Summary
Presenteras här är ett protokoll för att isolera olika undergrupper av makrofager och andra icke-immuna celler från mänskliga och mus hjärtmuskeln genom att förbereda en enda cellsuspension genom enzymatisk matsmältning. Gating system för flödescytometri baserad identifiering och karakterisering av isolerade makrofager presenteras också.
Abstract
Makrofager representerar de mest heterogena och rikliga immunceller populationer i hjärtat och är centrala i att köra inflammation och reparativ svar efter hjärtskada. Hur olika undergrupper av makrofager iscensätta immunsvaret efter hjärtskada är ett aktivt forskningsområde. Presenteras här är ett enkelt protokoll som vårt labb utför rutinmässigt, för utvinning av makrofager från mus och mänskliga hjärtmuskeln prover som erhållits från friska och sjuka individer. Kortfattat, detta protokoll innebär enzymatisk nedbrytning av hjärtvävnad för att generera en enda cellsuspension, följt av antikropp färgning, och flödescytometri. Denna teknik är lämplig för funktionella analyser utförs på sorterade celler samt bulk och Single cell RNA sekvensering. En stor fördel med detta protokoll är dess enkelhet, minimal dag till dag variation och bred tillämplighet möjliggör utredning av makrofag heterogenitet över olika musmodeller och mänskliga sjukdomsentiteter.
Introduction
Makrofager representerar den vanligast förekommande immun cells typen i hjärtat, och de spelar betydande roller i att generera robusta inflammatoriska och reparativa svar efter hjärtskada1,2,3,4. Tidigare identifierade vår grupp två stora undergrupper av makrofager i det murina hjärtat som härstammar från distinkta utvecklings ursprung5,6. I stort sett, distinkta populationer av vävnad bosatt hjärt makrofage undergrupper kan identifieras baserat på cellens yta uttrycket av CCR2 (C-C motiv Chemokine receptor 2). CCR2- makrofager (cellytan uttryck: CCR2-mhciilåg och CCR2-mhciihög) är av embryonala ursprung (primitiva och erythromyeloid linjer), kan själv förnya, och utgör en dominerande population under homeostatiska förhållanden. Resident CCR2+ makrofager är av slutgiltigt hematopoietiska ursprung, upprätthålls genom rekrytering från cirkulerande monocyter, och representerar en mindre population under homeostatiska förhållanden. Funktionellt, CCR2- makrofager generera minimal inflammation och är kritiska för koronar utveckling neonatal hjärta förnyelse5,7. Däremot CCR2+ makrofager initiera robusta inflammatoriska reaktioner efter hjärt förolämpningar och bidra till säkerheter kardiomyocyte skada, negativ ombyggnad av vänster kammare, och hjärtsvikt progression8,9.
Nyligen har vi visat att den mänskliga hjärtmuskeln innehåller också två distinkta undergrupper av makrofager identifierats på samma sätt som antingen CCR2- eller CCR2+8. Genuttryck och funktionella analyser avslöjade att Human CCR2- och CCR2+ makrofager representerar funktionellt skilda delmängder och är funktionellt analoga med CCR2- och CCR2+ makrofager som finns i musens hjärta. Human CCR2- makrofager uttrycker robusta nivåer av tillväxtfaktorer, inklusive IGF1, PDGF, CYR61 och HB-EGF. CCR2+ makrofager är berikade i chemokines och cytokiner som främjar inflammation, såsom Il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7, och TNF-a. Stimulerade CCR2+ makrofager utsöndrar markant högre nivåer av den inflammatoriska cytokin interleukinen-1 β (Il-1 β) i kulturen. Hur dessa delmängder bidrar Differentiellt till vävnad reparation och vänsterkammari (LV) remodeling i samband med hjärtskada förblir ett område av aktiv forskning.
Flödescytometri baserad analys av makrofagheterogenitet i mus och mänskligt hjärta kräver att smälta hjärt vävnaden och generera en enda cellsuspension följt av flödescytometrisk analys eller cell sortering för ytterligare nedströms processer såsom bulk RNA sekvensering/Single cell RNA sekvensering eller odling av cellerna för funktionella analyser. Det ursprungliga protokollet för att göra en enda cellsuspension från murina Hearts rapporterades först av Nahrendorf Group i Nahrendorf et al. 200710. Vårt labb har anpassat och modifierat protokollet för att extrahera makrofager från humant hjärtmuskeln. Med hjälp av samma protokoll men med smärre modifiering i färgning och gating system, CD45- stromaceller från humant hjärtmuskeln kan också skördas. Presenteras här, i text och video, är ett protokoll som utförs rutinmässigt för utvinning av makrofager eller stromacellstumörer från den mänskliga myocardium.
Prover från hjärtvävnad erhålls från vuxna patienter med dilaterad kardiomyopati (DCM: idiopatisk eller familjär) eller ischemisk kardiomyopati (ICM) som genomgår implantation av vänster kammar assistans (LVAD) eller hjärttransplantation. Explanted hjärtan eller LVAD kärnar ur intravaskulärt perfunderade med kall saltlösning, innan du påbörjar digestionstillvägagångsslagen. Det är viktigt att notera att "kvalitet" av vävnadsprov bestäms i form av ärrbildning eller fettvävnad infiltration kan i hög grad påverka avkastningen av makrofager. Hjärt prov med stora områden av ärrbildning kommer att ha mycket lägre cell avkastning och kan innebära allvarliga tekniska begränsningar när önskade nedströms analysmetoder kräver in vitro-cellodling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det protokoll som presenteras har godkänts av Washington University i St Louis institutions Review Board (#201305086). Alla ämnen ger informerat samtycke innan prov insamlingen och experimenten utförs i enlighet med det godkända studieprotokollet. Det presenterade protokollet utförs med godkännande av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Washington University School of Medicine och följer de riktlinjer som beskrivs i NIH guide för vård och användning av försöksdjur.
1. beredning av humana Kardiovävnadsprover
- Spola explanterad hjärtan genom kanylering vänster och höger kranskärl Ostia och parfymera med 200 mL kall saltlösning.
- Spola LVAD apikala kärnhus vävnader genom kanylera ett epikardiell kärl och parfymera med 50 ml kall saltlösning.
- Dissekera vävnadsprov från den apikala eller laterala väggen i den vänstra ventrikeln i kall saltlösning eller HBSS med en steril sax.
- Försiktigt dissekera ut epikardiell fett och chordae tendineae från preparatet med hjälp av fin sax.
- Dissekera vävnad bitar i bitar som väger cirka 200 mg med hjälp av en steril blad eller sax.
2. beredning av mus hjärta
- Euthanize musen genom CO2 kvävning eller cervikal dislokation.
- Öppna brösthålan med hjälp av vassa saxar. Använd trubbiga hemostatika för att lyfta hjärtat uppåt. Parfymera hjärtat med kallt PBS med en 25 G nål fäst på en 5 mL spruta. Parfymera tills hjärtat verkar blancherade i färg.
- Ta bort hjärtat och placera i en steril petriskål på is.
3. beredning av encellig suspension
- Placera mänskliga hjärtvävnad bitar (~ 200 mg) eller murina hjärta i en steril petriskål. Finhacka vävnaden med ett sterilt blad eller en steril sax.
- Ställ in digestionerna:
- Använd en slutlig matsmältning volym av 3 mL per mänsklig hjärtvävnad Chunk (200 mg) eller per en murin hjärta. Slutliga enzymkoncentrationer är följande: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), hyaluronidas (60 U/mL).
- Tillsätt DMEM och alla enzymer till ett 15 mL koniskt rör för varje digestionsreaktion. Med hjälp av rena tång, placera finmalet vävnad i varje reaktion röret. Blanda väl av mild vortexing.
- Smälta för 1 h vid 37 ° c i en skakande inkubator inställd på en låg till medelhög omrörnings hastighet.
- Efter 1 h av matsmältningen, ta rören ut från inkubatorn och placera på isen. Ställ in 50 mL koniska rör med en 40 μm cell SIL ovanpå. Fukta filtren med 2 mL enzymdeaktiverande (ED) buffert.
- Avaktivera digestionsenzymerna genom att tillsätta 8 mL ED-buffert i varje rötrest. Häll sedan den resulterande 13 mL total blandningen genom 40 μm cell SIL i 50 mL koniska rören. Överför proverna tillbaka i färskt 15 mL koniskt rör. Detta möjliggör optimal cell pulverform pelleteringsmedel och minimerar cell förluster vid centrifugering.
- Snurra proverna på 400 x g i 6 min (Centrifugera vid 4 ° c). Kassera supernatanten och lämna 0,5 mL media. Omsuspendera cellpelleten genom skonsam pipettering och tillsätt 1 mL ACK lyseringsbuffert. Snurra försiktigt röret och inkubera i rumstemperatur i 5 min för att utföra röda blodkroppar (RBC) Lys.
- Efter 5 min i ACK-buffert, tillsätt 9 mL DMEM till provet. Sätt tillbaka locket på rören och vänd försiktigt rören för att blanda, och filtrera genom en 40 μm cell SIL. Samla upp filtratet i 15 mL koniska rör.
- Centrifugera rören vid 400 x g i 6 min och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 mL FACS-buffert och Omsuspendera pelleten. Överför sedan i cellerna i FACS buffert till en 1,5 mL microcentrifug tub. Centrifugera igen vid 400 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 100 μl FACS-buffert. En enda cellsuspension är nu klar för antikropps färgning.
4. färgning av antikroppar
- En typisk Human antikropps panel består av följande antikroppar: CD45-PercpCy 5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Se tabell 1. Tillsätt alla antikroppar till hjärtinproverna vid 1:50 spädning och inkubera för ~ 30-40 min vid 4 ° c i mörker. Fortsätt till steg 4,4 nedan.
- För stromaceller (endotelceller, fibroblast, glatta muskelceller), tillsätt DRAQ5 (1 μM slutlig koncentration) och CD45-percpCy 5,5. Se tabell 1. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° c i mörker. Fortsätt till steg 4,4 nedan.
- För murina Heart makrofager tillsätt följande antikroppar: CD45-PercpCy 5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, och Ly6G-FITC. Se tabell 2. Tillsätt alla antikroppar till hjärtinproverna vid 1:100 spädning och inkubera för ~ 30-40 min vid 4 ° c i mörker. Fortsätt till steg 4,4 nedan.
- Tvätta proverna två gånger i FACS-bufferten. För varje tvätt, tillsätt 1 mL FACS buffert, försiktigt Vortex, och centrifugera vid 400 x g för 5 min, Omsuspendera i 350 μl av FACS buffert och tillsätt DAPI (1 μm, slutlig koncentration). Proverna är nu klara för FACS analys/sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som beskrivs tillåter isolering av makrofager från mus och humant myocardium. Med hjälp av samma protokoll, men med en annan färgning och gating strategi, stromaceller kan också skördas från den mänskliga myocardium. FACS resultat presenteras här förvärvades antingen på BD LSRII eller BD FACS ARIA III plattform. Kompensationskontroller genererades från enstaka färgkontroll prover från färgade splenocyter. Figur 1 visar obearbetade och bearbetade Human LVAD Core. Figur 2 visar det gating systemet för flödet sortering av CCR2- och CCR2+ mänskliga makrofager. Figur 3A visar det gating systemet för CD45- stromaceller från humant hjärtmuskeln och figur 3B visar bilder av Wright Stained FACS sorterade CD45+ och CD45- celler. Figur 4 beskriver gating systemet att sortera makrofager från en mus hjärta.
Figur 1: den humana LVAD-vävnadens kärna före och efter bearbetningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: flödescytometri gating system utnyttjas för att identifiera och karakterisera hjärt makrofagpopulationer i dilaterad kardiomyopati (DCM) eller ischemisk kardiomyopati (ICM) prover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: flödescytometri gating system för att isolera CD45- och CD45+ stromaceller från mänskliga prover. A) flödescytometrisystem som används för att isolera CD45- stromaceller från Human ischemisk KARDIOMYOPATI (ICM) eller dilaterad KARDIOMYOPATI (DCM). (B) Wright Stained FACS sorterade CD45- och CD45+ celler. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: flödescytometri gating system för att isolera olika makrofage undergrupper från mus hjärtat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antigen | Fluorophore | Klon | Tillverkare |
| CD45 | PercpCy 5,5 | 2D1 | Biolegend |
| CD64 | Fitc | 10,1 | Biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Biolegend |
| CCR2 | APC eller BV421 | K036C2 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabell 1: antikropps panel för humant hjärtmuskeln-preparat.
| Antigen | Fluorophore | Klon | Tillverkare |
| CD45 | PercpCy 5,5 | 30-F11 | Biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Biolegend |
| Ly6C | Fitc | HK 1.4 | Biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| DAPI | Thermo Fisher |
Tabell 2: antikropps panel för mus hjärt prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet tillåter utvinning av olika makrofage undergrupper från humant hjärtmuskeln. Protokollet är enkelt och tar 3 till 4 timmar att förbereda Single cellsuspension redo för FACS analys. Även om protokollet är relativt enkelt att utföra, det finns vissa tekniska aspekter som måste övervägas som kommer att minimera variationer. För det första är det nödvändigt att arbeta i tid med mänsklig vävnad för optimal cellernas lönsamhet. Det är viktigt att hålla vävnaden i kallt saltlösning/HBSS för att minimera celldöd. Det är också nödvändigt att ta bort epikardiell fett och annan bindväv från hjärtinfarkt provet. Konsekvent vävnad malning och matsmältningen gånger kommer att minska urvalet till prov variation.
Det finns både intra-assay och Inter-assay variation i vävnad nedbrytnings och efterföljande cell utbyten. Detta är en av begränsningarna i att förbereda en enda cellsuspension från vävnader. Det viktigaste sättet att minimera detta är genom att se till att enzymer är relativt nya, korrekt aliciterat, och lagras vid-80 ° c. Alikvoter bör endast användas en gång och ska inte sparas eller frysas igen. Enzymer som används är känsliga för frys tining cykler. En annan faktor är temperaturen på matsmältningen och skaka hastighet. Med hjälp av en termostat kontrollerad shaker som jämnt distribuerar värme hjälper till att minimera matsmältningen variation och förbättra cellernas lönsamhet.
Det är viktigt att nämna att absolut avkastning av makrofager från humant hjärtmuskeln är i allmänhet inte mycket hög. Vanligtvis cell utbytet varierar från ~ 20 000 till 50 000 totalt makrofager per 1200-1500 mg vävnad. Detta blir utmanande när den önskade nedströms analysmetoden involverar cellkulturer analyser. Fagocytos, Chemokine/cytokin produktion, cell stimulering, Morphometry, och gen uttrycks analyser (microarray, bulk RNA sekvensering, och Single cell RNA sekvensering) kan enkelt utföras. Kvaliteten på vävnaden bestämmer också lättheten i matsmältningen och efterföljande cell utbyte. Om vävnaden är fibrösa och ärrade, rötnings effektiviteten är suboptimal, och makrofagavkastning är sannolikt mycket låg.
En annan aspekt att tänka på är att myokardiell vävnad nedbrytning leder till betydande skräp formation. Detta gör att pelleten verkar lös. Således måste man vara noga med att inte kasta supernatanten under tvättsteg genom enkel dekantering. Det är tillrådligt att använda en uppsamlings kolv för sug-och vakuum avfall med en Pasteur-pipett för att samla upp supernatanten. Dessutom kommer att bibehålla centrifugen vid 4 ° c bidra till att minimera celldöd och prov förlust.
Även om detta protokoll beskriver ett sätt att extrahera makrofager från mänskliga myokardvävnadsprover, kan lyckad isolering av makrofage-undergrupper också uppnås från mus hjärtan utan betydande förändringar eller modifieringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt möjliggjordes genom finansiering från Children ' s Discovery Institute of Washington University och St. Louis Children ' s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Foundation of Barnes-Jewish Hospital (8038-88), och NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. stöds av NIH K08 HL123519 och Burroughs välkomst fond (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
