieert de celopbrengst van ~ 20.000 tot 50.000 totale macrofagen per 1200-1500 mg weefsel. Dit wordt een uitdaging wanneer de gewenste downstream-analysemethode betrekking heeft op de celcultuur-testen. Fagocytose, Chemokine/cytokine-productie, celstimulatie, morphometrie en genexpressie analyses (Microarray, bulk RNA-sequencing en single cell RNA-sequencing) kunnen eenvoudig worden uitgevoerd. De kwaliteit van het weefsel bepaalt ook het gemak van de spijsvertering en de daaropvolgende celopbrengst. Als het weefsel vezeliger en Scarred, spijsvertering efficiëntie is suboptimaal, en macrofaag opbrengst waarschijnlijk zeer laag.
Een ander aspect om te overwegen is dat de spijsvertering van myocardiale weefsel leidt tot aanzienlijke puin vorming. Dit zorgt ervoor dat de pellet los te verschijnen. Zo moet men voorzichtig zijn om de supernatant niet te verwijderen tijdens de wasstappen door eenvoudig decanteren. Met behulp van een zuig-/vacuüm afvalinzamel kolf met een Pasteur-pipet om het supernatant te verzamelen, is het raadzaam. Ook zal het onderhoud van de centrifuge bij 4 °C helpen om de celdood en het monsterverlies te minimaliseren.
Hoewel dit protocol een manier beschrijft om macrofagen uit menselijke myocardiale weefselmonsters te extraheren, kan succesvolle isolatie van macrofaag subsets ook worden bereikt met muis harten zonder belangrijke wijzigingen of aanpassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd mogelijk gemaakt door financiering van het Children's Discovery Institute van Washington University en St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Stichting van het Barnes-Jewish Hospital (8038-88) en de NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. wordt ondersteund door NIH K08 HL123519 en Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
