Summary
Presentert her er en protokoll for å isolere ulike delsett av makrofager og andre ikke-immune celler fra menneske og mus myokard ved å forberede en enkelt celle suspensjon gjennom enzymatisk fordøyelse. Gating ordninger for Flow flowcytometri basert identifisering og karakterisering av isolerte makrofager er også presentert.
Abstract
Makrofager representerer de mest heterogene og rikelig immun celle populasjoner i hjertet og er sentrale i kjøring betennelser og reparerende svar etter hjertestans skade. Hvordan ulike delsett av makrofager arrangerer immunresponsen etter hjertestans skade er et aktivt område av forskning. Presentert her er en enkel protokoll som vår Lab utfører rutinemessig, for ekstraksjon av makrofager fra mus og menneskelige myokard prøver Hentet fra friske og syke individer. Kort, innebærer denne protokollen enzymatisk fordøyelse av CARDIAC vev for å generere en enkelt celle suspensjon, etterfulgt av antistoff farging, og flyt flowcytometri. Denne teknikken er egnet for funksjonell analyser utført på sorterte celler, samt bulk og enkelt celle RNA sekvensering. En stor fordel med denne protokollen er dens enkelhet, minimal dag til dag variasjon og bred anvendelse tillater gransking av macrophage heterogenitet på tvers av ulike mus modeller og menneskelig sykdom enheter.
Introduction
Makrofager representerer den mest tallrike immun celletypen i hjertet, og de spiller viktige roller i å generere robuste inflammatoriske og reparerende svar etter CARDIAC skade1,2,3,4. Tidligere har gruppen vår identifisert to store delsett av makrofager i murine hjerte som er avledet fra forskjellige utviklingsmessige Origins5,6. Bredt, distinkte populasjoner av vev bosatt CARDIAC macrophage delsett kan identifiseres basert på celleoverflaten uttrykk for CCR2 (C-C motiv chemokine reseptor 2). CCR2- makrofager (celle overflate uttrykk: CCR2-MHCIIlav og CCR2-MHCIIhøy) er av embryonale opprinnelse (primitive og erythromyeloid linjene), i stand til å fornye seg selv, og representerer en dominerende befolkning under homøostatisk forhold. Resident CCR2+ makrofager er av definitive blodkreft opprinnelse, opprettholdes gjennom rekruttering av sirkulerende monocytter, og representerer en mindre befolkning under homøostatisk forhold. Funksjonelt, CCR2- makrofager generere minimal betennelse og er avgjørende for koronar utvikling nyfødt hjerte regenerering5,7. I kontrast CCR2+ makrofager initiere robuste inflammatoriske responser etter hjerte fornærmelser og bidra til sikkerhet cardiomyocyte skade, ugunstig remodeling av venstre ventrikkel, og hjertesvikt progresjon8,9.
Nylig har vi vist at den menneskelige myokard også inneholder to forskjellige delsett av makrofager identifisert på samme måte som enten CCR2- eller CCR2+8. Genuttrykk og funksjonelle analyser avslørte at humant CCR2- og CCR2+ makrofager representerer funksjonelt avvikende delsett og er funksjonelt analogt med CCR2- og CCR2+ makrofager funnet i muse hjertet. Human CCR2- makrofager uttrykker robuste nivåer av vekstfaktorer, inkludert IGF1, PDGF, CYR61 og HB-EGF. CCR2+ makrofager er beriket med chemokiner og cytokiner som fremmer betennelse, for eksempel Il-1B, Il-6, CCL-2, CCL-7 og TNF-a. Stimulert CCR2+ makrofager skiller markant høyere nivåer av inflammatorisk cytokin interleukin-1Β (Il-1β) i kulturen. Hvordan disse delsett differensielt bidra til vev reparasjon og venstre ventrikkel (LV) remodeling i sammenheng med CARDIAC skade er fortsatt et område av aktiv forskning.
Flow-flowcytometri basert analyse av macrophage heterogenitet i musen og menneskets hjerte krever fordøye CARDIAC vev og generere en enkelt celle suspensjon etterfulgt av flyt analytiske analyse eller celle sortering for videre nedstrøms prosesser som bulk RNA sekvensering/enkelt celle RNA sekvensering eller dyrking cellene for funksjonell analyser. Den opprinnelige protokollen for å lage en enkelt celle suspensjon fra murine hjerter ble først rapportert av Nahrendorf gruppe i Nahrendorf et al. 200710. Laboratoriet vårt har tilpasset og modifisert protokollen for å trekke ut makrofager fra den menneskelige myokard. Ved hjelp av samme protokoll, men med liten endring i farging og gating ordningen, kan CD45- stromal celler fra den menneskelige myokard også høstes. Presentert her, i tekst og video, er en protokoll som utføres rutinemessig for ekstraksjon av makrofager eller stromal fra den menneskelige myokard.
CARDIAC vevsprøver er innhentet fra voksne pasienter med utvidede kardiomyopati (DCM: idiopatisk eller familiær) eller iskemiske kardiomyopati (ICM) gjennomgår venstre ventrikkel hjelpeenhet (LVAD) implantation eller hjertestans transplantasjon. Eksplanterte hjerter eller LVAD kjerner er intravaskulært perfusert med kaldt saltvann før du starter fordøyelsen prosedyren. Det er viktig å merke seg at "kvalitet" av vev prøven bestemmes i form av grad av arrdannelse eller fettvev infiltrasjon kan i stor grad påvirke avkastningen av makrofager. Hjerte prøver med store områder av arrdannelse vil ha mye lavere celle utbytte og kan utgjøre alvorlig teknisk begrensning når ønsket nedstrøms analysemetoder krever in vitro celle dyrking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen som presenteres har blitt godkjent av Washington University i St. Louis institusjonelle Review Board (#201305086). Alle gir informert samtykke før prøvetaking samling og eksperimenter er utført i samsvar med den godkjente studien protokollen. Den presenterte protokollen er utført med godkjennelse av den institusjonelle Animal Care og use Committee ved Washington University School of Medicine og følger retningslinjene beskrevet i NIH guide for Stell og bruk av laboratorium dyr.
1. utarbeidelse av Human CARDIAC vevsprøver
- Skyll eksplanterte hjerter ved å cannulating venstre og høyre koronar og perfuse med 200 mL kaldt saltvann.
- Skyll LVAD apikale med kjerne vev ved å cannulating et epicardial fartøy og perfuse med 50 mL kaldt saltvann.
- Analysere vevsprøven fra apikale eller lateral veggen av venstre ventrikkel i kaldt saltvann eller HBSS ved hjelp av en steril saks.
- Forsiktig analysere ut epicardial Basin og chordae tendineae fra prøven benytter fin saks.
- Analysere vev biter i biter som veier ca 200 mg med hjelp av et sterilt blad eller saks.
2. utarbeidelse av mus Heart
- Euthanize musen ved CO2 kvelning eller cervical forvridning.
- Åpne brystet hulrom med hjelp av skarpe saks. Bruk stump hemostats for å løfte hjertet oppover. Perfuse hjertet med kald PBS ved hjelp av en 25 G nål festet til en 5 mL sprøyte. Perfuse til hjertet vises forvellet i fargen.
- Fjern hjertet og plasser i en steril Petri parabolen på isen.
3. utarbeidelse av single Cell suspensjon
- Plasser Human CARDIAC vev biter (~ 200 mg) eller murine hjerte i en steril Petri parabolen. Fin hakke vevet ved hjelp av en steril kniv eller saks.
- Sett opp digestions:
- Bruk en siste fordøyelsen volum på 3 mL per menneskelig CARDIAC vev blings (200 mg) eller per en murine hjerte. Endelige enzym konsentrasjoner er som følger: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
- For hver fordøyelsen reaksjon legge DMEM og alle enzymer til en 15 mL konisk rør. Med hjelp av ren tang, plasserer fint hakket vev i hvert reaksjons rør. Bland godt med milde virvlingen.
- Digest for 1 time ved 37 ° c i en risting inkubator satt til en lav til middels agitasjon hastighet.
- Etter 1 time med fordøyelsen, ta rørene ut fra inkubator og plass på isen. Sett opp 50 mL koniske rør med en 40 μm celle sil oppå. Fukt filtrene med 2 mL enzym deaktivering (ED)-buffer.
- Deaktiver fordøyelsen enzymer ved å legge 8 mL ED buffer til hver fordøyelsen tube. Hell deretter den resulterende 13 mL total blandingen gjennom 40 μm celle sil i 50 mL koniske rør. Overfør prøvene tilbake i friskt 15 mL konisk rør. Dette muliggjør optimale celle pelleting og minimerer celle tap under sentrifugering.
- Spinn prøvene ved 400 x g i 6 min (sentrifuge sett ved 4 ° c). Kast supernatanten som forlater 0,5 mL. Resuspend celle pellet ved milde pipettering og tilsett 1 mL av ACK lyse buffer. Roter røret forsiktig og ruge ved romtemperatur i 5 min for å utføre røde blodlegemer (RBC) lyse.
- Etter 5 minutter i ACK-buffer, legger du til 9 mL DMEM i prøven. Sett lokket tilbake på rørene og Vend rørene forsiktig for å mikse, og Filtrer gjennom en celle sil i 40 μm. Samle Filtrer i 15 mL koniske rør.
- Sentrifuger rørene ved 400 x g i 6 min og kast supernatanten.
- Tilsett 1 mL FACS buffer og resuspend pellet. Deretter overføres i cellene i FACS buffer til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube. Sentrifuger igjen ved 400 x g i 5 min. kast supernatanten og resuspend pellet i 100 ΜL av FACS buffer. En enkelt celle suspensjon er nå klar for antistoff farging.
4. antistoff farging
- Et typisk menneskelig antistoff panel består av følgende antistoffer: CD45-PercpCy 5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Vennligst se tabell 1. Tilsett alle antistoffer mot hjerte prøvene ved 1:50 fortynning og ruge i ~ 30-40 min. ved 4 ° c i mørket. Gå videre til trinn 4,4 nedenfor.
- For stromal celler (endothelial celler, Fibroblast, glatte muskelceller), tilsett DRAQ5 (1 μM siste konsentrasjon) og CD45-percpCy 5.5. Vennligst se tabell 1. Ruge i 30 min ved 4 ° c i mørket. Gå videre til trinn 4,4 nedenfor.
- For murine hjertet makrofager legge til følgende antistoffer: CD45-PercpCy 5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, og Ly6G-FITC. Vennligst referer til tabell 2. Tilsett alle antistoffer mot hjerte prøvene ved 1:100 fortynning og ruge i ~ 30-40 min. ved 4 ° c i mørket. Gå videre til trinn 4,4 nedenfor.
- Vask prøvene to ganger i FACS buffer. Tilsett 1 mL FACS buffer, forsiktig Vortex og sentrifuge ved 400 x g i 5 min, resuspend i 350 ΜL av FACS buffer og tilsett DAPI (1 μM, endelig konsentrasjon) for hver vask. Prøvene er nå klare for FACS analyse/sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet tillater isolering av makrofager fra mus og menneskelig myokard. Ved hjelp av samme protokoll, men med en annen farging og gating strategi, stromal celler kan også høstes fra den menneskelige myokard. FACS resultatene som presenteres her ble kjøpt enten på BD LSRII eller BD FACS ARIA III plattform. Kompensasjon kontroller ble generert fra én fargekontroll prøver fra farget splenocytes. Figur 1 viser ubehandlet og behandlet menneskelige LVAD kjerne. Figur 2 viser gating ordningen for flyt sortering av CCR2- og CCR2+ humant makrofager. Figur 3A viser gating ordningen for CD45- stromal celler fra menneskelig myokard og Figur 3B viser bilder av Wright beiset FACS sortert CD45+ og CD45- celler. Figur 4 beskriver gating ordningen til å sortere makrofager fra et muse hjerte.
Figur 1: den menneskelige LVAD vev kjerne før og etter prosessering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Flow flowcytometri gating ordningen benyttes til å identifisere og karakterisere CARDIAC macrophage bestander i utvidede kardiomyopati (DCM) eller iskemiske kardiomyopati (ICM) prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flow flowcytometri gating ordning for å isolere CD45- og CD45+ stromal celler fra menneskelige prøver. (A) Flow flowcytometri gating ordningen benyttet for å isolere CD45- stromal celler fra HUMANT iskemiske kardiomyopati (ICM) eller utvidet kardiomyopati (DCM) eksemplarer. (B) WRIGHT beiset FACS sortert CD45- og CD45+ celler. Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Flow flowcytometri gating ordning for å isolere ulike macrophage delsett fra musen hjertet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antigen | Fluoroforen | Klone | Produsenten |
| CD45 | PercpCy 5.5 | 2D1 | Biolegend |
| CD64 | FITC | 10,1 | Biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Biolegend |
| CCR2 | APC eller BV421 | K036C2 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabell 1: antistoff panel for humant myokard prøve.
| Antigen | Fluoroforen | Klone | Produsenten |
| CD45 | PercpCy 5.5 | 30-F11 | Biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Biolegend |
| Ly6C | FITC | HK 1.4 | Biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabell 2: antistoff panel for muse hjerte prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen gir mulighet for ekstraksjon av ulike macrophage delsett fra humant myokard. Protokollen er enkel og tar 3 til 4 timer for å forberede enkelt celle oppheng klar for FACS analyse. Selv om protokollen er relativt enkel å utføre, er det visse tekniske aspekter som må vurderes som vil minimere variasjon. For det første, arbeider i tide med menneskelig vev er nødvendig for optimal celle levedyktighet. Det er viktig å holde vevet i kaldt Saline/HBSS å minimere celle død. Det er også nødvendig å fjerne epicardial fett og annet bindevev fra hjerteinfarkt prøven. Konsistent vev hakking og fordøyelsen ganger vil redusere prøve å prøve variasjon.
Det er både intra-analysen og inter-analysen variasjon i vev digestions og påfølgende celle gir. Dette er en av begrensningene i å utarbeide en enkelt celle suspensjon fra vev. Den viktigste måten å minimere dette på er ved å sørge for at enzymer er relativt nye, riktig aliquoted og lagret ved-80 ° c. Alikvoter bør bare brukes én gang og bør ikke lagres eller fryses igjen. Enzymer som brukes er følsomme for fryse tine sykluser. En annen vurdering er temperaturen på fordøyelsen og risting hastighet. Ved hjelp av en termostat-kontrollert shaker som jevnt distribuerer varme bidrar til å minimere fordøyelsen variasjon og forbedre celle levedyktighet.
Det er viktig å nevne at absolutt utbytte av makrofager fra menneskelig myokard er generelt ikke veldig høy. Vanligvis cellen yield varierer fra ~ 20 000 til 50 000 totalt makrofager per 1200-1500 mg vev. Dette blir utfordrende når ønsket nedstrøms metode for analyse innebærer cellekultur analyser. Fagocytose, chemokine/cytokin produksjon, celle stimulering, morphometry og gen uttrykks analyser (Microarray, bulk RNA-sekvenser og enkelt celle RNA-sekvenser) kan enkelt utføres. Kvaliteten på vevet bestemmer også den enkle fordøyelsen og påfølgende celle yield. Hvis vevet er fiber og arr, er fordøyelsen effektivitet suboptimal, og macrophage yield vil trolig være svært lav.
Et annet aspekt å vurdere er at hjerteinfarkt vev fordøyelsen fører til betydelig rusk dannelse. Dette fører til at pellet skal vises løs. Således må man være forsiktig med å ikke forkaste supernatanten under vask trinn ved enkel decanting. Ved hjelp av en sug/vakuum avfall samling kolbe med Pasteur pipette å samle supernatanten er tilrådelig. Også opprettholde sentrifuge ved 4 ° c vil bidra til å minimere celle død og prøve tap.
Selv om denne protokollen beskriver en måte å trekke ut makrofager fra menneskelige hjerteinfarkt vevsprøver, kan vellykket isolering av macrophage delsett også oppnås fra mus hjerter uten vesentlige endringer eller modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble gjort mulig ved finansiering gitt fra barnas Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children ' s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), stiftelsen av Barnes-jødiske Hospital (8038-88), og NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. er støttet av NIH K08 HL123519 og Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
