Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

En nicotinamid-adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase-analyse er blevet tilpasset til halvhøj gennemløbs screening af små molekyle myosin-hæmmere. Denne kinetiske analyse køres i et 384-brønd mikroplade format med samlet reaktions volumen på kun 20 μL pr. brønd. Platformen bør gælde for stort set alle ADP-producerende enzymer.

Abstract

ATPase enzymer udnytte den frie energi lagret i adenosin trifosfat at katalysere en bred vifte af endergonic biokemiske processer in vivo, der ikke ville forekomme spontant. Disse proteiner er afgørende for væsentlige alle aspekter af cellulære liv, herunder metabolisme, celledeling, reaktioner på miljømæssige ændringer og bevægelse. Protokollen præsenteres her beskriver en nicotinamid adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase assay, der er blevet tilpasset til semi-høj gennemløb screening af små molekyle ATPase hæmmere. Analysen er blevet anvendt til hjerte-og skeletmuskulatur myosin II, to actin-baserede molekylære motor ATPases, som et bevis på princippet. Hydrolyse af ATP er koblet til oxidation af NADH ved enzymatiske reaktioner i analysen. For det første er ADP genereret af ATPase regenereret til ATP af pyruvatkinase (PK). PK katalyserer overgangen af fosfoenolpyruvat (PEP) til pyruvat parallelt. Efterfølgende, pyruvat er reduceret til laktat af lactat dehydrogenase (LDH), som katalyserer oxidation af NADH parallelt. Således, faldet i ATP koncentration er direkte korreleret til faldet i NADH koncentration, som efterfølges af ændring af den iboende fluorescens af NADH. Så længe der findes PEP i reaktionssystemet, er ADP-koncentrationen fortsat meget lav, hvilket forhindrer, at ATPase-enzymet hæmmes af sit eget produkt. Desuden er ATP-koncentrationen stadig næsten konstant, hvilket giver lineære tids kurser. Fluorescensen overvåges kontinuerligt, hvilket gør det let at anslå datakvaliteten og hjælper med at bortfiltrere potentielle artefakter (f. eks. som følge af sammensatte udfældning eller termiske ændringer).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Myosins er mekaniske kemiske energi transducere, der hydrolyserer adenosin trifosfat (ATP) til at generere retningsbestemt bevægelse langs filamenterne af actin cytoskelet i eukaryoter1,2. De har både strukturelt og kinetisk tilpasset deres forskellige intracellulære funktioner, såsom transport af organeller, muskelsammentrækning eller generering af cytoskelet spænding1,2. Myosin super Family er repræsenteret ved ~ 40 myosin gener, der tilhører ~ 12 forskellige myosin klasser i det menneskelige genom3,4. Medlemmer af myosin klasser spiller forskellige roller i en meget forskelligartet sæt af lidelser, såsom flere kræftformer, neurologiske lidelser, skelet myopatier, og hypertrofisk kardiomyopati5,6. I betragtning af det store antal fysiologiske og patologiske funktioner i disse molekylære motorer, er det ikke overraskende, at de bliver mere og mere anerkendt som Drug mål for en række betingelser7. Der er gjort betydelige fremskridt for nylig i opdagelsen af nye myosin-hæmmere8,9,10 og aktivatorer11, og for at forbedre egenskaberne for de eksisterende12, 13 , 14 , 15.

Nicotinamid-adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase-assay har længe været anvendt til at måle ATPase-aktiviteten af forskellige enzymer, såsom sarcoplasmisk reticulum ca2 + pumpe ATPase16, DNA-reparationen ATPase Rad5417, AAA + ATPase p9718 eller mikrotubulen motorisk kinesin19. Analysen anvender en ATP-regenereringscyklus. Adenosindiphosphat (ADP) genereret af ATPase regenereres til ATP af pyruvatkinase (PK), som forvandler et molekyle af phosphoenolpyruvat (PEP) til pyruvat parallelt. Efterfølgende reduceres pyruvat til laktat ved lactat dehydrogenase (LDH). Det, til gengæld, oxiderer et molekyle af NADH til NAD. Derfor er faldet i NADH-koncentrationen som en funktion af tid lig med ATP Hydrolysehastigheden. ATP-regenererings cyklussen holder ATP-koncentrationen næsten konstant, og ADP-koncentrationen er lav, så længe PEP er tilgængelig. Dette resulterer i lineære tids kurser, hvilket gør det enkelt at bestemme de indledende reaktions rater og hjælper med at undgå produkt hæmning af ADP19. Selv om den NADH-koblede ATPase-analyse allerede er blevet tilpasset til et 96-Well-format20, gør de høje reaktions volumener (~ 150 μl) det relativt dyrt på grund af den høje efterspørgsel efter reagenser, hvorved det bliver mindre modtagelig for hurtig screening af et stort antal Forbindelser. Alternative metoder, såsom malachite grøn assay19,21, som bygger på påvisning af fosfat produceret af ATPase enzym, blev vist sig mere egnet til miniaturisering og High-gennemløb screening22 , 23 , 24. det er dog mere sandsynligt, at en endepunkts analyse påvirkes af flere artefakter (diskuteret nedenfor), som kan forblive uopdagede i fravær af fuldtids kurser.

Her, den NADH-koblede ATPase assay er blevet optimeret til semi-høj gennemløb screening af små molekyle hæmmere. Skelet-og hjertemusklen myosin II og myosin-inhibitorer blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 og para-nitroblebbistatin12 anvendes til at PÅVISE analysens effekt, som er afhængig af NADH Fluorescens som en udlæser. Denne protokol kan anvendes til screening af projekter, der fokuserer på alle ADP-producerende enzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. klargøring af stamopløsninger og reagenser

  1. Forbered ditiotreitol (DTT) stamopløsning ved at opløse krystallinsk DTT i destilleret vand til en endelig koncentration på 1000 mm. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved-20 °C.
  2. Forbered ATP stamopløsning ved at opløse krystallinsk ATP i destilleret vand til en endelig koncentration på 100 mM. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved-20 °C.
  3. Forbered 10x NADH buffer indeholdende 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonsyre (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mm ethylenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N, n ′, n′-tetraeddikesyre (EGTA), og 3 mm Nan3. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved 4 °C.
  4. Forbered 1x myosin buffer indeholdende 10 mM MOPS og 0,1 mM EGTA. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved 4 °C. Tilsæt bovin serumalbumin (BSA) og DTT til en endelig koncentration på 0,1% (w/v%) henholdsvis 1 mM før brug.
  5. Forbered 1x actin buffer indeholdende 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, og 3 mm Nan3. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved 4 °C. Tilsæt BSA og DTT til en endelig koncentration på 0,1% (w/v%) henholdsvis 1 mM før brug.
  6. Forbered NADH stamopløsning ved at opløse krystallinsk NADH i 10x NADH buffer til en endelig koncentration på 5,5 mM. Opbevares ved-20 °C.
  7. Forbered PEP Stock Solution ved at opløse krystallinsk PEP i 10x NADH buffer til en endelig koncentration på 50 mM. Opbevares ved-20 °C.
  8. Forbered LDH stamopløsning ved at opløse lyofiliseret LDH pulver i en blanding af glycerol og 10x NADH buffer (50%: 50%) til en endelig koncentration på 2000 U/mL. Opløsningen centrifugeres for at fjerne eventuelle ikke-opløste proteiner (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Supernatanten overføres forsigtigt til et rent centrifugeglas. Opbevares ved-20 °C.
  9. Forbered PK-stamopløsning ved at opløse frysetørret PK-pulver i en blanding af glycerol og 10x NADH buffer (50%: 50%) til en endelig koncentration på 10000 U/mL. Opløsningen centrifugeres for at fjerne eventuelle ikke-opløste proteiner (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Supernatanten overføres forsigtigt til et rent centrifugeglas. Opbevares ved-20 °C.
  10. De frysetørede kardiale og skeletmuskulatur myosin II-prøver rekonstruere ved tilsætning af 100 μL destilleret vand for at opnå 10 mg/mL stamopløsninger svarende til henholdsvis ~ 37,9 μM og ~ 40,8 μM myosin-koncentrationer (monomerisk). Se producentens anvisninger for yderligere oplysninger.
  11. Forbered F-actin fra kanin muskel acetone pulver som beskrevet af Pardee og Spudich25.

2. måling af ATPase aktiviteter og hæmmende virkninger af små molekyle hæmmere

  1. Forbered sammensatte plade.
    1. Opløse forbindelser af interesse i høj kvalitet dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Opret femten-trins serielle 1:2 fortyndinger startende fra 10 mM sammensat koncentration i DMSO.
    3. Prøverne overføres til en 384-brønd polypropylen-plade i tre triplicater (12,5 μL hver) ved hjælp af en multikanals pipette. Brug to rækker på den sammensatte plade til en forbindelse (i stedet for tre kolonner) for at minimere antallet af brønde, som potentielt påvirkes af kanteffekter. Brug de sidste tre brønde i anden række for hver forbindelse som negativ kontrol (kun DMSO). Brug ikke den første og den sidste række på pladen til sammensatte fortyndinger.
    4. Overfør Pure DMSO til brønden i første række (reserveret til NADH kalibrering).
    5. Brug den sidste række til positiv kontrol.
      Bemærk: para-aminoblebbistatin ved 4 mm koncentration i DMSO blev anvendt her.
  2. Forbered 4500 μL af 20 μM fortyndet actin opløsning for hver analyse plade (384-brønd Black-Wall polystyren mikropladen) ved at fortynde actin stamopløsning i actin buffer. Bland opløsningen grundigt ved pipettering op og ned 30x ved hjælp af en 5 mL pipette for at reducere viskositet og heterogenitet ved at bryde actin filamenter. Opløsningen centrifugeres for at fjerne eventuelle udfældede proteiner (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Supernatanten overføres forsigtigt til et rent centrifugeglas.
  3. Forbered Master Mix indeholdende LDH og PK-enzymer ("enzym mix"). For hver analyse plade kombineres 171,4 μL LDH-opløsning, 171,4 μL PK-opløsning og 3189,3 μL eller 3252,9 μL myosin-buffer til assays, der involverer henholdsvis hjerte-eller skeletmuskulatur myosin II i et 15 mL konisk centrifugeglas. Tilsæt ikke myosin på dette tidspunkt for at undgå sammenlægning og nedbør.
  4. Forbered Master Mix, der indeholder alle substrater ("substrat mix"). For hver plade kombineres 162,1 μL ATP, 162,1 μL PEP og 324,1 μL NADH opløsning i et 15 mL konisk centrifugeglas. Tilføj ikke actin på dette tidspunkt for at undgå sammenlægning og nedbør.
  5. Opret syv-trins serielle 1:2 fortyndinger af NADH til kalibrering fra 250 μM.
    1. Bland 12,3 μL NADH stamopløsning med 257,7 μL myosin buffer i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
    2. Alikvot 135 μL myosin-buffer i syv 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
    3. Overfør 135 μL opløsning fra det første rør til den anden og bland ved pipettering. Gentag indtil du når 7th røret.
    4. Brug det sidste rør som No-NADH Control (kun buffer).
  6. Ved hjælp af en 8-kanals pipette overføres 20 μL af NADH-kalibreringsopløsningerne til den første række af analyse pladen i tre triplicater.
  7. Tilsæt 68 μL kardiel eller 4,2 μL skeletmuskulatur myosin II til enzym blandingen. Vortex kortvarigt.
  8. Undtagen den første række, dispenserer 8,4 μL af den forberedte myosin-enzym blanding i hver brønd af analyse pladen ved hjælp af en automatiseret dispenser.
  9. Overfør 100 nL af opløsninger fra den sammensatte plade til den analyse plade, der indeholder enzym blandingen, ved hjælp af et automatiseret væske håndteringssystem udstyret med et 100 nL PIN-værktøjs hoved.
  10. Analyse pladen rystes i 1 min ved stuetemperatur ved 1200 rpm ved hjælp af en mikropladen shaker.
  11. Tilsæt 4.052 μL af centrifugeret actin-opløsningen til substrat blandingen. Vortex kortvarigt.
  12. 11,6 μL actin-substrat blandes i hver brønd af analyse pladen (undtagen første række) for at starte den enzymatiske reaktion ved hjælp af en automatiseret dispenser.
  13. Analyse pladen rystes i 1 min ved stuetemperatur ved 1200 rpm ved hjælp af en mikropladen shaker.
  14. Analyse pladen centrifugeres ved 101 x g i 30 s.
  15. Sørg for, at plade læsernes indvendige temperatur er stabiliseret ved 25 °C. Læg pladen og ryst den i yderligere 30 s. Dette ryste trin er nødvendigt for at gøre formen af den flydende overflade ens i hver brønd og giver tid til pladen for at nå måle temperaturen.
  16. Optag NADH fluorescens i 30 min. scanning af pladen i 45 s intervaller. Brug en 380 nm, 10 nm båndbredde excitation filter og en 470 nm, 24 nm båndbredde emission filter i forbindelse med en 425 nm cut-off koldtlysreflektorlamper spejl. Kør målingen i højkoncentrations tilstand. Optimer antallet af blink, detektor forstærkning, plade dimensioner og måle højde, før du kører assays.
    Bemærk: endelige analysebetingelser er 300 nM hjerte/20 nM skeletmuskulatur myosin II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP i en buffer, der indeholder 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO og 1 mM DTT. Den totale volumen er 20 μL/brønd. Den højeste endelige sammensatte koncentration er 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatin i 0,5% DMSO fungerer som positiv kontrol og 0,5% DMSO alene er den negative kontrol. Alle målinger er udført i tre eksemplarer.

3. analyse af data

  1. Den observerede fluorescens intensitet afbildes med tiden for hver brønd.
  2. Udfør simpel lineær regression for at bestemme hældningen og skæringspunktet for fluorescens responser for hver brønd. Hældningen er proportional med ATP (NADH) forbrug sats, mens skæringspunktet er proportional med NADH koncentrationen i begyndelsen af målingen (t = 0 s).
  3. Konstruere en kalibreringskurve for NADH ved at plotte de opfanger, der er opnået for den første række af pladen mod koncentrationen af NADH. Sørg for, at aflyter afhænger lineært på NADH koncentration.
    Bemærk: opfanger anslår de reelle fluorescens intensiteter ved t = 0 s med meget mere selvtillid end gennemsnittet af den rå fluorescens intensitet læser på t ≈ 0 s.
  4. Udfør simpel lineær regression for at opnå hældningen og skæringspunktet af NADH kalibrerings linjen.
    Bemærk: skæringspunktet beskriver fluorescens baggrunds signal (ingen NADH til stede), mens hældningen svarer til den ekstra polerede/teoretiske fluorescens intensitet af en 1 M NADH-opløsning i det pågældende eksperiment.
  5. Opdel hældningen af fluorescens respons opnået for resten af brøndene ved hældningen af NADH-kalibrerings linjen for at konvertere fluorescens ændringer til ATP-forbrugsrater.
  6. Plotte ATP-forbrugs raterne mod koncentrationen af inhibitorer.
  7. For at bestemme hæmmende konstanter, brug passende statistisk software til at passe til dosis-responsdata til følgende kvadratiske ligning svarende til en simpel en-til-en binding ligevægtsmodel:
    Equation 1
    hvor y er ATP-forbrugs satsen, ymin er ATP-forbrugs raten int fraværet af inhibitor, yMax er den teoretiske ATP-forbrugshastighed ved 100% hæmning, Ki er den inhiberende konstante , [E]t og [i]t er den totale koncentration af enzymet (myosin) og inhibitor hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det typiske plade kort, der anvendes til screening af eksperimenter, er vist i figur 1. Den første og sidste række er forbeholdt NADH kalibrering og positiv kontrol (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), hhv. De resterende rækker (B til O) anvendes til at teste forbindelsers hæmmende aktivitet. Her tilberedes og overføres femten-trins serie 1:2 fortyndinger, der starter fra 10 mM sammensat koncentration i DMSO, fra den sammensatte plade til analyse pladen, således at den højeste endelige sammensatte koncentration er 50 μM (i 0,5% DMSO) på analyse pladen. To rækker bruges til at opnå en dosis-respons kurve for en forbindelse (48 data apoint/Compound). Bemærk, at plade layout kortene kan rekonstrueres til at understøtte de specifikke mål for et givent projekt. For eksempel, hvis målet var at opnå enkeltpunkts screening data for et stort antal forbindelser, man kunne teste 112 forbindelser på en enkelt 384-brønd plade ved hjælp af samme layout for positiv kontrol og NADH kalibrering (beregning med tre triplicater for hver sammensatte). Det tilrådes altid at have et minimum af 3 datapoint for en forbindelse (eller for hver koncentration) og for at undgå kun at bruge brøndene langs kanterne af pladen for en forbindelse, da disse datapoints kan påvirkes af kanteffekter. For at estimere betydningen af Edge effekter, altid køre en fuld plade med negativ kontrol først.

Fluorescens intensiteter har en lineær afhængighed af koncentrationen af NADH som vist i figur 2a. Hældningen af den lineære pasform bruges under dataanalyse til at konvertere fluorescens ændringer til reaktionshastigheder. Bemærk, at den rå fluorescens intensitet, der er opnået for hver brønd af NADH-kalibreringen, analyseres ved lineær regression først (en lignende analyse er vist i figur 2b, C for sammensatte data). Disse spor forventes at vise eksponentiel forfald over tid på grund af foto blegning af fluorophore. Men, foto blegning er meget langsom, og derfor kan de rå data analyseres ved lineær passer. Hældningen og skæringspunktet for disse anfald svarer til den oprindelige hastighed for foto blegning og fluorescens intensitet ved henholdsvis t = 0 s. Aflysninger af disse lineære passer anvendes i stedet for gennemsnittet af den rå fluorescens læser på t = 0 s at konstruere NADH kalibreringskurven, fordi aflysninger anslås baseret på flere data, og derfor de tilknyttede fejl er meget mindre.

Figur 2b,C viser, at uanset den anvendte myosin eller tilstedeværelsen af inhibitorer, er tids kurserne lineær i tidsvinduet af målingerne. De højeste (50 μM) og laveste (0 μM) inhibitor koncentrationer her svarer til henholdsvis ~ 100% og 0% hæmning. Bemærk, at på grund af mængden af rå data, ville den faktiske analyse synes kaotisk, hvis vist på et enkelt panel. Derfor er disse paneler blevet forenklet for bedre at visualisere processen. Gennemsnittet af de rå fluorescens intensitets læsninger blev beregnet for alle de parallelle eksperimenter (triplicater for hver koncentration) og konverteret til NADH-koncentrationer her. Der vises kun 3 inhibitor koncentrationer. I den virkelige analyse, hver rå fluorescens intensitet spor (48/sammensatte testet) analyseres ved lineær regression først, og efterfølgende, skråningerne er konverteret til ATP forbrug satser.

Det er altid tilrådeligt at påvise, at reaktions raterne ændrer sig lineært med enzym koncentrationen, som vist i figur 2D og figur2E for henholdsvis skelet-og hjertemusklen myosin II. Baseret på de lineære anfald kan den endelige analyse koncentration af enzymet let estimeres. For eksempel anbefales en reaktionshastighed på ~ 5 x 10-8 MS-1 til 30 minutters tids kurser. Hvis der anvendes en aktivator i reaktions blandingerne (som f. eks. actin her), anbefales det at køre forsøgene både i nærvær og fravær af Aktivatoren for at sikre, at den forventede effekt (aktivering) er til stede. Betingelserne og proceduren skal følge den endelige protokol så tæt som muligt. Her blev en fortyndings serie af myosin fremstillet i myosin-buffer i otte mikrocentrifuge glas først. Efterfølgende blev der tilsat en blanding af LDH-og PK-enzymer. Endelig blev Reaktionerne startet ved at tilføje substrat mix til hvert rør parallelt ved hjælp af en multikanals pipette. Reaktionsblandinger blev straks overført til en række af analyse pladen i tre triplicater. Hvis actin var fraværende, blev actin buffer brugt i stedet. Ingen andre parametre blev ændret (Se bemærkningen i trin 2,16 i protokollen for endelige analysebetingelser).

Figur 2F viser ATP-forbrugsrater opnået for flere negative og positive kontrolreaktioner (halv plade hver). Disse data kan sammenlignes baseret på Z ' værdi eller "screening vindues koefficient"26, som er en meget anvendt statistisk parameter til at anslå kvaliteten af High-gennemløb assays. Den sammenligner de positive og negative kontroller ved at tage hensyn til både midler og standardafvigelser:

Equation 2,

hvor σn, σp og μn, μp er standardafvigelser og midler af henholdsvis negative og positive kontroller. De to populationer er godt adskilte, hvis Z '-værdien falder mellem 0,5 og 1. A Z ' = 0,78 opnået her viser, at analysen kan betragtes som fremragende26.

For at påvise, at analysen kan anvendes til at bestemme hæmmende konstanter, har den lille molekyle myosin-hæmmer blebbistatin8 og to analoger, para-nitroblebbistatin12 og para-aminoblebbistatin13 er valgt her, som vist i figur 3a og figur 3b. Blebbistatin er en ikke-konkurrencedygtig, allosterisk myosin-hæmmer27,28. Et molekyle af blebbistatin binder sig til et motor domæne af myosin og blokerer ATPase-cyklussen ved at stabilisere myosin-ADP-fosfat komplekset27,28. Derfor blev de hæmmende virkninger af blebbistatinderivater modelleret ved hjælp af en simpel, en-til-en bindende model her (Se trin 3,7 i protokollen). Bemærk, at denne model muligvis ikke har været gældende, hvis ATP-forbrugs raterne ikke havde udvist lineær afhængighed af myosin-koncentrationen (Se figur 2D,E). Den kinetiske vandige Opløselighed af blebbistatin, para-nitroblebbistatin og para-aminoblebbistatin er rapporteret til henholdsvis 426 μm, 3,6 μm og 9,3 μM,13. Der blev ikke observeret nogen abnormiteter i signalet ved eller under de rapporterede Opløselighed i vores eksperimenter; imidlertid optrådte flere artefakter, når enten blebbistatin eller para-nitroblebbistatin blev anvendt over deres rapporterede opløseligheds værdier, som vist i figur 4. Det signal, som blev registreret ved koncentrationer, som var højere end opløseligheden, blev derfor udelukket fra dataanalysen i disse tilfælde. Para-aminoblebbistatin er meget opløseligt, og derfor var opløselighed ikke en begrænsende faktor i dette tilfælde.

Endelig er det altid anbefales at teste, om de hæmmende virkninger af eventuelle positive hits er specifikke for målet ATPase enzym. Det koblede reaktionssystem beskæftiger to andre enzymer, LDH og PK, og hæmning af en af disse ville resultere i et falsk positivt signal. Kørsel af ATPase-analysen med et ikke-forretningsmæssigt forbundet ATPase-enzym kan bidrage til at filtrere disse falske positive hits (for yderligere anbefalinger, se diskussion). Para-aminoblebbistatin og apyrase, et ATP-hydrolyserende enzym, der producerer ADP og uorganisk fosfat29, blev anvendt her som et eksempel til påvisning af et sådant kontrol eksperiment, som vist i figur 5.

Figure 1
Figur 1 : Analyse pladens layout. Syv-trins serie 1:2 fortyndinger af NADH begyndende fra 250 μM koncentration forberedes og efterfølgende udleveres i række A i tre eksemplarer til kalibrering (sort til grøn farve gradient). De sidste tre brønde af række A indeholder myosin buffer kun (ingen NADH kontrol, hvid). Den sidste række (P) anvendes til positiv kontrol (20 μM para-aminoblebbistatin; rød). Et typisk dosis-respons eksperiment kræver to rækker (f. eks. B og C). Derfor kan 7 dosis-respons eksperimenter køres parallelt på en enkelt 384-brønd plade (repræsenteret af blå til hvide farve gradienter). Hver prøve er indlæst som triplicater. Her starter de højeste endelige sammensatte koncentrationer ved 50 μM (i 0,5% DMSO). De sidste tre brønde i hver anden række er forbeholdt den negative kontrol (ingen forbindelse, 0,5% DMSO kun; cyan). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentative ATPase-data. A) en to-fold fortyndings serie af NADH blev fremstillet og overført til den første række af hver måleplade. Fluorescens intensitet blev registreret i 30 minutter, og de rå data blev analyseret ved simpel lineær regression. Skæringspunktet for hver regressionslinje blev plottet mod koncentrationen af NADH. Bemærk, at i et ideelt tilfælde kan fluorescens intensiteten ved t = 0 s simpelthen bruges til at opnå kalibrerings linjen. Mens de rå fluorescens data er meget støjende, giver aflytningen imidlertid et nøjagtigt estimat af fluorescens intensitet ved t = 0 s, og deres tilknyttede standardfejl (vist som fejllinjer) er meget lille. (B,C) Repræsentative fluorescens intensitet spor af skelet (B) og kardiale (C) muskel myosin II ATPase reaktioner blev registreret i nærværelse af forskellige niveauer (Se Insæt) af para-aminoblebbistatin. For nemheds skyld repræsenterer datapunkter og fejllinjer gennemsnittet af henholdsvis tre uafhængige målinger og den tilknyttede standardafvigelse. Simpel lineær regression blev udført (massive linjer) for at opnå reaktionshastigheder. Bemærk, at et typisk dosis-respons-eksperiment består af 15 forskellige inhibitor koncentrationer og negativ kontrol i triplicater på målepladen (Se figur 1), og den lineære regression udføres individuelt for hver fluorescens intensitet spor. For nemheds skyld er der kun vist 3 forskellige koncentrationer her. (D,E) Basal (rød) og actin-aktiveret (blå) ATPase-rater blev bestemt for forskellige skelet-(D) og kardiale (E) muskel myosin II-koncentrationer. ATPase-satserne viser lineær afhængighed af myosin-koncentrationen. F) positive (røde) og negative (blå) Kontroller (hver halve plade) blev kørt parallelt på en 384-brønd analyse plade, og z-faktoren (z ') blev beregnet til at vurdere kvaliteten af ATPase-analysen. En Z ' værdi på 0,78 indikerer en pålidelig analyse med meget godt adskilte positive og negative kontroller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Dosis-responskurver og analyse af inhibitoriske konstanter. Hjerte (A) og skelet (B) muskel myosin II blev brugt til at teste den hæmmende aktivitet af blebbistatin, para-aminoblebbistatin og para-nitroblebbistatin. ATPase satser (blå) blev opnået ved at anvende simpel lineær regression til de rå fluorescens data. Fejllinjer repræsenterer standardfejl ved montering og blev brugt som vægtningsfaktorer under montering af en kvadratisk ligning (Se trin 3,7 i protokollen), der repræsenterer en simpel ligevægts bindings model (rød). Data opnået over opløselighed var påvirket af artefakter og udelukket fra analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Opløselighed-relaterede artefakter. A) spor af fluorescens intensitet for blebbistatin opnået i en ATPase-analyse med skeletmuskulatur MYOSIN II viser lineært faldende signal afhængigt af mængden af inhibitor, der er til stede (blå). Men, når blebbistatin blev anvendt over opløselighed (50 μM Initial blebbistatin koncentration), en stigning i signalet blev observeret (rød), sandsynligvis på grund af dannelsen af lysstofrør blebbistatin krystaller13. B) i tilfælde af para-nitroblebistatin, som er en ikke-fluorescerende analog af blebbistatin12, forekom de rå fluorescens intensitets spor normale (faldende). Det højeste niveau af hæmning var imidlertid meget lavere end forventet (baseret på den positive kontrol). Derfor var kun de reaktions rater, der blev opnået under opløselighed (blå), inkluderet i dataanalysen. Reaktionshastigheder opnået over opløselighed (rød) afviger fra den fastsatte dosis-respons kurve (grøn), da udfældning begrænser mængden (koncentrationen) af den inhibitor, som forbliver i opløsningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Hæmmende virkninger af para- aminoblebbistatin i skeletmuskulatur myosin II og apyrase ATPase-assays. Para-aminoblebbistatin hæmmede skeletmuskulaturen MYOSIN II med en Ki på 1,7 μM, mens der ikke blev påvist nogen hæmning, når apyrase29 blev anvendt som en ATPase i det samme koblede reaktionssystem. Dette eksperiment viser klart, at para-aminoblebbistatin er specifikt for myosin og HÆMMER ikke PK eller LDH, og dermed er den detekterede hæmmende virkning ikke en artefakt. Apyrase blev anvendt ved 0,5 nM koncentration. Ingen myosin eller actin var til stede, og reaktionen blev udført i en buffer indeholdende 100 mM MOPS (pH = 7,0), 3 mM CaCl2, 2 mm Mgcl2,3mm Nan3, 1 mm DTT og 0,1% BSA. Der blev ikke foretaget andre ændringer af protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiske trin i protokollen

Optimer plade layoutet ved at køre flere plader med kun negativ kontrol (ATPase-reaktion uden inhibitor). Undersøg resultaterne omhyggeligt for mønstre i reaktionshastigheder. For eksempel kan disse opstå fra kanteffekter og/eller ufuldkommenheder i hydrofile overfladebelægning af "ikke bindende" plader. Hvis der observeres et mønster, skal du ændre plade type og/eller plade layout for at minimere artefakterne. For eksempel kan en typisk dosis-respons kurve (16 koncentrationer med triplicater, 48 point i alt) enten arrangeres i tre kolonner eller to rækker på en 384-brønd plade. Disse ordninger giver henholdsvis 6 og 4 datapoint, der sandsynligvis påvirkes af Edge effekter. Derfor foretrækkes række arrangementet altid.

Ændringer og fejlfinding

Bemærk, at de observerede fluorescens reaktioner skal være lineære gennem hele reaktionsforløbet. Ikke-linearitet kan forekomme i de første par minutter på grund af termiske ændringer eller i de sidste par minutter på grund af at nå ligevægt. Hvis der er ikke-lineariteter, kan man enten justere reaktionsparametrene (f. eks. fortynde myosin, ændre måle temperaturen) eller blot begrænse analysen til den lineære del af dataene.

Ikke-linearitet kan også være til stede i begyndelsen af reaktionerne, hvis bindingen af inhibitorer til ATPase enzym er langsom (forekommer i løbet af minutter). I dette tilfælde forventes reaktionen at aftage over tid, da enzym-inhibitor komplekset akkumuleres. Analyse pladen inkubates, før substrat blandingen tilføjes som nødvendigt for at undgå dette problem.

Analysebetingelserne skal vælges på en sådan måde, at den lineære del af reaktionerne er længere end 15 minutter. Kortere lineære dele svarer til mindre nyttige datapoints (< 20, da scanningen af hele pladen tager ~ 45 sekunder). Derfor giver de lineære passer mindre pålidelige skråninger (reaktionshastigheder) med meget højere standardfejl. På den anden side anbefales det ikke at få kinetiske læsninger længere end ~ 120 minutter. Sådanne eksperimenter kan blive påvirket af proteindenaturering eller koncentrations ændringer som følge af fordampning af opløsningsmiddel. Disse kriterier kan let nås ved at justere koncentrationen af myosin.

Det er vigtigt at sikre, at Reaktionerne katalyseres af PK og LDH ikke er sats begrænsning i det koblede reaktionssystem. Kontrolforsøg udført uden ATPase af interesse eller ved høje niveauer af en potent ATPase-hæmmer ville vise nogen (eller lidt) aktivitet. Tilføjelsen af ADP ville imidlertid resultere i et hurtigt signal fald, hvis LDH og PK er aktive og fungerer korrekt. Satsen for NADH forbrug forventes at være meget høj i dette kontrol eksperiment, så det er afgørende at starte påvisning så hurtigt som muligt efter reaktionen er blevet initieret ved tilsætning af ADP.

Det anbefales altid at udelukke eventuelle observerede ATPase-rater, der er opnået over inhibitor Rens opløselighed, fra dataanalysen. Da opløselighed afhænger af temperaturen, renhed af forbindelsen, og forskelle i sammensætningen af opløsningen, anbefales det stærkt at måle det under forhold, der er meget lig de faktiske forhold (temperatur, buffer, etc.) under hvor ATPase-analysen udføres. Forsøg på at bruge små molekyle hæmmere over opløselighed kan resultere i nedbør, der kan påvirke resultaterne (Se figur 4). Nedbør begrænser koncentrationen af stoffet ved eller nær opløselighed. Derfor kan ATPase-satserne ikke reduceres yderligere ved at tilføje mere inhibitor. Ved hjælp af en god positiv kontrol, der viser ~ 100% hæmning, derfor kan bidrage til at identificere sådanne afvigelser i signalet, selv om opløseligheden er ukendt. En stor forskel mellem den observerede reaktionshastighed for den positive kontrol og reaktionshastigheden, der hører til det maksimale inhiberende niveau (IMaks.) bestemt ved montering, er altid en god indikation af problemet. Gradvist udelukke flere og flere data fra analysen og/eller bruge den positive kontrol som jegMax og holde det fast under monteringsprocessen, indtil en bedre pasform opnås anbefales i sådanne tilfælde. Inhibitor udfældning kan også resultere i stærk lysspredning og kan også ændre de optiske egenskaber af inhibitorer, hvilket fører til unormalt højt observerede signal intensiteter i begyndelsen af reaktionerne og/eller stigende signaler over tid. Rådata skal altid inspiceres omhyggeligt, og de berørte koncentrationer skal udelukkes fra analysen.

Metodens begrænsninger

Den endelige analyse koncentration for ATPaser med et lavt omsætnings nummer (f. eks. hjertemusklen myosin II) skal være høj (flere hundrede nM) for at opnå målbare reaktions rater inden for tidsvinduet i analysen (30 − 120 minutter). Derfor kan det være vigtigt at anvende den kvadratiske bindings model til analyse af dosis-responskurver. Andre bindings modeller (hyperbolic, Hill) egner sig typisk ikke til analyse af sådanne data. Desuden fastsætter koncentrationen af ATPase en nedre grænse for rækken af målbare hæmmende konstanter, fordi dosisrespons kurverne ikke kan skelnes i praksis på grund af tilstedeværelsen af eksperimentelle fejl, hvis Ki er tæt på eller mindre end koncentrationen af ATPase.

Forskelle i sammensatte potenser bør altid kvantificeres ved at udføre dosis-respons eksperimenter og bestemme de hæmmende konstanter. Selv om enkeltpunkts screeningsdata afspejler disse forskelle i teorien, ville den manglende linearitet af svarene sammen med den eksperimentelle fejl gøre det yderst vanskeligt at foretage en sådan analyse. Forsøg med enkeltpunkts screening bør udformes, så selv de relativt svage inhibitorer med høj konfidensniveau indfanger sig ved at vælge en passende inhibitor koncentration og en foruddefineret tærskel respons grad til at skelne mellem aktive og inaktive Forbindelser.

At fastslå, at forskellene mellem de hæmmende konstanter er statistisk signifikante, udføres bedst ved at omskrive ligningen for ikke-lineær regression for at bestemme pKi (-logki) i stedet for Ki, da PKi er normalt distribueres, mens KI ikke er30. Usikkerheden for pKi er symmetrisk, mens den ikke er symmetrisk for KI31. Konfidensintervaller kan beregnes for pKi og t-test eller variansanalyse (ANOVA) kan anvendes til at afgøre, om midlerne til PKi -målingerne er signifikant forskellige. Der skal dog udvises forsigtighed ved udførelse af en sådan statistisk test, da de antager homoscedasticitet (samme varians af data i grupper). Man kan forvente højere varians forbundet med pKI , når en fuld dosis-respons kurve ikke kan opnås på grund af sammensatte opløselighed spørgsmål. I dette tilfælde bør der anvendes andre relevante statistiske tests, som ikke antager samme varians (f. eks.

Enhver sammensatte hæmmende PK eller LDH ville give et falsk positivt signal i den NADH-koblede ATPase-analyse. Nogle af disse falske positiver kan identificeres ved at køre analysen med et ikke-forretningsmæssigt forbundet ADP-producerende enzym. I dette tilfælde kan der ikke forventes nogen hæmning for reelle positive hits, medmindre inhibitorer er en ATP analog binding til begge enzymer. For at påvise en sådan analyse udførte vi en ATPase-analyse ved brug af para-aminoblebbistatin og apyrase, et ATP-hydrolyserende enzym, der ikke var relateret til myosines (Se figur 5). Alternativt kan der køres en anden funktionel analyse, der er specifik for det pågældende enzym, eller en anden ATPase-analyse, der ikke anvender PK og LDH, for at skelne mellem reelle og falske positive hits (f. eks. den malachite grønne analyse).

Måling og analyse af de kinetik af fluorescens intensitet i alle brønde kræver en plade læser hurtigt nok til at scanne hele pladen på mindre end ~ 90 − 60 sekunder.

Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder

I modsætning til den "traditionelle" absorbans-baserede udlæser16,17,18,19,20, den modificerede NADH-koblede ATPase assay præsenteret her er afhængig af NADH fluorescens. Dette gør analysen mere følsom, så brugeren kan reducere excitation lysintensitet og dermed beskytte NADH eller inhibitorer mod fotokemisk nedbrydning.

Selv om analysen generelt er blevet anset for ikke egnet til håndtering af et stort antal prøver32, er de små reaktions volumener, der opnås her (20 μl) i et 384-Well-format, gør den modtagelig for halvhøje gennemløbs Screenings applikationer, især Hvis der tages hensyn til bestemmelse af hæmmende konstanter.

Alternative metoder er normalt afhængige af påvisning af det uorganiske fosfat, der produceres af ATPase-enzymet. For eksempel, [γ-32P] ATP kan bruges som et substrat for ATPase og derefter, den befriede uorganiske fosfat kan måles baseret på dets radioaktivitet. Analysen er følsom; Det kræver imidlertid håndtering af radioaktive stoffer, og den resterende ATP skal adskilles fra den uorganiske fosfat (f. eks. ved adsorptions af ATP på trækul)33. I den ovennævnte malachite grøn test, fosfat reagerer med molybden under sure betingelser og den resulterende phosphomolybdate kompleks binder malachite grønne farvestof forårsager et skift i sit absorptionsspektrum19,21, 22,23,24. Denne metode kræver også slukning af ATPase-reaktionen; Derfor er det meste bruges som en Endpoint-assay, især i høj gennemløb format. I modsætning til den kontinuerlige monitorering af ATPase-reaktionen i den NADH-koblede analyse antager en endepunkts analyse blot lineære tids kurser og kan ikke afsløre artefakter, der fører til ikke-linearitet. Forbindelser interagere med malachite grøn eller det komplekse dannet kan også føre til artefakter21. Desuden er den malachite grønne analyse meget følsom over for fosfat forurening24. I modsætning hertil er den NADH-koblede analyse ikke følsom over for ADP-kontaminering, da ADP (som altid er til stede på forskellige niveauer i ATP-prøver) hurtigt omdannes til ATP ved PK i begyndelsen af reaktionen. Der er ikke behov for at slukke eller udskile produkterne. En anden fluorometrisk analyse til måling af ATPase satser er allerede blevet udviklet ved at koble ATP hydrolyse til reaktionen katalyseret af nukleosid var34. Men, at analysen ikke udnytter en ATP regenerering cyklus, derfor fastsættelsen af de indledende reaktionshastigheder kan være langt mere udfordrende.

Fremtidige anvendelser eller anvisninger af metoden

Mange enzymer, som er afhængige af ATPase-aktivitet, er blevet udforsket som potentielle stofmål. Disse omfatter cytoskeletale motoriske proteiner, der tilhører kinesin35 og dynein-familierne36 og DNA-helitilfældene37, som alle er Terminal effektorer i forskellige signalveje. Den analyse, der er beskrevet her, kan let optimeres til lægemiddel opdagelse og udviklingsprojekter, som involverer ethvert enzym, som katalyserer en reaktion, hvor ADP er et produkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra det nationale Institut for neurologiske lidelser og slagtilfælde og National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17, (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125, (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12, (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6, (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8, (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39, (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43, (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299, (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351, (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1, (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53, (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71, (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277, (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24, (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321, (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7, (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169, (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327, (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279, (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12, (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31, (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161, (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52, (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307, (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266, (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7, (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11, (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter