Summary
一种烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）与ATPase的检测已应用于小分子肌苷抑制剂的半高通量筛选。此动力学测定以 384 孔微孔板格式运行，总反应体积仅为每孔 20 μL。该平台应适用于几乎任何ADP生产酶。
Abstract
ATPase酶利用三磷酸腺苷中储存的游利用能量，催化体内各种不会自发发生的内发性生化过程。这些蛋白质对细胞生活的各个方面都至关重要，包括新陈代谢、细胞分裂、对环境变化的反应和运动。这里提出的协议描述了一种烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）耦合ATPase测定，该检测已适用于小分子ATPase抑制剂的半高通量筛选。该测定已应用于心脏和骨骼肌肌苷II，两个基于行为蛋白的分子运动ATPases，作为原理证明。ATP的水解通过测定中的酶反应与NADH的氧化结合。首先，由 ATPase 生成的 ADP 通过丙酮激酶 （PK） 再生为 ATP。PK催化磷酸二苯丙酸酯（PEP）与丙酮类酯的平行过渡。随后，乳酸通过乳酸脱氢酶（LDH）降低为乳酸盐，同时催化NADH的氧化。因此，ATP浓度的下降与NADH浓度的下降直接相关，随后是NADH内在荧光的变化。只要在反应系统中有PEP，ADP浓度仍然很低，避免由其自己的产品抑制ATPase酶。此外，ATP 浓度几乎保持不变，产生线性时间课程。荧光被持续监测，从而便于估计数据的质量，并有助于过滤出潜在的伪影（例如，由复合沉淀或热变化引起的）。
Introduction
肌苷是水解三磷酸腺苷（ATP）的机械化学能量传感器，用于在真核细胞1、2中沿活性素细胞骨架的丝状物产生定向运动。它们在结构和动力学上都适应了细胞内的各种功能，如细胞器的传输、肌肉收缩或细胞骨骼张力的产生1，2。肌苷超级家族由属于人类基因组3、4中12个不同肌苷类的+40肌苷基因表示。肌苷类的成员在一系列高度多样化的疾病中扮演着不同的角色，如几种癌症、神经系统疾病、骨骼肌病和肥大性心肌病5、6。鉴于这些分子马达的生理和病理功能很多，它们越来越被公认为各种条件的药物靶点，这并不奇怪。最近，在发现新的肌苷抑制剂8、9、10和活化剂11方面取得了重大进展，并改善了现有抑制剂12的特性。13,14,15.
烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）耦合ATPase测定早已用于测量各种酶的ATPase活性，如肉质性视网膜Ca2+泵ATPase 16，DNA修复ATPase Rad5417，AAA+ATPase p9718或微管马达运动体19。测定采用 ATP 再生循环。ATPase产生的二磷酸腺苷（ADP）通过丙酮酸激酶（PK）再生为ATP，将一个磷酸二醇酸（PEP）分子并联转化为丙酮酸盐。随后，通过乳酸脱氢酶（LDH）将丙酮酸酯降低为乳酸盐。这反过来又氧化了NADH的一个分子到NAD。因此，NADH浓度作为时间的函数的降低等于ATP水解率。只要 PEP 可用，ATP 再生循环就使 ATP 浓度几乎保持不变，ADP 浓度处于低水平。这导致线性时间课程，使得确定初始反应速率变得简单，并有助于避免ADP19对产品抑制。虽然NADH耦合ATPase测定已经适应了96井格式20，但高反应量（±150 μL）由于试剂需求较高，使得它不太适合快速筛选大量化合物。替代方法，如麦芽绿测定19，21，它依赖于检测由ATPase酶产生的磷酸盐，被证明更适合小型化和高通量筛选22,23,24.然而，端点测定更有可能受到几个工件的影响（下文讨论），如果没有全日制课程，这些伪像可能仍未被发现。
在这里，NADH耦合ATPase测定已针对小分子抑制剂的半高通量筛选进行了优化。骨骼和心肌肌苷II和肌苷抑制剂blebbisatin8，副阿米诺巴他丁13和准硝基布利他妥丁12用于证明测定的力量，它依赖于NADH荧光作为读出。该协议适用于筛选专注于任何ADP生产酶的项目。
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Protocol
1. 制备库存溶液和试剂
- 通过在蒸馏水中溶解结晶DTT至最终浓度为1000 mM，制备二硫二硫醇（DTT）库存溶液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 通过将蒸馏水中的结晶ATP溶解至100 mM的最终浓度，制备ATP库存溶液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 制备含有70mM 3-（N-变形）丙烷酸（MOPS）、10mM MgCl 2、0.9mM乙二醇-乙二醇（β-氨基乙醚）-N、N、N、N-四乙酸（EGTA）和3mMNaN3的10xNADH缓冲液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。储存在4°C。
- 制备含有10 mM MOPS和0.1 mM EGTA的1x肌苷缓冲液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。储存在4°C。将牛血清白蛋白 （BSA） 和 DTT 添加到 0.1% 的最终浓度（w/v%）和 1 mM，分别在使用前。
- 准备含有4 mM MOPS、0.1 mM EGTA、2 mM MgCl2和3 mM NaN3的1x肌素缓冲液。使用 1 M NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.0。储存在4°C。将 BSA 和 DTT 添加到 0.1% 的最终浓度（包括/v%）和 1 mM，分别在使用前。
- 通过在 10x NADH 缓冲液中溶解结晶 NADH 到最终浓度为 5.5 mM，制备 NADH 库存溶液。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 通过将 10x NADH 缓冲液中的结晶 PEP 溶解到 50 mM 的最终浓度，制备 PEP 库存溶液。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 通过在甘油和10x NADH缓冲液混合物中溶解冻干LDH粉末制备LDH库存溶液（50%：50%）到最终浓度为2000 U/mL。离心溶液，以去除任何未溶解的蛋白质存在（7，197 x g， 20 °C， 10 分钟）。小心地将上清液转移到干净的离心管中。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 通过在甘油和10x NADH缓冲液混合物中溶解冻干PK粉末制备PK库存溶液（50%：50%）最终浓度为10000 U/mL。离心溶液，以去除任何未溶解的蛋白质存在（7，197 x g， 20 °C， 10 分钟）。小心地将上清液转移到干净的离心管中。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 通过加入100μL蒸馏水，重新形成冻干心脏和骨骼肌肌肌酸II样品，以获得10mg/mL库存溶液，分别对应于±37.9 μM和+40.8 μM肌苷浓度（单体）。有关详细信息，请参阅制造商的说明。
- 从兔子肌肉丙酮粉制备F-actin，如帕迪和斯普迪奇25所述。
2. 测量小分子抑制剂的ATPase活性和抑制作用
- 准备复合板。
- 溶解优质二甲基硫酸盐（DMSO）中感兴趣的化合物。
- 从 DMSO 中的 10 mM 化合物浓度开始创建 15 步串行 1：2 稀释。
- 使用多通道移液器将样品转移到三联体（每块12.5 μL）的384孔聚丙烯板中。在复合板上对一个化合物（而不是三列）使用两行，以尽量减少可能受边缘效应影响的井数。将每个化合物的第二行的最后三口作为负控制（仅限 DMSO）。请勿将板上的第一行和最后一行用于复合稀释。
- 将纯 DMSO 传输到第一行的井中（保留用于 NADH 校准）。
- 使用最后一行进行正控制。
注：此处使用了DMSO中浓度为4 mM的副阿米诺比沙丁。
- 通过稀释Actin缓冲液中的Actin股票溶液，为每个测定板（384孔黑壁聚苯乙烯微板）制备4500μL的20μM稀释剂溶液。使用 5 mL 移液器上下移液 30x，彻底混合溶液，通过打破活性素细丝来降低粘度和异质性。离心溶液，以去除任何沉淀的蛋白质存在（7，197 x g，20 °C， 10 分钟）。小心地将上清液转移到干净的离心管中。
- 准备含有LDH和PK酶（"酶混合"）的主混合物。对于每个测定板，将171.4μL的LDH溶液、171.4μL的PK溶液和3189.3μL或3252.9 μL肌苷缓冲液分别结合在15 mL锥形离心管中，用于涉及心脏或骨骼肌肌黄蛋白II的测定。此时不要添加任何肌苷，以避免聚集和降水。
- 准备包含所有基板的主混合物（"基板混合"）。对于每个板，将 ATP 的 162.1 μL、162.1 μL 的 PEP 和 324.1 μL 的 NADH 溶液组合在 15 mL 锥形离心管中。此时不要添加 actin 以避免聚集和沉淀。
- 创建七步串行 1：2 稀释 NADH，以便从 250 μM 开始校准。
- 将12.3 μL的NADH库存溶液与257.7μL肌苷缓冲液混合在1.5 mL微离心管中。
- 亚细亚135 μL肌苷缓冲液放入7个1.5 mL微离心管中。
- 将135 μL溶液从第一管转移到第二管中，并通过移液混合。重复，直到达到第7管。
- 使用最后一根管作为无 NADH 控制（仅限缓冲器）。
- 使用 8 通道移液器，将 20 μL 的 NADH 校准解决方案以三联成片将 20 μL 传输到化片的第一行。
- 在酶混合物中加入68 μL的心脏或4.2 μL的骨骼肌肌肌苷II。漩涡简要。
- 除第一行外，使用自动分配器将制备的肌苷酶混合物的8.4 μL分给测定盘的每个孔。
- 使用配备 100 nL 销工具头的自动液体处理系统，将 100 nL 溶液从复合板转移到含有酶混合物的测定板。
- 使用微板摇床在室温1200rpm下摇动测定板1分钟。
- 在基材混合物中加入4，052 μL的离心反应液溶液。漩涡简要。
- 将 11.6 μL 的 actin-基质混合物放入测定板（第一行除外）的每个孔中，使用自动分配器启动酶反应。
- 使用微板摇床在室温1200rpm下摇动测定板1分钟。
- 将测定板在 101 x g下离心 30 s。
- 确保板式读卡器的内部温度稳定在 25°C。装入板并摇动 30 s。此摇动步骤是必要的，使液体表面的形状在每个孔中相似，并留出时间使板达到测量温度。
- 以 45 秒的间隔记录 NADH 荧光 30 分钟扫描板。使用 380 nm、10 nm 带宽激励滤波器和 470 nm 24 nm 带宽发射滤波器，以及 425 nm 截止双色镜。在高浓度模式下运行测量。在运行检测之前，优化闪烁次数、探测器增益、板尺寸和测量高度。
注： 最终测定条件为 300 nM 心脏/20 nM 骨骼肌肌肌苷 II，10 μM 肌素，40 U/mL LDH，200 U/mL PK，220 μM NADH，1 mM PEP，1 mM ATP 在缓冲液中包含 10 mM MOPS （pH = 7.0），2 mM MgCl2，0.15 mM EGTA，0.1 毫克/毫克 BSA，0.5% （v/v） DMSO 和 1 mM DTT。总体积为 20 μL/井。最高最终化合物浓度为50μM.20μM对αnoblebisatin，在0.5%DMSO中充当正对照，仅0.5%DMSO是负对照。 所有测量均以三次进行。
3. 分析数据
- 根据每口井的时间绘制观察到的荧光强度。
- 执行简单的线性回归，以确定每个井的荧光响应的斜率和截距。斜率与 ATP （NADH） 消耗率成正比，而截距与测量开始时的 NADH 浓度成正比（t = 0 s）。
- 通过绘制板块第一行获得的截距与 NADH 浓度的截距，为 NADH 构建校准曲线。确保截距线性取决于 NADH 浓度。
注： 截距估计 t = 0 s 处的实际荧光强度，其可信度远高于 t = 0 s 的原始荧光强度读数的平均值。 - 执行简单的线性回归以获得 NADH 校准线的斜率和截距。
注： 截距描述荧光背景信号（不存在 NADH），而斜率对应于该特定实验中 1 M NADH 溶液的外推/理论荧光强度。 - 将其余油井获得的荧光响应斜率除以 NADH 校准线的斜率，以将荧光变化转换为 ATP 消耗率。
- 根据抑制剂的浓度绘制 ATP 消耗率图。
- 要确定抑制常数，请使用适当的统计软件将剂量-响应数据拟合到以下二次方程，对应于简单的一对一结合平衡模型：
其中Y是 ATP 消费率，Y min是 ATP 消费率，没有抑制剂，Y最大值是理论 ATP 消耗率在 100% 抑制，K I是抑制常数，[E] t和[I]t分别是酶（肌苷）和抑制剂的总浓度。
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Representative Results
用于筛选实验的典型板布局图如图1所示。第一行和最后一行分别保留用于NADH校准和正控制（20μM准阿米诺比沙丁，0.5%DMSO）。其余行（B到O）用于测试化合物的抑制活性。在这里，从DMSO中的10 mM化合物浓度开始的15步序1：2稀释被制备并从复合板转移到测定板，使测定板上的最高最终化合物浓度为50μM（以0.5%DMSO为单位）。两行用于获取一种化合物（48个数据点/化合物）的剂量-响应曲线。请注意，可以重新设计板布局图以支持给定项目的特定目标。例如，如果目标是获取大量化合物的单点筛选数据，则可以使用相同的布局在单个 384 孔板上测试 112 种化合物，以便进行正控制和 NADH 校准（每个参数的三分法计算化合物）。建议对一个化合物（或每个浓度）至少具有 3 个数据点，并避免仅将板边缘上的孔用于一个化合物，因为这些数据点可能受边缘效应的影响。要估计边效应的重要性，始终只先运行具有负控制的完整板。
荧光强度对NADH浓度有线性依赖，如图2A所示。在数据分析过程中，线性拟合的斜率用于将荧光变化转换为反应速率。请注意，NADH 校准的每个井获得的原始荧光强度曲线首先通过线性回归进行分析（化合物数据如图2B，C 所示）。由于荧光光漂白，这些痕迹预计会随时间而呈指数衰减。然而，光漂白非常缓慢，因此，原始数据可以通过线性拟合进行分析。这些配合的斜率和截距率分别对应于光漂白的初始速率和 t = 0 s 的荧光强度。这些线性拟合的截距用于构造 NADH 校准曲线，而不是 t = 0 s 的原始荧光读数的平均值，因为截距是根据更多的数据估计的，因此相关误差要小得多。
图2B，C表明，无论使用肌苷或抑制剂是否存在，时间过程在测量的时间窗口是线性的。最高（50 μM）和最低（0μM）抑制剂浓度分别对应±100%和0%抑制。请注意，由于原始数据量大，如果显示在单个面板上，实际分析将显示为混乱。因此，这些面板已简化，以更好地可视化该过程。所有平行实验（每个浓度的三次）都计算了原始荧光强度读取的平均值，并在此转换为NADH浓度。仅显示 3 个抑制剂浓度。在实际分析中，首先通过线性回归分析每个原始荧光强度曲线（48/复合），然后将斜率转换为ATP消耗率。
证明反应速率随酶浓度线性变化，如骨骼和心肌肌苷 II 的图 2D和图2E所示。基于线性拟合，可以很容易地估计酶的最终测定浓度。例如，建议 30 分钟课程的反应速率为 +5 x 10-8 Ms-1。如果在反应混合物中使用活化剂（如此处的actin），建议在存在和不存在活化剂的情况下运行实验，以确保存在预期效果（激活）。条件和过程必须尽可能遵循最终协议。在这里，首先在8个微离心管的肌苷缓冲液中制备一个稀释系列肌苷。随后，加入LDH和PK酶的组合。最后，使用多通道移液器将基板混合平行添加到每个管中，从而开始反应。反应混合物立即转移到三联体测定板的一行。如果行为因不存在，则改为使用 actin 缓冲区。没有更改其他参数（有关最终测定条件，请参阅协议中步骤 2.16 的说明）。
图 2F显示了多个负控制和正控制反应（每个半板）获得的 ATP 消费率。这些数据可以基于Z值或"筛选窗口系数"26进行比较，这是一个广泛使用的统计参数，用于估计高通量测定的质量。它通过同时考虑手段和标准偏差来比较正负控制：
,
其中μn、 +p和μn、 μp分别是负数和正对照组的标准差和均值。如果 Z 的值介于 0.5 和 1 之间，则两个人口是分开的。此处获得的 Z' = 0.78 显示，测定可被视为优异的 26。
为了证明该测定可用于确定抑制常数，小分子肌苷抑制剂bbbisatin8和两个类似物，准硝基布利他丁12和准阿米诺比沙丁13有此处选中，如图3A和图3B所示。布莱比沙丁是一种没有竞争力的，阿波斯特克肌苷抑制剂27，28。一个分子的二苯并丁结合到肌苷的一个运动域，并通过稳定肌苷-ADP-磷酸盐复合物27、28来阻断ATPase循环。因此，使用简单的一对一绑定模型对白巴他丁衍生物的抑制作用进行了建模（参见协议中的步骤3.7）。请注意，如果 ATP 消费率未显示对肌苷浓度的线性依赖（参见图 2D，E ），则此模型可能不适用。据报道，乙酰乙酰沙丁、副硝基苯丙胺和副基苯丙胺的动力学溶性分别为426μM、3.6μM和9.3μM。在我们的实验中，在报告或低于报告的溶解度处未观察到信号异常;然而，当比比沙丁或副硝基布利沙丁被使用超过其报告的溶解度值时，出现了一些伪影，如图4所示。 因此，在这些情况下，在数据分析中排除了以高于溶解度浓度记录的信号。副亚金当品是高度可溶性的，因此，溶解性不是这种情况下的限制因素。
最后，建议测试任何阳性命中的抑制作用是否特定于目标ATPase酶。耦合反应系统采用另外两种酶LDH和PK，抑制其中一种会导致误报信号。使用不相关的 ATPase 酶运行 ATPase 测定可能有助于过滤掉这些误报命中（有关进一步的建议，请参阅讨论）。其中以生产ADP和无机磷酸盐29的ATP水解酶和甲酰胺酶为例，演示了这种对照实验，如图5所示。
图 1：盘面布局。从 250 μM 浓度开始制备 NADH 的七步串行 1：2 稀释，然后分三次分配到 A 排进行校准（黑色到绿色渐变）。行 A 的最后三口井仅包含肌苷缓冲液（无 NADH 控件，白色）。最后一行 （P） 用于正对照（20 μM准阿米诺比沙丁;红色）。典型的剂量反应实验需要两行（例如 B 和 C）。因此，7 个剂量反应实验可以在单个 384 孔板上并行运行（由蓝色到白色颜色渐变表示）。每个样本都加载为三重。在这里，最高的最终化合物浓度从50μM（以0.5%DMSO为单位）开始。每第二行的最后三口井保留给负控制（无化合物，仅 0.5% DMSO;青色）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：代表 ATPase 数据。（A） 制备了两倍稀释系列的NADH，并转移到每个测量板的第一行。光度强度记录30分钟，通过简单线性回归对原始数据进行分析。根据NADH的浓度绘制了每个回归线的截距。请注意，在理想情况下，t = 0 s 处的荧光强度可以简单地用于获得校准线。然而，虽然原始荧光数据非常嘈杂，截距在t = 0 s时给出荧光强度的准确估计，其相关的标准误差（如误差条所示）非常小。（B，C）在半基苯甲酸酯存在不同水平（见内动）的情况下记录到骨骼 （B） 和心脏 （C） 肌肉肌苷 II ATPase 反应的代表性荧光强度痕迹.为简单起见，数据点和误差条分别表示三个独立测量值和相关的标准差的平均值。执行简单线性回归（实线）以获得反应速率。请注意，典型的剂量反应实验由测量板上的15种不同的抑制剂浓度和三分位负控制组成（见图1），并且对每种荧光分别执行线性回归强度跟踪。为简单起见，此处仅显示 3 种不同的浓度。（D，E）基底 （红色） 和活性蛋白激活 （蓝色） ATPase 率确定为各种骨骼 （D） 和心脏 （E） 肌肉肌苷 II 浓度.ATPase速率显示对肌苷浓度的线性依赖。（F） 正（红色）和负（蓝色）控制（各半板）在384孔测定板上平行运行，并计算Z因子（Z'）以评估ATPase测定的质量。Z' 值 0.78 表示具有非常分离的正负对照的可靠测定。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：剂量-反应曲线和抑制常数分析。心脏 （A） 和骨骼 （B） 肌肉肌苷 II 用于测试白蛋白、副基苯丙胺和准硝基苯丙胺的抑制活性.通过将简单的线性回归应用于原始荧光数据，获得了ATPase速率（蓝色）。误差条表示拟合的标准误差，在拟合二次方程（参见协议步骤 3.7）期间用作加权因子，表示简单的平衡绑定模型（红色）。以上溶解度获得的数据受伪影影响，被排除在分析之外。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：与溶解度相关的伪像。（A） 使用骨骼肌肌肌苷 II 在 ATPase 测定中获得的乙二丁丁的荧光强度痕迹显示线性递减信号，具体取决于存在的抑制剂量（蓝色）。然而，当比比沙丁被使用高于溶解度（50 μM初始性比比沙丁浓度），信号增加（红色），很可能是由于形成明亮的荧光的比比沙丁晶体13。（B） 在对硝基苯丙胺的情况下，这是一种非荧光模拟的bbbisatin12，原始荧光强度痕迹出现正常（下降）。然而，最高的抑制水平大大低于预期（基于正控制）。因此，数据分析中只包括低于溶解度（蓝色）的反应速率。高于溶解度（红色）获得的反应速率与确定的剂量-反应曲线（绿色）不同，因为沉淀限制了溶液中残留的抑制剂的量（浓度）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5： 抑制作用第二段-骨骼肌肌苷II和ApyraseATPase测定中的阿米诺比沙丁。在相同的耦合反应系统中，当阿皮塞29用作ATPase时，副肌蛋白以1.7μM的KI抑制骨骼肌肌肌苷II，而未检测到抑制。该实验明确表明，副苯丙基沙丁对肌苷是特有，不抑制PK或LDH，因此检测到的抑制作用不是伪影。在0.5 nM浓度下使用Apyrase。不存在肌苷或肌表现不错，反应在含有100 mM MOPS（pH = 7.0）、3 mM CaCl 2、2 mM MgCl2、3mM NaN3、1mM DTT 和 0.1% BSA 的缓冲液中进行。未对协议作其他修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
协议中的关键步骤
通过运行多个仅带负控制（无抑制剂的 ATPase 反应）的板，优化板材布局。仔细检查结果，查看反应速率的模式。例如，这些可能由"非结合"板的亲水表面涂层的边缘效应和/或缺陷引起。如果观察到图案，请更改板类型和/或板布局，以尽量减少伪影。例如，典型的剂量反应曲线（带三重的 16 浓度，总计 48 点）可以排列在 384 孔板上的三列或两行中。这些排列分别产生 6 个和 4 个数据点，这些数据点可能受边缘效应的影响。因此，行排列始终是首选。
修改和故障排除
请注意，观察到的荧光反应在整个反应的整个过程中必须是线性的。由于热变化，非线性可能出现，也可能在最后几分钟由于达到平衡而发生。如果存在非线性，则可以调整反应参数（例如，稀释肌苷、更改测量温度），或者简单地将分析限制在数据的线性部分。
如果抑制剂与ATPase酶结合缓慢（发生在几分钟内），在反应开始时也可能存在非线性。在这种情况下，随着酶抑制剂复合物的积累，反应预计会随着时间的推移而减慢。根据需要在添加基板混合物之前孵育化化化化板，以避免此问题。
测定条件的选择方式必须使反应的线性部分长于15分钟。较短的线性零件对应于不太有用的数据点（<20，因为扫描整个板需要约 45 秒）。因此，线性拟合产生可靠性较低的斜率（反应速率），标准误差要高得多。另一方面，不建议获得超过±120分钟的动力学读取。此类实验可能受蛋白质变性或溶剂蒸发引起的浓度变化的影响。通过调整肌苷浓度，最容易满足这些标准。
必须确保PK和LDH催化的反应在耦合反应系统中不受速率限制。在没有感兴趣的ATPase或高浓度的强效ATPase抑制剂的情况下进行的对照实验不会显示（或很少）活性。但是，如果 LDH 和 PK 处于活动状态且工作正常，则添加 ADP 将导致快速信号减少。在本次对照实验中，NADH的消耗率预计非常高，因此在ADP的加入后，尽快启动检测至关重要。
建议从数据分析中排除任何超过抑制剂溶解度的观测ATPase速率。由于溶解度取决于化合物的温度、纯度和溶液成分的差异，因此强烈建议在与实际条件（温度、缓冲液等）高度相似的条件下进行测量。进行ATPase测定。尝试使用溶解度以上的小分子抑制剂可能会导致降水，从而影响结果（见图4）。 降水限制了化合物在溶解度或接近溶解度的浓度。因此，ATPase率不能通过添加更多抑制剂进一步降低。因此，使用良好的正控制，显示±100%抑制，可以帮助识别信号中的此类异常，即使溶解度未知。正对照的观测反应速率与拟合确定的最大抑制水平（I最大值）的反应速率之间的很大差异总是问题的良好指示。逐步排除越来越多的数据从分析和/或使用正控制作为I最大，并保持它在安装过程中固定，直到获得更好的适合在这种情况下，建议。抑制剂沉淀还可能导致强光散射，也可能改变抑制剂的光学特性，导致反应开始时观察到的信号强度异常高，并且/或随时间增加的信号。必须始终仔细检查原始数据，并且必须将受影响的浓度排除在分析之外。
方法的限制
低周转数（例如心肌肌苷 II）的 ATPass 的最终测定浓度必须高（几百 nM），以便在测定时间窗口内（30-120 分钟）达到可测量的反应速率。因此，使用二次结合模型分析剂量-反应曲线可能很重要。其他绑定模型（双曲、Hill）通常不适合分析此类数据。此外，ATPase 的浓度为可测量的抑制常数的范围设定了一个下限，因为如果 KI接近或小于ATPase的浓度。
应始终通过执行剂量-反应实验和确定抑制常数来量化化合物效力的差异。虽然单点筛选数据反映了理论上的这些差异，但响应的非线性以及实验误差将使得进行此类分析变得极其困难。单点筛选实验应设计为通过选择适当的抑制剂浓度和预定义的阈值响应水平来区分活性和非活性，从而捕获甚至具有高可信度的相对弱抑制剂化合物。
通过重新编写非线性回归方程来确定 pKI （-logKI）而不是 KI（pK I），最好确定抑制常数之间的差异具有统计显著性。正态分布，而 KI不是30。pKI的不确定性是对称的，而 K I31的不确定性不是对称的。可为 pKI计算置信区间，t 检验或方差分析 （ANOVA） 可用于确定 pKI测量方法是否显著不同。但是，在执行此类统计检验时必须谨慎，因为它们假定同质性（同组数据的相同方差）。当由于化合物溶解度问题而无法获得全剂量-响应曲线时，可以预期与 pKI相关的更高方差。在这种情况下，应使用其他适当的统计检验，不假定等方差（例如，Welch 的 t 检验）。
任何抑制PK或LDH的化合物都会在NADH耦合ATPase测定中发出假阳性信号。其中一些误报可以通过使用不相关的ADP产生酶进行测定来识别。在这种情况下，除非抑制剂是ATP模拟结合到两种酶，否则不能预期对实际阳性命中的抑制作用。为了证明这种分析，我们使用副苯丙胺和阿皮沙酶（一种与肌苷无关的ATP水解酶）进行了ATPase测定（见图5）。 或者，可以运行特定于感兴趣的酶的不同功能测定，或者不采用 PK 和 LDH 的不同 ATPase 测定，以区分真实和假阳性命中（例如，马拉奇特绿色测定）。
测量和分析所有油井的荧光强度动力学，需要一个足够快的板读取器，以在不到90~60秒内扫描整个板。
方法相对于现有/替代方法的意义
与"传统"吸收基读出16，17，18，19，20相比，这里提出的改良的NADH耦合ATPase测定依赖于NADH荧光。这使得测定更加灵敏，允许用户降低激发光强度，从而保护NADH或抑制剂免受光化学分解。
虽然该测定通常被认为不适合处理大量样品32，但此处以 384 井格式实现的小反应量（20 μL）使其适用于半高通量筛选应用，特别是如果考虑抑制常数的确定。
替代方法通常依赖于ATPase酶产生的无机磷酸盐的检测。例如，[+-32P]ATP可用作ATPase的基质，随后，可以根据其放射性测量释放的无机磷酸盐。测定是敏感的;然而，它要求处理放射性物质，剩余的ATP必须从无机磷酸盐中分离出来（例如，在木炭上吸附ATP）33。在上述麦芽绿测定中，磷酸盐在酸性条件下与莫解剂发生反应，由此产生的磷化物复合物结合马拉奇特绿色染料，导致其吸收谱19、21发生偏移。 22，23，24.该方法还需要淬火ATPase反应;因此，它主要用作端点测定，尤其是在高吞吐量格式中。与在NADH耦合测定中持续监测ATPase反应不同，端点测定只是假设线性时间过程，不能揭示导致非线性的伪影。化合物与麦芽绿或形成的复杂相互作用也可能导致伪影21。此外，麦芽绿测定对磷酸盐污染24非常敏感。相反，NADH 耦合检测对 ADP 污染不敏感，因为 ADP（在 ATP 样品中始终存在于各个级别）在反应开始时通过 PK 快速转换为 ATP。无需对产品进行淬火或分离。另一种用于测量ATPase速率的荧光测定已经通过将ATP水解与核苷磷酸酶34催化的反应相结合而开发出。然而，该测定没有利用ATP再生周期，因此确定初始反应速率可能更具挑战性。
方法的未来应用或方向
许多依赖ATPase活性的酶已被探索为潜在的药物靶点。这些包括细胞骨骼运动蛋白属于激酶35和dynein家族36和DNA血箱37，所有这些都是不同信号通路的终端效应。此处描述的测定可轻松针对药物发现和开发项目进行优化，这些项目涉及任何酶催化 ADP 是产品的反应。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家神经疾病和中风研究所和国家药物滥用研究所NS096833（CAM）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
References
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