Summary
ここで提示するプロトコルは、酵素消化を介して単一細胞懸濁液を調製することにより、マクロファージおよび他の非免疫細胞の様々なサブセットをヒトおよびマウスの心筋から単離するプロトコルである。単離されたマクロファージのフローサイトメトリーベースの同定および特性評価のためのゲーティングスキームも提示される。
Abstract
マクロファージは、心臓の中で最も異種で豊富な免疫細胞集団を表し、心損傷後の炎症および修復応答を駆動する中心的存在である。マクロファージの様々なサブセットが心損傷後の免疫応答をどのように調整するかについては、研究の活発な領域である。ここで提示されるのは、健康で病気の個体から得られたマウスおよびヒト心筋標本からのマクロファージの抽出のために、私たちの研究室が日常的に行う簡単なプロトコルです。簡単に言えば、このプロトコルは、単一細胞懸濁液を生成するために心臓組織の酵素消化を伴い、続いて抗体染色、およびフローサイトメトリーを生成する。この技術は、並べ替えられた細胞に対して行われる機能アッセイ、バルクおよび単一細胞RNAシーケンシングに適しています。このプロトコルの主な利点は、そのシンプルさ、日々の変動を最小限に抑え、広い適用性を備えており、さまざまなマウスモデルおよびヒト疾患エンティティにわたるマクロファージの不均一性を調査することができます。
Introduction
マクロファージは心臓の中で最も豊富な免疫細胞型を表し、心損傷1、2、3、4に続く堅牢な炎症および修復応答を生成する上で重要な役割を果たす。以前、私たちのグループは、異なる発達起源5、6に由来するマウス心臓におけるマクロファージの2つの主要なサブセットを同定した。広く、組織常駐心臓マクロファージサブセットの異なる集団は、CCR2(C−Cモチーフケモカイン受容体2)の細胞表面発現に基づいて同定することができる。CCR2-マクロファージ(細胞表面発現:CCR2-MHCII低およびCCR2-MHCII高)は胚起源(原始およびエリスロ骨髄系統)であり、自己再生することができ、恒主状態下で支配的な集団を表すことができる。居住者CCR2+マクロファージは、決定的な造血起源であり、循環単球からのリクルートを通じて維持され、恒静学的条件下でのマイナーな集団を表す。機能的には、CCR2-マクロファージは最小限の炎症を発生し、冠動脈発生新生児心臓再生5、7に不可欠である。対照的に、CCR2+マクロファージは、心侮辱に続いて強固な炎症反応を開始し、心筋細胞損傷、左心室の有害な改造、および心不全進行8、9に寄与する。
最近、ヒト心筋には、CCR2-またはCCR2+8のいずれかとして同様に同定されたマクロファージの2つの異なるサブセットも含まれていることが示されている。遺伝子発現および機能解析は、ヒトCCR2-およびCCR2+マクロファージが機能的に発散したサブセットを表し、マウス心臓に見られるCCR2およびCCR2+マクロファージに機能的に類似していることを明らかにした。ヒトCCR2-マクロファージは、IGF1、PDGF、Cyr61、およびHB-EGFを含む成長因子の堅牢なレベルを発現する。CCR2+マクロファージは、IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7、およびTNF-aなどの炎症を促進するケモカインおよびサイトカインに富む。刺激されたCCR2+マクロファージは、培養中の炎症性サイトカインインターロイキン-1β(IL-1β)の著しく高いレベルを分泌する。これらのサブセットが、心損傷の文脈における組織修復および左心室(LV)改造にどのように寄与するかを、依然として活発な研究の領域である。
マウスおよびヒト心臓におけるマクロファージ不均一性のフローサイトメトリーベースの分析では、心臓組織を消化し、単一細胞懸濁液を生成し、続いてバルクRNAシーケンシング/単一細胞RNAシーケンシングや機能アッセイのための細胞の培養などのさらなる下流プロセスのためのフローサイトメトリック分析または細胞選別を生成する必要があります。マウスの心臓から単一の細胞懸濁液を作るための元のプロトコルは、最初にナレンドルフらのナレンドルフグループによって報告されました 200710.私たちの研究室は、ヒト心筋からマクロファージを抽出するためにプロトコルを適応させ、改変しました。同じプロトコルを使用するが、染色およびゲーティングスキームにわずかな変更を加えて、ヒト心筋からの間質細胞のCD45も収穫することができる。ここで提示される、テキストおよびビデオにおいて、ヒト心筋からのマクロファージまたは間質の抽出のために日常的に行われるプロトコルである。
心臓組織標本は、拡張型心筋症(DCM:特発性または家族性)または虚血性心筋症(ICM)を受けた左心室補助装置(LVAD)移植または心臓移植を有する成人患者から得られる。励起された心臓またはLVADコアは、消化手順を開始する前に冷たい生理食リンで血管内に浸透する。瘢痕化または脂肪組織浸潤の程度の観点から決定される組織標本の「品質」は、マクロファージの収率に大きく影響を与えることができることに注意することが重要です。瘢痕の広い領域を有する心臓標本は、はるかに低い細胞収率を有し、所望の下流の分析方法がインビトロ細胞培養を必要とする場合に深刻な技術的制限を提起することができる。
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Protocol
提示されたプロトコルは、セントルイス機関審査委員会(#201305086)のワシントン大学によって承認されています。すべての被験者は、サンプル収集の前にインフォームド・コンセントを提供し、実験は承認された研究プロトコルに従って行われる。提示されたプロトコルは、ワシントン大学医学部の制度的動物ケアと使用委員会の承認を得て行われ、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに記載されているガイドラインに従います。
1. ヒト心臓組織標本の調製
- 左右の冠状動脈オスティアをカニューレして外れた心臓を洗い流し、200mLの冷たい生理食リンをパーフュージングする。
- 心膜血管をカニュールしてLVADアピカルコア組織をフラッシュし、50mLの冷たい生理線をパーフュージングします。
- 滅菌ハサミを用いて冷たい生理食塩糸またはHBSSの左心室の前壁または側壁から組織標本を解剖する。
- 細かいはさみを使用して、精心脂肪とコルダエテンディネアを慎重に解剖します。
- 滅菌ブレードやはさみの助けを借りて、約200mgの重量を量る部分に組織の塊を解剖します。
2. マウスハートの準備
- CO2窒息または子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
- 鋭いはさみの助けを借りて胸腔を開きます。鈍い止血を使用して心臓を上方に持ち上げます。5 mLの注射器に取り付けられた25 G針を使用して、冷たいPBSで心臓を熟読してください。心臓が色でブランチ表示されるまで、ペルフューズ。
- 心臓を取り除き、氷の上の無菌ペトリ皿に置きます。
3. 単一細胞懸濁液の調製
- ヒトの心臓組織チャンク(〜200mg)またはマウス心臓を無菌ペトリ皿に入れます。滅菌ブレードまたははさみを使用して組織を細かくミンチします。
- 消化を設定します。
- ヒト心臓組織チャンク(200mg)または1マウス心臓あたり3 mLの最終消化量を使用してください。最終的な酵素濃度は以下の通りです:コラゲナーゼ1(450 U/mL)、DNase1(60 U/mL)、ヒアルロニダーゼ(60 U/mL)。
- 各消化反応のために15 mL円錐管にDMEMおよびすべての酵素を加える。きれいな鉗子の助けを借りて、細かく細かく刻んだ組織を各反応管に入れます。穏やかな渦でよく混ぜます。
- 低~中攪拌速度に設定した振とうインキュベーターで37°で1時間の消化。
- 1時間消化した後、インキュベーターからチューブを取り出し、氷の上に置きます。上に40μmのセルストレーナーを備えた50mL円錐管を設置します。2 mL の酵素不活性化(ED)緩衝液でフィルターを濡らします。
- 各消化管に8mLのED緩衝液を加えて消化酵素を失活します。次に、得られた13 mLの全混合物を40μmの細胞ストレーナーを通して50 mL円錐管に注ぎます。サンプルを新鮮な15 mL円錐チューブに戻します。これは最適の細胞のペレットを可能にし、遠心分離の間の細胞損失を最小にする。
- サンプルを400 x gで6分間回転させます(遠心分離機を4°Cに設定)。0.5 mLのメディアを残して上清を捨てる。穏やかなピペットによって細胞ペレットを再サスペンドし、ACKリシスバッファーの1 mLを追加します。チューブを穏やかに旋回し、室温で5分間インキュベートし、赤血球(RBC)リシスを行います。
- ACKバッファに5分後、サンプルに9 mLのDMEMを追加します。蓋をチューブに戻し、チューブを軽く反転して混ぜ、40μmのセルストレーナーを通して濾過します。15 mL円錐形チューブで濾液を収集します。
- 400 x gでチューブを6分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 1 mL の FACS バッファを追加し、ペレットを再サスペンドします。次いで、FACS緩衝液中の細胞を1.5mLマイクロ遠心管に移す。再び400 x gで5分間、上清を廃棄し、FACSバッファの100°Lでペレットを再サスペンドします。単一細胞懸濁液が抗体染色の準備が整いました。
4. 抗体染色
- 典型的なヒト抗体パネルは、CD45-PercpCy5.5、CD14-PE、CD64-FITC、HLA-DR-APC/Cy7、CCR2-APCの抗体で構成されています。表 1を参照してください。1:50希釈で心臓サンプルにすべての抗体を追加し、暗闇の中で4°Cで〜30〜40分間インキュベートします。以下のステップ 4.4 に進みます。
- 間質細胞(内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞)の場合は、DRAQ5(1μM最終濃度)とCD45-percpCy5.5を加えます。表 1を参照してください。暗闇の中で4°Cで30分間インキュベートする。以下のステップ 4.4 に進みます。
- マウス心臓マクロファージの場合、CD45-PercpCy5.5、CD64-APC、MHCII-APC/Cy7、CCR2-BV421、およびLy6G-FITCの抗体を追加します。表 2を参照してください。1:100希釈で心臓サンプルにすべての抗体を追加し、暗闇の中で4°Cで〜30〜40分間インキュベートします。以下のステップ 4.4 に進みます。
- サンプルをFACSバッファで2回洗浄します。洗浄ごとに、FACSバッファー、穏やかに渦、遠心分離機を400 x gで5分間加え、350μLのFACSバッファーで再サスペンドし、DAPI(1μM、最終濃度)を加えます。サンプルが FACS 分析/並べ替えの準備ができました。
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Representative Results
記載されたプロトコルは、マウスおよびヒト心筋からのマクロファージの分離を可能にする。同じプロトコルを使用して、異なる染色およびゲーティング戦略を有するが、間質細胞はまた、ヒト心筋から収穫することができる。ここで提示されたFACSの結果は、BD LSRIIまたはBD FACS ARIA IIIプラットフォームのいずれかで取得されました。補償制御は、染色された脾細胞からの単一の色制御サンプルから生成された。図 1は、未処理および処理済みのヒト LVAD コアを示しています。図2は、CCR2-およびCCR2+ヒトマクロファージのフローソートのためのゲーティングスキームを示す。図3Aは、ヒト心筋からの間質細胞−CD45及び図3Bに対するゲーティングスキームを示し、CD45+およびCD45-細胞を選別したライト染色FACSの画像を示す。図4は、マウス心臓からマクロファージをソートするゲーティングスキームを示す。
図1:処理前後のヒトLVAD組織コア。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:拡張型心筋症(DCM)または虚血性心筋症(ICM)標本における心臓マクロファージ集団を同定し、特徴付けるために利用されるフローサイトメトリーゲーティングスキーム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒト試料からCD45−およびCD45+間質細胞を単離するフローサイトメトリーゲーティングスキーム。(A)ヒト虚血性心筋症(ICM)または拡張型心筋症(DCM)標本からCD45-間質細胞を単離するために利用されるフローサイトメトリーゲーティングスキーム。(B)ライト染色された FACS は CD45-および CD45+細胞を選別した。スケールバー = 100μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図4:フローサイトメトリーゲーティングスキームは、マウス心臓から種々のマクロファージサブセットを分離する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 抗原 | フルオロフォア | クローン | メーカー |
| CD45 | パークサイ5.5 | 2D1 | バイオレジェンド |
| CD64 | Fitc | 10.1 | バイオレジェンド |
| CD14 | Pe | M5E2 | バイオレジェンド |
| CCR2 | APC または BV421 | K036C2 | バイオレジェンド |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | バイオレジェンド |
| DRAQ5 | サーモフィッシャー | ||
| DAPI | サーモフィッシャー |
表1:ヒト心筋検体の抗体パネル
| 抗原 | フルオロフォア | クローン | メーカー |
| CD45 | パークサイ5.5 | 30-F11 | バイオレジェンド |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | バイオレジェンド |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8年 | バイオレジェンド |
| Ly6C | Fitc | 香港ドル1.4 | バイオレジェンド |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | バイオレジェンド |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | バイオレジェンド |
| DRAQ5 | サーモフィッシャー | ||
| DAPI | サーモフィッシャー |
表2:マウス心臓検体用抗体パネル
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Discussion
このプロトコルは、ヒト心筋からの種々のマクロファージサブセットの抽出を可能にする。プロトコルはシンプルで、FACS分析の準備が整った単一細胞懸濁液の準備に3~4時間かかります。プロトコルの実行は比較的簡単ですが、変動を最小限に抑える技術的な側面を考慮する必要があります。第一に、最適な細胞生存率を得るには、ヒト組織をタイムリーに働かすことができます。細胞死を最小限に抑えるために、組織を冷たい生理線/HBSSに保つことが重要です。心筋標本から心心膜脂肪や他の結合組織を除去することも必要です。一貫した組織のミンチと消化時間はサンプルの変化にサンプルを減らす。
組織消化とその後の細胞収率には、アッセイ内およびアッセイ間の変動の両方があります。これは、組織からの単一細胞懸濁液を調製する際の制限の1つである。これを最小限に抑える最も重要な方法は、酵素が比較的新しく、適切に引用され、-80°Cで保存されていることを確認することです。アリコートは1回だけ使用し、再び保存または凍結しないでください。使用される酵素は、融解サイクルを凍結することに敏感である。もう一つの考慮事項は、消化と振る速度の温度です。熱を均等に分配するサーモスタット制御シェーカーを使用すると、消化変動を最小限に抑え、細胞の生存率を向上させることができます。
ヒト心筋からのマクロファージの絶対収率は、一般にそれほど高くないことを言及することが重要である。通常、細胞収率は、組織1,200〜1,500mg当たりの合計マクロファージの〜〜20,000〜50,000から変化する。これは、望ましい下流の分析方法が細胞培養アッセイを伴う場合に困難になります。食細胞症、ケモカイン/サイトカイン産生、細胞刺激、形態測定、および遺伝子発現解析(マイクロアレイ、バルクRNAシーケンシング、および単一細胞RNAシーケンシング)を容易に行うことができる。組織の質はまた消化およびそれ以下の細胞収率の容易さを決定する。組織が線維化して瘢痕化している場合、消化効率は最適でなく、マクロファージ収率は非常に低くなる可能性が高い。
考慮すべきもう一つの側面は、心筋組織の消化が重要な破片形成につながるということです.これにより、ペレットが緩んで見えます。したがって、簡単なデカントによって洗浄工程中に上清を廃棄しないように注意する必要があります。上清を収集するためにパスツールピペットと吸引/真空廃棄物収集フラスコを使用することをお勧めします。また、遠心分離機を4°Cに保つと、細胞死とサンプル損失を最小限に抑えることができます。
このプロトコルは、ヒト心筋組織サンプルからマクロファージを抽出する方法を記述するが、マクロファージサブセットの正常な単離は、有意な変更または改変なしにマウス心臓から達成することもできる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、ワシントン大学の小児発見研究所とセントルイス小児病院(CH-II-2015-462、CH-II-2017-628)、バーンズ・ユダヤ病院財団(8038-88)、NHLBI(R01)から提供された資金によって可能になりました。HL138466、 R01 HL139714)。K.J.L.は、NIH K08 HL123519およびバロウズウェルカムファンド(1014782)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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