Summary
Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.
Abstract
Los macrófagos representan las poblaciones de células inmunitarias más heterogéneas y abundantes del corazón y son fundamentales para impulsar la inflamación y las respuestas reparadoras después de una lesión cardíaca. Cómo varios subconjuntos de macrófagos orquestan las respuestas inmunitarias después de una lesión cardíaca es un área activa de investigación. Aquí se presenta un protocolo simple que nuestro laboratorio realiza de forma rutinaria, para la extracción de macrófagos de muestras de ratón y miocardio humano obtenidas de individuos sanos y enfermos. Brevemente, este protocolo implica la digestión enzimática del tejido cardíaco para generar una suspensión de una sola célula, seguida de la tinción de anticuerpos, y la citometría de flujo. Esta técnica es adecuada para ensayos funcionales realizados en células clasificadas, así como secuenciación de ARN a granel y de una sola célula. Una de las principales ventajas de este protocolo es su simplicidad, mínima variación diaria y amplia aplicabilidad que permite investigar la heterogeneidad de los macrófagos en varios modelos de ratón y entidades de enfermedades humanas.
Introduction
Los macrófagos representan el tipo de células inmunitarias más abundante en el corazón, y desempeñan un papel importante en la generación de respuestas inflamatorias y reparativas robustas después de una lesión cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nuestro grupo identificaba dos subconjuntos principales de macrófagos en el corazón murino derivados de orígenes de desarrollo distintos5,6. En términos generales, se pueden identificar poblaciones distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes en tejidos en función de la expresión de la superficie celular de CCR2 (receptor de quimioquina con motivo C-C 2). CCR2- los macrófagos (expresión de la superficie celular: CCR2-MHCIIlow y CCR2-MHCIIhigh)son de origen embrionario (linajes primitivos y eritromieloides), capaces de autorenovarse y representar a una población dominante en condiciones homeostáticas. Los macrófagos residentes CCR2+ son de origen hematopoyético definitivo, se mantienen a través del reclutamiento de monocitos circulantes y representan a una población menor en condiciones homeostáticas. Funcionalmente, CCR2- los macrófagos generan una inflamación mínima y son críticos para el desarrollo coronario de regeneración cardíaca neonatal5,7. Por el contrario, CCR2+ macrófagos inician respuestas inflamatorias robustas después de insultos cardíacos y contribuyen a la lesión colateral de cardiomiocitos, la remodelación adversa del ventrículo izquierdo, y la progresión de la insuficiencia cardíaca8,9.
Recientemente, hemos demostrado que el miocardio humano también contiene dos subconjuntos distintos de macrófagos identificados de manera similar como CCR2- o CCR2+8. La expresión génica y los análisis funcionales revelaron que los macrófagos ccr2humanos - y CCR2+ representan subconjuntos funcionalmente divergentes y son funcionalmente análogos a CCR2- y los macrófagos CCR2+ que se encuentran en el corazón del ratón. CCR2 humano- los macrófagos expresan niveles robustos de factores de crecimiento, incluyendo IGF1, PDGF, Cyr61, y HB-EGF. CCR2+ macrófagos se enriquecen en quimioquinas y citoquinas que promueven la inflamación, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7, y TNF-a. Los macrófagos estimulados CCR2+ macrófagos secretan niveles notablemente más altos de la interleucina de citoquina inflamatoria-1o (IL-1o) en cultivo. La forma en que estos subconjuntos contribuyen diferencialmente a la reparación de tejidos y a la remodelación del ventular izquierdo (LV) en el contexto de una lesión cardíaca sigue siendo un área de investigación activa.
El análisis basado en citometría de flujo de la heterogeneidad de macrófagos en el ratón y el corazón humano requiere digerir el tejido cardíaco y generar una suspensión de una sola célula seguida de un análisis citométrico de flujo o clasificación celular para otros procesos aguas abajo, como la secuenciación masiva de ARN/secuenciación de ARN de una sola célula o el cultivo de las células para ensayos funcionales. El protocolo original para hacer una suspensión de una sola célula de corazones murinos fue reportado por primera vez por el grupo Nahrendorf en Nahrendorf et al. 200710. Nuestro laboratorio ha adaptado y modificado el protocolo para extraer macrófagos del miocardio humano. Usando el mismo protocolo pero con ligera modificación en el esquema de tinción y gating, CD45- células estromales del miocardio humano también se pueden cosechar. Aquí se presenta, en texto y vídeo, un protocolo que se realiza rutinariamente para la extracción de macrófagos o estromatos del miocardio humano.
Las muestras de tejido cardíaco se obtienen de pacientes adultos con cardiomiopatía dilatada (DCM: idiopática o familiar) o cardiomiopatía isquémica (MIC) sometidos a implantación de dispositivode asistencia ventricular izquierda (LVAD) o trasplante cardíaco. Los corazones explantados o los núcleos LVAD se perfunden intravascularmente con salina fría antes de iniciar el procedimiento de digestión. Es importante tener en cuenta que la "calidad" de la muestra de tejido determinada en términos de grado de cicatrización o infiltración de tejido adiposo puede afectar en gran medida el rendimiento de los macrófagos. Los especímenes cardíacos con grandes áreas de cicatrización tendrán un rendimiento celular mucho menor y pueden plantear una limitación técnica grave cuando los métodos de análisis aguas abajo deseados requieren el cultivo celular in vitro.
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Protocol
El protocolo presentado ha sido aprobado por la Universidad de Washington en st. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos los sujetos proporcionan consentimiento informado antes de la recolección de muestras y los experimentos se realizan de acuerdo con el protocolo de estudio aprobado. El protocolo presentado se realiza con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y sigue las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de especímenes de tejido cardíaco humano
- Enjuague los corazones explantados mediante la cánula de la ostia de la arteria coronaria izquierda y derecha y perfundie con 200 ml de salina fría.
- Enjuague los tejidos de núcleo apical de LVAD cannuando un vaso epicardial y perfundie con 50 ml de salina fría.
- Muestra de tejido diseccionado de la pared apical o lateral del ventrículo izquierdo en solución salina fría o HBSS utilizando una tijera estéril.
- Diseccionar cuidadosamente la grasa epicardial y las tendineas de chordae de la muestra usando tijeras finas.
- Diseccionar trozos de tejido en trozos que pesan aproximadamente 200 mg con la ayuda de una hoja estéril o tijeras.
2. Preparación del corazón del ratón
- Eutanasia del ratón mediante asfixia porCO2 o dislocación cervical.
- Abra la cavidad torácica con la ayuda de tijeras afiladas. Usa hemostats contundentes para levantar el corazón hacia arriba. Perfumar el corazón con PBS frío utilizando una aguja de 25 G unida a una jeringa de 5 ml. Perfundie hasta que el corazón aparezca blanqueado en color.
- Retire el corazón y colóquelo en un plato estéril de Petri sobre hielo.
3. Preparación de la suspensión de una sola célula
- Coloque trozos de tejido cardíaco humano (200 mg) o corazón murino en un plato estéril de Petri. Picar finamente el tejido usando una cuchilla estéril o tijeras.
- Configure las digestiones:
- Utilice un volumen de digestión final de 3 ml por trozo de tejido cardíaco humano (200 mg) o por corazón murino. Las concentraciones finales de enzimas son las siguientes: Colagenasa1 (450 U/ml), DNase1 (60 U/ml), Hialuronidasa (60 U/ml).
- Para cada reacción de digestión añadir DMEM y todas las enzimas a un tubo cónico de 15 ml. Con la ayuda de fórceps limpios, coloque el tejido finamente picado en cada tubo de reacción. Mezclar bien mediante vórtice suave.
- Digerir durante 1 h a 37oC en una incubadora de agitación a una velocidad de agitación baja a media.
- Después de 1 h de digestión, saque los tubos de la incubadora y colóquelos sobre hielo. Ponga tubos cónicos de 50 ml con un colador de células de 40 m en la parte superior. Humedezca los filtros con 2 ml de tampón de desactivación de enzimas (ED).
- Desactive las enzimas de digestión añadiendo 8 ml de tampón ED a cada tubo de digestión. A continuación, vierta la mezcla total de 13 ml resultante a través del colador de células de 40 m en los tubos cónicos de 50 ml. Transfiera las muestras de nuevo en un tubo cónico fresco de 15 ml. Esto permite una peletización celular óptima y minimiza la pérdida celular durante la centrifugación.
- Girar las muestras a 400 x g durante 6 min (Centrifugar a 4oC). Deseche el sobrenadante dejando 0,5 ml de medios. Resuspenda el pellet celular pipeteando suavemente y agregue 1 ml de tampón de lisis ACK. Gire suavemente el tubo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos para realizar la lisis de glóbulos rojos (RBC).
- Después de 5 min en el búfer ACK, agregue 9 mL de DMEM a la muestra. Vuelva a colocar la tapa en los tubos e invierta suavemente los tubos para mezclar y filtre a través de un colador de células de 40 m. Recoger el filtrado en tubos cónicos de 15 ml.
- Centrifugar los tubos a 400 x g durante 6 min y desechar el sobrenadante.
- Agregue 1 mL de búfer FACS y vuelva a suspender el pellet. A continuación, transfiera en las celdas del búfer FACS a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar de nuevo a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 ml de facS Buffer. Una suspensión de una sola célula ya está lista para la tinción de anticuerpos.
4. Staining de anticuerpos
- Un panel típico de anticuerpos humanos consta de los siguientes anticuerpos: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Consulte la Tabla 1. Añadir todos los anticuerpos a las muestras del corazón a 1:50 dilución e incubar por 30-40 min a 4 oC en la oscuridad. Continúe con el paso 4.4 a continuación.
- Para las células estromas (células endoteliales, fibroblastos, células musculares lisas), agregue DRAQ5 (concentración final de 1 M) y CD45-percpCy5.5. Consulte la Tabla 1. Incubar durante 30 min a 4oC en la oscuridad. Continúe con el paso 4.4 a continuación.
- Para los macrófagos cardíacos murinos, agregue los siguientes anticuerpos: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 y Ly6G-FITC. Consulte la Tabla 2. Añadir todos los anticuerpos a las muestras del corazón a 1:100 dilución e incubar por 30-40 min a 4 oC en la oscuridad. Continúe con el paso 4.4 a continuación.
- Lave las muestras dos veces en el búfer FACS. Para cada lavado, añadir 1 ml de tampón FACS, vórtice suavemente y centrífuga a 400 x g durante 5 min, resuspender en 350 ml de tampón FACS y añadir DAPI (1 M, concentración final). Las muestras ya están listas para el análisis/clasificación de FACS.
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Representative Results
El protocolo descrito permite el aislamiento de macrófagos del ratón y el miocardio humano. Usando el mismo protocolo, pero con una estrategia diferente de tinción y gating, las células estromales también se pueden cosechar del miocardio humano. Los resultados de FACS presentados aquí se adquirieron en la plataforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. Se generaron controles de compensación a partir de muestras de control de color único a partir de splenocitos manchados. La Figura 1 muestra el núcleo LVAD humano sin procesar y procesado. La Figura 2 muestra el esquema de gating para la clasificación de flujo de CCR2- y CCR2+ macrófagos humanos. La Figura 3A muestra el esquema de gating para CD45- células estromales del miocardio humano y la Figura 3B muestra imágenes de Wright manchado FACS clasificado CD45+ y CD45- células. La Figura 4 describe el esquema de gating para ordenar los macrófagos de un corazón del ratón.
Figura 1: El núcleo de tejido LVAD humano antes y después del procesamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de gating de citometría de flujo utilizado para identificar y caracterizar las poblaciones de macrófagos cardíacos en muestras de cardiomiopatía dilatada (DCM) o cardiomiopatía isquémica (MIC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de gating de citometría de flujo para aislar CD45- y CD45+ células estromales de muestras humanas. (A) Esquema de gating de citometría de flujo utilizado para aislar CD45- células estromales de muestras de cardiomiopatía isquémica humana (MIC) o cardiomiopatía dilatada (DCM). (B) Wright tiñó las células CD45y CD45+ ordenadas facS. Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esquema de gating de citometría de flujo para aislar varios subconjuntos de macrófagos del corazón del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Antígeno | Fluoróforo | Clon | Fabricante |
| CD45 | PercpCy5.5 | 2D1 | Biolegend |
| CD64 | Fitc | 10.1 | Biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Biolegend |
| CCR2 | APC o BV421 | K036C2 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tabla 1: Panel de anticuerpos para muestra de miocardio humano.
| Antígeno | Fluoróforo | Clon | Fabricante |
| CD45 | PercpCy5.5 | 30-F11 | Biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Biolegend |
| Ly6C | Fitc | HK1.4 | Biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tabla 2: Panel de anticuerpos para la muestra del corazón del ratón.
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Discussion
El protocolo permite la extracción de varios subconjuntos de macrófagos del miocardio humano. El protocolo es simple y tarda de 3 a 4 horas en preparar la suspensión de una sola célula lista para el análisis facS. Aunque el protocolo es relativamente fácil de realizar, hay ciertos aspectos técnicos que deben ser considerados que minimizarán la variabilidad. En primer lugar, trabajar de manera oportuna con tejido humano es necesario para una óptima viabilidad celular. Es importante mantener el tejido en salina fría/ HBSS para minimizar la muerte celular. También es necesario eliminar la grasa epicardial y otros tejidos conectivos de la muestra miocárdica. La picadura constante del tejido y los tiempos de digestión reducirán la muestra a la variación de la muestra.
Hay variabilidad intra-ensayo e interensayo en las digestiones de tejidos y rendimientos celulares posteriores. Esta es una de las limitaciones en la preparación de una suspensión de una sola célula de los tejidos. La forma más importante de minimizar esto es asegurándose de que las enzimas sean relativamente nuevas, debidamente alícidas y almacenadas a -80 oC. Las alícuotas deben utilizarse una sola vez y no deben guardarse ni congelarse de nuevo. Las enzimas utilizadas son sensibles a la congelación de los ciclos de descongelación. Otra consideración es la temperatura de la digestión y la velocidad de agitación. El uso de una coctelera controlada por termostato que distribuye uniformemente el calor ayuda a minimizar la variabilidad de la digestión y a mejorar la viabilidad celular.
Es importante mencionar que el rendimiento absoluto de los macrófagos del miocardio humano generalmente no es muy alto. Por lo general, el rendimiento celular varía de 20.000 a 50.000 macrófagos totales por cada 1.200-1.500 mg de tejido. Esto se vuelve difícil cuando el método de análisis descendente deseado implica ensayos de cultivo celular. La fagocitosis, la producción de quimioquina/citoquina, la estimulación celular, la morfometría y los análisis de expresión génica (microarray, secuenciación de ARN a granel y secuenciación de ARN de una sola célula) se pueden realizar fácilmente. La calidad del tejido también determina la facilidad de digestión y el rendimiento celular posterior. Si el tejido es fibroso y tiene cicatrices, la eficiencia de la digestión es subóptima, y es probable que el rendimiento de los macrófagos sea muy bajo.
Otro aspecto a tener en cuenta es que la digestión del tejido miocárdico conduce a una formación significativa de escombros. Esto hace que el pellet aparezca suelto. Por lo tanto, uno debe tener cuidado de no desechar el sobrenadante durante los pasos de lavado por simple decantación. Es aconsejable utilizar un matraz de recogida de residuos de aspiración/vacío con una pipeta Pasteur para recoger el sobrenadante. Además, el mantenimiento de la centrífuga a 4 oC ayudará a minimizar la muerte celular y la pérdida de muestra.
Aunque este protocolo describe una manera de extraer macrófagos de muestras de tejido miocárdico humano, el aislamiento exitoso de los subconjuntos de macrófagos también se puede lograr de los corazones del ratón sin cambios o modificaciones significativos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue posible gracias a la financiación del Children's Discovery Institute de la Universidad de Washington y del St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), la Fundación del Hospital Judío Barnes (8038-88) y la NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. cuenta con el apoyo de NIH K08 HL123519 y Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
