Summary
Présenté ici est un protocole pour isoler divers sous-ensembles de macrophages et d'autres cellules non immunisées du myocarde humain et de souris en préparant une suspension de cellules simples par la digestion enzymatique. Des schémas de gating pour l'identification et la caractérisation basées sur la cytométrie de flux sont également présentés.
Abstract
Les macrophages représentent les populations de cellules immunitaires les plus hétérogènes et abondantes dans le cœur et sont au cœur de l'inflammation et des réponses réparatrices après une blessure cardiaque. La façon dont divers sous-ensembles de macrophages orchestrent les réponses immunitaires après une lésion cardiaque est un domaine de recherche actif. Présenté ici est un protocole simple que notre laboratoire effectue régulièrement, pour l'extraction des macrophages à partir de spécimens de myocarde de souris et de myocardes humains obtenus à partir d'individus sains et malades. En bref, ce protocole implique la digestion enzymatique du tissu cardiaque pour générer une suspension de cellules simples, suivie de la coloration d'anticorps, et de la cytométrie de flux. Cette technique convient aux essais fonctionnels effectués sur les cellules triées ainsi qu'au séquençage de l'ARN en vrac et à cellule unique. Un avantage majeur de ce protocole est sa simplicité, la variation minimale au jour le jour et la grande applicabilité permettant l'étude de l'hétérogénéité macrophage à travers divers modèles de souris et entités de maladie humaine.
Introduction
Les macrophages représentent le type de cellules immunitaires le plus abondant dans le cœur, et ils jouent un rôle significatif dans la génération de réponses inflammatoires et réparatrices robustes à la suite d'une blessure cardiaque1,2,3,4. Auparavant, notre groupe a identifié deux sous-ensembles principaux de macrophages dans le coeur murine dérivé des origines développementales distinctes5,6. De façon générale, des populations distinctes de sous-ensembles de macrophage cardiaque résident dans les tissus peuvent être identifiées en fonction de l'expression de surface cellulaire de CCR2 (récepteur c-C motif c. chimiokine 2). CCR2- macrophages (expression de surface cellulaire: CCR2-MHCIIfaible et CCR2-MHCIIélevé) sont d'origine embryonnaire (lignées primitives et érythro-éloïdes), capable de se renouveler, et représentent une population dominante dans des conditions homéostatiques. Les macrophages cCR2résidents sont d'origine hématopoïétique définitive, sont maintenus par le recrutement de monocytes circulants, et représentent une population mineure dans des conditions homéostatiques. Fonctionnellement, CCR2- macrophages génèrent une inflammation minimale et sont critiques pour le développement coronaire régénération cardiaque néonatale5,7. En revanche, les macrophages CCR2initient des réponses inflammatoires robustes à la suite d'insultes cardiaques et contribuent à des lésions cardiomyocytes collatérales, à un remodelage défavorable du ventricule gauche et à une progression de l'insuffisance cardiaque8,9.
Récemment, nous avons montré que le myocarde humain contient également deux sous-ensembles distincts de macrophages identifiés de la même façon que soit CCR2- ou CCR28. L'expression génique et les analyses fonctionnelles ont révélé que les macrophages CCR2- et CCR2- humains représentent des sous-ensembles fonctionnellement divergents et sont fonctionnellement analogues auxmacrophages CCR2et CCR2 - trouvés dans le cœur de souris. CCR2 humain- les macrophages expriment des niveaux robustes de facteurs de croissance, y compris IGF1, PDGF, Cyr61, et HB-EGF. Les macrophages CCR2sont enrichis en chimiokines et cytokines qui favorisent l'inflammation, comme il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 et TNF-a. Les macrophages stimulés cCR2et sécrétifs sécrètent des niveaux nettement plus élevés de l'interleukine-1 inflammatoire de cytokine -1 (IL-1) dans la culture. La façon dont ces sous-ensembles contribuent différemment à la réparation des tissus et à la remodelage ventriculaire gauche (VL) dans le contexte des lésions cardiaques demeure un domaine de recherche active.
L'analyse basée sur la cytométrie de flux de l'hétérogénéité macrophage dans la souris et le coeur humain exige digérer le tissu cardiaque et produire une suspension de cellules simples suivie d'analyse cytométrique de flux ou de tri de cellules pour d'autres processus en aval tels que le séquençage en vrac d'ARN/séquençage d'ARN de cellules simples ou la culture des cellules pour des essais fonctionnels. Le protocole original pour faire une suspension de cellule simple des coeurs murineont ont été d'abord rapportés par le groupe de Nahrendorf dans Nahrendorf et autres 200710. Notre laboratoire a adapté et modifié le protocole pour extraire les macrophages du myocarde humain. En utilisant le même protocole, mais avec une légère modification dans la coloration et le schéma de gating, CD45- cellules stromales du myocarde humain peut également être récolté. Présenté ici, en texte et en vidéo, est un protocole qui est effectué régulièrement pour l'extraction de macrophages ou stromal à partir du myocarde humain.
Des spécimens de tissu cardiaque sont obtenus des patients adultes présentant la cardiomyopathie dilatée (DCM : idiopathique ou familiale) ou la cardiomyopathie ischémique (ICM) subissant l'implantation gauche d'appareil ventriculaire (LVAD) ou la transplantation cardiaque. Les cœurs explantés ou les noyaux de LVAD sont perfusés intravasculairement avec la saline froide avant de commencer la procédure de digestion. Il est important de noter que la « qualité » des échantillons de tissus déterminés en termes de degré de cicatrisation ou d'infiltration de tissu adipeux peut grandement affecter le rendement des macrophages. Les spécimens de coeur avec de grandes zones de cicatrice scarring auront le rendement beaucoup plus bas de cellules et peuvent poser la limitation technique sérieuse quand les méthodes désirées d'analyse en aval exigent la culture in vitro de cellules.
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Protocol
Le protocole présenté a été approuvé par l'Université de Washington à St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Tous les sujets donnent un consentement éclairé avant la collecte de l'échantillon et les expériences sont effectuées conformément au protocole d'étude approuvé. Le protocole présenté est exécuté avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de la Washington University School of Medicine et suit les lignes directrices décrites dans le Guide des NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation de spécimens de tissus cardiaques humains
- Rincer les cœurs explantés en cannisant l'ostie de l'artère coronaire gauche et droite et perfuser avec 200 ml de salin froid.
- Rincer les tissus acentraux de LVAD en cannisant un vaisseau épicardique et perfuser avec 50 ml de salin froid.
- Disséquer le spécimen de tissu de la paroi apicale ou latérale du ventricule gauche dans le salin froid ou HBSS utilisant un ciseaux stérile.
- Disséquez soigneusement la graisse épicardique et les tendineed d'accords du spécimen à l'aide de ciseaux fins.
- Disséquer les morceaux de tissu en morceaux pesant environ 200 mg à l'aide d'une lame stérile ou de ciseaux.
2. Préparation du coeur de souris
- Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 ou dislocation cervicale.
- Ouvrez la cavité thoracique à l'aide de ciseaux pointus. Utilisez des hemostats émoussés pour soulever le cœur vers le haut. Perfuser le cœur avec du PBS froid à l'aide d'une aiguille de 25 G attachée à une seringue de 5 ml. Persiblejusqu'à ce que le cœur semble blanchi en couleur.
- Retirer le cœur et le placer dans un plat stérile Petri sur la glace.
3. Préparation de la suspension à cellule unique
- Placer les morceaux de tissu cardiaque humain (200 mg) ou le cœur murine dans un plat stérile Petri. Hacher finement le tissu à l'aide d'une lame stérile ou de ciseaux.
- Configurez les digestions :
- Utilisez un volume de digestion final de 3 ml par morceau de tissu cardiaque humain (200 mg) ou par cœur murine. Les concentrations finales d'enzymes sont les suivantes : Collagène1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
- Pour chaque réaction de digestion ajouter DMEM et toutes les enzymes à un tube conique de 15 ml. À l'aide de forceps propres, placez le tissu finement haché dans chaque tube de réaction. Bien mélanger par un vortex doux.
- Digester pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur secouant réglé à une vitesse d'agitation faible à moyenne.
- Après 1 h de digestion, sortir les tubes de l'incubateur et les placer sur la glace. Mettre en place des tubes coniques de 50 ml avec une passoire cellulaire de 40 m sur le dessus. Mouillez les filtres avec 2 ml de tampon de désactivation enzymatique (ED).
- Désactiver les enzymes de digestion en ajoutant 8 ml de tampon ED à chaque tube de digestion. Verser ensuite le mélange total de 13 ml qui en résulte à travers la passoire à cellules de 40 m dans les tubes coniques de 50 ml. Transférer les échantillons dans un tube conique frais de 15 ml. Cela permet de granulés cellulaires optimaux et minimise la perte cellulaire pendant la centrifugation.
- Faire tourner les échantillons à 400 x g pendant 6 min (Centrifuge fixé à 4 oC). Jeter le supernatant en laissant 0,5 mL de support. Resuspendre la pastille cellulaire par pipetilage doux et ajouter 1 ml de tampon de lyse ACK. Faites tourbillonner doucement le tube et incubez à température ambiante pendant 5 minutes pour effectuer la lyse des globules rouges (RBC).
- Après 5 min dans le tampon ACK, ajouter 9 ml de DMEM à l'échantillon. Remettre le couvercle sur les tubes et inverser délicatement les tubes pour mélanger, et filtrer à travers une passoire à cellules de 40 m. Recueillir le filtrate dans des tubes coniques de 15 ml.
- Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 6 min et jeter le supernatant.
- Ajouter 1 mL de tampon FACS et resuspendre le granule. Transférer ensuite dans les cellules du tampon FACS dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifuge à nouveau à 400 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 100 'L de FACS Buffer. Une suspension à cellule unique est maintenant prête pour la coloration des anticorps.
4. Staining d'anticorps
- Un panneau d'anticorps humain typique se compose des anticorps suivants : CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Veuillez consulter le tableau 1. Ajouter tous les anticorps aux échantillons de cœur à 1:50 dilution et couver pendant 30-40 min à 4 oC dans l'obscurité. Passez à l'étape 4.4 ci-dessous.
- Pour les cellules stromales (cellules endothéliales, fibroblaste, cellules musculaires lisses), ajoutez DRAQ5 (concentration finale de 1 M) et CD45-percpCy5.5. Veuillez consulter le tableau 1. Incuber pendant 30 min à 4 oC dans l'obscurité. Passez à l'étape 4.4 ci-dessous.
- Pour les macrophages cardiaques murins, ajoutez les anticorps suivants : CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 et Ly6G-FITC. Veuillez consulter le tableau 2. Ajouter tous les anticorps aux échantillons de cœur à 1:100 dilution et couver pendant 30-40 min à 4 oC dans l'obscurité. Passez à l'étape 4.4 ci-dessous.
- Laver les échantillons deux fois dans le tampon FACS. Pour chaque lavage, ajouter 1 mL de tampon FACS, vortex doucement, et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min, resuspendre dans 350 'L de tampon FACS et ajouter DAPI (1 M, concentration finale). Les échantillons sont maintenant prêts pour l'analyse et le tri FACS.
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Representative Results
Le protocole décrit permet l'isolement des macrophages de la souris et du myocarde humain. En utilisant le même protocole, mais avec une stratégie différente de coloration et de gating, les cellules stromales peuvent également être récoltées à partir du myocarde humain. Les résultats de FACS présentés ici ont été acquis soit sur la plate-forme BD LSRII ou BD FACS ARIA III. Des contrôles de compensation ont été produits à partir d'échantillons de contrôle de couleur unique des splenocytes souillés. La figure 1 montre le noyau lVD humain non traité et traité. La figure 2 montre le schéma de gating pour le tri des flux de CCR2- et CCR2- macrophages humains. La figure 3A montre le schéma de gating pour CD45- cellules stromales du myocarde humain et la figure 3B montre des images de Wright taché e CD45et CD45- cellules. La figure 4 décrit le schéma de gating pour trier les macrophages à partir d'un cœur de souris.
Figure 1 : Le noyau humain de tissu de LVAD avant et après traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Système de gating de cytométrie de flux utilisé pour identifier et caractériser les populations cardiaques de macrophage dans les spécimens dilatés de cardiomyopathie (DCM) ou de cardiomyopathie ischémique (ICM). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Schéma de gating de cytométrie de flux pour isoler les cellules CD45- et CD45et stromal à partir d'échantillons humains. (A) Système de gating cytométrie de flux utilisé pour isoler CD45- cellules stromales de la cardiomyopathie ischémique humaine (ICM) ou des spécimens dilatéde de cardiomyopathie (DCM). (B) Wright a souillé lescellules CD45- et CD45. Barres d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Schéma de gating de cytométrie de flux pour isoler divers sous-ensembles de macrophage du coeur de souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Antigène | Fluorophore | Clone | Fabricant |
| CD45 (en) | PercpCy5.5 PercpCy5.5 PercpCy5.5 Percp | 2D1 Annonces | Biolegend Biolegend |
| CD64 (en) | Fitc | 10.1 | Biolegend Biolegend |
| CD14 (en) | Pe | M5E2 (en) | Biolegend Biolegend |
| CCR2 (en) | APC ou BV421 | K036C2 K036C2 | Biolegend Biolegend |
| MHCII (en) | APC/Cy7 | L243 (L243) | Biolegend Biolegend |
| DRAQ5 (en) | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tableau 1 : Panneau d'anticorps pour spécimen de myocarde humain.
| Antigène | Fluorophore | Clone | Fabricant |
| CD45 (en) | PercpCy5.5 PercpCy5.5 PercpCy5.5 Percp | 30-F11 | Biolegend Biolegend |
| CD64 (en) | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend Biolegend |
| Ly6G (Ly6G) | PE/Cy7 | 1A8 Annonces | Biolegend Biolegend |
| Ly6C (En) | Fitc | HK1.4 (en) | Biolegend Biolegend |
| CCR2 (en) | BV421 BV421 (bv421) | SA203G11 | Biolegend Biolegend |
| MHCII (en) | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend Biolegend |
| DRAQ5 (en) | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tableau 2 : Panneau d'anticorps pour spécimen de coeur de souris.
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Discussion
Le protocole permet l'extraction de divers sous-ensembles de macrophages à partir du myocarde humain. Le protocole est simple et prend de 3 à 4 heures pour préparer une suspension à cellule unique prête pour l'analyse FACS. Bien que le protocole soit relativement simple à exécuter, il y a certains aspects techniques qui doivent être considérés qui minimiseront la variabilité. Tout d'abord, travailler en temps opportun avec les tissus humains est nécessaire pour une viabilité cellulaire optimale. Il est important de garder le tissu dans la saline froide /HBSS pour minimiser la mort cellulaire. Il est également nécessaire d'enlever la graisse épicardique et d'autres tissus conjonctifs du spécimen myocardique. Les temps constants de mincing et de digestion des tissus réduiront la variation de l'échantillon à l'échantillon.
Il y a à la fois la variabilité intra-analyse et inter-analyse dans les digestions de tissu et les rendements cellulaires suivants. C'est l'une des limitations dans la préparation d'une suspension à cellule unique des tissus. La façon la plus importante de minimiser cela est de s'assurer que les enzymes sont relativement nouvelles, correctement aliquoted, et stockés à -80 oC. Les Aliquots ne doivent être utilisés qu'une seule fois et ne doivent pas être conservés ou congelés à nouveau. Les enzymes utilisées sont sensibles aux cycles de dégel. Une autre considération est la température de la digestion et la vitesse de secousse. L'utilisation d'un shaker à thermostat qui répartit uniformément la chaleur aide à minimiser la variabilité de la digestion et à améliorer la viabilité cellulaire.
Il est important de mentionner que le rendement absolu des macrophages du myocarde humain n'est généralement pas très élevé. Habituellement, le rendement cellulaire varie de 20 000 à 50 000 macrophages totaux par 1 200 à 1 500 mg de tissu. Cela devient difficile lorsque la méthode d'analyse en aval souhaitée implique des tests de culture cellulaire. La phagocytose, la production de chimiokine/cytokine, la stimulation cellulaire, la morphométrie et les analyses d'expression génique (microarray, séquençage de l'ARN en vrac et séquençage de l'ARN à cellule unique) peuvent être facilement effectuées. La qualité du tissu détermine également la facilité de digestion et le rendement cellulaire subséquent. Si le tissu est fibreux et marqué, l'efficacité de digestion est sous-optimale, et le rendement de macrophage est susceptible d'être très bas.
Un autre aspect à considérer est que la digestion des tissus myocardiques conduit à la formation de débris importants. Cela provoque l'impression lâche de la pastille. Ainsi, il faut faire attention de ne pas jeter le supernatant pendant les étapes de lavage par simple décantation. Il est conseillé d'utiliser une fiole de collecte des déchets d'aspiration/vide avec une pipette Pasteur pour recueillir le supernatant. De plus, le maintien de la centrifugeuse à 4 oC aidera à réduire au minimum la mort cellulaire et la perte d'échantillon.
Bien que ce protocole décrit un moyen d'extraire des macrophages des échantillons de tissu myocardique humain, l'isolement réussi des sous-ensembles de macrophage peut également être réalisé des coeurs de souris sans changements significatifs ou modifications.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été rendu possible grâce à un financement du Children's Discovery Institute de l'Université de Washington et de l'Hôpital pour enfants st. Louis (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), de la Fondation de l'Hôpital juif Barnes (8038-88) et de l'NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. est soutenu par NIH K08 HL123519 et Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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