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Biochemistry

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

Published: August 17, 2019 doi: 10.3791/60017
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 2, 1,2
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

Summary

Un test ATPase couplé à la nicotinamide adenine (NADH) a été adapté au dépistage semi-élevé de la myosine par petite molécule. Cet essai cinétique est exécuté dans un format microplate de 384 puits avec des volumes de réaction totaux de seulement 20 L par puits. La plate-forme devrait s'appliquer à pratiquement n'importe quelle enzyme productrice d'ADP.

Abstract

Les enzymes ATPase utilisent l'énergie libre stockée dans le triphosphate d'adénosine pour catalyser une grande variété de processus biochimiques endergoniques in vivo qui ne se produiraient pas spontanément. Ces protéines sont cruciales pour essentiellement tous les aspects de la vie cellulaire, y compris le métabolisme, la division cellulaire, les réponses aux changements environnementaux et le mouvement. Le protocole présenté ici décrit un nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-couplé ATPase-assay qui a été adapté au criblage semi-haut de débit des inhibiteurs de petite molécule d'ATPase. L'analyse a été appliquée à la myosine du muscle cardiaque et squelettique II, deux ATPases à base d'actine, comme preuve de principe. L'hydrolyse de l'ATP est couplée à l'oxydation de NADH par des réactions enzymatiques dans l'effort. Tout d'abord, l'ADP généré par l'ATPase est régénéré en ATP par pyruvate kinase (PK). PK catalyse la transition du phosphoenolpyruvate (PEP) à la pyruvate en parallèle. Par la suite, le pyruvate est réduit au lactate par la déshydrogénase de lactate (LDH), qui catalyse l'oxydation du NADH en parallèle. Ainsi, la diminution de la concentration d'ATP est directement corrélée à la diminution de la concentration de NADH, qui est suivie du changement à la fluorescence intrinsèque de NADH. Tant que la PPE est disponible dans le système de réaction, la concentration d'ADP reste très faible, évitant l'inhibition de l'enzyme ATPase par son propre produit. En outre, la concentration atp reste presque constante, donnant des cours de temps linéaires. La fluorescence est surveillée en permanence, ce qui permet d'estimer facilement la qualité des données et aide à filtrer les artefacts potentiels (p. ex., résultant de précipitations composées ou de changements thermiques).

Introduction

Les myosines sont des transducteurs d'énergie mécanochimique qui hydrolysent l'adénosine triphosphate (ATP) pour générer un mouvement directionnel le long des filaments du cytosquelette d'actine chez les eucaryotes1,2. Ils se sont adaptés structurellement et kinétiquement à leurs différentes fonctions intracellulaires, telles que le transport d'organites, la contraction musculaire ou la génération de tension cytosquelettique1,2. La superfamille de myosine est représentée par 40 gènes de myosine appartenant à 12 classes distinctes de myosine dans le génome humain3,4. Les membres des classes de myosine jouent divers rôles dans un ensemble très divers de désordres, tels que plusieurs cancers, désordres neurologiques, myopathies squelettiques, et cardiomyopathie hypertrophique5,6. Étant donné le grand nombre de fonctions physiologiques et pathologiques de ces moteurs moléculaires, il n'est pas surprenant qu'ils soient de plus en plus reconnus comme cibles médicamenteuses pour une variété de conditions7. Des progrès significatifs ont été réalisés récemment dans la découverte de nouveaux inhibiteurs de la myosine8,9,10 et activateurs11, et d'améliorer les propriétés des existants12, 13 (en) , 14 (en) , 15.

L'analyse ATPase couplée à la nicotinamide adenine (NADH) a longtemps été utilisée pour mesurer l'activité ATPase de diverses enzymes, telles que le réticulum sarcoplasmique Ca2 pompe ATPase16, la réparation de l'ADN ATPase Rad5417, l'AAA ATPase p9718 ou la kinésine moteur microtubule19. L'analyse utilise un cycle de régénération ATP. L'adénosine diphosphate (ADP) généré par l'ATPase est régénéré en ATP par pyruvate kinase (PK), qui transforme une molécule de phosphoenolpyruvate (PEP) en pyruvate en parallèle. Par la suite, le pyruvate est réduit au lactate par la déshydrogénase de lactate (LDH). Cela, à son tour, oxyde une molécule de NADH à NAD. Par conséquent, la diminution de la concentration de NADH en fonction du temps équivaut au taux d'hydrolyse atp. Le cycle de régénération de l'ATP maintient la concentration d'ATP presque constante et la concentration ADP faible tant que le PEP est disponible. Il en résulte des cours de temps linéaires, ce qui rend simple de déterminer les taux de réaction initiaux et aide à éviter l'inhibition du produit par ADP19. Bien que l'assay ATPase couplé au NADH ait déjà été adapté à un format de 96 puits20, les volumes de réaction élevés (150 l) le rendent relativement cher en raison de la forte demande de réactifs, ce qui le rend moins propice à un dépistage rapide d'un grand nombre de Composés. D'autres méthodes, telles que l'essai vert malachite19,21, qui repose sur la détection du phosphate produit par l'enzyme ATPase, se sont avérées plus appropriées pour la miniaturisation et le dépistage à haut débit22 , 23 Ans, états-unis , 24. Cependant, un point de terminaison est plus susceptible d'être affecté par plusieurs artefacts (discutés ci-dessous), qui peuvent rester inconnus en l'absence de cours à temps plein.

Ici, l'analyse ATPase couplée nADH a été optimisée pour le criblage semi-haut de débit des inhibiteurs de petite molécule. La myosine des muscles squelettiques et cardiaques II et les inhibiteurs de la myosine blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 et para-nitroblebbistatin12 sont utilisés pour démontrer la puissance de l'avertissement, qui repose sur NADH fluorescence comme une lecture. Ce protocole est propice aux projets de dépistage axés sur les enzymes productrices d'ADP.

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Protocol

1. Préparation de solutions de stock et de réactifs

  1. Préparer la solution de stock de dithiothreitol (TNT) en dissolvant la TNT cristalline dans de l'eau distillée à une concentration finale de 1000 mM. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Aliquot et magasin à -20 oC.
  2. Préparer la solution de stock ATP en dissolvant l'ATP cristallin dans de l'eau distillée à une concentration finale de 100 mM. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Aliquot et magasin à -20 oC.
  3. Préparer 10x tampon NADH contenant 70 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM d'éthylène glycol-bis (ether aminoéthyle)-N,N,N,N,Nô,N'-tétraacetic acid (EGTA), et 3 mM NaN3. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Conserver à 4 oC.
  4. Préparer 1x tampon de myosine contenant 10 mM MOPS et 0,1 mM EGTA. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Conserver à 4 oC. Ajouter l'albumine de sérum bovin (BSA) et la TNT à une concentration finale de 0,1 % (w/v%) et 1 mm, respectivement, avant utilisation.
  5. Préparer 1x tampon d'actine contenant 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, et 3 mM NaN3. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Conserver à 4 oC. Ajouter bSA et TNT à une concentration finale de 0,1 % (w/v%) et 1 mm, respectivement, avant utilisation.
  6. Préparer la solution de stock NADH en dissolvant le NADH cristallin dans le tampon 10x NADH à une concentration finale de 5,5 mM. Aliquot et magasin à -20 oC.
  7. Préparer la solution de stock PEP en dissolvant le PEP cristallin dans un tampon NADH 10x jusqu'à une concentration finale de 50 mM. Aliquot et magasin à -20 oC.
  8. Préparer la solution de stock LDH en dissolvant la poudre lyophilisée LDH dans un mélange de glycérol et de tampon NADH 10x (50%:50%) à une concentration finale de 2000 U/mL. Centrifuger la solution pour éliminer toute protéine non dissoute présente (7 197 x g, 20 oC, 10 min). Transférer soigneusement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre. Aliquot et magasin à -20 oC.
  9. Préparer la solution de stock PK en dissolvant la poudre de PK lyophilisée dans un mélange de glycérol et de tampon NADH 10x (50%:50%) à une concentration finale de 10000 U/mL. Centrifuger la solution pour éliminer toute protéine non dissoute présente (7 197 x g, 20 oC, 10 min). Transférer soigneusement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre. Aliquot et magasin à -20 oC.
  10. Reconstituer les échantillons de myosine du muscle cardiaque et squelettique lyophilisé en ajoutant 100 échantillons d'eau distillée ll pour obtenir des solutions de stock de 10 mg/mL correspondant respectivement à 37,9 m et 40,8 millions de myosines (monomeric). Pour plus de détails, consultez les instructions du fabricant.
  11. Préparer F-actin à partir de poudre d'acétone musculaire de lapin tel que décrit par Pardee et Spudich25.

2. Mesurer les activités atpases et les effets inhibiteurs des inhibiteurs des petites molécules

  1. Préparer la plaque composée.
    1. Dissoudre les composés d'intérêt dans le diméthylsulfoxide (DMSO) de haute qualité.
    2. Créez des dilutions en série 1:2 en 15 étapes à partir de 10 mM de concentration composée dans DMSO.
    3. Transférer les échantillons dans une plaque de polypropylène de 384 puits dans des tripliciats (12,5 l chacun) à l'aide d'une pipette multicanal. Utilisez deux rangées sur la plaque composée pour un composé (au lieu de trois colonnes) pour minimiser le nombre de puits potentiellement affectés par les effets de bord. Utilisez les trois derniers puits de la deuxième rangée pour chaque composé comme contrôle négatif (DMSO seulement). N'utilisez pas la première et la dernière rangée sur la plaque pour les dilutions composées.
    4. Transférer d'un DMSO pur dans les puits de la première rangée (réservé à l'étalonnage NADH).
    5. Utilisez la dernière rangée pour un contrôle positif.
      REMARQUE: Para-aminoblebbistatin à 4 mM de concentration dans DMSO a été utilisé ici.
  2. Préparer 4500 l de 20 m de solution d'actine diluée pour chaque plaque d'analyse (384 puits microplaque de polystyrène à parois noires) en diluant la solution de stock d'actine dans le tampon d'actine. Mélanger la solution à fond en faisant monter et descendre 30x à l'aide d'une pipette de 5 ml pour réduire la viscosité et l'hétérogénéité en cassant les filaments d'actine. Centrifuger la solution pour éliminer toute protéine précipitée présente (7 197 x g, 20 oC, 10 min). Transférer délicatement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre.
  3. Préparer le mélange maître contenant des enzymes LDH et PK (« mélange d'enzymes »). Pour chaque plaque d'essai, combinez 171,4 L de solution LDH, 171,4 L de solution PK et 3189,3 L ou 3252,9 L de tampon de myosine pour des analyses impliquant des myosines cardiaques ou squelettiques, respectivement, dans un tube de centrifugeuse conique de 15 ml. N'ajoutez pas de myosine à ce stade pour éviter l'agrégation et les précipitations.
  4. Préparer le mélange maître contenant tous les substrats (« mélange de substrat »). Pour chaque assiette, combiner 162,1 L d'ATP, 162,1 l de PEP et 324,1 L de solution NADH dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml. N'ajoutez pas d'actine à ce stade pour éviter l'agrégation et les précipitations.
  5. Créez des dilutions en série 1:2 en sept étapes de NADH pour l'étalonnage à partir de 250 M.
    1. Mélanger 12,3 L de solution de stock NADH avec 257,7 l de tampon de myosine dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    2. Aliquot 135 l de tampon de myosine en sept tubes microcentrifuges de 1,5 ml.
    3. Transférer 135 l de solution du premier tube dans le second et mélanger par pipetting. Répéter l'opération jusqu'à ce qu'elle atteigne le tube de 7 e.
    4. Utilisez le dernier tube comme contrôle sans NADH (tampon seulement).
  6. À l'aide d'une pipette à 8 canaux, transférer 20 L des solutions d'étalonnage NADH dans la première rangée de la plaque d'assay dans des tripliciats.
  7. Ajouter 68 l de myosine cardiaque ou 4,2 l de myosine du muscle squelettique II au mélange d'enzymes. Vortex brièvement.
  8. À l'exception de la première rangée, distribuez 8,4 l du mélange de myosine-enzyme préparé dans chaque puits de la plaque d'essai à l'aide d'un distributeur automatisé.
  9. Transférer 100 nL de solutions de la plaque composée à la plaque d'essai contenant un mélange d'enzymes à l'aide d'un système automatisé de manipulation liquide équipé d'une tête d'outil de broche de 100 nL.
  10. Agiter la plaque d'analyse pendant 1 min à température ambiante à 1200 tr/min à l'aide d'un shaker microplaque.
  11. Ajouter 4 052 L de la solution d'actine centrifugeau au mélange de substrat. Vortex brièvement.
  12. Distribuer 11,6 L de mélange actin-substrat dans chaque puits de la plaque d'analyse (sauf première rangée) pour démarrer la réaction enzymatique à l'aide d'un distributeur automatisé.
  13. Agiter la plaque d'analyse pendant 1 min à température ambiante à 1200 tr/min à l'aide d'un shaker microplaque.
  14. Centrifuger la plaque d'assay à 101 x g pour 30 s.
  15. Assurez-vous que la température intérieure du lecteur de plaque a été stabilisée à 25 oC. Chargez la plaque et secouez pendant encore 30 s. Cette étape de secousse est nécessaire pour rendre la forme de la surface liquide similaire dans chaque puits et laisse le temps à la plaque d'atteindre la température de mesure.
  16. Enregistrez la fluorescence NADH pendant 30 min en scannant la plaque en 45 s intervalles. Utilisez un filtre d'excitation de bande passante de 380 nm, 10 nm et un filtre d'émission de bande passante de 470 nm et 24 nm en conjonction avec un miroir dichroïque coupé de 425 nm. Exécutez la mesure en mode haute concentration. Optimisez le nombre de flashs, le gain du détecteur, les dimensions de la plaque et la hauteur de mesure avant d'exécuter les essais.
    REMARQUE : Les conditions finales d'essais sont 300 nM cardiaque/20 nM myosine de muscle squelettique II, 10 'M actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 'M NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP dans un tampon contenant 10 mM MOPS (pH '7.0), 2 m MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5 % (v/v) DMSO et 1 mM DTT. Le volume total est de 20 l/puits. La concentration composée finale la plus élevée est de 50 M. 20 m para-aminoblebbistatin dans 0,5% DMSO sert de contrôle positif et 0,5% DMSO seul est le contrôle négatif. Toutes les mesures sont effectuées en tripliques.

3. Analyse des données

  1. Tracer l'intensité de fluorescence observée contre le temps pour chaque puits.
  2. Effectuer une régression linéaire simple pour déterminer la pente et intercepter les réponses de fluorescence pour chaque puits. La pente est proportionnelle au taux de consommation de l'ATP (NADH), tandis que l'interception est proportionnelle à la concentration de NADH au début de la mesure (t ' 0 s).
  3. Construire une courbe d'étalonnage pour NADH en traçant les interceptions obtenues pour la première rangée de la plaque contre la concentration de NADH. Assurez-vous que les interceptions dépendent linéairement de la concentration nADH.
    REMARQUE : Les interceptions estiment les intensités réelles de fluorescence à t ' 0 s avec beaucoup plus de confiance que la moyenne de l'intensité de fluorescence brute se lit à t - 0 s.
  4. Effectuer une simple régression linéaire pour obtenir la pente et intercepter la ligne d'étalonnage NADH.
    REMARQUE : L'interception décrit le signal de fond de fluorescence (aucun NADH présent), alors que la pente correspond à l'intensité extrapolée/théorique de fluorescence d'une solution de 1 M NADH dans cette expérience particulière.
  5. Divisez la pente de la réponse de fluorescence obtenue pour le reste des puits par la pente de la ligne d'étalonnage NADH pour convertir les changements de fluorescence aux taux de consommation d'ATP.
  6. Tracer les taux de consommation d'ATP par rapport à la concentration de l'inhibiteur.
  7. Pour déterminer les constantes inhibitrices, utilisez un logiciel statistique approprié pour adapter les données dose-réponse à l'équation quadratique suivante correspondant à un modèle d'équilibre contraignant simple :
    Equation 1
    où Y est le taux de consommation ATP, Ymin est le taux de consommation ATP int l'absence d'inhibiteur, Ymax est le taux théorique de consommation ATP à 100% d'inhibition, KI est la constante inhibitrice , [E]t et [i]t sont la concentration totale de l'enzyme (myosine) et de l'inhibiteur, respectivement.

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Representative Results

La carte typique de mise en page des plaques utilisée pour les expériences de dépistage est illustrée dans la figure 1. Les première et dernière rangées sont réservées à l'étalonnage et au contrôle positif du NADH (20 M para-aminoblebbistatin, 0,5% de DMSO), respectivement. Les lignes restantes (B à O) sont utilisées pour tester l'activité inhibitrice des composés. Ici, les dilutions en série 1:2 en quinze étapes à partir de 10 mM de concentration composée dans le DMSO sont préparées et transférées de la plaque composée à la plaque d'asto, de sorte que la concentration composée finale la plus élevée est de 50 M (en 0,5 % DMSO) sur la plaque d'astodonte. Deux rangées sont utilisées pour obtenir une courbe dose-réponse pour un composé (48 points de données/composé). Notez que les cartes de mise en page des plaques peuvent être repensées pour soutenir les objectifs spécifiques d'un projet donné. Par exemple, si l'objectif était d'obtenir des données de dépistage à un seul point pour un grand nombre de composés, on pourrait tester 112 composés sur une seule plaque de 384 puits en utilisant la même disposition pour un contrôle positif et l'étalonnage nADH (calcul avec des tripliciats pour chaque composé). Il est toujours conseillé d'avoir un minimum de 3 points de données pour un composé (ou pour chaque concentration) et d'éviter d'utiliser uniquement les puits le long des bords de la plaque pour un composé, car ces points de données peuvent être influencés par des effets de bord. Pour estimer l'importance des effets de bord, exécutez toujours une plaque complète avec le contrôle négatif seulement d'abord.

Les intensités de fluorescence ont une dépendance linéaire à la concentration de NADH comme le montre la figure 2A. La pente de l'ajustement linéaire est utilisée lors de l'analyse des données pour convertir les changements de fluorescence aux taux de réaction. Notez que la trace d'intensité de fluorescence brute obtenue pour chaque puits de l'étalonnage NADH est analysée par régression linéaire d'abord (une analyse similaire est montrée dans la figure 2B, C pour les données composées). On s'attend à ce que ces traces montrent la décomposition exponentielle au fil du temps due au photoblanchiment du fluorophore. Cependant, le photoblanchiment est très lent et, par conséquent, les données brutes peuvent être analysées par des ajustements linéaires. La pente et l'interception de ces ajustements correspondent au taux initial de photoblanchiment et à l'intensité de fluorescence à t - 0 s, respectivement. Les interceptions de ces ajustements linéaires sont utilisées au lieu de la moyenne de la fluorescence brute se lit à t ' 0 s pour construire la courbe d'étalonnage NADH parce que les interceptions sont estimées sur la base de plus de données et, par conséquent, les erreurs associées sont beaucoup plus petites.

La figure 2B,C démontre que, indépendamment de la myosine utilisée ou de la présence de l'inhibiteur, les cours temporels sont linéaires dans la fenêtre temporelle des mesures. Les concentrations d'inhibiteurs les plus élevées (50 m) et les plus faibles (0 M) correspondent ici à une inhibition de 100 % et de 0 %, respectivement. Notez qu'en raison de la quantité de données brutes, l'analyse réelle apparaîtrait chaotique si elle était affichée sur un seul panneau. Par conséquent, ces panneaux ont été simplifiés pour mieux visualiser le processus. La moyenne des lectures d'intensité de fluorescence brute a été calculée pour toutes les expériences parallèles (triplicates pour chaque concentration) et convertie en concentrations de NADH ici. Seulement 3 concentrations d'inhibiteurs sont indiquées. Dans l'analyse réelle, chaque trace d'intensité de fluorescence brute (48/composé testé) est analysée par régression linéaire d'abord, et par la suite, les pentes sont converties en taux de consommation ATP.

Il est toujours conseillé de démontrer que les taux de réaction changent linéairement avec la concentration enzymatique, comme le montrent la figure 2D et la figure2E pour la myosine du skeletal et du muscle cardiaque II, respectivement. Sur la base des ajustements linéaires, la concentration finale d'analyse de l'enzyme peut être facilement estimée. Par exemple, un taux de réaction de 5 x 10-8 Ms-1 est recommandé pour les cours de 30 min. Si un activateur est utilisé dans les mélanges de réaction (comme actin ici), il est recommandé d'exécuter les expériences à la fois en présence et en l'absence de l'activateur pour s'assurer que l'effet attendu (activation) est présent. Les conditions et la procédure doivent suivre le protocole final aussi étroitement que possible. Ici, une série de dilution de la myosine a été préparée dans le tampon de myosine dans huit tubes de microcentrifuge d'abord. Par la suite, un mélange d'enzymes LDH et PK ont été ajoutés. Enfin, les réactions ont commencé par l'ajout de mélange de substrat à chaque tube en parallèle, à l'aide d'une pipette multicanal. Les mélanges de réaction ont été immédiatement transférés à une rangée de la plaque d'astodonte dans des triplicates. Si actin était absent, le tampon d'actine a été utilisé à la place. Aucun autre paramètre n'a été modifié (voir la note de l'étape 2.16 dans le protocole pour les conditions d'assiduie finale).

La figure 2F montre les taux de consommation d'ATP obtenus pour de multiples réactions de contrôle négatives et positives (demi-plaque chacun). Ces données peuvent être comparées en fonction de la valeur de Z ou du « coefficient de fenêtre de filtrage »26, qui est un paramètre statistique largement utilisé pour estimer la qualité des tests à haut débit. Il compare les contrôles positifs et négatifs en tenant compte à la fois des moyens et des écarts types :

Equation 2,

où lesécarts négatifs et positifs sont respectivement les écarts et les moyens des contrôles négatifs et positifs. Les deux populations sont bien séparées si la valeur du Z se situe entre 0,5 et 1. Un Z' 0,78 obtenu ici montre que l'analyse peut être considérée comme excellente26.

Pour démontrer que l'analyse peut être utilisée pour déterminer les constantes inhibitrices, la petite molécule myosine blebbistatin8 et deux analogues, para-nitroblebbistatin12 et para-aminoblebbistatin13 ont été choisi ici, comme le montrent la figure 3A et la figure 3B. Blebbistatin est un inhibiteur de la myosine allostérique non compétitif27,28. Une molécule de blebbistatin se lie à un domaine moteur de la myosine et bloque le cycle ATPase en stabilisant le complexe myosin-ADP-phosphate27,28. Par conséquent, les effets inhibiteurs des dérivés de la blebbistatine ont été modélisés à l'aide d'un modèle de liaison simple et unique ici (voir l'étape 3.7 dans le protocole). Il est à noter que ce modèle n'a peut-être pas été applicable si les taux de consommation de l'ATP n'avaient pas montré de dépendance linéaire à la concentration de myosine (voir la figure 2D,E). La solubilité aqueuse cinétique de la blebbistatine, du para-nitroblebbistatatin et de la para-aminoblebbistatinea été rapportée pour être 426 M, 3.6 m et 9.3 M, respectivement13. Aucune anomalie dans le signal n'a été observée à ou au-dessous des solubilités rapportées dans nos expériences ; cependant, plusieurs artefacts sont apparus lorsque la blebbistatin e ou la para-nitroblebbistatin a été utilisée au-dessus de leurs valeurs de solubilité rapportées, comme le montre la figure 4. Par conséquent, le signal enregistré à des concentrations supérieures à la solubilité a été exclu de l'analyse des données dans ces cas. Lapara-aminoblebbistatine est hautement soluble, et par conséquent, la solubilité n'était pas un facteur limitant dans ce cas.

Enfin, il est toujours recommandé de vérifier si les effets inhibiteurs de tout impact positif sont spécifiques à l'enzyme ATPase cible. Le système de réaction couplé emploie deux autres enzymes, LDH et PK, et l'inhibition de l'un d'eux se traduirait par un faux signal positif. Exécution de l'essai ATPase avec une enzyme ATPase sans rapport peut aider à filtrer ces faux coups positifs (pour d'autres recommandations, voir discussion). Para-aminoblebbistatin et apyrase, une enzyme d'hydrolysme ATP produisant ADP et phosphate inorganique29, ont été utilisés ici comme un exemple pour démontrer une telle expérience de contrôle, comme le montre la figure 5.

Figure 1
Figure 1 : Mise en page des plaques d'astodonte. Sept étapes série 1:2 dilutions de NADH à partir de 250 m de concentration est préparé et ensuite distribué dans la rangée A en tripler pour l'étalonnage (dégradé de couleur noir à vert). Les trois derniers puits de la rangée A contiennent seulement de la myosine (pas de contrôle NADH, blanc). La dernière rangée (P) est utilisée pour le contrôle positif (20 M para-aminoblebbistatin; rouge). Une expérience de dose-réponse typique nécessite deux lignes (p. ex., B et C). Par conséquent, 7 expériences dose-réponse peuvent être menées en parallèle sur une seule plaque de 384 puits (représentée par des dégradés de couleur bleu à blanc). Chaque échantillon est chargé en tripliciates. Ici, les concentrations composées finales les plus élevées commencent à 50 M (en 0,5 % de DMSO). Les trois derniers puits de chaque deuxième rangée sont réservés au contrôle négatif (pas de composé, 0,5% DMSO seulement; cyan). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Données ATPase représentatives. (A) Une série de dilution à deux volets de NADH a été préparée et transférée dans la première rangée de chaque plaque de mesure. L'intensité de fluorescence a été enregistrée pendant 30 min et les données brutes ont été analysées par régression linéaire simple. L'interception de chaque ligne de régression a été tracée contre la concentration de NADH. Notez que dans un cas idéal, l'intensité de fluorescence à t '0 s pourrait simplement être utilisée pour obtenir la ligne d'étalonnage. Cependant, bien que les données de fluorescence brute soient très bruyantes, les interceptions donnent une estimation précise de l'intensité de la fluorescence à t - 0 s et de leur erreur standard associée (indiquée sous forme de barres d'erreur) est très faible. (B,C) Des traces représentatives d'intensité de fluorescence du squelette (B) et des réactions cardiaques (C) de myosine de muscle II d'ATPase ont été enregistrées en présence de divers niveaux (voir insets) de para-aminoblebbistatin. Pour la simplicité, les points de données et les barres d'erreur représentent la moyenne de trois mesures indépendantes et l'écart type associé, respectivement. Une régression linéaire simple a été effectuée (lignes solides) pour obtenir des taux de réaction. Notez qu'une expérience de dose-réponse typique est composée de 15 concentrations d'inhibiteurs différentes et d'un contrôle négatif dans les tripliques sur la plaque de mesure (voir la figure 1) et la régression linéaire est effectuée individuellement pour chaque fluorescence trace d'intensité. Pour plus de simplicité, seules 3 concentrations différentes sont présentées ici. (D,E) Les taux basaux (rouges) et d'ACTine (bleus) atPase ontété déterminés pour diverses concentrations de myosine musculaire squelettique (D) et cardiaque (E). Les taux ATPase montrent une dépendance linéaire à la concentration de myosine. (F) Les commandes positives (rouges) et négatives (bleues) (demi-plaque chacune) ont été exécutés en parallèle sur une plaque d'essai de 384 biens et le facteur Z (Z') a été calculé pour évaluer la qualité de l'analyse ATPase. Une valeur Z de 0,78 indique un test fiable avec des contrôles positifs et négatifs très bien séparés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Courbes dose-réponse et analyse des constantes inhibitrices. Cardiaque (A) et le myosin de muscle deB) ont été employés pour tester l'activité inhibitrice de la blebbistatin, de la para-aminoblebbistatin et de la para-nitroblebbistatatin. Les taux D'ATPase (bleu) ont été obtenus en appliquant la régression linéaire simple aux données brutes de fluorescence. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de l'ajustement et ont été utilisées comme facteurs de pondération lors de l'ajustement d'une équation quadratique (voir l'étape 3.7 dans le protocole) représentant un modèle de liaison d'équilibre simple (rouge). Les données obtenues ci-dessus se sont fait influencer par des artefacts et ont été exclues de l'analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Artefacts liés à la solubilité. (A) Les traces d'intensité de fluorescence pour la blebbistatin obtenue dans un assay d'ATPase utilisant la myosine de muscle squelettique II montrent le signal décroissant linéairement selon la quantité d'inhibiteur présent (bleu). Cependant, lorsque la blebbistatine a été utilisée au-dessus de la solubilité (50 millions de concentration initiale de blebbistatin), une augmentation du signal a été observée (rouge), probablement en raison de la formation de cristaux de blebbistatin lumineux13. (B) Dans le cas de la para-nitroblebbistatin, qui est un analogue non fluorescent de la blebbistatin12, les traces brutes d'intensité de fluorescence sont apparues normales (diminution). Cependant, le niveau d'inhibition le plus élevé était beaucoup plus faible que prévu (basé sur le contrôle positif). Par conséquent, seuls les taux de réaction obtenus ci-dessous solubilité (bleu) ont été inclus dans l'analyse des données. Les taux de réaction obtenus au-dessus de la solubilité (rouge) divergent de la courbe dose-réponse déterminée (vert), car les précipitations limitent la quantité (concentration) de l'inhibiteur restant en solution. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Effets inhibiteurs de para- aminoblebbistatin dans le myosin eodu skeletal II et les essais d'ATPase d'apyrase. Para-aminoblebbistatin inhibé myosin muscle squelettique II avec un KI de 1,7 M, tandis qu'aucune inhibition n'a été détectée lorsque l'apyrase29 a été utilisé comme un ATPase dans le même système de réaction couplée. Cette expérience démontre clairement que la para-aminoblebbistatin est spécifique à la myosine et n'inhibe pas PK ou LDH, ainsi l'effet inhibiteur détecté n'est pas un artefact. L'apyrase a été utilisée à une concentration de 0,5 nM. Aucune myosine ou actine n'était présente, et la réaction a été effectuée dans un tampon contenant 100 mM MOPS (pH 7,0), 3 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 3 mM NaN3, 1 mM DTT, et 0,1% BSA. Aucune autre modification n'a été apportée au protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Étapes critiques du protocole

Optimisez la disposition des plaques en exécutant plusieurs plaques avec un contrôle négatif seulement (réaction ATPase sans inhibiteur). Inspectez soigneusement les résultats pour les tendances des taux de réaction. Par exemple, ceux-ci peuvent résulter d'effets de bord et/ou d'imperfections dans le revêtement hydrophile de surface des plaques « non contraignantes ». Si un modèle est observé, changez le type de plaque et/ou la disposition de la plaque pour minimiser les artefacts. Par exemple, une courbe dose-réponse typique (16 concentrations avec des tripliciats, 48 points au total) peut être disposée en trois colonnes ou deux rangées sur une plaque de 384 puits. Ces arrangements donnent 6 et 4 points de données, respectivement, qui sont probablement affectés par des effets de bord. Par conséquent, l'arrangement de ligne est toujours préféré.

Modifications et dépannage

Notez que les réponses de fluorescence observées doivent être linéaires tout au long du cours complet de la réaction. Des non-linéarités peuvent se produire dans les premières minutes en raison de changements thermiques ou dans les dernières minutes en raison de l'atteinte de l'équilibre. Si des non-linéarles sont présentes, on peut soit ajuster les paramètres de réaction (p. ex., diluer la myosine, modifier la température de mesure) soit simplement limiter l'analyse à la partie linéaire des données.

Des non-linéarités peuvent également être présentes au début des réactions si la liaison de l'inhibiteur de l'enzyme ATPase est lente (se produisant pendant des minutes). Dans ce cas, on s'attend à ce que la réaction ralentisse au fil du temps pendant que le complexe d'enzyme-inhibiteur s'accumule. Incuber la plaque d'assay avant d'ajouter le mélange de substrat au besoin pour éviter ce problème.

Les conditions d'analyse doivent être choisies de manière à ce que la partie linéaire des réactions dure plus de 15 minutes. Les parties linéaires plus courtes correspondent à des points de données moins utiles (lt;20, car la numérisation de la plaque entière prend 45 secondes). Par conséquent, les ajustements linéaires donnent des pentes moins fiables (taux de réaction) avec des erreurs standard beaucoup plus élevées. D'autre part, il n'est pas recommandé d'obtenir des lectures cinétiques de plus de 120 minutes. De telles expériences pourraient être affectées par la dénaturation des protéines ou des changements de concentration dus à l'évaporation des solvants. Ces critères peuvent être remplis plus facilement en ajustant la concentration de myosine.

Il est important de s'assurer que les réactions catalysées par PK et LDH ne sont pas limitant les taux dans le système de réaction couplée. Les expériences de contrôle effectuées sans l'ATPase d'intérêt ou à des niveaux élevés d'un inhibiteur atPase puissant ne montrerait aucune (ou peu) activité. Toutefois, l'ajout d'ADP entraînerait une diminution rapide du signal si LDH et PK sont actifs et fonctionnent correctement. Le taux de consommation de NADH devrait être très élevé dans cette expérience de contrôle, il est donc crucial de commencer la détection dès que possible après que la réaction a été initiée par l'ajout d'ADP.

Il est toujours recommandé d'exclure de l'analyse des données les taux ATPase observés obtenus au-dessus de la solubilité de l'inhibiteur. Comme la solubilité dépend de la température, de la pureté du composé et des différences dans la composition de la solution, il est fortement recommandé de la mesurer dans des conditions très similaires aux conditions réelles (température, tampon, etc.) sous que l'assay ATPase est effectuée. Tenter d'utiliser de petits inhibiteurs de molécules au-dessus de la solubilité peut entraîner des précipitations qui pourraient influencer les résultats (voir la figure 4). Les précipitations limitent la concentration du composé à la solubilité ou presque. Par conséquent, les taux ATPase ne peuvent pas être réduits davantage en ajoutant plus d'inhibiteur. L'utilisation d'un bon contrôle positif qui montre une inhibition de 100 % peut donc aider à identifier de telles anomalies dans le signal, même si la solubilité est inconnue. Une grande différence entre le taux de réaction observé du contrôle positif et le taux de réaction appartenant au niveau maximal d'inhibition (Imax) déterminé par l'ajustement est toujours une bonne indication du problème. Peu à peu, l'exclusion de plus en plus de données de l'analyse et / ou en utilisant le contrôle positif que jemax et le garder fixé pendant le processus d'ajustement jusqu'à ce qu'un meilleur ajustement est obtenu est recommandé dans de tels cas. Les précipitations d'inhibiteur peuvent également entraîner une forte diffusion de la lumière et peuvent également modifier les propriétés optiques de l'inhibiteur, ce qui entraîne des intensités de signal observées anormalement élevées au début des réactions et/ou l'augmentation des signaux au fil du temps. Les données brutes doivent toujours être soigneusement inspectées et les concentrations affectées doivent être exclues de l'analyse.

Limites de la méthode

La concentration finale d'analyse pour les ATPases avec un faible nombre de rotation (par exemple, la myosine du muscle cardiaque II) doit être élevée (plusieurs centaines de nM) pour atteindre des taux de réaction mesurables dans la fenêtre de temps de l'analyse (30 à 120 minutes). Par conséquent, il pourrait être important d'utiliser le modèle de liaison quadratique pour l'analyse des courbes dose-réponse. D'autres modèles de liaison (hyperboliques, Hill) ne conviennent généralement pas à l'analyse de ces données. En outre, la concentration de l'ATPase fixe une limite inférieure à la gamme de constantes inhibitrices mesurables parce que les courbes de réponse de dose deviennent indiscernables dans la pratique en raison de la présence d'erreurs expérimentales si le KI est proche ou inférieur à la concentration de l'ATPase.

Les différences dans les puissances composées doivent toujours être quantifiées en effectuant des expériences dose-réponse et en déterminant les constantes inhibitrices. Bien que les données de dépistage ponctuelle reflètent ces différences en théorie, la non-linéarité des réponses, ainsi que l'erreur expérimentale, rendraient extrêmement difficile l'exécution d'une telle analyse. Les expériences de dépistage à un seul point devraient être conçues pour capturer même les inhibiteurs relativement faibles avec une grande confiance en choisissant une concentration d'inhibiteur séparssif et un niveau de réponse seuil prédéfini pour distinguer entre actif et inactif Composés.

Établir que les différences entre les constantes inhibitrices sont statistiquement significatives est mieux réalisée en réécrivant l'équation pour la régression non linéaire pour déterminer pKI (-logKI) au lieu de KI, comme pKje suis normalement distribué, tandis que Kje n'ai pas30. L'incertitude pour pKI est symétrique, alors qu'il n'est pas symétrique pour KI31. Les intervalles de confiance peuvent être calculés pour le pKI et le test t ou l'analyse de la variance (ANOVA) peut être utilisé pour déterminer si les moyens de mesures pKI sont significativement différents. Toutefois, il faut faire preuve de prudence lors de l'exécution d'un tel test statistique, car ils supposent l'homoscedasticité (même variance des données dans les groupes). On peut s'attendre à une variance plus élevée associée à pKI quand une courbe dose-réponse complète ne peut pas être obtenue en raison de problèmes de solubilité composée. Dans ce cas, d'autres tests statistiques appropriés n'assumant pas des écarts égaux (p. ex., le test t de Welch) devraient être utilisés.

N'importe quel composé inhibant PK ou LDH donnerait un signal positif faux dans l'assay NADH-couplé d'ATPase. Certains de ces faux positifs peuvent être identifiés en exécutant l'essai avec une enzyme de production d'ADP sans rapport. Dans ce cas, aucune inhibition pour les coups positifs réels ne peut être prévue, à moins que l'inhibiteur soit une liaison analogique d'ATP aux deux enzymes. Pour démontrer une telle analyse, nous avons effectué un essai ATPase à l'aide de para-aminoblebbistatin et d'apyrase, une enzyme d'hydrolysme ATP non liée aux myosines (voir figure 5). Alternativement, un essai fonctionnel différent spécifique à l'enzyme d'intérêt, ou un autre essai d'ATPase n'employant pas PK et LDH peut être exécuté pour distinguer entre les coups positifs réels et faux (par exemple, l'essai vert malachite).

La mesure et l'analyse de la cinétique de l'intensité de fluorescence dans tous les puits exigent un lecteur de plaque assez rapide pour numériser la plaque entière en moins de 90 à 60 secondes.

Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes/alternatives

Opposé à la lecture "traditionnelle" basée sur l'absorption16,17,18,19,20, l'exemple modifié NADH couplé ATPase présenté ici repose sur la fluorescence NADH. Cela rend l'essai plus sensible, permettant à l'utilisateur de réduire l'intensité lumineuse de l'excitation et ainsi protéger NADH ou les inhibiteurs contre la décomposition photochimique.

Bien que l'analyse ait été généralement considérée comme ne pouvant pas convenir à la manipulation d'un grand nombre d'échantillons32, les petits volumes de réaction obtenus ici (20 l) dans un format de 384 puits le rendent propice aux demandes de dépistage à semi-débit, en particulier si l'on tient compte de la détermination des constantes inhibitrices.

Les méthodes alternatives reposent généralement sur la détection du phosphate inorganique produit par l'enzyme ATPase. Par exemple, l'ATP [32P] peut être utilisé comme substrat pour l'ATPase et, par la suite, le phosphate inorganique libéré peut être mesuré en fonction de sa radioactivité. L'astodonte est sensible; cependant, elle exige la manipulation de substances radioactives et l'ATP restant doit être séparé du phosphate inorganique (par exemple, par adsorption de l'ATP sur le charbon de bois)33. Dans l'analyse verte malachite mentionnée ci-dessus, le phosphate réagit avec le molybdate dans des conditions acides et le complexe de phosphomolybdate qui en résulte lie le colorant vert malachite provoquant un changement dans son spectre d'absorption19,21, 22,23,24. Cette méthode nécessite également l'étanchéité de la réaction ATPase; par conséquent, il est principalement utilisé comme un point de terminaison-assay, en particulier dans le format de haut débit. Contrairement à la surveillance continue de la réaction ATPase dans l'analyse couplée nADH, un analyse de point de terminaison suppose simplement des cours de temps linéaires et ne peut pas révéler les artefacts conduisant à des non-linéarités. Composés interagissant avec le vert malachite ou le complexe formé peut également conduire à des artefacts21. De plus, l'assay vert malachite est très sensible à la contamination par le phosphate24. En revanche, l'analyse couplée NADH n'est pas sensible à la contamination ADP comme ADP (qui est toujours présent à différents niveaux dans les échantillons ATP) est rapidement transformé en ATP par PK au début de la réaction. Il n'est pas nécessaire d'éteindre ou de séparer les produits. Un autre résultat fluorométrique pour la mesure des taux d'ATPase a déjà été développé en couplant l'hydrolyse ATP à la réaction catalysée par la phosphorylase nucléoside34. Cependant, cet analyse n'utilise pas un cycle de régénération de l'ATP, c'est pourquoi la détermination des taux de réaction initiaux peut être beaucoup plus difficile.

Applications ou orientations futures de la méthode

Beaucoup d'enzymes reposant sur l'activité d'ATPase ont été explorées en tant que cibles potentielles de drogue. Il s'agit notamment des protéines cytosquelettiques motrices appartenant à la kinésie35 et les familles de dynein36 et les hélices de l'ADN37, qui sont tous les effecteurs terminaux dans diverses voies de signalisation. Le test décrit ici peut être facilement optimisé pour la découverte de médicaments et les projets de développement impliquant une enzyme catalysant une réaction dans laquelle ADP est un produit.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Neurological Disorders and Stroke et du National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

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Biochimie Numéro 150 Analyse ATPase NADH fluorescence dépistage semi-haut débit constante inhibitrice myosine
Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules
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Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, … More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

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