Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים ותאים אחרים שאינם חסינים מפני שריר הלב של האדם והעכבר על ידי הכנת תא השעיה יחיד באמצעות עיכול אנזימטי. מערכות המשך הזדהות לצורך זרימה cy, מבוססי זיהוי ואפיון של מקרופאגים מבודדים מוצגים גם.
Abstract
מקרופאגים מייצגים את אוכלוסיית התא הטרוגנית ביותר ושופע החיסונית בלב הם מרכזיים בנהיגה בדלקת ותגובות מענה לאחר פציעה לב. כיצד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים לארגן את התגובות החיסונית לאחר פגיעה בלב הוא תחום פעיל של מחקר. מוצג כאן הוא פרוטוקול פשוט כי המעבדה שלנו מבצעת באופן שגרתי, עבור החילוץ של מקרופאגים מן העכבר ושריר הלב האנושי באמצעות דגימות שהתקבלו מאנשים בריאים וחולים. בקצרה, פרוטוקול זה כרוך בעיכול אנזימטי של רקמת הלב כדי ליצור השעיה תא בודד, ואחריו כתמים נוגדן, ולזרום cy, לנסות. טכניקה זו מתאימה עבור בחני פונקציונלי שבוצעה על תאים ממוינים, כמו גם בצובר תאים בודדים RNA ברצף. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הפשטות שלה, יום מינימלי הווריאציה היום והישימות רחב המאפשר חקירה של מקרופאג טרוגניות על פני מודלים העכבר השונים ישויות המחלה האנושית.
Introduction
מקרופאגים מייצגים את הסוג הנפוץ ביותר התא החיסונית בלב, והם משחקים תפקידים משמעותיים ביצירת מענה דלקתי ומשנה תגובות בעקבות פגיעה לב1,2,3,4. בעבר, הקבוצה שלנו זיהה שתי קבוצות מערכות מרכזיות של מקרופאגים בליבו של מוראו נגזר ממקורותהתפתחותיים ברורים 5,6. באופן כללי, אוכלוסיות נפרדות של הרקמה תושב מקרופאג מערכות המשנה הלב יכול להיות מזוהה מבוסס על הביטוי משטח התא של CCR2 (C-C מוטיב קולטן כימוקין 2). CCR2- מקרופאגים (משטח התא ביטוי: CCR2-MHCIIנמוך ו CCR2-mhciiגבוה) הם של מוצא עובריים (פרימיטיבי ואריטרומטיות לינאואיד), מסוגל לחדש את עצמו, ולייצג אוכלוסייה דומיננטית תחת תנאים הומסטטיים. תושב CCR2+ מקרופאגים הם של מוצא מוחלט המטופאות, נשמרים באמצעות גיוס מתוך במחזור מונוציטים, ומייצגים אוכלוסיה קטין תחת תנאים הומסטטיים. פונקציונלית, CCR2- מקרופאגים ליצור דלקת מינימלית הם קריטיים להתפתחות כלילית בלב התחדשות הלב5,7. לעומת זאת, CCR2+ מקרופאגים ליזום תגובות דלקתיות חזקים בעקבות עלבונות לב ולתרום לפציעה קרדיולוגית מודלקת, שיפוץ לוואי של החדר השמאלי, ואת אי ספיקת לב התקדמות8,9.
לאחרונה, הצגנו שריר הלב האנושי גם מכיל שתי קבוצות מערכות נפרדות של מקרופאגים המזוהים באופן דומהגם CCR2 או CCR2+8. ביטוי גנים וניתוחים פונקציונליים חשף כי האדם CCR2- ו CCR2+ מקרופאגים לייצג תת מערכות מבחינה פונקציונלית ו הם אנלוגית פונקציונלית CCR2- ו CCR2 מקרופאגים נמצא בלב העכבר. האדם CCR2- מקרופאגים לבטא רמות עמידות של גורמי גדילה, כולל IGF1, Pdgf, Cyr61, ו-HB-egf. CCR2+ מקרופאגים מועשרים נוגדנים ו ציטוקינים המעודדים דלקת, כגון il-1b, il-6, ccl-2, ccl-7, ו-tnf-a. מגורה CCR2+ מקרופאגים להפריש רמות גבוהות במידה ניכרת של ציטוקינים דלקתיות interleukin-1β (IL-1β) בתרבות. כיצד ערכות המשנה הללו לתרום באופן מהותי לתיקון רקמות ושמאלית חדרית (LV) שיפוץ בהקשר של פציעה בלב נשאר שטח של מחקר פעיל.
זרימה-cyמקרופאג try ניתוח מבוסס של טרוגניות בעכבר וללב האדם דורש לעכל את רקמת הלב ויצירת השעיית תא יחיד ואחריו הניתוח cy, מיון התא עבור תהליכים נוספים במורד הזרם כגון בצובר ברצף RNA/תא יחיד RNA רצפי או culturing תאים עבור assays פונקציונלי. הפרוטוקול המקורי לביצוע השעיית תא בודד מלבבות מורדין דווחו לראשונה על ידי קבוצת נחרנדורף בנחדורף ואח '. 200710. המעבדה שלנו הותאמה ושינתה את הפרוטוקול לחלץ מקרופאגים משריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו אך עם שינוי קל בצביעת והערכה, התאים CD45- סטרומה משריר הלב האנושי וניתן גם לקצור. מוצג כאן, בטקסט ובווידאו, הוא פרוטוקול המתבצע באופן שגרתי עבור חילוץ של מקרופאגים או סטרומה משריר הלב האנושי.
דגימות של רקמות לב מתקבלים מחולים מבוגרים עם שריר הלב מורחבים (DCM: אידיופטית או משפחתית) או מחלת שריר הלב (ICM) שעברו שמאל חדרית לסייע המכשיר (LVAD) השרשה או השתלת לב. לבבות הסבר או ליבות LVAD הם בלתי מפותחים עם תמיסת מלח קר לפני תחילת תהליך העיכול. חשוב לציין כי "איכות" של הדגימה הרקמה נקבע במונחים של מידת צלקות או הסתננות רקמת שומן יכול מאוד להשפיע על התשואה של מקרופאגים. דגימות לב עם אזורים גדולים של צלקות יהיה הרבה יותר תאים התשואה הנמוכה והוא יכול להוות מגבלה טכנית רצינית כאשר הרצוי המטה ניתוח שיטות דורשים תא מתורבת culturing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול המוצג אושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בלוח הסקירה המוסדי של סנט לואיס (#201305086). כל הנושאים מעניקים הסכמה מושכלת לפני איסוף המדגם והניסויים מתבצעים בהתאם לפרוטוקול הלמידה המאושר. הפרוטוקול המוצג מבוצע עם אישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש באוניברסיטת וושינגטון בבית הספר לרפואה וכדלקמן ההנחיות המתוארות במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת דגימות של רקמת לב האדם
- פלאש הסבר לבבות על ידי cannulating השמאלי והימני של עורק העורקים הכליליים ואת מבשם עם 200 mL של תמיסת מלח קר.
- ריקון הרקמות האפימיות של LVAD על ידי canנולגאת כלי הקיבול ומבשם עם 50 mL של תמיסת מלח קר.
- מנתח רקמות הדגימה מן הקיר פסגה או לרוחב של החדר השמאלי בתמיסת מלח קר או hbss באמצעות מספריים סטרילי.
- בזהירות לנתח את שומן אפיארdial וכורתיים מתוך הדגימה באמצעות מספריים עדינים.
- נתח נתחי רקמות לחתיכות במשקל כ 200 מ ג עם עזרה של להב סטרילי או מספריים.
2. הכנת לב העכבר
- המתת חסד העכבר על ידי שיתוף2 חנק או נקע בצוואר הרחם.
- פתח את חלל החזה בעזרת מספריים חדים. השתמש במכשיר קהה. כדי להרים את הלב כלפי מעלה מבשם הלב עם ה-PBS הקרה באמצעות מחט של 25 גרם המצורפת למזרק של 5 מ ל. מעשה עד שהלב מופיע בצבע.
- הסר את הלב והמקום בצלחת פטרי סטרילית על הקרח.
3. הכנת תא יחיד הבולם
- מניחים נתחי רקמת לב אנושיים (~ 200 מ"ג) או לב מורין בצלחת פטרי סטרילית. שימוש דק ברקמה או במספריים סטריליים.
- הגדר את העיכול:
- השתמש בנפח העיכול הסופי של 3 מ ל לחלק רקמת הלב האנושית (200 mg) או ללב מורין אחד. ריכוזי האנזים הסופיים הם כדלקמן: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
- עבור כל תגובת עיכול להוסיף DMEM ואת כל האנזימים ל 15 מ"ל צינור חרוט. בעזרת מלקחיים נקיים, מניחים את הרקמה הקצוצה לתוך כל צינורית התגובה. מערבבים היטב על ידי הורטקנג עדין.
- מעכל עבור 1 h ב 37 ° c בחממה רועדת מוגדר מהירות נמוכה עד בינונית.
- לאחר 1 שעות של עיכול, להוציא את הצינורות מתוך החממה ומקום על הקרח. הגדר את 50 mL חרוט צינורות עם מסננת תא 40 יקרומטר על גבי. להרטיב את המסננים עם 2 מ ל של הפסקת אנזימים (ED) מאגר.
- לנטרל את אנזימי העיכול על ידי הוספת 8 מ ל של מאגר ED לכל צינור עיכול. לאחר מכן יוצקים את כתוצאה 13 ml שילוב כולל דרך מסננת תא 40 יקרומטר לתוך הצינורות החרוטי 50 mL. העבר את הדגימות חזרה בצינור החרוט החדש של 15 מ"ל. זה מאפשר להתאים את התא אופטימלית וממזער את אובדן התאים במהלך צנטריפוגה.
- לסובב את דגימות ב 400 x g עבור 6 דקות (צנטריפוגה להגדיר ב 4 ° c). להיפטר supernatant עוזב 0.5 mL של מדיה. השהה מחדש את הגלולה על ידי ליטוף עדין והוסף 1 mL של מאגר הליזה ACK. בעדינות מערבולת הצינור והדגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות לבצע הליזה תא דם אדום (RBC).
- לאחר 5 דקות במאגר ACK, הוסף 9 מ"ל של DMEM למדגם. לשים את המכסה בחזרה על הצינורות בעדינות להפוך את הצינורות לערבב, ולסנן דרך מסננת תא 40 יקרומטר. לאסוף את פילטרט ב 15 מ"ל שפופרות חרוט.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x g עבור 6 דקות ולהיפטר supernatant.
- הוסף 1 מ ל של מאגר FACS והשהה מחדש את הגלולה. לאחר מכן העבירו את התאים במאגר FACS לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. צנטריפוגה שוב ב 400 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב 100 μl של מאגר facs. השעיית תא בודד מוכן כעת לצביעת נוגדנים.
4. מכתים את הנוגדן
- פאנל הנוגדן האנושי טיפוסי מורכב של נוגדנים הבאים: CD45-PercpCy 5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. נא פנה לטבלה 1. הוסף את כל הנוגדנים לדגימות הלב ב-1:50 דילול ו-דגירה עבור ~ 30-40 דקות ב 4 ° c בחושך. המשך לשלב 4.4 למטה.
- עבור תאים סטרומה (תאים אנדותל, פיברובלסט, תאי שריר חלק), הוסף DRAQ5 (1 הריכוז הסופי μM) ו-CD45-percpCy 5.5. נא פנה לטבלה 1. המשך 30 דקות ב -4 ° c בחשכה. המשך לשלב 4.4 למטה.
- עבור מקרופאגים לב מורלין להוסיף את הנוגדנים הבאים: CD45-PercpCy 5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, ו Ly6G-FITC. . אנא פנה לשולחן 2 הוסף את כל הנוגדנים לדגימות הלב ב-1:100 דילול ו-דגירה עבור ~ 30-40 דקות ב 4 ° c בחושך. המשך לשלב 4.4 למטה.
- שטוף את הדגימות פעמיים במאגר FACS. עבור כל כביסה, להוסיף 1 מ ל של מאגר FACS, בעדינות מערבולת, ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות, להשעות מחדש ב 350 μl של מאגר facs ולהוסיף dapi (1 μm, ריכוז סופי). הדגימות מוכנות כעת לניתוח/מיון של FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול תיאר מאפשר בידוד של מקרופאגים מהעכבר ושריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו, אבל עם כתמים שונים האסטרטגיה לאחר הפעולה, התאים סטרומה יכול גם להיות נקצרו משריר הלב האנושי. תוצאות FACS המוצגות כאן נרכשו על פלטפורמת השלישי BD או BD. שולטת הפיצוי נוצרו מדגימות של בקרת צבע אחת מתוך הטחול מוכתם. איור 1 מציג את הליבה האנושית של lvad לא מעובד. איור 2 מציג את התוכנית לאחר מיון הזרימה של CCR2- and CCR2+ מקרופאגים אנושיים. איור 3מראה את התוכנית של הCD45- סטרומה תאים משריר הלב האדם והדמות 3ב מראה תמונות של רייט ויטראז מיון CD45+ ו CD45- תאים. איור 4 מתאר את סכימת הצבירה כדי למיין מקרופאגים מליבו של העכבר.
איור 1: הליבה של רקמת LVAD האנושית לפני ואחרי עיבוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הזרימה cy, לנסות לאתר את התוכנית מנוצל כדי לזהות ולאפיין אוכלוסיות מקרופאג לב מחלת שריר הלב (DCM) או איסכמי שריר הלב (ICM) דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזרימה cy, לנסות את התוכנית כדי לבודד CD45- and CD45+ מסטרומה תאים מדגימות אדם. (א) הזרימהcy, לנסות מערכת מנוצל כדי לבודד תאים CD45- סטרומה של מחלת שריר הלב האנושית (ICM) או מורחבים שריר הלב (dcm) דגימות. (ב) רייט ויטראז ' מיון CD45- and CD45+ תאים. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הזרימה cyמקרופאג try הערכה לבודד תת קבוצות מ שונות מלב העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
אנטיגן | פלואור | שיבוט | יצרן |
CD45 | PercpCy 5.5 | ענת שלמה | ביואגדה |
CD64 | מיכל הג | 10.1 | ביואגדה |
CD14 | PE | M5E2 | ביואגדה |
CCR2 | APC או BV421 | K036C2 | ביואגדה |
הוראות המשך | נגמ ש/Cy7 | L243 | ביואגדה |
DRAQ5 | תרמו פישר | ||
דאפי | תרמו פישר |
שולחן 1: פאנל נוגדן עבור הדגימה שריר הלב של האדם.
אנטיגן | פלואור | שיבוט | יצרן |
CD45 | PercpCy 5.5 | 30-F11 | ביואגדה |
CD64 | APC | X54-5/7.1 | ביואגדה |
Ly6G | PE/Cy7 | מיכל כהן | ביואגדה |
Ly6C | מיכל הג | HK 1.4 | ביואגדה |
CCR2 | BV421 | SA203G11 | ביואגדה |
הוראות המשך | נגמ ש/Cy7 | M5/114.15.2 | ביואגדה |
DRAQ5 | תרמו פישר | ||
דאפי | תרמו פישר |
שולחן 2: הפאנל נוגדן לדגימה לב העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול מאפשר חילוץ של תת קבוצות ממקרופאג שונות משריר הלב האנושי. הפרוטוקול הוא פשוט ולוקח 3 כדי 4 שעות כדי להכין ההשעיה תא יחיד מוכן ניתוח FACS. למרות שהפרוטוקול הוא פשוט יחסית לביצוע, ישנם היבטים טכניים מסוימים שצריך להיחשב שיצמצם את השונות. ראשית, עבודה בזמן האופנה עם רקמת האדם היא הכרחית עבור הכדאיות האופטימלית של תאים. חשוב לשמור את הרקמה מלוחים קר/HBSS כדי למזער את מוות התאים. יש צורך גם להסיר שומן אפיארדיאל ורקמת חיבור אחרים מתוך הדגימה שריר הלב. הרקמות וזמני העיכול העקביים של הרקמה תפחית את הדגימה מהווריאציה לדוגמה.
יש גם שינויים בתוך היישום ובשני הצדדים בעיכול ובתשואות התאים העוקבות. זוהי אחת המגבלות בהכנת השעיית תא בודד מרקמות. הדרך החשובה ביותר למזער זאת היא על-ידי הפיכת אנזימים בטוחים חדשים יחסית, מצוטט כראוי, ומאוחסנים ב-80 ° c. יש להשתמש ב-ali, בפעם אחת בלבד, ולא להינצל או לקפוא שוב. אנזימים המשמשים בשימוש רגישים להקפיא מחזורי ההפשרה. שיקול נוסף הוא טמפרטורת העיכול ומהירות הטלטול. שימוש בשייקר מבוקר תרמוסטט המפיץ באופן שווה את החום מסייע למזער את ההבדלים בעיכול ולשפר את הכדאיות בתאים.
חשוב לציין כי התשואה המוחלטת של מקרופאגים משריר הלב האנושי הוא בדרך כלל לא גבוה מאוד. בדרך כלל התשואה התא משתנה מ-~ 20,000 כדי 50,000 מקרופאגים הכולל לכל 1200-1500 מ ג של רקמות. זה הופך להיות מאתגר כאשר הרצוי במורד שיטת הניתוח כרוכה התרבות התא assays. Phagocyציטוזה, כימוקין/cyטוקין הייצור, הגירוי התא, לזמורמטריה, וניתוח גנים ביטוי (microarray, בצובר רצפי RNA, ו בודדת ברצף RNA תא) ניתן לבצע בקלות. איכות הרקמה גם קובעת את קלות העיכול ואת תפוקת התאים העוקבות. אם הרקמה היא סיבית ומצולקת, יעילות העיכול היא תת-אופטימלית, והתשואה המקרופאג עשויה להיות נמוכה מאוד.
היבט נוסף שיש לשקול הוא שעיכול רקמת שריר הלב מוביל להיווצרות פסולת משמעותית. זה גורם לגלולה להיראות רופף. לכן יש להקפיד שלא להשליך את הסופרנטנט במהלך שטיפת הצעדים באמצעות היין הפשוט. באמצעות שאיבה/פסולת אוסף בקבוקון עם הצינורות פסטר כדי לאסוף את הסופרנטאנט מומלץ. כמו כן, שמירה על הצנטריפוגה ב -4 ° c תסייע למזער את מוות התאים ואת ההפסד לדוגמה.
למרות פרוטוקול זה מתאר דרך לחלץ מקרופאגים מן האדם דגימות רקמה שריר הלב, בידוד מוצלח של קבוצות משנה מקרופאג יכול להיות גם מושגת מליבם של העכבר ללא שינויים משמעותיים או שינויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
פרויקט זה התאפשר על ידי מימון המסופק ממכון גילוי הילדים של אוניברסיטת וושינגטון וביה לילדים סנט לואיס (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), הקרן של בארנס-בית חולים יהודי (8038-88), ו NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. נתמך על ידי NIH K08 HL123519 ובורוז קרן ברוך הבא (1014782).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
Forceps | VWR | 82027-406 | |
HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
Hemostats | VWR | 63042-052 | |
Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).