Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

Published: August 17, 2019 doi: 10.3791/60017
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 2, 1,2
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

Summary

وقد تم تكييف فحص أدينوكليوتيد أدينين (NADH) المقترنة ATPase لفحص الإنتاجية شبه العالية من مثبطات الموسين جزيء صغير. يتم تشغيل هذا التقييم الحركي في شكل لوحة دقيقة 384 جيدا مع أحجام التفاعل الكلي من 20 ميكرولتر فقط لكل بئر. يجب أن تكون المنصة قابلة للتطبيق على أي إنزيم منتج من ADP تقريبًا.

Abstract

تستخدم إنزيمات ATPase الطاقة الحرة المخزنة في الأدينوسين ثلاثي الفوسفات لتحفيز مجموعة واسعة من العمليات الكيميائية الحيوية الإنجرغوية في الجسم الحي التي لن تحدث تلقائيًا. هذه البروتينات هي حاسمة أساسا لجميع جوانب الحياة الخلوية, بما في ذلك التمثيل الغذائي, انقسام الخلايا, الاستجابات للتغيرات البيئية والحركة. يصف البروتوكول المعروض هنا فحص ادرينالين أدينوكليوتيد (NADH) المقترن بـ ATPase الذي تم تكييفه مع فحص الإنتاجية شبه العالية لمثبطات ATPase جزيء صغير. وقد تم تطبيق هذا القول على عضلة القلب والهيكل العظمي myosin الثاني، وهما المحرك الجزيئي القائم على الأكتين ATPases، كدليل على المبدأ. ويقترن التحلل المائي من ATP إلى أكسدة NADH عن طريق ردود الفعل الأنزيمية في التبيّاع. أولاً، يتم تجديد ADP التي تم إنشاؤها بواسطة ATPase إلى ATP بواسطة بييوروفات كيناز (PK). PK يحفز الانتقال من فوسفونولبيروفات (PEP) إلى بيروفات في نفس الوقت. في وقت لاحق، يتم تقليل بيروفات إلى اللاكتات عن طريق اللاكتات dehydrogenase (LDH)، الذي يحفز أكسدة NADH في نفس الوقت. وبالتالي، يرتبط الانخفاض في تركيز ATP مباشرة بالانخفاض في تركيز NADH، الذي يتبعه تغيير في الفلورة الجوهرية لـ NADH. طالما PEP متاح في نظام رد الفعل، تركيز ADP لا يزال منخفضا جدا، وتجنب تثبيط إنزيم ATPase من قبل المنتج الخاص به. وعلاوة على ذلك، فإن تركيز ATP لا يزال ثابتا تقريبا، مما أسفر عن دورات زمنية خطية. ويتم رصد الفلورة باستمرار، مما يسمح بتقدير سهل لنوعية البيانات ويساعد على تصفية القطع الأثرية المحتملة (على سبيل المثال، الناشئة عن هطول الأمطار المركبأو التغيرات الحرارية).

Introduction

Myosins هي محولات الطاقة الميكانوكيميائية التي تحلل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) لتوليد حركة الاتجاه على طول خيوط الهيكل السيتولي أكتين في eukaryotes1,2. لديهم على حد سواء هيكليا وحركيا تتكيف مع وظائفها داخل الخلايا المختلفة، مثل نقل العضيات، وتقلص العضلات أو توليد التوتر الخلوي الهيكلي1،2. يتم تمثيل عائلة الموسين الخارقة من قبل ~ 40 جينات الموسين التي تنتمي إلى ~ 12 فئات myosin متميزة في الجينوم البشري3،4. أعضاء من فصول myosin تلعب أدوارمختلفة في مجموعة متنوعة للغاية من الاضطرابات, مثل العديد من السرطانات, الاضطرابات العصبية, اعتلال العضلات والهيكل العظمي, واعتلال عضلة القلب الضخامي5,6. وبالنظر إلى العدد الكبير من الوظائف الفسيولوجية والمرضية لهذه المحركات الجزيئية، فإنه ليس من المستغرب أنها أصبحت معترف بها بشكل متزايد كأهداف المخدرات لمجموعة متنوعة من الظروف7. وقد أحرز تقدم كبير مؤخرا في اكتشاف مثبطات الموسين الجديدة8و9و10 والمنشطات11، وتحسين خصائص الموجودةمنها 12، 13 , 14 سنة , 15.

وقد استخدمت منذ فترة طويلة نيكوتيناميد أدينين الدينوكليوتيد (NADH) المقترنة ATPase فحص لقياس نشاط ATPase من الإنزيمات المختلفة، مثل الريسكوبلازمية الشبكية Ca2 + مضخة ATPase16، وإصلاح الحمض النووي ATPase Rad5417، وAAA + ATPase p9718 أو ميكروتوبول الحركية kinesin19. يستخدم هذا التساي دورة تجديد ATP. يتم تجديد أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) التي تم إنشاؤها بواسطة ATPase إلى ATP بواسطة بينوفات كيناز (PK)، الذي يحول جزيء واحد من فوسفونولبيروفات (PEP) إلى بيروفات في نفس الوقت. في وقت لاحق، يتم تقليل البيروفات إلى اللاكتات عن طريق اللاكتات dehydrogenase (LDH). وهذا، بدوره، يُخأكّد جزيء واحد من NADH إلى NAD. ولذلك، فإن الانخفاض في تركيز NADH كدالة للوقت يساوي معدل التحلل المائي ATP. دورة تجديد ATP تحافظ على تركيز ATP ثابت تقريبا وتركيز ADP منخفضة طالما PEP متاح. وهذا يؤدي إلى دورات زمنية خطية، مما يجعل من السهل تحديد معدلات التفاعل الأولية ويساعد على تجنب تثبيط المنتج من قبل ADP19. على الرغم من أن اختبار ATPase المقترنة بNADH قد تم تكييفها بالفعل مع شكل 96-well20، فإن أحجام التفاعل العالية (~ 150 ميكرولتر) تجعلها مكلفة نسبيا بسبب ارتفاع الطلب على الكواشف، مما يجعلها أقل قابلية للفحص السريع لأعداد كبيرة من المركبات. الأساليب البديلة، مثل الفحص الأخضر المالاشيت19،21،الذي يعتمد على الكشف عن الفوسفات الذي ينتجه إنزيم ATPase، ثبت أنها أكثر ملاءمة للتصغير والفحص عالي الإنتاجية22 , 23 , 24- ومع ذلك، من المرجح أن يتأثر الاختبار بنقطة النهاية بعدة قطع أثرية (ترد مناقشتها أدناه)، والتي قد تظل غير مكتشفة في غياب دورات دراسية بدوام كامل.

هنا، تم تحسين فحص ATPase المقترن بNADH لفحص الإنتاجية شبه العالية لمثبطات الجزيئات الصغيرة. الهيكل العظمي وعضلة القلب myosin الثاني ومثبطات myosin blebbistatin8, الفقرة أمينوبلبستاتين13 وpara-nitroblebbistatin 12 تستخدم لإثبات قوة من فحص, الذي يعتمد على NADH الفلورة كقراءة. هذا البروتوكول قابل لفحص المشاريع التي تركز على أي إنزيمات منتجة من شرطة أبوظبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد حلول الأسهم والكواشف

  1. إعداد dithiothreitol (DTT) حل الأسهم عن طريق حل DTT البلورية في الماء المقطر إلى تركيز نهائي من 1000 mM. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد حل مخزون ATP عن طريق حل ATP البلورية في الماء المقطر إلى تركيز نهائي من 100 MM. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد 10X NADH العازلة التي تحتوي على 70 مل 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS)، 10 مل مغكل2،0.9 مليون طن إيثيلين غليكول-بيس (β-aminoethyl الأثير) -N، N، N′،N′-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA)، و 3 MM NaN3. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. إعداد 1x المخزن المؤقت myosin التي تحتوي على 10 مل MOPS و 0.1 mM EGTA. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. إضافة ألبوممصل البقر (BSA) وDTT إلى تركيز نهائي من 0.1٪ (ث / الخامس٪) و1 mM، على التوالي، قبل الاستخدام.
  5. إعداد 1X الأكتين العازلة التي تحتوي على 4 م م MOPS،0.1 mM EGTA، 2 M MCl 2، و 3 MN3. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. إضافة BSA وDTT إلى تركيز نهائي قدره 0.1٪ (ث / v٪) و1 mM، على التوالي، قبل الاستخدام.
  6. إعداد حل مخزون NADH عن طريق حل NADH البلورية في 10X NADH العازلة إلى تركيز نهائي من 5.5 mM. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  7. إعداد حل الأسهم PEP عن طريق حل PEP البلورية في 10X NADH العازلة إلى تركيز نهائي من 50 MM. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  8. إعداد محلول مخزون LDH عن طريق حل مسحوق LDH lyophilized في خليط من الجلسرين و10X NADH العازلة (50٪: 50٪) إلى تركيز نهائي قدره 2000 U/mL. الطرد المركزي الحل لإزالة أي بروتين غير مذاب الحالي (7,197 × ز, 20 °C, 10 دقيقة). نقل supernatant في أنبوب الطرد المركزي نظيفة بعناية. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  9. إعداد محلول مخزون PK عن طريق حل مسحوق PK الليوفيل في خليط من الجلسرين و10X NADH العازلة (50٪: 50٪) إلى تركيز نهائي قدره 10000 U/mL. الطرد المركزي الحل لإزالة أي بروتين غير مذاب الحالي (7,197 × ز, 20 °C, 10 دقيقة). نقل supernatant في أنبوب الطرد المركزي نظيفة بعناية. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  10. إعادة تشكيل عينات عضلة القلب والهيكل العظمي الليوفيل myosin II عن طريق إضافة 100 ميكرولتر الماء المقطر للحصول على 10 ملغ / مل حلول الأسهم المقابلة ل ~ 37.9 ميكرومتر و ~ 40.8 ميكرومتر تركيزات الموسين (مونوميريك)، على التوالي. لمزيد من التفاصيل، راجع إرشادات الشركة المصنعة.
  11. إعداد F-أكتين من مسحوق الأسيتون العضلات الأرنب كما هو موضح من قبل باردي وسبوديش25.

2. قياس أنشطة ATPase والآثار المثبطة لمثبطات الجزيئات الصغيرة

  1. إعداد لوحة مركب.
    1. حل المركبات ذات الاهتمام في ثنائي ميثيل سولفوكسيد عالية الجودة (DMSO).
    2. إنشاء خمسة عشر خطوة المسلسل 1:2 التخفيفات بدءاً من تركيز مركب 10 mM في DMSO.
    3. نقل العينات إلى لوحة البولي بروبلين 384 جيدا في triplicates (12.5 ميكرولتر لكل منهما) باستخدام ماصة متعددة القنوات. استخدم صفين على اللوحة المركبة لمجمع واحد (بدلاً من ثلاثة أعمدة) لتقليل عدد الآبار التي يحتمل أن تتأثر بتأثيرات الحافة. استخدام الآبار الثلاثة الأخيرة في الصف الثاني لكل مركب كتحكم سلبي (DMSO فقط). لا تستخدم الصف الأول والأخير على اللوحة للتخفيف المركب.
    4. نقل DMSO نقية في آبار الصف الأول (محفوظة لمعايرة NADH).
    5. استخدم الصف الأخير للتحكم الإيجابي.
      ملاحظة: تم استخدام باراأمينوبلبِيستاتين عند تركيز 4 مم في DMSO هنا.
  2. إعداد 4500 درجة مئوية من 20 ميكرومتر محلول الأكتين المخفف لكل لوحة فحص (384-well أسود الجدار البوليستيرين ميكروتليت) عن طريق تخفيف محلول الأوراق المالية أكتين في العازلة أكتين. خلط الحل تماما عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 30X باستخدام ماصة 5 مل للحد من اللزوجة وعدم التجانس عن طريق كسر خيوط الأكتين. الطرد المركزي الحل لإزالة أي البروتين عجلت الحالية (7,197 × ز,20 درجة مئوية, 10 دقيقة). نقل بعناية supernatant في أنبوب الطرد المركزي نظيفة.
  3. إعداد مزيج رئيسي يحتوي على إنزيمات LDH وPK ("مزيج الإنزيمات"). لكل لوحة فحص، الجمع بين 171.4 ميكرولتر من محلول LDH، 171.4 ميكرولتر من محلول PK و 3189.3 ميكرولتر أو 3252.9 ميكرولتر من المخزن المؤقت myosin للفحص التي تنطوي على عضلة القلب أو الهيكل العظمي myosin الثاني، على التوالي، في أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل. لا تضيف أي myosin في هذه المرحلة لتجنب التجميع وهطول الأمطار.
  4. إعداد مزيج رئيسي يحتوي على جميع الركائز ("مزيج الركيزة"). لكل لوحة، الجمع بين 162.1 درجة مئوية من ATP، 162.1 ميكرولتر من PEP و 324.1 ميكرولتر من محلول NADH في أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل. لا تقم بإضافة الأكتين في هذه المرحلة لتجنب التجميع وهطول الأمطار.
  5. إنشاء سبع خطوات سلسلة 1:2 تخفيف NADH للمعايرة بدءا من 250 μM.
    1. مزيج 12.3 درجة مئوية من حل المخزون NADH مع 257.7 ميكرولتر من المخزن المؤقت myosin في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل.
    2. Aliquot 135 درجة مئوية من المايوسين العازلة في سبعة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
    3. نقل 135 درجة مئوية من الحل من الأنبوب الأول إلى الثاني ومزيج من الأنابيب. كرر حتى تصل إلىأنبوب 7.
    4. استخدم الأنبوب الأخير كعنصر تحكم لا NADH (المخزن المؤقت فقط).
  6. باستخدام ماصة 8 قنوات، نقل 20 ميكرولتر من حلول معايرة NADH إلى الصف الأول من لوحة القياس في triplicates.
  7. إضافة 68 ميكرولتر من القلب أو 4.2 ميكرولتر من العضلات الهيكلية myosin الثاني إلى مزيج الإنزيم. دوامة لفترة وجيزة.
  8. باستثناء الصف الأول، الاستغناء عن 8.4 ميكرولتر من مزيج إنزيم myosin-إعداد في كل بئر من لوحة اختبار باستخدام موزع الآلي.
  9. نقل 100 مل من الحلول من لوحة مركب إلى لوحة اختبار تحتوي على مزيج الإنزيم باستخدام نظام المناولة السائل الآلي مجهزة 100 نمل رئيس أداة دبوس.
  10. هز لوحة التبيّاق لمدّة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند 1200 دورة في الدقيقة باستخدام الهزاز الدقيق.
  11. إضافة 4052 درجة مئوية من محلول أكتين الطرد المركزي إلى مزيج الركيزة. دوامة لفترة وجيزة.
  12. الاستغناء عن 11.6 ميكرولتر من مزيج الركيزة الأكتين في كل بئر من لوحة اختبار (باستثناء الصف الأول) لبدء رد الفعل الأنزيمي باستخدام موزع الآلي.
  13. هز لوحة التبيّاق لمدّة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند 1200 دورة في الدقيقة باستخدام الهزاز الدقيق.
  14. الطرد المركزي لوحة الفاكس في 101 × ز لمدة 30 ق.
  15. تأكد من أن درجة الحرارة الداخلية لقارئ لوحة قد استقرت عند 25 درجة مئوية. تحميل لوحة ويهز لمدة 30 s أخرى. هذه الخطوة تهتز ضروري لجعل شكل سطح السائل مماثلة في كل بئر ويسمح الوقت لللوحة للوصول إلى درجة حرارة القياس.
  16. سجل NADH الفلورة لمدة 30 دقيقة مسح لوحة في 45 ق فترات. استخدام 380 نانومتر, 10 نانومتر عرض النطاق الترددي الإثارة مرشح و 470 نانومتر, 24 نانومتر مرشح الانبعاثات عرض النطاق الترددي بالاقتران مع مرآة dichroic قطع 425 نانومتر. تشغيل القياس في وضع التركيز العالي. تحسين عدد الومضات، واكتساب كاشف، وأبعاد لوحة وارتفاع القياس قبل تشغيل الاختبارات.
    ملاحظة: حالات فحص النهائي هي 300 nM القلب / 20 nM العضلات الهيكلية myosin الثاني، 10 ميكرومتر أكتين، 40 U / مل LDH، 200 U / مل PK، 220 μM NADH، 1 م PEPM، 1 M ATP في جهاز احتياطي يحتوي على 10 مل MOPS (درجة الحموضة = 7.0)، 2 MM MgCl2 ، 0.15 m EGTA، 0.1 ملغ / مل BSA، 0.5٪ (V / v) DMSO و 1 MDTT. الحجم الإجمالي هو 20 درجة مئوية / جيدا. أعلى تركيز مركب النهائي هو 50 μM. 20 μM الفقرة-أمينوبلبِيستاتين في 0.5٪ DMSO بمثابة السيطرة الإيجابية و 0.5٪ DMSO وحدها هي السيطرة السلبية. يتم إجراء جميع القياسات في triplicates.

3. تحليل البيانات

  1. رسم كثافة الفلورة لوحظ مع الوقت لكل بئر.
  2. إجراء انحدار خطي بسيط لتحديد الميل واعتراض استجابات الفلورة لكل بئر. يتناسب الميل مع معدل استهلاك ATP (NADH)، في حين يتناسب الاعتراض مع تركيز NADH في بداية القياس (t = 0 s).
  3. إنشاء منحنى معايرة لNADH عن طريق رسم الاعتراضات التي تم الحصول عليها للصف الأول من اللوحة ضد تركيز NADH. تأكد من أن الاعتراضات تعتمد خطياً على تركيز NADH.
    ملاحظة: تقدر عمليات الاعتراض كثافة الفلورة الحقيقية في t = 0 s مع ثقة أكبر بكثير من متوسط كثافة الفلورة الخام يقرأ في t - 0 s.
  4. قم بإجراء انحدار خطي بسيط للحصول على الميل واعتراض خط معايرة NADH.
    ملاحظة: يصف الاعتراض إشارة الخلفية الفلورية (لا يوجد NADH الحالي)، في حين يتوافق المنحدر مع كثافة الفلورة الاستقراء/النظرية لحل NADH 1 M في تلك التجربة بالذات.
  5. تقسيم منحدر استجابة الفلورة التي تم الحصول عليها لبقية الآبار عن طريق منحدر خط معايرة NADH لتحويل التغيرات الفلورية إلى معدلات استهلاك ATP.
  6. رسم معدلات استهلاك ATP ضد تركيز المانع.
  7. لتحديد الثوابت المثبطة، استخدم البرامج الإحصائية المناسبة لاحتواء بيانات استجابة الجرعة مع المعادلة التربيعية التالية المقابلة لنموذج توازن ملزم واحد إلى واحد بسيط:
    Equation 1
    حيث Y هو معدل استهلاك ATP، Ymin هو معدل استهلاك ATP INT عدم وجود مثبط، Yماكس هو معدل استهلاك ATP النظري عند تثبيط 100٪، KI هو ثابت مثبط ، [E]ر و [I]ر هي التركيز الكلي للإنزيم (myosin) والمانع، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر خريطة تخطيط اللوحة النموذجية المستخدمة في تجارب الفرز في الشكل 1. يتم حجز الصفوف الأولى والأخيرة لمعايرة NADH والتحكم الإيجابي (20 ميكرومتر بارا-أمينوبلبِستياتين، 0.5٪ DMSO)، على التوالي. يتم استخدام الصفوف المتبقية (B إلى O) لاختبار النشاط المثبط للمركبات. هنا، يتم إعداد خمسة عشر خطوة المسلسل 1:2 تخفيف بدءا من تركيز مركب 10 mM في DMSO ونقلها من لوحة مركب إلى لوحة تخفيض، بحيث أعلى تركيز مركب النهائي هو 50 درجة مئوية (في 0.5٪ DMSO) على لوحة تخفيض. يتم استخدام صفين للحصول على منحنى الجرعة استجابة لمجمع واحد (48 نقطة بيانات / مركب). لاحظ أنه يمكن إعادة تصميم مخططات تخطيط اللوحة لدعم الأهداف المحددة لمشروع معين. على سبيل المثال، إذا كان الهدف هو الحصول على بيانات فحص أحادية النقطة لعدد كبير من المركبات، يمكن للمرء اختبار 112 مركبًا على لوحة واحدة من 384 بئرًا باستخدام نفس التخطيط للتحكم الإيجابي ومعايرة NADH (حساب مع ثلاثية لكل مركبة لكل مركب مركب). ينصح دائما أن يكون الحد الأدنى من 3 نقاط البيانات لمجمع واحد (أو لكل تركيز) وتجنب استخدام الآبار فقط على طول حواف لوحة لمجمع واحد، كما قد تتأثر هذه النقاط البيانات من آثار الحافة. لتقدير أهمية آثار الحافة، تشغيل دائما لوحة كاملة مع السيطرة السلبية فقط أولا.

وكثافة الفلورة تعتمد اعتماداً خطياً على تركيز NADH كما هو مبين في الشكل 2ألف. يتم استخدام ميل الاحتواء الخطي أثناء تحليل البيانات لتحويل تغيرات الفلورة إلى معدلات التفاعل. لاحظ أن تتبع كثافة الفلورة الخام الذي تم الحصول عليه لكل بئر من معايرة NADH يتم تحليله بالانحدار الخطي أولاً (يظهر تحليل مماثل في الشكل 2B،Cللبيانات المركبة). ومن المتوقع أن تظهر هذه الآثار تسوسا ً هائلاً مع مرور الوقت بسبب التبييض الضوئي للفلوروفور. ومع ذلك، تبييض الصور بطيء جدا، وبالتالي، يمكن تحليل البيانات الخام من قبل يناسب الخطية. ويتوافق الميل والاعتراض لهذه النوبات مع المعدل الأولي للتبييض الضوئي وكثافة الفلورة في t = 0 s، على التوالي. يتم استخدام اعتراض هذه النوبات الخطية بدلاً من متوسط الفلورة الخام يقرأ في t = 0 s لبناء منحنى معايرة NADH لأن عمليات الاعتراض مقدرة استناداً إلى المزيد من البيانات، وبالتالي، الأخطاء المرتبطة بها أصغر بكثير.

الشكل 2B،C يوضح أنه بغض النظر عن myosin المستخدمة أو وجود المانع ، والدورات الزمنية الخطية في الإطار الزمني للقياسات. أعلى (50 درجة مئوية) وأدنى (0 درجة مئوية) تركيزات مثبطات هنا تتوافق مع ~ 100٪ و 0٪ تثبيط، على التوالي. لاحظ أنه نظرًا لكمية البيانات الأولية، سيبدو التحليل الفعلي فوضويًا إذا ظهر على لوحة واحدة. ولذلك، تم تبسيط هذه اللوحات لتصور العملية بشكل أفضل. تم حساب متوسط قراءات كثافة الفلورة الخام لجميع التجارب المتوازية (ثلاثية لكل تركيز) وتحويلها إلى تركيزات NADH هنا. يتم عرض 3 تركيزات مثبطات فقط. في التحليل الحقيقي، يتم تحليل كل تتبع كثافة الفلورة الخام (48/مركب اختبار) عن طريق الانحدار الخطي أولا، وبعد ذلك، يتم تحويل المنحدرات إلى معدلات استهلاك ATP.

فمن المستحسن دائما أن تثبت أن معدلات التفاعل تتغير خطيا مع تركيز الإنزيم، كما هو مبين في الشكل 2D والشكل 2E للهيكل العظمي وعضلة القلب myosin الثاني، على التوالي. استناداً إلى النوبات الخطية، يمكن تقدير تركيز الفحص النهائي للإنزيم بسهولة. على سبيل المثال، ينصح بمعدل رد فعل من ~ 5 × 10-8 Ms-1 لدورات الوقت 30 دقيقة. إذا تم استخدام المنشط في خلائط التفاعل (مثل actin هنا)، فمن المستحسن لتشغيل التجارب في كل من وجود وعدم وجود المنشط لضمان وجود التأثير المتوقع (التنشيط). ويجب أن تتبع الشروط والإجراءات البروتوكول النهائي بأكبر قدر ممكن من الدقة. هنا، تم إعداد سلسلة تخفيف من myosin في العازلة myosin في ثمانية أنابيب الطرد المركزي الجزئي أولا. وفي وقت لاحق، أضيف مزيج من إنزيمات LDH وPK. وأخيرا، بدأت ردود الفعل عن طريق إضافة مزيج الركيزة إلى كل أنبوب في نفس الوقت، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات. تم نقل خلطات التفاعل على الفور إلى صف واحد من لوحة التويس في triplicates. إذا كان الأكتين غائباً، يتم استخدام المخزن المؤقت للأكتين بدلاً من ذلك. لم يتم تغيير أية معلمات أخرى (راجع ملاحظة الخطوة 2.16 في البروتوكول للحصول على شروط التبيّن النهائية).

ويبين الشكل 2F معدلات استهلاك ATP التي تم الحصول عليها لردود فعل التحكم السلبية والإيجابية المتعددة (نصف لوحة لكل منها). ويمكن مقارنة هذه البيانات على أساس قيمة Z أو "معامل نافذة الفرز"26، وهو معلمة إحصائية تستخدم على نطاق واسع لتقدير جودة الاختبارات عالية الإنتاجية. وهو يقارن الضوابط الإيجابية والسلبية عن طريق أخذ كل من الوسائل والانحرافات المعيارية في الاعتبار:

Equation 2,

حيث n ، وp و μn، و درجةp هي الانحرافات المعيارية ووسائل الضوابط السلبية والإيجابية، على التوالي. يتم فصل السكان اثنين بشكل جيد إذا كانت قيمة Z 'يقع بين 0.5 و 1. A Z' = 0.78 تم الحصول عليها هنا يظهر أن الفحص يمكن أن يعتبر ممتازا26.

لإثبات أن الفحص يمكن استخدامها لتحديد الثوابت المثبطة، وجزيء صغير myosin المانع blebbistatin8 واثنين من نظائرها، الفقرةnitroblebbistatin12 وشبهأمينوبلبستاتين13 لديها تم اختياره هنا، كما هو مبين في الشكل 3A والشكل 3B. Blebbistatin هو غير تنافسي، مثبطات اللوستريك موسين27،28. جزيء واحد من blebbistatin يربط إلى مجال محرك واحد من myosin وكتل دورة ATPase عن طريق تثبيت مجمع myosin-ADP-الفوسفات27،28. ولذلك، تم نمذجة الآثار المثبطة لمشتقات blebbistatin باستخدام نموذج بسيط، واحد إلى واحد ملزمة هنا (انظر الخطوة 3.7 في البروتوكول). لاحظ أن هذا النموذج قد لا يكون قابلاً للتطبيق إذا لم تظهر معدلات استهلاك ATP اعتمادًا خطيًا على تركيز الموسين (انظر الشكل 2D,E). وقد أفيد أن الذوبان المائي الحركي للبلبِيستاتين، وشبهنيتويبيستاتين وشبهأمينوبلبِيستاتين، هو 426 ميكرومتر، و3.6 ميكرومتر، و9.3 ميكرومتر، على التوالي13. لم تلاحظ أي تشوهات في الإشارة عند أو أقل من الذوبان اتُبلغ عنه في تجاربنا؛ ومع ذلك، ظهرت العديد من القطع الأثرية عندما تم استخدام إما blebbistatin أو para-nitroblebbistatin فوق قيم الذوبان المبلغ عنها، كما هو مبين في الشكل 4. ولذلك، استُبعدت الإشارة المسجلة بتركيزات أعلى من القابلية للذوبان من تحليل البيانات في هذه الحالات. الفقرة-أمينوبلبِيستاتين قابل للذوبان للغاية، وبالتالي، لم يكن الذوبان عاملاً مقيداً في هذه الحالة.

وأخيراً، فمن المستحسن دائماً لاختبار ما إذا كانت الآثار المثبطة لأي إصابات إيجابية محددة لإنزيم ATPase الهدف. يستخدم نظام التفاعل المقترن اثنين من الإنزيمات الأخرى، LDH وPK، وتثبيط واحد من هذه من شأنه أن يؤدي إلى إشارة إيجابية كاذبة. تشغيل اختبار ATPase مع إنزيم ATPase غير ذات صلة قد تساعد على تصفية هذه الزيارات الإيجابية كاذبة (لمزيد من التوصيات، انظر المناقشة). وقداستخدمت بارا-أمينوبلبِيستاتين وأبيراز، وهو إنزيم ATP تحلل إنتاج ADP والفوسفات غير العضوي29، هنا كمثال لإثبات مثل هذه التجربة السيطرة، كما هو مبين في الشكل 5.

Figure 1
الشكل 1 تخطيط لوحة الإنقبة: يتم إعداد سبع خطوات المسلسل 1:2 تخفيف NADH بدءا من تركيز 250 درجة مئوية وصرفها في وقت لاحق في الصف A في ثلاثة أضعاف للمعايرة (أسود إلى أخضر تدرج اللون). الآبار الثلاثة الأخيرة من الصف A تحتوي على المخزن المؤقت myosin فقط (لا يوجد عنصر تحكم NADH، أبيض). الصف الأخير (P) يستخدم للتحكم الإيجابي (20 μM الفقرة-أمينوبلبِيستاتين; أحمر). وتتطلب التجربة النموذجية للاستجابة للجرعة صفين (على سبيل المثال، B و C). لذلك، يمكن تشغيل 7 تجارب الجرعة استجابة بالتوازي على لوحة واحدة 384 جيدا (ممثلة بالتدرجات اللون الأزرق إلى الأبيض). يتم تحميل كل عينة كما triplicates. هنا، أعلى تركيزات المركب النهائي تبدأ في 50 درجة مئوية (في 0.5٪ DMSO). يتم حجز الآبار الثلاثة الأخيرة من كل صف ثان للتحكم السلبي (لا مركب، 0.5٪ DMSO فقط؛ سماوي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 بيانات ATPase التمثيلية. (أ) تم إعداد سلسلة تخفيف مزدوجة من NADH ونقلها إلى الصف الأول من كل لوحة قياس. تم تسجيل كثافة الفلورة لمدة 30 دقيقة وتم تحليل البيانات الخام عن طريق الانحدار الخطي البسيط. تم رسم اعتراض كل خط انحدار ضد تركيز NADH. لاحظ أنه في حالة مثالية، يمكن استخدام كثافة الفلورة في t = 0 s ببساطة للحصول على خط المعايرة. ومع ذلك، في حين أن بيانات الفلورة الخام صاخبة جداً، فإن عمليات الاعتراض تعطي تقديراً دقيقاً لشدة الفلورة في t = 0 s والخطأ القياسي المرتبط بها (كما هو موضح كأشرطة خطأ) صغير جداً. (باء،جيم) تم تسجيل آثار كثافة الفلورة التمثيلية للهيكل العظمي (B) والقلب (C) العضلات myosin II ATPase ردود الفعل في وجود مستويات مختلفة (انظر insets) من الفقرةأمينوبلبستاتين. للبساطة، تمثل نقاط البيانات وأشرطة الخطأ متوسط ثلاثة قياسات مستقلة والانحراف المعياري المرتبط بها، على التوالي. تم تنفيذ الانحدار الخطي البسيط (خطوط صلبة) للحصول على معدلات رد الفعل. لاحظ أن تجربة نموذجية للجرعة والاستجابة تتألف من 15 تركيزات مثبطات مختلفة وتحكم سلبي في الثلاثية على لوحة القياس (انظر الشكل1) ويتم إجراء الانحدار الخطي بشكل فردي لكل فلورة تتبع كثافة. للبساطة، يتم عرض 3 تركيزات مختلفة فقط هنا. (دال،هاء) تم تحديد معدلات ATPase القاعدية (الحمراء) والأكتين المنشط(الأزرق) لمختلف الهياكل العظمية (D) والقلب (E) العضلات myosin II التركيزات. تظهر معدلات ATPase الاعتماد الخطي على تركيز الموسين. (F) تم تشغيل الضوابط الإيجابية (الحمراء) والسلبية (الأزرق) (نصف لوحة لكل منهما) بالتوازي على لوحة فحص 384-well وتم حساب عامل Z (Z') لتقييم نوعية اختبار ATPase. تشير قيمة Z البالغة 0.78 إلى اختبار موثوق به مع عناصر تحكم إيجابية وسلبية منفصلة بشكل جيد جدًا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 منحنيات الجرعة والاستجابة وتحليل الثوابت المثبطة. تم استخدامالقلب (A) والهيكل العظمي (B) العضلات myosin الثاني لاختبار النشاط المثبط من blebbistatin، الفقرةأمينوبلبِيستاتين وشبه-nitroblebbistatin. تم الحصول على معدلات ATPase (الأزرق) عن طريق تطبيق الانحدار الخطي البسيط على بيانات الفلورة الخام. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي في التركيب واستخدمت كعوامل ترجيح أثناء تركيب معادلة رباعية (انظر الخطوة 3.7 في البروتوكول) تمثل نموذج ربط توازن بسيط (أحمر). وتأثرت البيانات التي تم الحصول عليها فوق القابلية للذوبان بالقطع الأثرية واستبعدت من التحليل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 القطع الأثرية المتعلقة بالذوبان: (أ) آثار شدة الفلورة لblebbistatin التي تم الحصول عليها في اختبار ATPase باستخدام العضلات الهيكلية myosin الثاني تظهر إشارة انخفاض خطيا اعتمادا على كمية من المانع الحالي (الأزرق). ومع ذلك، عندما تم استخدام blebbistatin فوق الذوبان (50 درجة مئوية تركيز blebbistatin الأولي)، لوحظت زيادة في إشارة (الأحمر)، على الأرجح بسبب تشكيل بلورات blebbistatin الفلورسنت الزاهية13. (ب) في حالة الفقرة-nitroblebbistatin،وهو التناظرية غير الفلورسنت من blebbistatin12، ظهرت آثار كثافة الفلورة الخام طبيعية (تناقص). ومع ذلك، كان أعلى مستوى من تثبيط أقل بكثير مما كان متوقعا (استنادا إلى السيطرة الإيجابية). ولذلك، لم تدرج في تحليل البيانات سوى معدلات التفاعل التي تم الحصول عليها دون الذوبان (الأزرق). وتختلف معدلات التفاعل التي يتم الحصول عليها فوق القابلية للذوبان (الأحمر) عن منحنى الجرعة والاستجابة المحدد (الأخضر)، حيث يحد هطول الأمطار من كمية (تركيز) المثبط المتبقي في الحل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 الآثار المثبطة لل: الفقرة الفرعية أمينوبلبِيستاتين في العضلات الهيكلية myosin الثاني وapyrase ATPase الاختبارات. Para-aminoblebbistatin تثبيط العضلات الهيكلية myosin الثاني مع KI من 1.7 μM, في حين لم يتم الكشف عن أي تثبيط عندما تم استخدام apyrase29 كATPase في نفس نظام رد الفعل المقترنة. هذه التجربة تبين بوضوح أن شبهأمينوبلبِيستاتين هو خاص بـ myosin ولا يمنع PK أو LDH، وبالتالي فإن التأثير المثبط المكتشف ليس قطعة أثرية. وقد استخدم البيراس بتركيز 0.5 مليون متر. لم يكن هناك myosin أو actin، وتم تنفيذ رد الفعل في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100مل MOPS (الرقم الهيدروجيني = 7.0)، 3 مليون متر CaCl 2، 2 MM MgCl2،3 MM NaN3،1 mM DTT، و 0.1٪ BSA. ولم تُدخلت أي تعديلات أخرى على البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول

تحسين تخطيط لوحة عن طريق تشغيل عدة لوحات مع السيطرة السلبية فقط (رد فعل ATPase مع عدم وجود مثبط). فحص النتائج بعناية لأنماط في معدلات رد الفعل. على سبيل المثال، قد تنشأ هذه من آثار الحافة و / أو العيوب في طلاء سطح الماء من لوحات "غير ملزمة". إذا لوحظ نمط، قم بتغيير نوع اللوحة و/أو تخطيط اللوحة لتقليل القطع الأثرية. على سبيل المثال، يمكن ترتيب منحنى نموذجي للجرعة والاستجابة (16 تركيزات مع ثلاثة توائم، 48 نقطة المجموع) إما في ثلاثة أعمدة أو صفين على لوحة 384 جيدا. وتسفر هذه الترتيبات عن 6 و4 نقاط بيانات، على التوالي، يحتمل أن تتأثر بتأثيرات الحافة. لذلك، يتم دائماً تفضيل ترتيب الصف.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

لاحظ أن استجابات الفلورة الملاحظة يجب أن تكون خطية طوال الوقت الكامل لرد الفعل. قد تحدث غير الخطية في الدقائق القليلة الأولى بسبب التغيرات الحرارية أو في الدقائق القليلة الماضية بسبب الوصول إلى التوازن. وإذا كانت العوامل غير الخطية موجودة، يمكن للمرء إما ضبط بارامترات التفاعل (على سبيل المثال، تمييع الموسين، وتغيير درجة حرارة القياس) أو ببساطة قصر التحليل على الجزء الخطي من البيانات.

قد تكون غير الخطية موجودة أيضا في بداية ردود الفعل إذا كان ربط المانع إلى إنزيم ATPase بطيء (يحدث على مدى دقائق). في هذه الحالة، من المتوقع أن يتباطأ رد الفعل مع مرور الوقت مع تراكم مجمع مثبطات الإنزيم. احتضان لوحة تحليل قبل إضافة مزيج الركيزة حسب الضرورة لتجنب هذه المشكلة.

يجب اختيار شروط التبيّن بطريقة تكون فيها الجزء الخطي من ردود الفعل أطول من 15 دقيقة. تتوافق الأجزاء الخطية الأقصر مع نقاط بيانات أقل فائدة (<20، حيث يستغرق مسح اللوحة بأكملها حوالي 45 ثانية). ولذلك، فإن الخطي يناسب العائد المنحدرات أقل موثوقية (معدلات رد الفعل) مع أخطاء قياسية أعلى بكثير. من ناحية أخرى، لا ينصح للحصول على قراءات حركية أطول من ~ 120 دقيقة. قد تتأثر هذه التجارب بإزالة الصبغة البروتينية أو تغيرات التركيز بسبب تبخر المذيبات. ويمكن استيفاء هذه المعايير بسهولة أكبر عن طريق ضبط تركيز الموسين.

من المهم التأكد من أن ردود الفعل التي تحفزها PK وLDH لا تحد من معدل في نظام رد الفعل المقترنة. تجارب التحكم التي أجريت دون ATPase من الفائدة أو على مستويات عالية من مثبطات ATPase قوية لن تظهر أي نشاط (أو القليل). ومع ذلك، فإن إضافة ADP سيؤدي إلى انخفاض إشارة سريعة إذا كان LDH وPK نشطة وتعمل بشكل صحيح. ومن المتوقع أن يكون معدل استهلاك NADH مرتفعاً جداً في تجربة التحكم هذه، لذلك من الأهمية بمكان البدء في الكشف في أقرب وقت ممكن بعد بدء رد الفعل بإضافة شرطة أبوظبي.

فمن المستحسن دائما لاستبعاد أي معدلات ATPase لوحظ ة تم الحصول عليها فوق قابلية الذوبان من المانع من تحليل البيانات. وبما أن الذوبان يعتمد على درجة الحرارة، ونقاء المركب، والاختلافات في تكوين الحل، فمن المستحسن للغاية لقياسه في ظل ظروف مشابهة للغاية للظروف الفعلية (درجة الحرارة، العازلة، الخ) تحت التي يتم إجراء هاتباس. قد تؤدي محاولة استخدام مثبطات جزيء صغير فوق الذوبان إلى هطول الأمطار التي يمكن أن تؤثر على النتائج (انظر الشكل4). هطول الأمطار يحد من تركيز المجمع في أو بالقرب من الذوبان. ولذلك، لا يمكن تخفيض معدلات ATPase أكثر عن طريق إضافة المزيد من المثبطات. استخدام عنصر تحكم إيجابي جيد يظهر ~ 100٪ تثبيط، لذلك، يمكن أن تساعد على تحديد مثل هذه الشذوذ في الإشارة، حتى لو كان الذوبان غير معروف. وهناك فرق كبير بين معدل رد الفعل الملاحظ للسيطرة الإيجابية ومعدل رد الفعل التي تنتمي إلى مستوى تثبيط قصوى (أناكحدأقصى) التي يحددها تركيب هو دائما مؤشر جيد للمشكلة. تدريجيا استبعاد المزيد والمزيد من البيانات من التحليل و / أو استخدام السيطرة الإيجابية وأناماكس والحفاظ على ثابتة خلال عملية المناسب حتى يتم الحصول على تناسب أفضل ينصح في مثل هذه الحالات. كما قد يؤدي هطول الأمطار المثبط إلى تشتت قوي للضوء وقد يغير أيضاً الخصائص البصرية للمثبط، مما يؤدي إلى كثافات عالية بشكل غير طبيعي للإشارة الملاحظة في بداية التفاعلات و/أو زيادة الإشارات مع مرور الوقت. ويجب دائما ً فحص البيانات الأولية بعناية، كما يجب استبعاد التركيزات المتأثرة من التحليل.

قيود الأسلوب

يجب أن يكون تركيز الفحص النهائي لـ ATPases مع عدد دوران منخفض (على سبيل المثال، عضلة القلب myosin II) مرتفعًا (عدة مئات من الـ nM) لتحقيق معدلات تفاعل قابلة للقياس ضمن الإطار الزمني للفحص (30-120 دقيقة). ولذلك، قد يكون من المهم استخدام نموذج الربط التربيعي لتحليل منحنيات الاستجابة للجرعة. نماذج ملزمة أخرى (القطع الزائد، هيل) عادة ليست مناسبة لتحليل هذه البيانات. وعلاوة على ذلك، فإن تركيز ATPase يضع حدا ً أدنى لمجموعة الثوابت المثبطة القابلة للقياس لأن منحنيات استجابة الجرعة لا يمكن تمييزها في الممارسة العملية بسبب وجود أخطاء تجريبية إذا كان KI قريبًا من أو أقل من تركيز ATPase.

وينبغي دائماً تحديد الاختلافات في الفعالية المركبة كمياً عن طريق إجراء تجارب الجرعة والاستجابة وتحديد الثوابت المثبطة. وعلى الرغم من أن بيانات الفرز بنقطة واحدة تعكس هذه الاختلافات من الناحية النظرية، فإن عدم الخطية في الردود، إلى جانب الخطأ التجريبي، سيجعل من الصعب للغاية إجراء مثل هذا التحليل. وينبغي تصميم تجارب فحص نقطة واحدة لالتقاط حتى مثبطات ضعيفة نسبيا مع ثقة عالية عن طريق اختيار تركيز مثبطات مناسبة ومستوى استجابة عتبة محددة مسبقا للتمييز بين نشط وغير نشط المركبات.

إثبات أن الاختلافات بين الثوابت المثبطة ذات أهمية إحصائية يتم تنفيذها على أفضل وجه عن طريق إعادة كتابة المعادلة للانحدار غير الخطي لتحديد pKI (-logKI)بدلاً من KI، كما pKI توزيعها عادة، في حين Kأنا ليست30. عدم اليقين لpKI متناظرة، في حين أنها ليست متناظرة لKI31. يمكن حساب فترات الثقة لpKI و t-test أو تحليل التباين (ANOVA) يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كانت وسائل قياسات pKI مختلفة بشكل ملحوظ. ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند إجراء مثل هذا الاختبار الإحصائي كما أنها تفترض المثلية (نفس الفرق في البيانات في مجموعات). يمكن للمرء أن يتوقع تباين أعلى المرتبطة pKالأول عندما لا يمكن الحصول على منحنى جرعة استجابة كاملة بسبب قضايا الذوبان المركب. وفي هذه الحالة، ينبغي استخدام اختبارات إحصائية مناسبة أخرى لا تفترض وجود فروق متساوية (مثل اختبار ويلش).

أي مركب تثبيط PK أو LDH من شأنه أن يعطي إشارة إيجابية كاذبة في اختبار ATPase المقترنة NADH. ويمكن تحديد بعض هذه الإيجابيات كاذبة عن طريق تشغيل الفحص مع إنزيم ADP المنتجة لا علاقة لها. في هذه الحالة، لا يمكن توقع أي تثبيط لضربات إيجابية حقيقية، إلا إذا كان المانع هو ربط التماثلية ATP لكلا الإنزيمات. ولإثبات هذا التحليل، قمنا بإجراء تقييم ATPase باستخدام بارا- أمينوبلبِيستاتين وأبيراز، وهو إنزيم تحلل ATP لا علاقة له بالميوسين (انظر الشكل5). بدلا من ذلك، يمكن إجراء فحص وظيفي مختلف خاص بإنزيم الفائدة، أو اختبار ATPase مختلف لا يستخدم PK وLDH للتمييز بين الضربات الإيجابية الحقيقية والكاذبة (على سبيل المثال، الفحص الأخضر المالاشيت).

يتطلب قياس وتحليل حركية شدة الفلورة في جميع الآبار قارئ لوحة سريع بما يكفي لمسح اللوحة بأكملها في أقل من 90-60 ثانية تقريبًا.

أهمية الطريقة فيما يتعلق بالأساليب القائمة/البديلة

على عكس "التقليدية" على أساس الامتصاص القراءة16،17،18،19،20،تعديل NADH المقترنة ATPase & وهذا يجعل من التصاق أكثر حساسية، مما يسمح للمستخدم للحد من شدة ضوء الإثارة وبالتالي حماية NADH أو مثبطات ضد التحلل الكيميائي الضوئي.

على الرغم من أن الفحص يعتبر عموما غير مناسب للتعامل مع عدد كبير من العينات32،فإن أحجام التفاعل الصغيرة التي تحققت هنا (20 درجة مئوية) في شكل 384 بئرا يجعلها قابلة لتطبيقات فحص الإنتاجية شبه العالية، وخاصة إذا تم النظر في تحديد الثوابت المثبطة.

تعتمد الطرق البديلة عادة على الكشف عن الفوسفات غير العضوي الذي ينتجه إنزيم ATPase. على سبيل المثال، يمكن استخدام [γ-32P]ATP كالركيزة لATPase وبعد ذلك، يمكن قياس الفوسفات غير العضوي المحرر على أساس نشاطه الإشعاعي. والقول بالحساسية حساس؛ ومع ذلك، فإنه يتطلب مناولة المواد المشعة وATP المتبقية يجب فصلها عن الفوسفات غير العضوي (على سبيل المثال، عن طريق الامتزاز من ATP على الفحم)33. في التحليل الأخضر مالاشيت المذكورة أعلاه، والفوسفات يتفاعل مع molybdate في ظل الظروف الحمضية ومجمع phosphomolybdate الناتجة يربط صبغة الأخضر malachite مما تسبب في تحول في الطيف امتصاصه19،21، 22،23،24. هذا الأسلوب يتطلب أيضا تبريد رد فعل ATPase; لذلك، يتم استخدامه في الغالب كنقطة نهاية، خاصة في تنسيق الإنتاجية العالية. وعلى النقيض من الرصد المستمر لرد فعل ATPase في الاختبار المقترن بNADH، فإن الاختبار بنقطة النهاية يفترض ببساطة دورات زمنية خطية ولا يمكن أن يكشف عن القطع الأثرية التي تؤدي إلى عدم الخطية. المركبات التي تتفاعل مع الأخضر malachite أو مجمع شكلت قد يؤدي أيضا إلى التحف21. وعلاوة على ذلك، فإن التبسي الأخضر المالاشيت حساس جدا للتلوث الفوسفات24. وعلى النقيض من ذلك، فإن الدراسة التي يقترن بها NADH ليست حساسة للتلوث ADP كما ADP (الذي هو دائما موجود على مستويات مختلفة في عينات ATP) يتم تحويلها بسرعة إلى ATP بواسطة PK في بداية رد الفعل. ليست هناك حاجة لتبريد أو فصل المنتجات. وقد تم بالفعل تطوير آخر الاختبار الفلوري لقياس معدلات ATPase عن طريق اقتران التحلل المائي ATP إلى رد الفعل حفزمن قبل فوسفوريلاز النيوكليوزيد34. ومع ذلك، فإن هذا الفحص لا يستخدم دورة تجديد ATP، وبالتالي فإن تحديد معدلات رد الفعل الأولية يمكن أن يكون أكثر صعوبة بكثير.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات للطريقة

وقد تم استكشاف العديد من الإنزيمات التي تعتمد على نشاط ATPase كأهداف محتملة للأدوية. وتشمل هذه البروتينات الحركية الخلوية الهيكلية التي تنتمي إلى kinesin35 وdynein الأسر36 وعلب طائرات الهليكوبتر الحمض النووي37، وكلها هي المحركات الطرفية في مسارات الإشارات المتنوعة. يمكن تحسين الفحص الموضح هنا بسهولة لاكتشاف المخدرات ومشاريع التطوير التي تنطوي على أي إنزيم يحفز رد فعل فيه ADP هو منتج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 150، اختبار ATPase، NADH، الفلورة، فحص شبه عالي الإنتاجية، ثابت مثبط، myosin
تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, … More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter