Summary
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.
Abstract
ATPase 효소는 아데노신 삼인산에 저장된 자유 에너지를 활용하여 자발적으로 발생하지 않는 생체 내 다양한 엔더고닉 생화학 적 과정을 촉매합니다. 이 단백질은 물질 대사, 세포 분열, 환경 변화 및 운동에 대한 반응을 포함하여 세포 생활의 본질적으로 모든 측면에 중요합니다. 여기서 제시된 프로토콜은 소분자 ATPase 억제제의 반높은 처리량 스크리닝에 적응된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합된 ATPase 분석법을 기술한다. 이 분석법은 심장 및 골격 근 myosin II의, 원리의 증거로, 2개의 액틴 기지를 둔 분자 모터 ATPases에 적용되었습니다. ATP의 가수분해는 분석에서 효소 반응에 의해 NADH의 산화에 결합된다. 먼저, ATPase에 의해 생성된 ADP는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생성된다. PK는 포스포네놀피루바트(PEP)의 전이를 병렬로 피루브화로 촉매한다. 그 후, 피루브산은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소되어 NADH의 산화를 병렬로 촉매합니다. 따라서, ATP 농도의 감소는 NADH 농도의 감소와 직접적으로 상관되며, 이는 NADH의 본질적인 형광에 대한 변화에 뒤따른다. PEP가 반응 시스템에서 사용할 수 있는 한, ADP 농도는 매우 낮게 유지되어 자체 제품에 의한 ATPase 효소의 억제를 피합니다. 또한 ATP 농도는 거의 일정하게 유지되어 선형 시간 코스를 생성합니다. 형광은 지속적으로 모니터링되어 데이터 품질을 쉽게 추정할 수 있으며 잠재적인 아티팩트(예: 복합 침전 또는 열 변화로 인한)를 필터링하는 데 도움이 됩니다.
Introduction
묘신은 진핵생물1,2에서액틴 세포골격의 필라멘트를 따라 방향운동을 생성하기 위해 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 가수분해하는 메카노케미컬 에너지 트랜스듀서이다. 그(것)들은 세포기관의 수송, 근육 수축 또는 세포골격 긴장의 생성과 같은 그들의 각종 세포내 기능에 구조적으로 그리고 운동적으로 적응한1,2. 상기 미오신 수퍼패밀리는 인간 게놈3,4에서~12개의 뚜렷한 묘신 클래스에 속하는 ~40개의 미오신 유전자로 나타난다. 미오신 클래스의 구성원은 여러 암, 신경 장애, 골격 근병증 및 비대성 심근병증5,6과같은 매우 다양한 장애 세트에서 다양한 역할을 한다. 이러한 분자 모터의 많은 생리적 및 병리학적 기능을 감안할 때, 다양한 조건에 대한 약물 표적으로 점점인식되고 있는 것은 놀라운 일이 아니다 7. 최근 새로운 미오신 억제제8,9,10 및 활성제11의발견에 상당한 진전이 이루어졌으며, 기존 12의 특성을개선하고, 13세 , 14세 , 15.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 ATPase 분석기는 오랫동안 사르코플라스 망상 Ca2+ 펌프 ATPase16,DNA 수리 ATPase Rad5417,AAA+와 같은 다양한 효소의 ATPase 활성을 측정하는 데 사용되어 왔습니다. ATPase p9718 또는 미세소관 모터 키네신19. 이 분석은 ATP 재생 주기를 사용합니다. ATPase에 의해 생성된 아데노신 디포스페이트(ADP)는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생되며, 이는 인산피루바트(PEP)의 한 분자를 병렬로 피루베이트로 변형시킵니다. 그 후, 피루브산염은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소됩니다. 즉, 차례로, NAD에 NADH의 한 분자를 산화. 따라서, 시간의 함수로서 NADH 농도의 감소는 ATP 가수분해 속도와 같다. ATP 재생 주기는 PEP를 사용할 수 있는 한 ATP 농도를 거의 일정하게 유지하고 ADP 농도를 낮게 유지합니다. 이것은 선형 시간 과정을 초래, 쉽게 초기 반응 속도를 결정하고 ADP19에의해 제품 억제를 방지하는 데 도움이. NADH 결합 ATPase 분석은 이미 96 웰 포맷20에적응되었지만, 높은 반응 량 (~150 μL)은 시약의 높은 수요로 인해 상대적으로 비싸므로 많은 수의 빠른 스크리닝이 덜 가능합니다. 화합물. ATPase 효소에 의해 생성된 인산염의 검출에 의존하는 말라카이트 녹색 분석법19,21과같은 대체 방법은 소형화 및 고처리량 스크리닝(22)에 더 적합한 것으로 입증되었습니다. , 23세 , 24. 그러나 끝점 분석기는 풀 타임 과정이 없는 상태에서 발견되지 않은 상태로 남아있을 수있는 여러 유물 (아래에 설명됨)의 영향을받을 가능성이 높습니다.
여기서, NADH-결합 된 ATPase 분석기는 소분자 억제제의 반 높은 처리량 스크리닝에 최적화되었습니다. 골격 및 심장 근육 myosin II와 myosin 억제제 blebbistatin8, 파라-aminoblebbistatin13 및 파라-nitroblebbistatin12 는 NADH에 의존하는 분석의 힘을 입증하기 위하여 이용됩니다 판독으로 형광. 이 프로토콜은 모든 ADP 생산 효소에 초점을 맞춘 스크리닝 프로젝트에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 재고 솔루션 및 시약 준비
- 증류수에서 결정성 DTT를 1000 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 디티오트레이톨(DTT) 스톡 용액을 준비한다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 증류수에서 결정성 ATP를 100 mM의 최종 농도로 용해시켜 ATP 스톡 솔루션을 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 70 mM 3-(N-morpholino)를 함유하는 10x NADH 완충제를 준비하여 프로판설포닉산(MOPS), 10 mM MgCl 2, 0.9 mM 에틸렌 글리콜-비스(β-aminoethyl ether)-N,N,N,N,N′, N′, N′,테트라아세트산(EGTA) 및 3 mMNaN을준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 10 mM MOPS 및 0.1 mM EGTA를 포함하는 1x 미오신 완충액을 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 DTT를 0.1 %의 최종 농도에 추가 (w / v %) 사용하기 전에 각각 1 mM.
- 4 mM MOPS, 0.1 mM EGTA, 2 mM MgCl2및 3 mM NaN3를포함하는 1x 액틴 버퍼를 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 최종 농도0.1%(w/v%)에 BSA 및 DTT 추가 사용하기 전에 각각 1 mM.
- 결정성 NADH를 10x NADH 완충액에서 5.5 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 NADH 스톡 용액을 준비한다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 10x NADH 버퍼에서 결정성 PEP를 50 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 PEP 스톡 용액을 준비한다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 글리세롤과 10x NADH 버퍼(50%:50%)의 혼합물에 호우필화된 LDH 분말을 용해시켜 LDH 스톡 용액을 준비합니다. 2000 U/mL의 최종 농도로 결정됩니다. 용액을 존재하지 않은 단백질(7,197 x g, 20°C, 10분)을 제거한다. 상급체를 깨끗한 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮김을 옮김으로 옮김을 조심스럽게 옮김을 넣습니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 글리세롤과 10x NADH 버퍼(50%:50%)를 혼합하여 호우필화된 PK 분말을 용해시켜 PK 스톡 용액을 준비합니다. 10000 U/mL의 최종 농도로 결정됩니다. 용액을 존재하지 않은 단백질(7,197 x g, 20°C, 10분)을 제거한다. 상급체를 깨끗한 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮김을 옮김으로 옮김을 조심스럽게 옮김을 넣습니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 100 μL 증류수를 첨가하여 동구성 심장 및 골격 근미오신 II 샘플을 재구성하여 각각 ~37.9 μM 및 ~40.8 μm myosin 농도 (단모름)에 해당하는 10 mg/mL 스톡 솔루션을 얻습니다. 자세한 내용은 제조업체의 지침을 참조하십시오.
- 파르디와 스푸디치25에의해 설명 된 대로 토끼 근육 아세톤 분말에서 F-액틴을 준비합니다.
2. 작은 분자 억제제의 ATPase 활동 및 억제 효과 측정
- 컴파운드 플레이트를 준비합니다.
- 고품질 디메틸설산화물(DMSO)에 관심 있는 화합물을 용해시다.
- DMSO에서 10 mM 화합물 농도에서 시작하여 15 단계 직렬 1:2 희석을 생성합니다.
- 다중 채널 파이펫을 사용하여 샘플을 384 웰 폴리프로필렌 플레이트에 삼중항(각각 12.5 μL)으로 옮김을 전달합니다. 에지 효과의 영향을 받을 수 있는 웰 수를 최소화하려면 하나의 컴파운드(3개의 열 대신)에 대해 컴파운드 플레이트에 두 행을 사용합니다. 각 화합물에 대한 두 번째 행의 마지막 세 웰을 음수 제어(DMSO만)로 사용합니다. 화합물 희석을 위해 플레이트의 첫 번째 행과 마지막 행을 사용하지 마십시오.
- 순수 한 DMSO를 첫 번째 행의 우물로 전송합니다 (NADH 교정용으로 예약됨).
- 양수 제어를 위해 마지막 행을 사용합니다.
참고: DMSO에서 4 mM 농도에서 파라-아미노블레비스타틴을 여기에서 사용하였습니다.
- 액틴 스톡 용액을 액틴 완충액으로 희석하여 각 분석판(384웰 블랙월 폴리스티렌 마이크로플레이트)에 대해 20 μM 희석액의 4500 μL을 준비한다. 5mL 파이펫을 사용하여 30x 위아래로 파이펫팅하여 액틴 필라멘트를 파괴하여 점도와 이질성을 줄임으로써 솔루션을 철저히 혼합합니다. 존재하는 임의의 침전된 단백질을 제거하는 용액을 원심분리기(7,197 x g,20°C, 10분). 조심스럽게 깨끗한 원심 분리튜브에 상급을 옮김을 옮김을 옮김.
- LDH와 PK 효소("효소 믹스")를 함유한 마스터 믹스를 준비합니다. 각 분석판에 대해, 171.4 μL의 LDH 용액, 171.4 μL의 PK 용액 및 3189.3 μL 또는 3252.9 μl의 미오신 완충액을 각각 15 mL 간선 원심 분리튜브에 결합합니다. 집계 및 강수량을 피하기 위해이 시점에서 myosin을 추가 하지 마십시오.
- 모든 기판("기판 혼합")을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 각 플레이트마다 ATP 162.1 μL, PEP 162.1 μL, NADH 용액 324.1 μL을 15 mL 원소 원심분리튜브에 결합합니다. 집계 및 강수량을 피하기 위해 이 시점에서 액틴을 추가하지 마십시오.
- 250 μM부터 교정을 위해 NADH의 7단계 직렬 1:2 희석을 생성합니다.
- 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 257.7 μL의 미오신 완충액과 NADH 스톡 용액 12.3 μL을 혼합합니다.
- 7 개의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 미오신 완충액의 Aliquot 135 μL.
- 제1 튜브에서 제2 튜브로 용액 135 μL을 전달하고 파이펫팅하여 혼합합니다. 7번째 튜브에 도달할 때까지 반복합니다.
- 마지막 튜브를 NADH 없음 제어(버퍼만 사용)로 사용합니다.
- 8채널 파이펫을 사용하여 NADH 교정 솔루션의 20 μL을 삼중 분석 판의 첫 번째 행으로 이송합니다.
- 효소 믹스에 68 μL의 심장 또는 4.2 μL의 골격 근 미오신 II를 추가합니다. 소용돌이 짧게.
- 첫 번째 행을 제외하고, 자동 디스펜서를 사용하여 제조된 미오신 효소 혼합물의 8.4 μL을 분석 판의 각 웰내로 분배한다.
- 100 nL 핀 툴 헤드가 장착된 자동 액체 처리 시스템을 사용하여 화합물 플레이트에서 효소 혼합을 함유하는 분석 판으로 100 nL의 용액을 전달합니다.
- 마이크로 플레이트 셰이커를 사용하여 실온에서 1200 rpm에서 1 분 동안 분석 판을 흔들어줍니다.
- 기판 혼합물에 원심 분리 된 액틴 용액의 4,052 μL을 추가하십시오. 소용돌이 짧게.
- 11.6 μL의 액틴 기판 혼합물을 분석판의 각 웰(제1열 제외)에 분배하여 자동 디스펜서를 사용하여 효소 반응을 개시한다.
- 마이크로 플레이트 셰이커를 사용하여 실온에서 1200 rpm에서 1 분 동안 분석 판을 흔들어줍니다.
- 30s에 대한 101 x g에서 분석 판을 원심 분리기.
- 플레이트 리더의 내부 온도가 25°C에서 안정화되었는지 확인합니다. 접시를로드하고 다른 30 s를 위해 흔들어. 이 흔들림 단계는 각 우물에서 액체 표면의 모양을 유사하게 하고 플레이트가 측정 온도에 도달할 수 있는 시간을 허용하기 위해 필요합니다.
- NADH 형광을 45초 간격으로 플레이트를 스캐닝하는 30분 동안 기록합니다. 425 nm 컷오프 이색 미러와 함께 380 nm, 10nm 대역폭 여기 필터 및 470 nm, 24 nm 대역폭 방출 필터를 사용합니다. 고농도 모드에서 측정을 실행합니다. 검정을 실행하기 전에 플래시, 검출기 게인, 플레이트 치수 및 측정 높이를 최적화합니다.
참고: 최종 분석 조건은 300 nM 심장/20 nM 골격 근 myosin II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 μM NADH, 1 mM PEP, 1mM ATP를 포함하는 완충제에서 10 mM MPS (pH = 7.0), m2M2M , 0.15 mM EGTA, 0.1 mg/mL BSA, 0.5% (v/v) DMSO 및 1 mM DTT. 총 부피는 20 μL / 웰입니다. 가장 높은 최종 화합물 농도는 50 μM. 20 μM파라-아미노블비스타틴에서 0.5% DMSO로 양성 대조군역할을 하며, 0.5% DMSO만이 음성 대조군이다. 모든 측정은 삼중 항으로 수행됩니다.
3. 데이터 분석
- 각 웰에 대한 시간에 대해 관찰된 형광 강도를 플로팅합니다.
- 간단한 선형 회귀를 수행하여 각 웰에 대한 형광 반응의 기울기 및 절편을 결정합니다. 경사는 ATP(NADH) 소비율에 비례하며, 절편은 측정 시작 시 NADH 농도에 비례합니다(t= 0s).
- NADH의 농도에 대하여 플레이트의 첫 번째 행에 대해 얻어진 절편을 플로팅하여 NADH에 대한 교정 곡선을 구성한다. 요격이 NADH 농도에 선형으로 종속되는지 확인합니다.
참고: 인터셉트는 t°C에서 읽는 원시 형광 강도의 평균보다 훨씬 더 자신감을 가지고 t=0s에서 실제 형광 강도를 추정합니다. - 간단한 선형 회귀를 수행하여 NADH 교정 선의 경사 및 절편을 가져옵니다.
참고: 절편은 형광 배경 신호(NADH 존재 없음)를 설명하고 경사는 특정 실험에서 1M NADH 용액의 추정/이론적 형광 강도에 해당합니다. - NADH 교정 라인의 기울기에 의해 웰의 나머지 부분에 대해 얻어진 형광 반응의 경사를 나누어 형광 변화를 ATP 소비율로 변환합니다.
- 억제제의 농도에 대해 ATP 소비율을 플로팅합니다.
- 억제 상수를 결정하려면 간단한 일대일 바인딩 평형 모델에 해당하는 다음 이차 방정식에 용량 응답 데이터를 맞추기 위해 적절한 통계 소프트웨어를 사용합니다.
여기서 Y는 ATP 소비율이, Y민은 ATP 소비율이 억제제의 부재를 int, Ymax는 이론적 ATP 소비율이 100% 억제, KI는 저해상수 , [E]t 및 [I]t는 각각 효소(myosin) 및 억제제의 총 농도이다.
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Representative Results
선별 실험에 사용되는 일반적인 플레이트 레이아웃 맵은 그림1에 나와 있습니다. 첫 번째 행과 마지막 행은 NADH 교정 및 양성 제어(각각 20 μM para-aminoblebbistatin, 0.5% DMSO)를 위해 예약되어 있습니다. 나머지 행(B~O)은 화합물의 억제 활성을 테스트하는 데 사용된다. 여기서, 15단계 직렬 1:2 희석은 DMSO에서 10 mM 화합물 농도로부터 시작하여 화합물 플레이트로부터 분석판으로 제조 및 이송되고, 따라서 가장 높은 최종 화합물 농도가 50 μM(0.5% DMSO)이 되도록 분석판상에 있다. 두 행은 하나의 화합물(48개의 데이터 포인트/복합)에 대한 용량 응답 곡선을 가져오는 데 사용됩니다. 플레이트 레이아웃 맵은 지정된 프로젝트의 특정 목표를 지원하도록 다시 설계할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 수의 화합물에 대한 단일 포인트 스크리닝 데이터를 얻는 것이 목표인 경우, 양성 제어 및 NADH 교정을 위해 동일한 레이아웃을 사용하여 단일 384 웰 플레이트에서 112개의 화합물을 테스트할 수 있습니다(각 화합물에 대한 삼중항으로 계산) 화합물)을 참조하십시오. 이러한 데이터 포인트는 에지 효과의 영향을 받을 수 있으므로 항상 한 화합물(또는 각 농도)에 대해 최소 3개의 데이터 포인트를 사용하고 한 컴파운드에 대해 플레이트 가장자리를 따라 웰만 사용하지 않는 것이 좋습니다. 가장자리 효과의 중요성을 추정하려면 항상 먼저 음의 컨트롤이 있는 전체 플레이트를 실행합니다.
형광 강도는 도 2A에도시된 바와 같이 NADH의 농도에 대한 선형 의존성을 가짐을 가진다. 선형 맞춤의 기울기는 데이터 분석 중에 형광 변화를 반응 속도로 변환하는 데 사용됩니다. NADH 교정의 각 웰에 대해 얻어진 원시 형광 강도 추적은 먼저 선형 회귀에 의해 분석됩니다(화합물 데이터에 대한 유사한 분석은 도 2B,C에 나타내있음). 이 추적은 형광소의 광표백으로 인해 시간이 지남에 따라 기하 급수적 인 부패를 보일 것으로 예상됩니다. 그러나 광표백은 매우 느리기 때문에 원시 데이터를 선형 맞춤으로 분석할 수 있습니다. 이러한 맞춤의 경사 및 절편은 각각 t = 0s의 광표백 및 형광 강도의 초기 속도에 해당합니다. 이러한 선형 맞춤의 절편은 더 많은 데이터를 기반으로 절편이 추정되므로 NADH 보정 곡선을 구성하기 위해 t = 0s에서 읽는 원시 형광의 평균 대신에 사용되며, 따라서 관련 오차는 훨씬 작습니다.
도 2B,C는 사용된 미오신 또는 억제제의 존재여부에 관계없이, 시간 과정이 측정의 시간 창에서 선형임을 보여준다. 여기서 가장 높은(50 μM) 및 최저(0 μM) 억제제 농도는 각각 ~100% 및 0% 억제에 해당한다. 원시 데이터의 양으로 인해 단일 패널에 표시되면 실제 분석이 혼란스러워 보입니다. 따라서 이러한 패널은 프로세스를 더 잘 시각화하기 위해 단순화되었습니다. 원시 형광 강도 판독의 평균은 모든 병렬 실험(각 농도에 대한 삼중체)에 대해 계산되었고 여기에서 NADH 농도로 변환되었다. 단지 3 억제제 농도가 표시됩니다. 실제 분석에서 각 원시 형광 강도 추적(48/화합물 테스트)은 먼저 선형 회귀에 의해 분석되고, 그 후 경사는 ATP 소비율로 변환됩니다.
해골 및 심장 근육 미오신 II에 대한 도 2D 및 도2E에 나타난 바와 같이 반응 속도가 효소 농도에 따라 선형으로 변한다는 것을 항상 입증하는 것이 좋습니다. 선형 맞춤에 기초하여, 효소의 최종 분석 농도는 쉽게 추정될 수 있다. 예를 들어 30분 시간 코스의 경우 ~ 5 x 10-8 Ms-1의 반응 속도를 권장합니다. 활성제는 반응 혼합물(예: 여기서 액틴)에서 사용되는 경우, 예상되는 효과(activation)가 존재하는지 확인하기 위해 활성제의 존재 및 부재 모두에서 실험을 실행하는 것이 좋습니다. 조건과 절차는 가능한 한 밀접하게 최종 프로토콜을 따라야 합니다. 여기서, 미오신의 희석계열을 8개의 미세원심지 튜브에서 먼저 미오신 완충액으로 제조하였다. 이어서, LDH 및 PK 효소의 혼합을 첨가하였다. 마지막으로, 반응은 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 튜브에 기판 혼합물을 병렬로 첨가함으로써 시작되었다. 반응 혼합물을 삼각액에서 분석 판의 한 행으로 즉시 옮겼다. 액틴이 없는 경우 액틴 버퍼를 대신 사용했습니다. 다른 파라미터는 변경되지 않았다(최종 분석 조건에 대한 프로토콜에서 단계 2.16 참조).
도 2F는 다중 음성 및 양성 대조반응(각각 하프 플레이트)에 대해 얻어진 ATP 소비율을 나타낸다. 이들 데이터는 Z' 값 또는 "스크리닝 윈도우 계수"26에기초하여 비교될 수 있으며, 이는 고처리량 분석의 품질을 추정하기 위해 널리 사용되는 통계적 파라미터이다. 수단과 표준 편차를 모두 고려하여 양수 및 부정 대조군을 비교합니다.
,
여기서 σn, σp 및 μn, μp는 각각 음수 및 양수 대조군의 표준 편차 및 수단입니다. Z의 값이 0.5에서 1 사이인 경우 두 인구는 잘 구분됩니다. 여기서 얻어진 Z' = 0.78은 분석이 우수한26으로간주될 수 있음을 보여준다.
분석이 억제 상수를 결정하는데 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 소분자 미오신 억제제 블레비스타틴8 및 2개의 유사체, 파라-니트로블비스타틴(12) 및 파라-아미노블비스타틴(13)을갖는다. 그림 3A 및 그림 3B와같이 여기에 선택되었습니다. 블레비스타틴은 경쟁력이 없는 알로스테릭 미오신 억제제27,28. 블레비스타틴의 한 분자는 미오신의 하나의 모터 도메인에 결합하고 미오신-ADP-인산염 복합체27,28을안정화시킴으로써 ATPase 주기를 차단한다. 따라서, 블레비스타틴 유도체의 억제 효과는 여기서 간단한 일대일 결합 모델을 사용하여 모델링되었다(프로토콜에서 3.7단계 참조). ATP 소비율이 미오신 농도에 선형 의존성을 나타내지 않은 경우 이 모델이 적용되지 않았을 수 있습니다(그림 2D,E참조). 블레비스타틴, 파라-니트로블비스타틴 및 파라-아미노블비스타틴의 운동수성 용해도는 각각 13μM, 3.6 μM 및 9.3 μM인것으로 보고되었다. 신호에 이상이 우리의 실험에서 보고 된 용해도 이하로 관찰되지 않았다; 그러나 그림4와 같이 블레비스타틴 또는 파라-니트로블비스타틴이 보고된 용해도 값 이상으로 사용될 때 여러 아티팩트가 나타났다. 따라서, 용해도보다 높은 농도에서 기록된 신호는 이러한 경우의 데이터 분석에서 제외되었다. 파라-아미노블비스타틴은 용해성이 높고, 따라서 용해도는 이 경우에 제한적인 요인이 아니었다.
마지막으로, 어떤 긍정적인 안타의 억제 효과 대상 ATPase 효소에 특정 여부를 테스트 하는 것이 좋습니다. 결합된 반응 시스템은 두 개의 다른 효소, LDH 및 PK를 사용하며, 이들 중 하나의 억제는 거짓 양성 신호를 초래할 것이다. 관련없는 ATPase 효소로 ATPase 분석기를 실행하는 것은 이러한 거짓 양성 안타를 필터링하는 데 도움이 될 수 있습니다 (추가 권장 사항에 대한, 토론 참조). 파라-아미노블비스타틴 및 아피라아제, ADP 및 무기 인산염을 생산하는 ATP 가수분해효소(29)는도 5에 도시된 바와 같이 이러한 대조군 실험을 입증하기 위해 여기에 사용하였다.
그림 1 : 분석 판 레이아웃. 250 μM 농도로부터 시작되는 NADH의 7단계 직렬 1:2 희석이 제조되고 이어서 캘리브레이션을 위한 삼중A행으로 분배된다(검정색에서 녹색 색 그라데이션). 행 A의 마지막 세 웰에는 미오신 버퍼만 포함됩니다(NADH 제어 없음, 흰색 없음). 마지막 행(P)은 양성 대조군(20 μM para-aminoblebbistatin; 적색)을 위해 사용된다. 일반적인 용량-반응 실험은 두 행(예를 들어, B 및 C)을 필요로 한다. 따라서, 7개의 투여량-응답 실험은 단일 384 웰 플레이트(파란색에서 흰색 색 그라데이션으로 표시)에 병렬로 실행될 수 있다. 모든 샘플은 삼중으로 로드됩니다. 여기서, 가장 높은 최종 화합물 농도는 50 μM(0.5% DMSO)에서 시작된다. 모든 두 번째 행의 마지막 세 웰은 음의 제어(화합물 없음, 0.5% DMSO 만, 시안)를 위해 예약됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 대표 ATPase 데이터. (a) NADH의 2중 희석 계열을 제조하고 각 측정 플레이트의 제1 열로 옮겼다. 형광 강도는 30분 동안 기록되었고 원시 데이터는 간단한 선형 회귀에 의해 분석되었다. 각 회귀 라인의 차단은 NADH의 농도에 대하여 플롯되었다. 이상적인 경우 t = 0s의 형광 강도를 사용하여 교정 라인을 얻을 수 있습니다. 그러나 원시 형광 데이터가 매우 시끄러운 동안, 절편은 t = 0s에서 형광 강도의 정확한 추정을 제공하고 관련 표준 오차 (오류 막대로 표시)는 매우 작습니다. (B,C) 골격(B)과 심장(C) 근육 미오신II ATPase 반응의 대표적인 형광 강도 트레이스는 파라-아미노블비스타틴의 다양한 레벨(inset 참조)의 존재에 기록되었다. 단순화를 위해 데이터 포인트와 오류 막대는 각각 3개의 독립적인 측정값과 관련 표준 편차의 평균을 나타냅니다. 반응 속도를 얻기 위해 간단한 선형 회귀를 수행하였다(실선). 일반적인 용량-반응 실험은 측정 판의 삼중체에서 15가지 억제제 농도 및 음성 대조군으로 구성되며(그림 1참조) 각 형광에 대해 개별적으로 선형 회귀가 수행됩니다. 강도 추적. 간단히 하기 위해 3개의 다른 농도만 여기에 표시됩니다. (D,E) 기저(적색) 및 액틴 활성화(청색) ATPase 비율은 다양한골격(D) 및 심장(E) 근육 미오신 II 농도에 대해 결정되었다. ATPase 비율은 미오신 농도에 대한 선형 의존성을 보여줍니다. (f) 양성(적색) 및 음극(blue) 대조군(half plate each)을 384-well 세이 플레이트상에서 병렬로 실행하고 Z-인자(Z')를 계산하여 ATPase 분석법의 품질을 평가하였다. Z값이 0.78이면 매우 잘 분리된 양수 및 음수 대조군으로 신뢰할 수 있는 분석값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 용량-응답 곡선 및 억제 상수 분석. 심장(A) 및 골격(B) 근육 미오신 II는 블레비스타틴, 파라-아미노블리스타틴및 파라-니트로블비스타틴의억제 활성을 시험하기 위해 사용되었다. ATPase 레이트(blue)는 원시 형광 데이터에 간단한 선형 회귀를 적용하여 수득하였다. 에러 바는 피팅의 표준 오차를 나타내고 간단한 평형 결합 모델(적색)을 나타내는 이차 방정식(프로토콜에서 3.7단계 참조)을 피팅하는 동안 가중치 계수로서 사용되었다. 용해도 이상으로 얻은 데이터는 아티팩트의 영향을 받았으며 분석에서 제외되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 용해도 관련 아티팩트. (a) ATPase 분석에서 얻어진 블레비스타틴에 대한 형광 강도 추적은 골격근 미오신 II를 사용하여 존재하는 억제제의 양에 따라 선형적으로 감소하는 신호를 보여준다(파란색). 그러나, 블레비스타틴이 용해도(50 μM 초기 블레비스타틴 농도) 이상으로 사용되었을 때, 신호의 증가(적색)가 관찰되었고, 가장 밝은 형광블리비스타틴 결정(13)의 형성으로 인한 가능성이 가장 높았다. (b) 파라-니트로블비스타틴의 경우, 이는 블레비스타틴(12)의 비형광유사체이며, 원시 형광 강도 의 흔적은 정상(감소)으로 나타났다. 그러나, 억제의 가장 높은 수준은 예상보다 훨씬 낮았다 (긍정적 인 대조군을 기반으로). 따라서, 용해도(blue) 이하에서 수득된 반응 속도만 데이터 분석에 포함되었다. 용해도(적색) 이상으로 수득된 반응 속도는 결정된 투여량-반응 곡선(녹색)으로부터 발산되고, 침전은 용액에 잔류하는 억제제의 양(concentration)을 제한한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 억제 효과 파라- 골격 근 myosin II와 아피라제 ATPase 아세 아세 아세아제 의 아미노 블레티스타틴. 파라-아미노블비스타틴은 K I1.7 μM을 가진 골격근 미오신 II를 억제하였고, 아피라제29가 동일한 결합 반응 시스템에서 ATPase로 사용되었을 때 억제가 검출되지 않았다. 본 실험은 파라-아미노블비스타틴이 미오신에 특이적이며 PK 또는 LDH를 억제하지 않는다는 것을 명확하게 입증하며, 따라서 검출된 억제 효과는 아티팩트가 아니다. 아피라아제는 0.5 nM 농도에서 사용되었다. 미오신 또는 액틴이 존재하지 않았고, 반응은 100 mM MOPS(pH=7.0), 3 mM CaCl 2, 2mM MgCl2,3 mM NaN3,1 mM DTT 및 0.1% BSA를 포함하는 완충제에서 수행되었다. 프로토콜을 수정하지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요한 단계
음의 제어만 있는 여러 플레이트(억제제 없는 ATPase 반응)를 실행하여 플레이트 레이아웃을 최적화합니다. 반응 속도의 패턴을 신중하게 검사합니다. 예를 들어, 이들은 "비 바인딩"플레이트의 친수성 표면 코팅의 가장자리 효과 및 / 또는 결함에서 발생할 수 있습니다. 패턴이 관찰되면 아티팩트를 최소화하기 위해 플레이트 유형 및/또는 플레이트 레이아웃을 변경합니다. 예를 들어, 일반적인 투여량-응답 곡선(삼중분액이 있는 16농도, 총 48점)은 3개의 컬럼 또는 384웰 플레이트에 2열로 배열될 수 있다. 이러한 배열은 각각 6데이터와 4개의 데이터 포인트를 생성하며, 이는 에지 효과의 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 행 배열은 항상 바람직합니다.
수정 및 문제 해결
관찰된 형광 반응은 반응의 풀 타임 코스 전반에 걸쳐 선형이어야 합니다. 비선형은 열 변화로 인해 처음 몇 분 또는 평형에 도달하여 마지막 몇 분 동안 발생할 수 있습니다. 비선형이 존재하는 경우 반응 파라미터(예: 미오신 희석, 측정 온도 변화)를 조정하거나 단순히 분석을 데이터의 선형 부분으로 제한할 수 있습니다.
비선형성은 또한 ATPase 효소에 대한 억제제의 결합이 느리면 반응의 시작 부분에 존재할 수 있다(분 이상 발생). 이 경우 효소 억제제 복합체가 축적됨에 따라 시간이 지남에 따라 반응이 느려질 것으로 예상됩니다. 이 문제를 피하기 위해 필요에 따라 기판 혼합물을 첨가하기 전에 분석 판을 배양한다.
분석 조건은 반응의 선형 부분이 15 분 이상인 방식으로 선택되어야합니다. 짧은 선형 부품은 덜 유용한 데이터 포인트에 해당합니다(전체 플레이트의 스캐닝에는 ~45초가 걸리므로). 따라서 선형 맞춤은 훨씬 더 높은 표준 오차와 함께 덜 신뢰할 수 있는 경사(반응 속도)를 생성합니다. 한편, ~120분 이상 운동 판독을 얻는 것은 권장되지 않는다. 이러한 실험은 용매 증발로 인한 단백질 변성 또는 농도 변화에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 기준은 미오신 농도를 조절함으로써 가장 쉽게 충족될 수 있다.
PK 및 LDH에 의해 촉매된 반응이 결합된 반응 시스템에서 속도 제한되지 않도록 하는 것이 중요하다. 관심의 ATPase 없이 또는 강력한 ATPase 억제제의 높은 수준에서 수행 된 제어 실험은 더 (또는 작은) 활성을 표시하지 않을 것이다. 그러나 LDH와 PK가 활성화되어 있고 올바르게 작동하면 ADP가 추가되면 신호가 빠르게 감소합니다. NADH 소비의 비율은 이 대조군 실험에서 매우 높을 것으로 예상되므로 ADP의 첨가에 의해 반응이 개시된 후 가능한 한 빨리 검출을 시작하는 것이 중요합니다.
항상 데이터 분석에서 억제제의 용해도 이상으로 얻은 관찰된 ATPase 속도를 배제하는 것이 좋습니다. 용해도는 화합물의 온도, 순도 및 용액의 조성차이에 따라 달라지므로 실제 조건(온도, 완충액 등)과 매우 유사한 조건에서 측정하는 것이 좋습니다. ATPase 분석이 수행됩니다. 용해도 이상의 소분자 억제제를 사용하려고 하면 결과에 영향을 줄 수 있는 침전이 발생할 수 있습니다(그림 4참조). 침전은 용해도 또는 거의 용해도에 가까운 화합물의 농도를 제한합니다. 따라서, ATPase 속도 더 많은 억제제추가 추가 감소 될 수 없다. ~ 100 % 억제를 보여주는 좋은 양성 대조군을 사용하면 용해도가 알려지지 않은 경우에도 신호에서 이러한 이상을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피팅에 의해 결정된 최대 억제 수준(I max)에 속하는 양성 대조군과반응 속도의 관찰반응속도 간의 큰 차이는 항상 문제의 좋은 지표이다. 이러한 경우 분석에서 점점 더 많은 데이터를 제외하고 또는최대로 긍정적 인 컨트롤을 사용하고 피팅 과정에서 더 나은 적합성을 얻을 때까지 고정 된 상태로 유지하는 것이 좋습니다. 억제제 침전은 또한 강한 광 산란귀착될 수 있고 또한 억제제의 광학적인 속성을 바꿀 수 있습니다, 반응의 시작 부분에 비정상적으로 높은 관찰 신호 강도로 이끌어 내거나 시간이 지남에 따라 증가신호. 원시 데이터는 항상 신중하게 검사해야 하며 영향을 받는 농도는 분석에서 제외해야 합니다.
방법의 제한 사항
낮은 회전율(예를 들어, 심장 근육 myosin II)을 가진 ATPases에 대한 최종 분석 농도는 분석의 시간 창 내에서 측정 가능한 반응 속도를 달성하기 위해 (수백 nM) 높어야 합니다 (30-120 분). 따라서, 용량-응답 곡선의 분석을 위해 이차 결합 모델을 사용하는 것이 중요할 수 있다. 다른 결합 모델(쌍곡선, 힐)은 전형적으로 이러한 데이터의 분석에 적합하지 않다. 더욱이, ATPase의 농도는 K I이 가깝거나 그 이하인 경우 실험 오차의 존재로 인해 투여량 응답 곡선이 실제로 구별되지 않기 때문에 측정 가능한 억제 상수의 범위에 대한 하한을 설정한다. ATPase의 농도.
화합물 효능의 차이는 항상 용량 반응 실험을 수행하고 억제 상수를 결정하여 정량화되어야한다. 단일 포인트 스크리닝 데이터는 이론에서 이러한 차이를 반영하지만, 실험 오차와 함께 응답의 비선형성은 이러한 분석을 수행하기가 매우 어렵게 만들 것입니다. 단일 점 선별 실험은 활성 및 비활성을 구별하기 위해 적절한 억제제 농도와 미리 정의된 임계값 응답 수준을 선택하여 상대적으로 약한 억제제조차도 높은 신뢰도를 가지고 포착하도록 설계되어야 합니다. 화합물.
억제 상수 간의 차이가 통계적으로 유의하다는 것을 확립하는 것은 pKI 대신 PK I(-logKI)을 결정하기 위해 비선형 회귀 방정식을 다시 작성하여 가장 잘 수행됩니다. 일반적으로 배포, K나는 30하지않은 동안 . PKI에 대한 불확실성은 대칭이지만 KI31에대한 대칭은 아닙니다. 신뢰구간은 pK I에 대해 계산될 수 있고, pKI 측정의 수단이 현저하게 다른지 여부를 결정하기 위해 t-검정 또는 분산(ANOVA)의 분석이 사용될 수 있다. 그러나 이러한 통계 적 테스트를 수행할 때는 동종(그룹 내 데이터의 동일한 분산)을 가정할 때 주의해야 합니다. 화합물 용해도 문제로 인해 전체 투여량-응답 곡선을 얻을 수 없을 때 pK I와 관련된 더 높은 차이를 기대할 수 있다. 이 경우 동일한 분산(예: 웰치의 t 검정)을 가정하지 않는 다른 적절한 통계 검정을 사용해야 합니다.
PK 또는 LDH를 억제하는 임의의 화합물은 NADH 결합 ATPase 분석법에서 거짓 양성 신호를 줄 것이다. 이러한 거짓 양성 중 일부는 관련없는 ADP 생산 효소로 분석결과를 실행하여 확인할 수 있습니다. 이 경우, 억제제가 두 효소에 결합하는 ATP 유사체가 아니라면, 실제 양성 적중을 위한 억제는 기대할 수 없다. 이러한 분석을 입증하기 위해, 우리는 미오신과 관련이 없는 ATP 가수분해 효소인 파라-아미노블레비스타틴 및 아피라아제를 사용하여 ATPase 분석을 수행하였다(그림 5참조). 대안적으로, 관심 있는 효소에 특이적인 상이한 기능성 분석법, 또는 PK 및 LDH를 채용하지 않는 상이한 ATPase 분석법은 실제 및 거짓 양성 적중(예를 들어, 말라카이트 녹색 분석법)을 구별하기 위해 실행될 수 있다.
모든 웰에서 형광 강도의 역학을 측정하고 분석하려면 전체 플레이트를 ~90-60초 이내에 스캔할 수 있을 만큼 빠른 플레이트 리더가 필요합니다.
기존/대체 방법에 대한 방법의 중요성
"전통적인" 흡광도 기반판독16,17,18,19,20에반대, 여기에 제시된 수정된 NADH 결합 ATPase 분석술은 NADH 형광에 의존한다. 이것은 분석이 더 민감하게, 사용자가 여기 광강도를 감소시키고, 따라서 NADH 또는 광화학적 분해에 대한 억제물을 보호할 수 있게 합니다.
이 분석서는 일반적으로 많은 수의 샘플을 처리하는 데 적합하지 않은 것으로 간주되었지만384웰 형식으로 여기에 달성 된 작은 반응 량 (20 μL)은 특히 반 높은 처리량 스크리닝 응용 프로그램에 적합합니다. 억제 상수의 결정이 고려되는 경우.
대체 방법은 일반적으로 ATPase 효소에 의해 생성된 무기 인산염의 검출에 의존합니다. 예를 들어, [γ-32P]ATP는 ATPase에 대한 기판으로서 사용될 수 있고, 이어서, 해방된 무기 인산염은 그 방사능에 기초하여 측정될 수 있다. 분석은 민감합니다. 그러나, 방사성 물질의 취급이 필요하며, 나머지 ATP는 무기 인산염(예를 들어, 숯에 ATP의 흡착에 의해)으로부터 분리되어야 한다33. 전술한 말라카이트 녹색 분석에서, 인산염은 산성 조건하에서 몰리브데이트와 반응하고 생성된 인산염 복합체는 말라카이트 녹색 염료를 결합하여 흡수 스펙트럼19,21의변화를 일으킨다. 22,23,24. 이 방법은 또한 ATPase 반응의 담금질이 필요합니다. 따라서 특히 처리량이 높은 형식에서는 주로 끝점 분석으로 사용됩니다. NADH 결합 분석에서 ATPase 반응의 지속적인 모니터링과는 달리, 엔드포인트 분석실험은 단순히 선형 시간 과정을 가정하고 비선형으로 이어지는 아티팩트를 공개할 수 없습니다. 말라카이트 녹색 또는 복합체형성과 상호작용하는 화합물은또한 아티팩트(21)로 이어질 수 있다. 더욱이, 말라카이트 녹색 분석제는 인산염오염(24)에매우 민감하다. 대조적으로, NADH 결합 분석제는 ADP(ATP 샘플의 다양한 수준에서 항상 존재하는)로서 ADP 오염에 민감하지 않으며 반응의 시작 부분에서 PK에 의해 ATP로 빠르게 변형된다. 제품의 담금질 또는 분리가 필요하지 않습니다. ATPase 비율의 측정을 위한 또 다른 형광 분석술은 이미 핵포라제(34)에 의해 촉매반응을 촉매하는 반응에 ATP 가수분해를 결합시킴으로써 개발되었다. 그러나, 그 분석제는 ATP 재생 주기를 이용하지 않으며, 그러므로 초기 반응 비율의 결정은 훨씬 더 도전적일 수 있습니다.
메서드의 향후 응용 프로그램 또는 방향
ATPase 활동에 의존하는 많은 효소는 잠재적인 약물 표적으로 탐구되었습니다. 이들은 키네신(35) 및 다인계 패밀리(36)와 DNA 헬리콥터(37)에속하는 세포골격 운동 단백질을 포함하며, 이들 모두는 다양한 신호 경로에서 말단 이펙터이다. 여기서 설명된 분석은 ADP가 제품인 반응을 촉매하는 효소를 포함하는 약물 발견 및 개발 프로젝트에 쉽게 최적화될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 약물 남용 NS096833 (CAM)에 대한 신경 장애 및 뇌졸중및 국립 연구소의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
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