Summary
여기서 제시된 프로토콜은 효소 소화를 통해 단일 세포 현탁액을 준비시킴으로써 인간 및 마우스 심근으로부터 대식세포 및 기타 비면역 세포의 다양한 서브세트를 분리하는 프로토콜이다. 유세포분석 기반 식별 및 절연 대식세포의 특성화를 위한 게이팅 방식도 제시된다.
Abstract
대식세포는 심장에서 가장 이질적이고 풍부한 면역 세포 집단을 나타내며 심장 손상 후 염증 및 회복 반응을 유도하는 데 핵심적입니다. 어떻게 대식 세포의 다양 한 하위 집합 심장 부상 후 면역 반응을 조율 연구의 활성 영역. 여기에 제시된 간단한 프로토콜은 우리 실험실이 건강하고 병들인 개인에게서 얻은 마우스와 인간 심근 표본에서 대식세포의 추출을 위해 일상적으로 수행하는 간단한 프로토콜입니다. 간략하게, 이 프로토콜은 항체 염색, 및 유세포 측정에 선행된 단 하나 세포 현탁액을 생성하기 위하여 심장 조직의 효소 소화를 관련시킵니다. 이 기술은 대량 및 단세포 RNA 시퀀싱뿐만 아니라 정렬된 세포에서 수행되는 기능성 분석법에 적합합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 단순성, 최소한의 일일 변동 및 다양한 마우스 모델 및 인간 질병 개체에 대한 대식세포 이질성에 대한 조사를 허용하는 광범위한 적용성입니다.
Introduction
대식세포는 심장에서 가장 풍부한 면역세포 유형을 나타내며, 심장 손상1,2,3,4에이어 강력한 염증 및 회복 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 한다. 이전에, 우리 그룹은 뚜렷한 발달 기원5,6에서파생된 뮤린 심혼에 있는 대식세포의 2개의 중요한 부세트를 확인했습니다. 광범위하게, 조직 상주 심장 대식세포 서브세트의 뚜렷한 집단은 CCR2의 세포 표면 발현에 기초하여 확인될 수 있다(C-C 모티프 케모카인 수용체 2). CCR2- 대식세포(세포 표면 발현: CCR2- MHCII낮고 CCR2- MHCII높음)는배아 기원(원시및 적혈구 계보)이며, 자가 갱신할 수 있고, 동압 조건 하에서 지배적인 집단을 나타낸다. 상주 CCR2+ 대식세포는 확실한 조혈 기원이며, 순환 단핵구로부터의 모집을 통해 유지되며, 항상성 조건하에서 소집단을 나타낸다. 기능적으로, CCR2- 대식세포는 최소한의 염증을 생성하고 관상 동맥 발달 신생아 심장 재생에 중요하다5,7. 대조적으로, CCR2+ 대식세포는 심장 모욕에 따라 강력한 염증 반응을 개시하고 부수적인 심근세포 손상, 좌심실의 불리한 리모델링 및 심부전진행에 기여한다8,9.
최근, 우리는 인간 심근이 또한 CCR2- 또는 CCR2+8로유사하게 확인된 대식세포의 2개의 별개의 부집합을 포함한다는 것을 보여주었습니다. 유전자 발현 및 기능적 분석은 인간 CCR2- 및 CCR2+ 대식세포가 기능적으로 서로 다른 서브세트를 나타내며, 마우스 심장에서 발견되는 CCR2 + 대식세포와 기능적으로 유사하다는 것을 밝혀냈습니다. 인간CCR2- 대식세포는 IGF1, PDGF, Cyr61 및 HB-EGF를 포함한 강력한 수준의 성장 인자를 표현합니다. CCR2+ 대식세포는 IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 및 TNF-a와 같은 염증을 촉진하는 케모카인 및 사이토카인에서 풍부하게 함유된다. 자극된 CCR2+ 대식세포는 배양에서 염증성 사이토카인 인터류킨-1β(IL-1β)의 현저하게 높은 수준을 분비한다. 이 분부 집합이 어떻게 달리 조직 수선에 기여하고 심장 상해의 맥락에서 좌심실 (LV) 개조는 적극적인 연구의 지역 남아 있습니다.
마우스와 인간의 심장에서 대식세포 이질성의 흐름 세포 분석 기반 분석은 심장 조직을 소화하고 단일 세포 현탁액을 생성하고 대량 RNA 시퀀싱/단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 기능성 분석과 같은 추가 하류 프로세스에 대한 세포 선별을 생성해야 합니다. 뮤린 하트에서 단일 세포 현탁액을 만들기위한 원래 프로토콜은 Nahrendorf 외. 200710에서Nahrendorf 그룹에 의해 처음 보고되었다. 우리의 실험실은 인간의 심근에서 대식세포를 추출하기 위해 프로토콜을 조정하고 수정했습니다. 동일한 프로토콜을 사용하지만 염색 및 게이팅 방식에서 약간의 변형으로,CD45-인간 심근으로부터의 기질 세포도 수확될 수 있다. 여기에 제시된 텍스트 및 비디오에서, 인간 심근으로부터 대식세포 또는 기질의 추출을 위해 일상적으로 수행되는 프로토콜이다.
심장 조직 견본은 확장된 심근병증 (DCM: 특발성 또는 가족) 또는 허혈성 심근병증 (ICM)을 겪고 있는 좌심실 보조 장치 (LVAD) 이식 또는 심장 이식을 가진 성인 환자에게서 얻어진다. 심이식 심질 또는 LVAD 코어는 소화 절차를 시작하기 전에 차가운 식염수와 함께 혈관이 심어져 있습니다. 흉터 또는 지방 조직 침투의 정도에서 결정 된 조직 표본의 "품질"은 대식세포의 수율에 크게 영향을 미칠 수 있음을 유의하는 것이 중요합니다. 흉터의 넓은 지역을 가진 심혼 견본은 훨씬 더 낮은 세포 수율을 가질 것이고 원하는 다운스트림 분석 방법 체외 세포 배양을 요구할 때 심각한 기술적 한계를 제기할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
제시된 프로토콜은 세인트 루이스 기관 검토 위원회 (#201305086)에있는 워싱턴 대학에 의해 승인되었습니다. 모든 피험자는 샘플 수집 전에 정보에 입각한 동의를 제공하고 실험은 승인된 연구 프로토콜에 따라 수행됩니다. 제시된 프로토콜은 워싱턴 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인으로 수행되며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 설명된 지침을 따릅니다.
1. 인간 심장 조직 표본의 준비
- 왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥 오스티아를 캐뉼로 심은 심장을 씻어 내고 200 mL의 차가운 식염수로 주입하십시오.
- LVAD 에피카디얼 용기를 캐뉼링하여 LVAD 정점 코어티를 세척하고 50 mL의 차가운 식염수를 주입합니다.
- 멸균 가위를 사용하여 차가운 식염수 또는 HBSS에서 좌심실의 상피 또는 측면 벽으로부터 조직 시편을 해부합니다.
- 조심스럽게 미세 가위를 사용하여 표본에서 후두 지방과 chordae tendineae을 해부.
- 멸균 블레이드 또는 가위를 도움으로 약 200mg의 무게로 조직 덩어리를 해부하십시오.
2. 마우스 심장의 준비
- CO2 질식 또는 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.
- 날카로운 가위의 도움으로 가슴 구멍을 엽니 다. 무딘 지혈을 사용하여 심장을 위쪽으로 들어 올립니다. 5 mL 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용하여 차가운 PBS로 심장을 침전시하십시오. 심장이 희미해 진 것 까지 만드십.
- 심장을 제거하고 얼음에 멸균 페트리 접시에 놓습니다.
3. 단세포 현탁액의 준비
- 인간의 심장 조직 덩어리 (~200 mg) 또는 무린 심장을 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 멸균 블레이드 나 가위를 사용하여 조직을 잘게 다듬습니다.
- 소화 설정:
- 인간의 심장 조직 덩어리 당 3 mL의 최종 소화 볼륨을 사용 하 여 (200 mg) 또는 1 murine 심장 당. 최종 효소 농도는 다음과 같습니다: 콜라게나제1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), 히알루로니다제 (60 U/mL).
- 각 소화 반응에 대해 DMEM과 모든 효소를 15 mL 원엽 튜브에 추가합니다. 깨끗한 집게의 도움으로, 각 반응 튜브에 미세하게 다진 조직을 배치합니다. 부드러운 소용돌이로 잘 섞어보시다.
- 37°C에서 1시간 동안 소화하여 낮은 또는 중간 교반 속도로 설정된 교반기에서.
- 소화 1 시간 후, 인큐베이터에서 튜브를 꺼내 얼음위에 놓습니다. 상단에 40 μm 세포 스트레이너와 50 mL 원점 튜브를 설정합니다. 효소 비활성화 (ED) 완충액2 mL로 필터를 적시다.
- 각 소화 관에 ED 버퍼 8 mL를 추가 하 여 소화 효소를 비활성화 합니다. 이어서 생성된 13 mL 총 혼합물을 40 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원점 튜브에 부어 넣는다. 샘플을 신선한 15 mL 원추형 튜브로 다시 옮김. 이것은 최적 세포 펠릿을 가능하게 하고 원심분리 도중 세포 손실을 극소화합니다.
- 샘플을 400 x g에서 6분 동안 회전시다(4°C로 설정된 원심분리기). 0.5 mL의 미디어를 남기는 상급체를 폐기하십시오. 부드러운 파이펫팅으로 세포 펠릿을 다시 중단하고 ACK 라시스 버퍼 1 mL을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이시키고 실온에서 5 분 동안 배양하여 적혈구 (RBC) 용해를 수행합니다.
- ACK 버퍼에서 5분 후에 9mL의 DMEM을 샘플에 추가합니다. 뚜껑을 다시 튜브에 다시 놓고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합하고 40 μm 셀 스트레이너를 통해 필터링합니다. 15 mL 원엽 튜브에서 여과액을 수집합니다.
- 튜브를 400 x g에서 6 분 동안 원심 분리하고 상한체를 버립니다.
- FACS 버퍼 1mL를 추가하고 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 이어서 FACS 버퍼에서 세포를 1.5 mL 마이크로원지소지 튜브로 옮김을 전달한다. 원심분리기는 다시 400 x g에서 5분 간. 상급체를 버리고 FACS 버퍼의 100 μL에서 펠릿을 다시 놓습니다. 단일 세포 현탁액은 이제 항체 염색을 위한 준비되었습니다.
4. 항체 염색
- 일반적인 인간 항체 패널은 다음과 같은 항체로 구성됩니다: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. 표 1을참조하십시오. 모든 항체를 1:50 희석시에 심장 시료에 첨가하고 어둠 속에서 4°C에서 ~30-40분 동안 배양한다. 아래 4.4 단계로 진행하십시오.
- 기질 세포 (내피 세포, 섬유 아세포, 평활근 세포)의 경우 DRAQ5 (최종 농도 1 μM) 및 CD45-percpCy5.5를 추가하십시오. 표 1을참조하십시오. 어둠 속에서 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 아래 4.4 단계로 진행하십시오.
- 뮤린 심장 대식세포의 경우 CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 및 Ly6G-FITC와 같은 항체를 추가합니다. 표 2를참조하십시오. 모든 항체를 1:100 희석에서 심장 샘플에 추가하고 어둠 속에서 4 °C에서 ~ 30-40 분 동안 배양합니다. 아래 4.4 단계로 진행하십시오.
- FACS 버퍼에서 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척시, FACS 버퍼 1 mL을 추가하고, 부드럽게 소용돌이, 원심분리기를 5분 동안 400 x g에 넣고, FACS 버퍼 350 μL로 다시 중단하고 DAPI(1 μM, 최종 농도)를 추가합니다. 이제 샘플이 FACS 분석/정렬에 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
기재된 프로토콜은 마우스와 인간 심근으로부터 대식세포의 분리를 허용한다. 동일한 프로토콜을 사용하지만, 다른 염색 및 게이팅 전략을 사용하여, 기질 세포는 또한 인간 심근으로부터 수확될 수 있다. 여기에 제시된 FACS 결과는 BD LSRII 또는 BD FACS ARIA III 플랫폼에서 획득되었습니다. 보정 제어는 스테인드 비장 세포에서 단일 색상 제어 샘플에서 생성되었다. 도 1은 처리되지 않은 인간 LVAD 코어를 나타낸다. 도 2는 CCR2-및 CCR2+인간 대식세포의 유동 선별을 위한 게이팅 방식을 나타낸다. 도3A는 CD45-인간 심근으로부터의 기질 세포및 도 3B에 대한 게이팅 방식을 나타낸 것으로, 라이트 염색 FACS 정렬된 CD45+및 CD45-세포의 이미지를 나타낸다. 도 4는 마우스 심장으로부터 대식세포를 정렬하는 게이팅 방식을 설명한다.
도 1: 인간 LVAD 조직 코어를 처리 전후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유동 세포 분석 게이팅 방식은 확장된 심근증(DCM) 또는 허혈성 심근병증(ICM) 표본에서 심장 대식세포 집단을 식별하고 특성화하는 데 활용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 인간 샘플로부터CD45-및 CD45+ 기질 세포를 분리하는 유세포분석 게이팅 방식. (a)인간 허혈성 심근증(ICM) 또는 확장된 심근병증(DCM) 시편으로부터 CD45-기질 세포를 분리하는 데 이용된 유동 세포분석 게이팅 방식. (B)라이트 스테인드 FACS는 CD45- 및 CD45+ 세포를 분류하였다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 마우스 심장으로부터 다양한 대식세포 서브세트를 분리하는 유세포분석 게이팅 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Antigen | 플루오로포어 | 복제 | 제조업체 |
| CD45 | 퍼프시5.5 | 2D1 | 바이오 레전드 |
| CD64 | Fitc | 10.1 | 바이오 레전드 |
| CD14 | Pe | M5E2 | 바이오 레전드 |
| CCR2 | APC 또는 BV421 | K036C2 | 바이오 레전드 |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | 바이오 레전드 |
| 드라Q5 | 써모 피셔 | ||
| DAPI | 써모 피셔 |
표 1: 인간 심근 시편에 대한 항체 패널.
| Antigen | 플루오로포어 | 복제 | 제조업체 |
| CD45 | 퍼프시5.5 | 30-F11 | 바이오 레전드 |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | 바이오 레전드 |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | 바이오 레전드 |
| Ly6C | Fitc | HK1.4 | 바이오 레전드 |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | 바이오 레전드 |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | 바이오 레전드 |
| 드라Q5 | 써모 피셔 | ||
| DAPI | 써모 피셔 |
표 2: 마우스 심장 시편용 항체 패널.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 인간 심근으로부터 다양한 대식세포 서브세트를 추출할 수 있게 한다. 이 프로토콜은 간단하며 FACS 분석을 위해 준비된 단일 셀 현탁액을 준비하는 데 3~4시간이 걸립니다. 프로토콜은 수행하기가 비교적 간단하지만 가변성을 최소화할 수 있는 특정 기술적 측면을 고려해야 합니다. 첫째, 최적의 세포 생존을 위해 인간 조직과 적시에 작업하는 것이 필요합니다. 세포 사멸을 최소화하기 위해 조직을 차가운 식염수/HBSS에 보관하는 것이 중요합니다. 또한 심근 시편에서 상피 지방 및 기타 결합 조직을 제거해야합니다. 일관된 조직 다듬기 및 소화 시간은 샘플 변이에 대한 샘플을 감소시게 됩니다.
조직 소화 및 후속 세포 수율에 있는 intra 분석 및 교차 분석 가변성이 둘 다 있습니다. 이것은 조직에서 단 하나 세포 현탁액을 준비에 있는 제한의 한개입니다. 이를 최소화하는 가장 중요한 방법은 효소가 비교적 새롭고 적절하게 aliquoted되고 -80 °C에 저장되도록하는 것입니다. Aliquots는 한 번만 사용해야 하며 다시 저장하거나 동결해서는 안 됩니다. 사용되는 효소는 해동 주기를 동결하는 데 민감합니다. 또 다른 고려 사항은 소화와 떨림 속도의 온도입니다. 열을 고르게 분배하는 온도 조절 식 셰이커를 사용하면 소화 가변성을 최소화하고 세포 생존력을 향상시킬 수 있습니다.
인간의 심근에서 대식세포의 절대 수율은 일반적으로 매우 높지 않다는 것을 언급하는 것이 중요합니다. 일반적으로 세포 수율은 조직의 1,200-1,500 mg 당 ~ 20,000 ~ 50,000 총 대식세포에서 다릅니다. 이것은 분석의 원하는 다운스트림 방법이 세포 배양 분석을 관련시키는 때 도전이 됩니다. 식세포증, 케모킨/사이토카인 생산, 세포 자극, 모르포메이션 및 유전자 발현 분석(마이크로어레이, 벌크 RNA 시퀀싱 및 단세포 RNA 시퀀싱)을 쉽게 수행할 수 있습니다. 조직의 품질은 또한 소화및 후속 세포 수율의 용이성을 결정합니다. 조직이 섬유질이고 흉터가 있는 경우에, 소화 효율은 최적이 아니고, 대식세포 수율은 아주 낮을 가능성이 높습니다.
고려해야 할 또 다른 측면은 심근 조직 소화가 상당한 파편 형성으로 이어진다는 것입니다. 이로 인해 펠릿이 느슨하게 나타납니다. 따라서, 하나는 간단한 디캔팅에 의해 세척 단계 동안 상급을 폐기하지 않도록주의해야합니다. 파스퇴르 피펫과 흡입 / 진공 폐기물 수집 플라스크를 사용하여 상류를 수집하는 것이 좋습니다. 또한 원심분리기를 4°C로 유지하면 세포 사멸 및 시료 손실을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
이 프로토콜은 인간의 심근 조직 샘플에서 대식세포를 추출하는 방법을 설명하지만, 대식세포 하위 세트의 성공적인 격리는 또한 중요한 변경 또는 수정없이 마우스 심장에서 달성 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 워싱턴 대학의 아동 발견 연구소와 세인트 루이스 아동 병원 (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), 반스 유대인 병원 재단 (8038-88), NHLBI (R01)에서 제공하는 기금으로 가능했습니다. HL138466, R01 HL139714). K.J.L.은 NIH K08 HL123519 및 버로우스 웰컴 펀드(1014782)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
