Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Abstract

ATPase-Enzyme nutzen die in Adenosintriphosphat gespeicherte freie Energie, um eine Vielzahl von endergonischen biochemischen Prozessen in vivo zu katalysieren, die nicht spontan auftreten würden. Diese Proteine sind entscheidend für alle Aspekte des Zelllebens, einschließlich Stoffwechsel, Zellteilung, Reaktionen auf Umweltveränderungen und Bewegung. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen nicotinamidadenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelten ATPase-Assay, der an das semi-hohe Durchsatzscreening kleiner Molekül-ATPase-Inhibitoren angepasst wurde. Der Assay wurde als Beweis für das Prinzip auf Herz- und Skelettmuskel Myosin II, zwei aktinbasierte molekularmotorische ATPases, angewendet. Die Hydrolyse von ATP wird mit der Oxidation von NADH durch enzymatische Reaktionen im Assay gekoppelt. Zunächst wird die von der ATPase erzeugte ADP durch Pyruvatkinase (PK) zu ATP regeneriert. PK katalysiert den Übergang von Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat parallel. Anschließend wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat reduziert, was die Oxidation von NADH parallel katalysiert. Somit steht die Abnahme der ATP-Konzentration in direktem Zusammenhang mit der Abnahme der NADH-Konzentration, gefolgt von einer Veränderung der intrinsischen Fluoreszenz von NADH. Solange PEP im Reaktionssystem verfügbar ist, bleibt die ADP-Konzentration sehr gering, wodurch eine Hemmung des ATPase-Enzyms durch sein eigenes Produkt vermieden wird. Darüber hinaus bleibt die ATP-Konzentration nahezu konstant, was zu linearen Zeitkursen führt. Die Fluoreszenz wird kontinuierlich überwacht, was eine einfache Abschätzung der Datenqualität ermöglicht und dabei hilft, potenzielle Artefakte herauszufiltern (z. B. durch zusammengesetzte Fällungen oder thermische Veränderungen).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Myosine sind mechanochemische Energiewandler, die Adenosintriphosphat (ATP) hydrolysieren, um richtungsweisende Bewegungen entlang der Filamente des Aktin-Zytoskeletts in Eukaryoten1,2zu erzeugen. Sie haben sich sowohl strukturell als auch kinetisch an ihre verschiedenen intrazellulären Funktionen angepasst, wie z.B. den Transport von Organellen, Muskelkontraktion oder die Erzeugung von Zytoskelettspannung1,2. Die Myosin-Überfamilie wird durch 40 Myosin-Gene repräsentiert, die zu 12 verschiedenen Myosin-Klassen im menschlichen Genom3,4gehören. Mitglieder der Myosin-Klassen spielen verschiedene Rollen in einer sehr unterschiedlichen Reihe von Erkrankungen, wie mehrere Krebsarten, neurologische Störungen, Skelettmyopathien, und hypertrophe Kardiomyopathie5,6. Angesichts der großen Anzahl von physiologischen und pathologischen Funktionen dieser molekularen Motoren, ist es nicht verwunderlich, dass sie zunehmend als Wirkstoffziele für eine Vielzahl von Bedingungen erkannt werden7. Erhebliche Fortschritte wurden in letzter Zeit bei der Entdeckung neuer Myosininhibitoren8,9,10 und Aktivatoren11, und zur Verbesserung der Eigenschaften der bestehenden12 , 13 , 14 , 15.

Der nicotinamidadenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelte ATPase-Assay wird seit langem verwendet, um die ATPase-Aktivität verschiedener Enzyme zu messen, wie z.B. die sarkoplasmische Retikulum-Ca 2+-Pumpe ATPase16, die DNA-Reparatur ATPase Rad5417, die AAA+ ATPase p9718 oder der Mikrotubuli-Motor Kinesin19. Der Test verwendet einen ATP-Regenerationszyklus. Das von der ATPase erzeugte Adenosindiphosphat (ADP) wird durch Pyruvatkinase (PK) zu ATP regeneriert, wodurch ein Molekül Phosphoenolpyruvat (PEP) parallel in Pyruvat umwandelt. Anschließend wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat reduziert. Das wiederum oxidiert ein Molekül von NADH zu NAD. Daher entspricht die Abnahme der NADH-Konzentration in Abhängigkeit von der Zeit der ATP-Hydrolyserate. Der ATP-Regenerationszyklus hält die ATP-Konzentration nahezu konstant und die ADP-Konzentration niedrig, solange PEP verfügbar ist. Dies führt zu linearen Zeitkursen, was es einfach macht, die anfänglichen Reaktionsraten zu bestimmen und hilft, Produkthemmung durch ADP19zu vermeiden. Obwohl der NADH-gekoppelte ATPase-Assay bereits an ein 96-Well-Format20angepasst wurde, machen die hohen Reaktionsvolumina (ca. 150 l) es aufgrund der hohen Nachfrage nach Reagenzien relativ teuer, so dass er weniger anfällig für eine schnelle Abschirmung großer Verbindungen. Alternative Methoden wie der Malachit-Grüntest19,21, der auf dem Nachweis des vom ATPase-Enzym produzierten Phosphats beruht, erwiesen sich als besser geeignet für die Miniaturisierung und das Hochdurchsatzscreening22 , 23 , 24. Ein Endpunkttest wird jedoch eher von mehreren Artefakten beeinflusst (siehe unten), die ohne Vollzeitkurse unentdeckt bleiben können.

Hier wurde der NADH-gekoppelte ATPase-Assay für das semi-hohe Durchsatzscreening kleiner Molekülinhibitoren optimiert. Skelett- und Herzmuskelmyosin II und die Myosininhibitoren Blebbistatin8, Para-Aminoblebbistatin13 und Para-Nitroblebbistatin12 werden verwendet, um die Kraft des Assays zu demonstrieren, der auf NADH beruht Fluoreszenz als Auslesung. Dieses Protokoll ist für Screening-Projekte zugänglich, die sich auf alle ADP-produzierenden Enzyme konzentrieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Vorbereitung von Lagerlösungen und Reagenzien

  1. Bereiten Sie die Lagerlösung Dithiothreitol (DTT) vor, indem Sie kristallines DTT in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 1000 mM auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Aliquot und lagern bei -20 °C.
  2. Bereiten Sie die ATP-Lagerlösung vor, indem Sie kristallines ATP in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 mM auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Aliquot und lagern bei -20 °C.
  3. 10x NADH-Puffer mit 70 mM 3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM Ethylenglykol-Bis(-Aminoethylether)-N,N,N,N-Tetraessigsäure (EGTA) und 3 mM NaN3vorbereiten. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Bei 4 °C lagern.
  4. Bereiten Sie 1x Myosinpuffer mit 10 mM MOPS und 0,1 mMEGTA vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Bei 4 °C lagern. Rinderserumalbumin (BSA) und DTT zu einer Endkonzentration von 0,1% (w/v%) hinzufügen bzw. 1 mM vor Der Anwendung.
  5. Bereiten Sie 1x Aktinpuffer mit 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2und 3 mM NaN3vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Bei 4 °C lagern. BSA und DTT zu einer Endkonzentration von 0,1% hinzufügen (w/v%) bzw. 1 mM vor Der Anwendung.
  6. Bereiten Sie die NADH-Lagerlösung vor, indem Sie kristalline NADH in 10x NADH-Puffer auf eine Endkonzentration von 5,5 mM auflösen. Aliquot und lagern bei -20 °C.
  7. Bereiten Sie die PEP-Lagerlösung vor, indem Sie kristallines PEP in 10x NADH-Puffer auf eine Endkonzentration von 50 mM auflösen. Aliquot und lagern bei -20 °C.
  8. Herstellung der LDH-Stammlösung durch Auflösen von lyophilisiertem LDH-Pulver in einer Mischung aus Glycerin und 10x NADH-Puffer (50%:50%) einer Endkonzentration von 2000 U/ml. Zentrifugieren Sie die Lösung, um das vorhandene ungelöste Protein zu entfernen (7.197 x g, 20 °C, 10 min). Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein sauberes Zentrifugenrohr. Aliquot und lagern bei -20 °C.
  9. Bereiten Sie PK-Stammlösung durch Auflösen von lyophilisiertem PK-Pulver in einer Mischung aus Glycerin und 10x NADH-Puffer (50%:50%) einer Endkonzentration von 10000 U/ml. Zentrifugieren Sie die Lösung, um das vorhandene ungelöste Protein zu entfernen (7.197 x g, 20 °C, 10 min). Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein sauberes Zentrifugenrohr. Aliquot und lagern bei -20 °C.
  10. Rekonstituieren Sie die lyophilisierten Herz- und Skelettmuskelmyosin-II-Proben, indem Sie 100 l destilliertes Wasser hinzufügen, um 10 mg/ml-Stammlösungen zu erhalten, die 37,9 M bzw. 40,8 M Myosinkonzentrationen (monomer) entsprechen. Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers.
  11. Bereiten Sie F-Actin aus Kaninchenmuskel AcetonPulver, wie von Pardee und Spudich25beschrieben.

2. Messung von ATPase-Aktivitäten und hemmenden Wirkungen von kleinen Molekülinhibitoren

  1. Bereiten Sie zusammengesetzte Platte.
    1. Lösen Sie Verbindungen von Interesse in hochwertigem Dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Erstellen Sie fünfzehnstufige serielle 1:2 Verdünnungen ab 10 mM Compoundkonzentration in DMSO.
    3. Übertragen Sie die Proben mit einer Mehrkanalpipette auf eine 384-Well-Polypropylenplatte in Dreisprachigen (je 12,5 l). Verwenden Sie zwei Zeilen auf der Verbundplatte für eine Verbindung (anstelle von drei Spalten), um die Anzahl der Brunnen zu minimieren, die potenziell von Kanteneffekten betroffen sind. Verwenden Sie die letzten drei Bohrungen in der zweiten Reihe für jede Verbindung als Negativkontrolle (nur DMSO). Verwenden Sie nicht die erste und die letzte Reihe auf der Platte für zusammengesetzte Verdünnungen.
    4. Übertragen Sie reines DMSO in die Brunnen der ersten Reihe (reserviert für die NADH-Kalibrierung).
    5. Verwenden Sie die letzte Zeile für die positivsteuernde Steuerung.
      HINWEIS: Para-Aminoblebbistatin bei 4 mM Konzentration in DMSO wurde hier verwendet.
  2. Bereiten Sie für jede Assayplatte (384-well Black-Wall-Polystyrol-Mikroplatte) 4500 l von 20 M verdünnte Aktinlösung vor, indem Sie die Actin-Lagerlösung im Aktinpuffer verdünnen. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie 30x mit einer 5 ml Pipette nach oben und unten pipetieren, um Viskosität und Heterogenität durch Brechen von Aktinfilamenten zu reduzieren. Zentrifugieren Sie die Lösung, um vorhandene gefällte Proteine zu entfernen (7.197 x g, 20 °C, 10 min). Den Überstand vorsichtig in ein sauberes Zentrifugenrohr geben.
  3. Bereiten Sie Master-Mix mit LDH- und PK-Enzymen ("Enzymmix") vor. Kombinieren Sie für jede Testplatte 171,4 l LDH-Lösung, 171,4 l PK-Lösung und 3189,3 l oder 3252,9 l Myosinpuffer für Assays mit Herz- oder Skelettmuskel-Myosin-II-Lösung in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr. Fügen Sie an dieser Stelle kein Myosin hinzu, um Aggregation und Niederschlag zu vermeiden.
  4. Bereiten Sie master mix mit allen Substraten ("Substratmischung"). Kombinieren Sie für jede Platte 162,1 l ATP, 162,1 l PEP und 324,1 l NADH-Lösung in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr. Fügen Sie an dieser Stelle kein Actin hinzu, um Aggregation und Niederschlag zu vermeiden.
  5. Erstellen Sie siebenstufige serielle 1:2 Verdünnungen von NADH für die Kalibrierung ab 250 M.
    1. Mischen Sie 12,3 l NADH-Stammlösung mit 257,7 l Myosinpuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
    2. Aliquot 135 l Myosinpuffer in sieben 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren.
    3. 135 L Lösung aus dem ersten Rohr in das zweite geben und durch Pipettieren mischen. Wiederholen Sie dies, bis sie das7. Rohr erreicht.
    4. Verwenden Sie die letzte Röhre als No-NADH-Steuerelement (nur Puffer).
  6. Übertragen Sie mit einer 8-Kanal-Pipette 20 l der NADH-Kalibrierlösungen in die erste Reihe der Assayplatte in Triplicaten.
  7. Fügen Sie dem Enzymmix 68 l Kardial oder 4,2 l SkelettmuskelMyosin II hinzu. Wirbel kurz.
  8. Mit Ausnahme der ersten Reihe 8,4 l des vorbereiteten Myosin-Enzym-Mixes in jeden Brunnen der Assayplatte mit einem automatisierten Spender.
  9. Übertragen Sie 100 nL Lösungen von der Verbundplatte auf die Assayplatte, die Enzymmischung enthält, mit einem automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystem, das mit einem 100 nL-Stiftwerkzeugkopf ausgestattet ist.
  10. Schütteln Sie die Assayplatte 1 min bei Raumtemperatur bei 1200 Umdrehungen pro Minute mit einem Mikroplatten-Shaker.
  11. Fügen Sie 4.052 l der zentrifugierten Aktinlösung in die Substratmischung ein. Wirbel kurz.
  12. Geben Sie 11,6 l Actin-Substrat-Mix in jede Bohrung der Assayplatte (außer der ersten Reihe) ein, um die enzymatische Reaktion mit einem automatisierten Spender zu starten.
  13. Schütteln Sie die Assayplatte 1 min bei Raumtemperatur bei 1200 Umdrehungen pro Minute mit einem Mikroplatten-Shaker.
  14. Zentrifugieren Sie die Assayplatte bei 101 x g für 30 s.
  15. Stellen Sie sicher, dass die Innentemperatur des Plattenlesers bei 25 °C stabilisiert wurde. Laden Sie die Platte und schütteln Sie für weitere 30 s. Dieser Schüttelschritt ist notwendig, um die Form der flüssigen Oberfläche in jedem Brunnen ähnlich zu machen und lässt der Platte Zeit, um die Messtemperatur zu erreichen.
  16. Nehmen Sie die NADH-Fluoreszenz für 30 min auf, die Platte in 45 s Intervallen zu scannen. Verwenden Sie einen 380 nm, 10 nm Bandbreiten-Erregungsfilter und einen 470 nm, 24 nm Bandbreiten-Emissionsfilter in Verbindung mit einem 425 nm abgesenkten dichroitischen Spiegel. Führen Sie die Messung im Hochkonzentrationsmodus aus. Optimieren Sie die Anzahl der Blitze, die Detektorverstärkung, die Plattenabmessungen und die Messhöhe, bevor Sie die Tests ausführen.
    HINWEIS: Die Endaufnahmebedingungen sind 300 nM Herz/20 nM Skelettmuskel Myosin II, 10 M Actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 M NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP in einem Puffer mit 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/ml BSA, 0,5% (v/v) DMSO und 1 mM DTT. Das Gesamtvolumen beträgt 20 L/Well. Die höchste Endkonzentrationskonzentration liegt bei 50 M. 20 M Para-Aminoblebbistatin in 0,5% DMSO dient als Positivkontrolle und 0,5% DMSO allein ist die negative Kontrolle. Alle Messungen werden in Dreiern durchgeführt.

3. Analysieren von Daten

  1. Plotten Sie die beobachtete Fluoreszenzintensität gegen die Zeit für jeden Brunnen.
  2. Führen Sie eine einfache lineare Regression durch, um die Neigung und das Abfangen der Fluoreszenzantworten für jeden Brunnen zu bestimmen. Die Steigung ist proportional zur ATP-Verbrauchsrate (NADH), während der Abfangproportional zur NADH-Konzentration zu Beginn der Messung ist (t = 0 s).
  3. Konstruieren Sie eine Kalibrierkurve für NADH, indem Sie die für die erste Reihe der Platte erhaltenen Abschnitte gegen die Konzentration von NADH zeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Abfangabschnitte linear von der NADH-Konzentration abhängen.
    ANMERKUNG: Die Intercepts schätzen die realen Fluoreszenzintensitäten auf t = 0 s mit viel mehr Vertrauen als der Durchschnitt der Rohfluoreszenzintensität liest bei t 0 s.
  4. Führen Sie eine einfache lineare Regression durch, um die Steigung und den Abfang der NADH-Kalibrierungslinie zu erhalten.
    ANMERKUNG: Der Intercept beschreibt das Fluoreszenz-Hintergrundsignal (kein NADH vorhanden), während die Steigung der extrapolierten/theoretischen Fluoreszenzintensität einer 1 M NADH-Lösung in diesem speziellen Experiment entspricht.
  5. Teilen Sie die Steigung der Fluoreszenzantwort, die für den Rest der Brunnen erhalten wird, durch die Steigung der NADH-Kalibrierlinie, um Fluoreszenzänderungen in ATP-Verbrauchsraten umzuwandeln.
  6. Zeichnen Sie die ATP-Verbrauchsraten gegen die Konzentration des Inhibitors.
  7. Um hemmende Konstanten zu bestimmen, verwenden Sie geeignete statistische Software, um die Dosis-Wirkungs-Daten an die folgende quadratische Gleichung anzupassen, die einem einfachen Eins-zu-Eins-Bindungsgleichgewichtsmodell entspricht:
    Equation 1
    wobei Y die ATP-Verbrauchsrate ist, Ymin die ATP-Verbrauchsrate int das Fehlen eines Inhibitors ist, Ymax ist die theoretische ATP-Verbrauchsrate bei 100% Hemmung, KI ist die hemmende Konstante , [E]t und [I]t sind die Gesamtkonzentration des Enzyms (Myosin) bzw. des Inhibitors.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die typische Plattenlayoutkarte, die für Screening-Experimente verwendet wird, ist in Abbildung 1dargestellt. Die erste und letzte Zeile sind für die NADH-Kalibrierung und Positivkontrolle reserviert (20 M Para-Aminoblebbistatin, 0,5% DMSO). Die übrigen Reihen (B bis O) werden verwendet, um die hemmende Aktivität von Verbindungen zu testen. Hierbei werden fünfzehnstufige serielle 1:2 Verdünnungen ab 10 mM Compoundkonzentration in DMSO vorbereitet und von der Verbundplatte auf die Assayplatte übertragen, so dass die höchste Endmassekonzentration 50 m (in 0,5% DMSO) auf der Assayplatte beträgt. Zwei Zeilen werden verwendet, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve für eine Verbindung zu erhalten (48 Datenpunkte/Verbindung). Beachten Sie, dass die Plattenlayoutkarten neu gestaltet werden können, um die spezifischen Ziele eines bestimmten Projekts zu unterstützen. Wenn es beispielsweise darum ginge, Single-Point-Screening-Daten für eine große Anzahl von Verbindungen zu erhalten, könnte man 112 Verbindungen auf einer einzigen 384-Well-Platte mit dem gleichen Layout für die Positivkontrolle und NADH-Kalibrierung (Berechnung mit Triplizierten für jede Verbindung). Es wird immer empfohlen, mindestens 3 Datenpunkte für eine Verbindung (oder für jede Konzentration) zu haben und zu vermeiden, nur die Brunnen entlang der Kanten der Platte für eine Verbindung zu verwenden, da diese Datenpunkte durch Kanteneffekte beeinflusst werden können. Um die Bedeutung von Kanteneffekten abzuschätzen, führen Sie immer zuerst eine vollbeinige Platte mit Negativkontrolle aus.

Die Fluoreszenzintensitäten haben eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration von NADH, wie in Abbildung 2Adargestellt. Die Steigung der linearen Anpassung wird während der Datenanalyse verwendet, um Fluoreszenzänderungen in Reaktionsgeschwindigkeiten umzuwandeln. Beachten Sie, dass die Rohfluoreszenzintensitätsspur, die für jeden Bohrkörper der NADH-Kalibrierung erhalten wurde, zunächst durch lineare Regression analysiert wird (eine ähnliche Analyse ist in Abbildung 2B,C für zusammengesetzte Daten dargestellt). Es wird erwartet, dass diese Spuren im Laufe der Zeit aufgrund der Photobleichung des Fluorophors exponentiellen Zerfall zeigen. Das Photobleichen ist jedoch sehr langsam und daher können die Rohdaten durch lineare Passungen analysiert werden. Die Steigung und das Abfangen dieser Passungen entsprechen der Anfangsrate der Photobleaching und der Fluoreszenzintensität bei t = 0 s. Die Abfangabschnitte dieser linearen Passungen werden anstelle des Durchschnitts der Rohfluoreszenzlesungen bei t = 0 s verwendet, um die NADH-Kalibrierungskurve zu konstruieren, da die Intercepts auf der Grundlage von mehr Daten geschätzt werden und daher die zugehörigen Fehler viel kleiner sind.

Abbildung 2B,C zeigt, dass unabhängig vom verwendeten Myosin oder dem Vorhandensein des Inhibitors die Zeitläufe im Zeitfenster der Messungen linear sind. Die höchsten (50 M) und niedrigsten (0 M) Inhibitorkonzentrationen entsprechen hier einer Hemmung von 100 % bzw. 0 %. Beachten Sie, dass die tatsächliche Analyse aufgrund der Menge an Rohdaten chaotisch erscheinen würde, wenn sie in einem einzigen Panel angezeigt wird. Daher wurden diese Panels vereinfacht, um den Prozess besser zu visualisieren. Der Durchschnitt der Rohfluoreszenzintensität sierte für alle parallelen Experimente (Triplikate für jede Konzentration) und wurde hier in NADH-Konzentrationen umgewandelt. Es werden nur 3 Inhibitorkonzentrationen angezeigt. In der realen Analyse wird jede Rohefluoreszenzintensitätsspur (48/compound tested) zunächst durch lineare Regression analysiert und anschließend in ATP-Verbrauchsraten umgerechnet.

Es ist immer ratsam, nachzuweisen, dass sich die Reaktionsraten linear mit der Enzymkonzentration ändern, wie in Abbildung 2D und Abbildung2E für Skelett- bzw. Herzmuskelmyosin II dargestellt. Basierend auf den linearen Passungen kann die endgültige Assay-Konzentration des Enzyms leicht geschätzt werden. Für 30-min-Zeitkurse wird z. B. eine Reaktionsgeschwindigkeit von 5 x 10-8 Ms-1 empfohlen. Wenn ein Aktivator in den Reaktionsgemieren (z. B. Actin hier) verwendet wird, wird empfohlen, die Experimente sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit des Aktivators durchzuführen, um sicherzustellen, dass die erwartete Wirkung (Aktivierung) vorhanden ist. Die Bedingungen und das Verfahren müssen dem endgültigen Protokoll so genau wie möglich folgen. Hier wurde zunächst eine Verdünnungsserie von Myosin im Myosinpuffer in acht Mikrozentrifugenröhren hergestellt. Anschließend wurde eine Mischung aus LDH- und PK-Enzymen hinzugefügt. Schließlich wurden die Reaktionen durch Zugabe von Substratmischung zu jedem Rohr parallel, mit einer Mehrkanalpipette begonnen. Reaktionsmischungen wurden sofort in einer Reihe der Assayplatte in Triplicaten übertragen. Wenn Actin fehlte, wurde stattdessen ein Actin-Puffer verwendet. Andere Parameter wurden nicht geändert (siehe Anmerkung von Schritt 2.16 im Protokoll für endgültige Testbedingungen).

Abbildung 2F zeigt die ATP-Verbrauchsraten für mehrere negative und positive Kontrollreaktionen (jeweils halbplatte). Diese Daten können anhand des Z-Werts oder des "Screening-Fensterkoeffizienten"26verglichen werden, einem weit verbreiteten statistischen Parameter zur Schätzung der Qualität von Tests mit hohem Durchsatz. Es vergleicht die positiven und negativen Kontrollen unter Berücksichtigung sowohl der Mittelwerte als auch der Standardabweichungen:

Equation 2,

wobei die Standardabweichungen und Mittel der negativen bzw. positiven Kontrollen in den Jahren n, p und n, p sind. Die beiden Populationen sind gut getrennt, wenn der Wert des Z zwischen 0,5 und 1 fällt. Ein Z' = 0,78 hier erhalten zeigt, dass der Assay kann als ausgezeichnet26betrachtet werden.

Um zu zeigen, dass der Assay zur Bestimmung hemmender Konstanten verwendet werden kann, haben das kleine Molekül Myosinhemmer Blebbistatin8 und zwei Analoga, Para-Nitroblebbistatin12 und Para-Aminoblebbistatin13 wurde hier ausgewählt, wie in Abbildung 3A und Abbildung 3Bdargestellt. Blebbistatin ist ein nicht konkurrenzfähiger, allosterischer Myosin-Inhibitor27,28. Ein Molekül von Blebbistatin bindet an eine motorische Domäne von Myosin und blockiert den ATPase-Zyklus durch Stabilisierung des Myosin-ADP-Phosphat-Komplexes27,28. Daher wurde die hemmende Wirkung von Blebbistatin-Derivaten mit einem einfachen Eins-zu-Eins-Bindungsmodell modelliert (siehe Schritt 3.7 im Protokoll). Beachten Sie, dass dieses Modell möglicherweise nicht anwendbar war, wenn die ATP-Verbrauchsraten keine lineare Abhängigkeit von der Myosinkonzentration gezeigt hatten (siehe Abbildung 2D,E). Die kinetische wässrige Löslichkeit von Blebbistatin, Para-Nitroblebbistatin und Para-Aminoblebbistatin wurde mit 426 ,M, 3,6 m bzw. 9,3 m bzw.13) berichtet. Es wurden keine Anomalien im Signal bei oder unter den gemeldeten Löslichkeiten in unseren Experimenten beobachtet; jedoch traten mehrere Artefakte auf, wenn entweder Blebbistatin oder Para-Nitroblebbistatin über ihren gemeldeten Löslichkeitswerten verwendet wurde, wie in Abbildung 4dargestellt. Daher wurde das in Konzentrationen, die höher als die Löslichkeit waren, in diesen Fällen von der Datenanalyse ausgeschlossen. Para-Aminoblebbistatin ist sehr löslich, und daher war lösliche in diesem Fall kein begrenzender Faktor.

Schließlich, Es wird immer empfohlen zu testen, ob die hemmende Wirkung von positiven Treffern spezifisch für das Ziel-ATPase-Enzym sind. Das gekoppelte Reaktionssystem verwendet zwei andere Enzyme, LDH und PK, und die Hemmung eines dieser Enzyme würde zu einem falsch positiven Signal führen. Die Durchführung des ATPase-Assays mit einem nicht verwandten ATPase-Enzym kann helfen, diese falsch positiven Treffer herauszufiltern (weitere Empfehlungen finden Sie in der Diskussion). Para-Aminoblebbistatin und Apyrase, ein ATP-Hydrolysenenzym, das ADP und anorganisches Phosphat29produziert, wurden hier als Beispiel verwendet, um ein solches Kontrollexperiment zu demonstrieren, wie in Abbildung 5dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1 : Assay-Platten-Layout. Siebenstufige serielle 1:2 Verdünnungen von NADH ab 250 M Konzentration werden vorbereitet und anschließend in Reihe A in Dreifache zur Kalibrierung (schwarz bis grün Farbverlauf) abgegeben. Die letzten drei Bohrungen der Zeile A enthalten nur Einen Myosinpuffer (kein NADH-Steuerelement, weiß). Die letzte Zeile (P) wird für die Positivkontrolle (20 'M para-aminoblebbistatin; red) verwendet. Ein typisches Dosis-Wirkungs-Experiment erfordert zwei Reihen (z. B. B und C). Daher können 7 Dosis-Wirkungs-Experimente parallel auf einer einzigen 384-Well-Platte durchgeführt werden (dargestellt durch blaue bis weiße Farbverläufe). Jede Probe wird als Triplicate geladen. Hier beginnen die höchsten Endkonzentrationen bei 50 m (in 0,5% DMSO). Die letzten drei Brunnen jeder zweiten Reihe sind für die Negativkontrolle reserviert (keine Verbindung, nur 0,5% DMSO; Cyan). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative ATPase-Daten. (A) Eine zweifache Verdünnungsreihe von NADH wurde vorbereitet und in die erste Reihe jeder Messplatte übertragen. Die Fluoreszenzintensität wurde 30 min lang aufgezeichnet und die Rohdaten mittels einfacher linearer Regression analysiert. Der Abfang jeder Regressionslinie wurde gegen die Konzentration von NADH geplottet. Beachten Sie, dass im Idealfall die Fluoreszenzintensität bei t = 0 s einfach verwendet werden könnte, um die Kalibrierlinie zu erhalten. Während die Rohfluoreszenzdaten jedoch sehr laut sind, geben die Abfangabschnitte eine genaue Schätzung der Fluoreszenzintensität bei t = 0 s an, und der zugehörige Standardfehler (angezeigt als Fehlerbalken) ist sehr klein. (B,C) Repräsentative Fluoreszenzintensitätsspuren des Skeletts (B) und des Herzmuskels (C) DER ATPase-Reaktionen wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen (siehe Eingebungen) von Para-Aminoblebbistatin aufgezeichnet. Der Einfachheit halber stellen Datenpunkte und Fehlerbalken den Durchschnitt von drei unabhängigen Messungen bzw. die zugehörige Standardabweichung dar. Einfache lineare Regression wurde durchgeführt (feste Linien), um Reaktionsraten zu erhalten. Beachten Sie, dass ein typisches Dosis-Wirkungs-Experiment aus 15 verschiedenen Inhibitorkonzentrationen und Negativkontrollen in Triplicaten auf der Messplatte besteht (siehe Abbildung 1) und die lineare Regression für jede Fluoreszenz einzeln durchgeführt wird. Intensitätsspur. Der Einfachheit halber werden hier nur 3 verschiedene Konzentrationen gezeigt. (D,E) Basal (rot) und actinaktiviert (blau) ATPase Raten wurden für verschiedene Skelett (D) und Herz (E) Muskel myosin II Konzentrationen bestimmt. Die ATPase-Raten zeigen eine lineare Abhängigkeit von der Myosinkonzentration. (F) Positive (rote) und negative (blaue) Kontrollen (jeweils halbplatte) wurden parallel auf einer 384-Well-Assayplatte ausgeführt, und der Z-Faktor (Z') wurde berechnet, um die Qualität des ATPase-Assays zu bewerten. Ein Z'-Wert von 0,78 deutet auf einen zuverlässigen Test mit sehr gut getrennten positiven und negativen Kontrollen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Dosis-Wirkungs-Kurven und Analyse hemmender Konstanten. Herz (A) und Skelett (B) Muskel Myosin I I wurden verwendet, um die hemmende Aktivität von Blebbistatin, Para-Aminoblebbistatin und Para-Nitroblebbistatinzu testen. ATPase-Raten (blau) wurden durch einfache lineare Regression auf die Rohfluoreszenzdaten erreicht. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Fittings dar und wurden als Gewichtungsfaktoren beim Anpassen einer quadratischen Gleichung verwendet (siehe Schritt 3.7 im Protokoll), die ein einfaches Gleichgewichtsbindungsmodell (rot) darstellt. Die über die Löslichkeit gewonnenen Daten wurden durch Artefakte beeinflusst und von der Analyse ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Löslichkeitsbezogene Artefakte. (A) Fluoreszenzintensitätsspuren für Blebbistatin, die in einem ATPase-Assay mit Skelettmuskel Myosin II erhalten wurden, zeigen linear abnehmendes Signal in Abhängigkeit von der Menge des vorhandenen Inhibitors (blau). Bei der Verwendung von Blebbistatin über der Löslichkeit (50 M anfängliche Blebbistatin-Konzentration) wurde jedoch eine Erhöhung des Signals beobachtet (rot), wahrscheinlich aufgrund der Bildung von hell fluoreszierenden Blebbistatinkristallen13. (B) Bei Para-Nitroblebbistatin, einem nicht fluoreszierenden Analogon von Blebbistatin12, erschienen die Rohfluoreszenzintensitätsspuren normal (abnehmend). Die höchste Hemmungsstufe war jedoch viel niedriger als erwartet (basierend auf der positiven Kontrolle). Daher wurden nur die unter der Löslichkeit (blau) ermittelten Reaktionsraten in die Datenanalyse einbezogen. Die über der Löslichkeit (rot) erhaltenen Reaktionsraten weichen von der ermittelten Dosis-Wirkungs-Kurve (grün), da die Niederschlagsmenge (Konzentration) des in lösungsberuhigten Inhibitors begrenzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Hemmende Wirkungen von para- Aminoblebbistatin in Skelettmuskel Myosin II und Apyrase ATPase Assays. Para-Aminoblebbistatin hemmte skelettöses Myosin II mit einem KI von 1,7 M, während keine Hemmung festgestellt wurde, wenn Apyrase29 als ATPase im selben gekoppelten Reaktionssystem verwendet wurde. Dieses Experiment zeigt deutlich, dass Para-Aminoblebbistatin myosin spezifisch ist und PK oder LDH nicht hemmt, daher ist die nachgewiesene hemmende Wirkung kein Artefakt. Apyrase wurde mit einer Konzentration von 0,5 nM verwendet. Es war kein Myosin oder Aktin vorhanden, und die Reaktion wurde in einem Puffer mit 100 mM MOPS (pH = 7,0), 3 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 3 mM NaN3, 1 mM DTT und 0,1% BSA durchgeführt. Es wurden keine weiteren Änderungen am Protokoll vorgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritische Schritte im Protokoll

Optimieren Sie das Plattenlayout, indem Sie mehrere Platten nur mit Negativkontrolle betreiben (ATPase-Reaktion ohne Inhibitor). Prüfen Sie die Ergebnisse sorgfältig auf Muster in Reaktionsgeschwindigkeiten. Diese können z. B. durch Kanteneffekte und/oder Unvollkommenheiten in der hydrophilen Oberflächenbeschichtung von "unverbindlichen" Platten entstehen. Wenn ein Muster beobachtet wird, ändern Sie den Plattentyp und/oder das Plattenlayout, um die Artefakte zu minimieren. Beispielsweise kann eine typische Dosis-Wirkungs-Kurve (16 Konzentrationen mit Triplicaten, 48 Punkte insgesamt) entweder in drei Spalten oder zwei Reihen auf einer 384-Well-Platte angeordnet werden. Diese Anordnungen ergeben 6 bzw. 4 Datenpunkte, die wahrscheinlich von Kanteneffekten beeinflusst werden. Daher wird die Zeilenanordnung immer bevorzugt.

Änderungen und Fehlerbehebung

Beachten Sie, dass die beobachteten Fluoreszenzreaktionen während des gesamten Hauptzeitverlaufs der Reaktion linear sein müssen. Nichtlinearitäten können in den ersten Minuten aufgrund von thermischen Veränderungen oder in den letzten Minuten aufgrund des Erreichens des Gleichgewichts auftreten. Wenn Nichtlinearitäten vorhanden sind, kann man entweder Reaktionsparameter anpassen (z.B. Myosin verdünnen, Messtemperatur ändern) oder die Analyse einfach auf den linearen Teil der Daten beschränken.

Nichtlinearitäten können auch zu Beginn der Reaktionen vorhanden sein, wenn die Bindung des Inhibitors an das ATPase-Enzym langsam ist (über Minuten auftretend). In diesem Fall wird erwartet, dass sich die Reaktion im Laufe der Zeit verlangsamt, wenn sich der Enzyminhibitor-Komplex ansammelt. Inkubieren Sie die Assayplatte, bevor Sie die Substratmischung nach Bedarf hinzufügen, um dieses Problem zu vermeiden.

Die Assay-Bedingungen müssen so gewählt werden, dass der lineare Teil der Reaktionen länger als 15 Minuten ist. Kürzere lineare Teile entsprechen weniger nützlichen Datenpunkten (<20, da das Scannen der gesamten Platte 45 Sekunden dauert). Daher ergeben die linearen Passungen weniger zuverlässige Steigungen (Reaktionsraten) mit viel höheren Standardfehlern. Auf der anderen Seite wird nicht empfohlen, kinetische Lesevorgänge zu erhalten, die länger als 120 Minuten sind. Solche Experimente können durch Proteindenaturierung oder Konzentrationsänderungen aufgrund der Lösungsmittelverdampfung beeinflusst werden. Diese Kriterien können am einfachsten erfüllt werden, indem die Myosinkonzentration angepasst wird.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die von PK und LDH ausgelösten Reaktionen im gekoppelten Reaktionssystem nicht eine Ratenbegrenzung sind. Kontrollexperimente, die ohne die ATPase von Interesse oder auf einem hohen Niveau eines potenten ATPase-Inhibitors durchgeführt wurden, zeigten keine (oder wenig) Aktivität. Das Hinzufügen von ADP würde jedoch zu einer schnellen Signalabnahme führen, wenn LDH und PK aktiv sind und ordnungsgemäß funktionieren. Es wird erwartet, dass die Rate des NADH-Verbrauchs in diesem Kontrollexperiment sehr hoch sein wird, daher ist es entscheidend, so schnell wie möglich mit der Erkennung zu beginnen, nachdem die Reaktion durch die Zugabe von ADP ausgelöst wurde.

Es wird immer empfohlen, alle beobachteten ATPase-Raten, die über der Löslichkeit des Inhibitors ermittelt wurden, von der Datenanalyse auszuschließen. Da die Löslichkeit von der Temperatur, Reinheit der Verbindung und Unterschieden in der Zusammensetzung der Lösung abhängt, wird dringend empfohlen, sie unter Bedingungen zu messen, die den tatsächlichen Bedingungen (Temperatur, Puffer usw.) unter die atPase-Assay durchgeführt wird. Der Versuch, kleine Molekülinhibitoren über lösliche Weise zu verwenden, kann zu Niederschlägen führen, die die Ergebnisse beeinflussen könnten (siehe Abbildung 4). Niederschlag begrenzt die Konzentration der Verbindung bei oder in der Nähe von Löslichkeit. Daher können die ATPase-Raten nicht weiter reduziert werden, indem mehr Inhibitor hinzugefügt wird. Mit einer guten positiv-Kontrolle, die zeigt, 100% Hemmung, kann daher helfen, solche Anomalien im Signal zu identifizieren, auch wenn die Löslichkeit unbekannt ist. Ein großer Unterschied zwischen der beobachteten Reaktionsgeschwindigkeit der Positivkontrolle und der Reaktionsgeschwindigkeit, die zum maximalen Hemmungsniveau (Imax) gehört, das durch Fitting bestimmt wird, ist immer ein guter Hinweis auf das Problem. Nach und nach wird in solchen Fällen empfohlen, immer mehr Daten aus der Analyse und/oder der Positivkontrolle zu schließen, wie ich max, und sie während des Fitting-Prozesses festzuhalten, bis eine bessere Anpassung erzielt wird. Inhibitor-Ausfällung kann auch zu einer starken Lichtstreuung führen und auch die optischen Eigenschaften des Inhibitors verändern, was zu ungewöhnlich hohen beobachteten Signalintensitäten zu Beginn der Reaktionen und/oder zunehmenden Signalen im Laufe der Zeit führt. Rohdaten müssen immer sorgfältig geprüft und die betroffenen Konzentrationen von der Analyse ausgenommen werden.

Einschränkungen der Methode

Die abschließende Assaykonzentration für ATPase mit geringer Umsatzzahl (z.B. Herzmuskelmyosin II) muss hoch sein (mehrere hundert nM), um messbare Reaktionsraten innerhalb des Zeitfensters des Assays (30 bis 120 Minuten) zu erreichen. Daher kann es wichtig sein, das quadratische Bindungsmodell für die Analyse von Dosis-Wirkungs-Kurven zu verwenden. Andere Bindungsmodelle (hyperbolisch, Hill) sind in der Regel nicht für die Analyse solcher Daten geeignet. Darüber hinaus setzt die Konzentration des ATPase eine untere Grenze für den Bereich messbarer hemmender Konstanten, da die Dosis-Wirkungs-Kurven in der Praxis aufgrund von experimentellen Fehlern nicht mehr zu unterscheiden sind, wenn das KI nahe oder kleiner als die Konzentration der ATPase.

Unterschiede in den zusammengesetzten Potenzen sollten immer quantifiziert werden, indem Dosis-Wirkungs-Experimente durchgeführt und die hemmenden Konstanten bestimmt werden. Obwohl die Daten des Einzelpunkt-Screenings diese theoretischen Unterschiede widerspiegeln, würde die Nichtlinearität der Antworten zusammen mit dem experimentellen Fehler die Durchführung einer solchen Analyse extrem erschweren. Einpunkt-Screening-Experimente sollten so konzipiert sein, dass sie selbst die relativ schwachen Inhibitoren mit hohem Vertrauen erfassen, indem eine geeignete Inhibitorkonzentration und ein vordefinierter Schwellenwert für die Reaktionsfähigkeit gewählt werden, um zwischen aktiven und inaktiven Verbindungen.

Die Feststellung, dass die Unterschiede zwischen den hemmenden Konstanten statistisch signifikant sind, wird am besten durch neu schreibende Gleichung für nichtlineare Regression durchgeführt, um pKI (-logKI) anstelle von K I zu bestimmen, da pKI normal verteilt, während KI nicht30ist. Die Unsicherheit für pKI ist symmetrisch, während sie für KI31nicht symmetrisch ist. Konfidenzintervalle können für pKI berechnet werden und t-Test oder Varianzanalyse (ANOVA) kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Mittelwerte der pK I-Messungen signifikant unterschiedlich sind. Bei der Durchführung eines solchen statistischen Tests ist jedoch Vorsicht geboten, da sie von der Homoscedastizität ausgehen (gleiche Varianz der Daten in Gruppen). Man kann eine höhere Varianz im Zusammenhang mit pKI erwarten, wenn eine volle Dosis-Wirkungs-Kurve aufgrund von Problemen mit der Compoundlöslichkeit nicht erhalten werden kann. In diesem Fall sollten andere geeignete statistische Tests verwendet werden, bei der keine gleichen Varianzen angenommen werden (z. B. Welchs t-Test).

Jede Verbindung, die PK oder LDH hemmt, würde ein falsch positives Signal im NADH-gekoppelten ATPase-Assay geben. Einige dieser falschen Positivmeldungen können identifiziert werden, indem der Test mit einem nicht verwandten ADP-produzierenden Enzym ausgeführt wird. In diesem Fall ist keine Hemmung für echte positive Treffer zu erwarten, es sei denn, der Inhibitor ist eine ATP-analoge Bindung an beide Enzyme. Um eine solche Analyse zu demonstrieren, führten wir einen ATPase-Test mit Para-Aminoblebbistatin und Apyrase durch, einem ATP-Hydrolysonenenzym, das nicht mit Myosinen verwandt ist (siehe Abbildung 5). Alternativ kann ein anderer funktioneller Test, der für das Enzym von Interesse spezifisch ist, oder ein anderer ATPase-Assay ohne PK und LDH durchgeführt werden, um zwischen realen und falsch positiven Treffern zu unterscheiden (z. B. den Malachit-Grünen-Assay).

Die Messung und Analyse der Kinetik der Fluoreszenzintensität in allen Brunnen erfordert einen Plattenleser, der schnell genug ist, um die gesamte Platte in weniger als 90 bis 60 Sekunden zu scannen.

Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden

Im Gegensatz zum "traditionellen" Absorptions-basierten Auslesen16,17,18,19,20setzt der modifizierte NADH-gekoppelte ATPase-Assay, der hier vorgestellt wird, auf NADH-Fluoreszenz. Dies macht den Test empfindlicher, so dass der Benutzer Anregung Lichtintensität zu reduzieren und damit NADH oder die Inhibitoren vor photochemischer Zersetzung zu schützen.

Obwohl der Assay allgemein als nicht geeignet für die Handhabung einer großen Anzahl von Proben32angesehen wurde, sind die hier erreichten kleinen Reaktionsvolumina (20 l) im 384-Well-Format für semi-hohe Durchsatz-Screening-Anwendungen, insbesondere für wenn die Bestimmung hemmender Konstanten in Betracht gezogen wird.

Alternative Methoden basieren in der Regel auf dem Nachweis des durch das ENZYM ATPase produzierten anorganischen Phosphats. Zum Beispiel kann [-32P]ATP als Substrat für die ATPase verwendet werden und anschließend kann das freigesetzte anorganische Phosphat anhand seiner Radioaktivität gemessen werden. Der Test ist sensibel; es erfordert jedoch den Umgang mit radioaktiven Stoffen, und der verbleibende ATP muss vom anorganischen Phosphat getrennt werden (z. B. durch Adsorption von ATP auf Holzkohle)33. Im oben genannten Malachit-Grüntest reagiert Phosphat mit Molybdat unter sauren Bedingungen und der resultierende Phosphomolybdatkomplex bindet den Malachit-Grünfarbstoff, was zu einer Verschiebung seines Absorptionsspektrums19,21, 22,23,24. Diese Methode erfordert auch das Abschrecken der ATPase-Reaktion; Daher wird es meist als Endpunkt-Assay verwendet, vor allem im Format mit hohem Durchsatz. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Überwachung der ATPase-Reaktion im NADH-gekoppelten Assay nimmt ein Endpunkttest einfach lineare Zeitläufe an und kann keine Artefakte offenbaren, die zu Nichtlinearitäten führen. Verbindungen, die mit Malachitgrün interagieren oder der komplex gebildete kann auch zu Artefakten führen21. Darüber hinaus ist der Malachit-Grün-Assay sehr empfindlich gegen Phosphatkontamination24. Im Gegensatz dazu ist der NADH-gekoppelte Assay nicht empfindlich auf ADP-Kontamination, da ADP (die immer auf verschiedenen Ebenen in ATP-Proben vorhanden ist) von PK zu Beginn der Reaktion schnell in ATP umgewandelt wird. Es besteht keine Notwendigkeit zum Abschrecken oder Trennen der Produkte. Ein weiterer fluormetrischer Test zur Messung der ATPase-Raten wurde bereits durch Kopplung der ATP-Hydrolyse an die mit Nukleosidphosphorylase34katalysierte Reaktion entwickelt. Dieser Test nutzt jedoch keinen ATP-Regenerationszyklus, daher kann die Bestimmung der anfänglichen Reaktionsraten viel schwieriger sein.

Zukünftige Anwendungen oder Anweisungen der Methode

Viele Enzyme, die auf ATPase-Aktivität verlassen, wurden als potenzielle Arzneimittelziele untersucht. Dazu gehören zytoskelettale motorische Proteine der Kinesin-35- und Dynein-Familien36 und der DNA-Helicases37, die alle die endstationsischen Effektoren in verschiedenen Signalwegen sind. Der hier beschriebene Test kann leicht für Arzneimittelentdeckungs- und Entwicklungsprojekte optimiert werden, bei denen jedes Enzym eine Reaktion katalysieren, bei der ADP ein Produkt ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Neurological Disorders and Stroke und des National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17, (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125, (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12, (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6, (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8, (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39, (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43, (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299, (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351, (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1, (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53, (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71, (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277, (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24, (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321, (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7, (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169, (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327, (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279, (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12, (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31, (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161, (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52, (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307, (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266, (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7, (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11, (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter