Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

Published: August 17, 2019 doi: 10.3791/60017
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 2, 1,2
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

Summary

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

Abstract

האנזימים atpase לנצל את האנרגיה החופשית מאוחסן אדנוזין טריפוספט כדי לזרז מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים מאנדריוני ב vivo זה לא היה מתרחש באופן ספונטני. חלבונים אלה חיוניים למעשה כל ההיבטים של החיים הסלולריים, כולל חילוף החומרים, החטיבה התא, תגובות שינויים סביבתיים ותנועה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הסביבה הזאת באמצעות הקרנת מולקולות של מולקולה קטנה (NADH) בשילוב של מולקולת התפוקה למחצה. הדבר הוחל על שריר לב השלד רירן II של, שני actin מבוססי מנוע מולקולרי ATPases, כהוכחה לעיקרון. ההידרוליזה של ATP משולב לחמצון של NADH על ידי תגובות אנזימטיות בבחינה. ראשית, ה-ADP שנוצר על-ידי ה-ATPase נוצר מחדש ל-ATP על ידי פירובט קינאז (PK). PK מזרז את המעבר של פוספולרופפירובט (פפ) לפירובט במקביל. לאחר מכן, פירובט מצטמצם לקטט על ידי לקטט דהידרוגנאז (LDH), אשר מזרז את החמצון של NADH במקביל. לפיכך, הירידה בריכוז ה-ATP מכוונת ישירות לירידה בריכוז NADH, הבאה לאחר שינוי בזריחה הפנימית של NADH. כל עוד מערכת ה-פפ זמינה במערכת התגובה, ריכוז ה-ADP נותר נמוך מאוד, ונמנע מעיכוב באנזים ATPase באמצעות מוצר משלו. יתרה מזאת, הריכוז של ATP נשאר כמעט קבוע ומניב קורסי זמן ליניאריים. הזריחה מנוטרת ברציפות, אשר מאפשר הערכה קלה של איכות הנתונים ומסייע לסנן חפצים פוטנציאליים (למשל, הנובעים משקעים מורכבים או שינויים תרמיים).

Introduction

מיוחטאים הם מכניכי אנרגיה מכימיים הידרוליייז אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי ליצור תנועה כיוונית לאורך החוטים של השלד של אקטין ב eukaryotes1,2. יש להם הן מבנית ומותאם באופן מבחינה מדומה פונקציות תאיים שונות שלהם, כגון התחבורה של אורגלים, התכווצות שרירים או את הדור של מתח ציטושלד1,2. רירן משפחה מיוצגת על ידי ~ 40 רירן גנים השייכים ~ 12 מחלקות רירן נפרדות בגנום האדם3,4. חברי הכיתות רירן לשחק תפקידים שונים בקבוצה מגוונת מאוד של הפרעות, כגון מספר סוגי סרטן, הפרעות נוירולוגיות, השלד myopathies, ו יפרטרופית שריר הלב5,6. בהתחשב במספר הגדול של התפקודים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של המנועים המולקולריים הללו, אין זה מפתיע שהם נעשים יותר ויותר מוכרים כמטרות סמים עבור מגוון של תנאים7. התקדמות משמעותית נעשתה לאחרונה בגילוי של מעכבי רירן חדשים8,9,10 ומפעילים11, כדי לשפר את המאפיינים של הקיימים12, מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , . חמש עשרה

המלון הינו בשילוב עם השימוש באותו מספר שימש למדידת פעילות ה-ATPase באנזימים שונים, כגון הsarcoplasmic הרשת2 + משאבת atpase16, תיקון DNA atpase Rad5417, AAA + ATPase p9718 או מנוע מיקרוכדורית19. התהליך מעסיק מעגל התחדשות של ATP. אדנוזין diphosphate (ADP) שנוצר על ידי ATPase הוא נוצר מחדש ל-ATP על ידי פירובט קינאז (PK), אשר הופך מולקולה אחת של פוספולרופפירופיבט (פפ) לפירובט במקביל. לאחר מכן, פירובט מופחת כדי לקטט ידי לקטט דהידרוגנאז (LDH). זה, בתורו, מחמצן אחד מולקולה של NADH ל-NAD. לפיכך, הירידה בריכוז NADH כפונקציה של זמן שווה לקצב ההידרוליזה של ATP. מחזור ה-ATP שומר על ריכוז ה-ATP כמעט קבוע והריכוז של ADP מועט כל עוד האפשרות של ה-פפ זמינה. התוצאה היא קורסי זמן ליניארי, מה שהופך אותו פשוט כדי לקבוע את שיעורי התגובה הראשונית ומסייע להימנע מעיכוב המוצר על ידי ADP19. למרות הדרישה NADH מצמידים ATPase כבר הותאם 96-היטב בפורמט20, התגובה הגבוהה ביותר (~ 150 μl) לעשות את זה יקר יחסית בשל הביקוש הגבוה של ריאגנטים, עיבוד זה קל פחות להקרנה מהירה של מספרים גדולים של תרכובות. שיטות אלטרנטיביות, כגון השיטה הירוקה למלאכית19,21, המסתמכת על גילוי הפוספט המיוצר על ידי האנזים atpase, הוכחו מתאימים יותר למזעור ולהקרנה בתפוקה גבוהה22 , מיכל בן 23 , 24. עם זאת, שיטת נקודות קצה עשויה להיות מושפעת ממספר פריטים (שנדונו להלן), שעלולים להישאר לא מתקיימים בהיעדר קורסים במשרה מלאה.

כאן, הבקשה NADH ביחד ATPase ממוטבת עבור הקרנת תפוקה למחצה גבוהה של מעכבי מולקולה קטנה. שריר השלד ושרירי הלב רירן II ו רירן מעכבי בלייבסטטין8, פארא-האמיביוסטטין11 ו פארא-ניטרוגליצרין בליביוסטטין12 משמשים כדי להדגים את כוחה של היכולת, אשר נשענת על nadh פלואורסצנטית כבדיקה. פרוטוקול זה הוא קל לסינון פרויקטים התמקדו כל הפקת האנזימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פתרונות מניות וריאגנטים

  1. להכין את הפתרון המלאי (DTT) מניות על ידי המסת DTT גבישי במים מזוקקים לריכוז הסופי של 1000 מ"מ. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  2. הכנת פתרון מניות ATP על ידי המסת ATP גבישי במים מזוקקים לריכוז הסופי של 100 מ"מ. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  3. להכין מאגר 10x NADH המכיל 70 mM 3-(N-מורגוולינו) חומצה propanesulfonic (מגבים), 10 מ"מ MgCl2, 0.9 mm אתילן גליקול-bis (β-עמינח האתר)-N, N, n ′, n′-טטראצטט חומצה (egta), ו 3 מ"מ נאן3. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. חנות ב -4 ° c.
  4. להכין מאגר רירן x המכיל 10 מ"מ מגבים ו 0.1 mM EGTA. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. חנות ב -4 ° c. הוסף סרום של שור הבקר (BSA) ו-DTT לריכוז הסופי של 0.1% (w/v%) ו -1 מ"מ, בהתאמה, לפני השימוש.
  5. הכינו מאגר אקטין 1x המכיל 4 מ"מ, 0.1 mm egta, 2 מ"מ mgcl2, ו 3 מ"מ נאן3. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. חנות ב -4 ° c. הוסף BSA ו-DTT לריכוז הסופי של 0.1% (w/v%) ו -1 מ"מ, בהתאמה, לפני השימוש.
  6. הכנת פתרון מלאי NADH על ידי המסת NADH הגבישי בשנת מאגר NADH 10x לריכוז הסופי של 5.5 מ"מ. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  7. הכינו פתרון מלאי ה-אפ על ידי המסת ה-פפ הגבישית במאגר של 10x NADH לריכוז הסופי של 50 מ"מ. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  8. הכנת פתרון מניות LDH על-ידי המסת אבקת ליאופהנד בתערובת של גליצרול ומאגר 10x הנדח (50%: 50%) לריכוז הסופי של 2000-U/mL. צנטריפוגה את הפתרון כדי להסיר כל חלבון מומס הנוכחי (7,197 x g, 20 ° c, 10 דקות). להעביר את הסופרנטאנט. לצינור צנטריפוגה נקי בזהירות מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  9. הכינו פתרון מניות PK על-ידי המסת אבקת PK ליאופ, בתערובת של גליצרול ו-10x מאגר NADH (50%: 50%) לריכוז הסופי של 10000-U/mL. צנטריפוגה את הפתרון כדי להסיר כל חלבון מומס הנוכחי (7,197 x g, 20 ° c, 10 דקות). להעביר את הסופרנטאנט. לצינור צנטריפוגה נקי בזהירות מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  10. ליצור מחדש את השריר הלב ואת השלד רירן II דגימות על ידי הוספת 100 μL מים מזוקקים כדי להשיג 10 mg/mL פתרונות מניות המתאימים ~ 37.9 μM ו ~ 40.8 μM רירן ריכוזים (monomeric), בהתאמה. לקבלת פרטים נוספים, ראה הוראות היצרן.
  11. הכינו F-actin מאבקה של שריר הארנב כמתואר על ידי Pardee ו Spudich25.

2. מדידת פעילויות ATPase והשפעות מעכבות של מעכבי מולקולה קטנה

  1. . הכן צלחת מורכבת
    1. התמוססות תרכובות עניין בdimethylsulfoxide באיכות גבוהה (DMSO).
    2. צור 15-צעד סדרתי 1:2 מדלל החל מ 10 מ"מ ריכוז מתחם ב DMSO.
    3. העבר את הדגימות לצלחת פוליפרופילן 384-היטב ב טריליטים (12.5 μL כל אחד) באמצעות פיפטה רב-ערוצית. השתמש בשתי שורות על הלוח המורכב עבור תרכובת אחת (במקום שלוש עמודות) כדי למזער את מספר הבארות שעלולות להיות מושפעות מאפקטי קצה. השתמש בשלוש הבארות האחרונות בשורה השניה עבור כל תרכובת כפקד שלילי (DMSO בלבד). אין להשתמש בשורה הראשונה והאחרונה בלוח עבור מדלל מורכבים.
    4. העבר DMSO טהור לתוך הבארות של השורה הראשונה (שמור עבור כיול NADH).
    5. השתמש בשורה האחרונה לבקרה חיובית.
      הערה: פארא-האמיאובליביוסטטין בריכוז 4 מ"מ ב dmso שימש כאן.
  2. הכינו 4500 μl של 20 μm מדולל פתרון אקטין עבור כל צלחת השיטת (384-ובכן שחור הקיר פוליסטירן microplate) על ידי דילול פתרון מניות אקטין במאגר אקטין. לערבב את הפתרון ביסודיות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 30x באמצעות הפיפטה 5 מ ל כדי להפחית את צמיגות וטרוגניות על ידי שבירת החוטים אקטין. צנטריפוגה את הפתרון כדי להסיר את כל חלבון זירז הנוכחי (7,197 x g, 20 ° c, 10 דקות). העבר בזהירות את הסופרנטאנט. לתוך צינור צנטריפוגה נקי
  3. הכן תמהיל מומחה המכיל אנזימי LDH ו-PK ("תערובת אנזימים"). עבור כל צלחת השיטת, לשלב 171.4 μl של פתרון ldh, 171.4 μl של פתרון PK ו 3189.3 μl או 3252.9 μl של רירן מאגר עבור בחני מעורבים שריר הלב או השלד רירן II של, בהתאמה, ב 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה חרוטי. אל תוסיף רירן בנקודה זו כדי למנוע צבירה ומשקעים.
  4. להכין מיקס מאסטר המכיל את כל מצעים ("תערובת מצע"). עבור כל צלחת, לשלב 162.1 μL של ATP, 162.1 μL של פפ ו 324.1 μL של פתרון NADH בשפופרת צנטריפוגה של 15 מ"ל. אין להוסיף אקטין בשלב זה כדי למנוע צבירה ומשקעים.
  5. צור שבעה שלבים סידוריים 1:2 באורך של NADH עבור כיול החל מ 250 μM.
    1. מערבבים 12.3 μL של פתרון מלאי NADH עם 257.7 μL של מאגר רירן בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
    2. Aliquot 135 μL של מאגר רירן לתוך שבעה 1.5 מ ל צינורות מיקרוצנטריפוגה.
    3. העברת 135 μL של הפתרון מהצינור הראשון לתוך השני ומערבבים על ידי ליטוף. חזור עלהרכבת עד . שנגיע לשפופרת השביעית
    4. השתמש בצינור האחרון כפקד ללא-NADH (מאגר בלבד).
  6. באמצעות פיפטה של 8 ערוצים, העבר 20 μL של פתרונות כיול NADH לתוך השורה הראשונה של צלחת השימוש בטריליטים.
  7. הוסף 68 μL של לב או 4.2 μL של שריר השלד רירן II כדי לערבב אנזימים. . מערבולת בקצרה
  8. מלבד השורה הראשונה, לתת 8.4 μL של מיקס רירן-אנזים מוכן לתוך כל טוב של צלחת היישום באמצעות מנפק אוטומטי.
  9. העברת 100 nL של פתרונות מלוחית המתחם ועד לצלחת העיבוד המכילה את תמהיל האנזימים באמצעות מערכת הטיפול האוטומטי בנוזל מצויד בראש כלי 100 nL pin.
  10. לנער את צלחת השימוש 1 דקות בטמפרטורת החדר ב 1200 סל ד באמצעות מיקרופלייט שייקר.
  11. הוסף 4,052 μl של הפתרון centrifuged אקטין לתמהיל המצע. . מערבולת בקצרה
  12. לוותר 11.6 μL של actin-מצע לערבב לתוך כל טוב של צלחת השיטת (למעט שורה ראשונה) כדי להתחיל את התגובה אנזימטית באמצעות מנפק אוטומטי.
  13. לנער את צלחת השימוש 1 דקות בטמפרטורת החדר ב 1200 סל ד באמצעות מיקרופלייט שייקר.
  14. צנטריפוגה את צלחת המנה ב 101 x g עבור 30 s.
  15. ודא שהטמפרטורה הפנימית של קורא הלוחית התייצב ב -25 ° c. . העמיסו את הצלחת ונענו לעוד 30 שנות זה צעד לרעוד הוא הכרחי כדי להפוך את הצורה של המשטח הנוזלי דומה בכל היטב ומאפשר זמן לצלחת להגיע לטמפרטורת המדידה.
  16. הקלטת זריחה NADH עבור 30 דקות סריקת הצלחת במרווחי זמן של 45 s. השתמש 380 ננומטר, 10 מסנן העירור של רוחב הפס ו 470 nm, 24 מסנן פליטת רוחב פס בשילוב עם 425 nm לגזור דיקרואיק mirror. הפעל את המדידה במצב ריכוז גבוה. למטב את מספר הבזקים, לצבור גלאי, מידות צלחת וגובה מדידה לפני הפעלת assays.
    הערה: תנאי שנקבע סופי הם 300 ננומטר לב/20 שריר השלד nM רירן II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 מ"מ פפ, 1 מ"מ ATP במאגר המכיל 10 מ"מ מגבים (pH = 7.0), 2 מ"מ MgCl2 , 0.15 mM EGTA, 0.1 mg/mL BSA, 0.5% (v/v) DMSO ו 1 מ"מ DTT. הנפח הכולל הוא 20 μL/ובכן. הריכוז המורכב הסופי הגבוה ביותר הוא 50 μM. 20 μM פארא-האמילבלביוסטטין ב 0.5% dmso משמש כשליטה חיובית 0.5% dmso בלבד הוא שליטה שלילית. כל המדידות מתבצעות. בטריפליטים

3. ניתוח נתונים

  1. העלילה עוצמת הקרינה הנצפה נגד הזמן עבור כל טוב.
  2. בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי לקבוע את השיפוע ואת החיתוך של תגובות הזריחה עבור כל טוב. השיפוע פרופורציונלי לקצב הצריכה של ATP (NADH), בעוד שהחיתוך פרופורציונלי לריכוז NADH בתחילת המדידה (t = 0 s).
  3. בנו עקומת כיול עבור NADH על ידי התוויית ההודעות שהתקבלו עבור השורה הראשונה של הצלחת נגד הריכוז של NADH. ודא כי ההודעות תלויות בצורה קווית בריכוז NADH.
    הערה: המיירט מעריכים את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית האמיתית ב-t = 0 עם הרבה יותר ביטחון מאשר הממוצע של העוצמה הפלואורסצנטית הגולמי קורא ב-t ≈ 0.
  4. בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי להשיג את השיפוע והחיתוך של קו כיול NADH.
    הערה: החיתוך מתאר את אות הרקע הפלואורסצנטי (אין כרגע NADH), בעוד השיפוע מתאים לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית/תאורטית של פתרון של 1 מ-NADH בניסוי מסוים זה.
  5. חלק את השיפוע של תגובת הקרינה הפלואורסצנטית שהושג לשאר הבארות על-ידי השיפוע של קו כיול NADH כדי להמיר שינויי זריחה לתעריפי צריכת ה-ATP.
  6. התווה את תעריפי צריכת ה-ATP כנגד ריכוז המעכב.
  7. כדי לקבוע קבועים מעכבות, השתמש בתוכנה סטטיסטית מתאימה כדי להתאים לנתוני המינון-תגובה למשוואה הריבועית הבאה, המתאימה למודל שיווי משקל פשוט של אחד-לאחד:
    Equation 1
    כאשר y הוא קצב צריכת ה-Atp, ymin הוא קצב ה-atp Int היעדר המעכב, ymax הוא קצב הצריכה התיאורטי של ה-atp ב-100% עיכוב, KI הוא הקבוע המעכב , [ה]t ו [אני]t הם ריכוז מוחלט של האנזים (רירן) ומעכב, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המפה האופיינית לפריסת הלוח המשמשת לסינון ניסויים מוצגת באיור 1. השורות הראשונות והאחרונות שמורות עבור כיול NADH ושליטה חיובית (20 μM פארא-האמיבלביוסטטין, 0.5% dmso), בהתאמה. השורות הנותרות (ב-O) משמשות לבדיקת פעילות העכבות של תרכובות. כאן, 15-צעד סדרתי 1:2 לדילול החל מ 10 מילימטר הריכוז מתחם ב DMSO מוכנים והועברו מן הצלחת המתחם לצלחת הקבע, כך ריכוז המתחם הסופי הגבוה ביותר הוא 50 μM (ב 0.5% DMSO) על צלחת היכולת. שתי שורות משמשות לקבלת עקומת תגובת מינון עבור תרכובת אחת (48 נקודות נתונים/מתחם). שים לב כי ניתן לתכנן מחדש את מפות פריסת הצלחות כדי לתמוך במטרות הספציפיות של פרוייקט נתון. לדוגמה, אם המטרה הייתה להשיג נתוני הקרנה של נקודה אחת עבור מספר גדול של תרכובות, ניתן לבדוק 112 תרכובות על צלחת אחת 384-באר באמצעות פריסה זהה עבור שליטה חיובית וכיול NADH (חישוב עם טריליטים עבור כל תרכובת). תמיד מומלץ לקבל מינימום של 3 datapoints עבור תרכובת אחת (או עבור כל ריכוז) ולהימנע משימוש רק בארות לאורך קצות הצלחת עבור תרכובת אחת, כמו אלה נקודות נתונים עשויים להיות מושפעים תופעות הקצה. כדי להעריך את החשיבות של אפקטי קצה, הפעל תמיד צלחת מלאה עם שליטה שלילית בלבד תחילה.

לעוצמות הקרינה יש תלות ליניארית בריכוז NADH כפי שמוצג באיור 2A. השיפוע של ההתאמה הליניארית משמש במהלך ניתוח נתונים כדי להמיר שינויי זריחה לתעריפי התגובה. שים לב כי מעקב האינטנסיביות של הזריחה הגולמית המתקבל עבור כל באר של כיול NADH מנותח על ידי רגרסיה לינארית תחילה (ניתוח דומה מוצג באיור 2B, C עבור נתונים מורכבים). עקבות אלה צפויים להראות ריקבון מעריכי לאורך זמן עקב הלבנת של fluorophore. עם זאת, photobleaching לבנה היא איטית מאוד ולכן, הנתונים הגולמיים ניתן לנתח על ידי מתאים ליניאריים. השיפוע והחיתוך של מתאימים אלה מתאימים לשיעור ההתחלתי של הלבנה ועוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ב-t = 0, בהתאמה. ההודעות של התאים הליניארים האלה משמשות במקום הממוצע של הזריחה הגולמית קוראת ב-t = 0 כדי לבנות את עקומת כיול NADH מכיוון שהקריאות מוערכות בהתבסס על נתונים נוספים ולכן השגיאות המשויכות קטנות בהרבה.

איור 2b,C מדגים כי ללא קשר לרירן בשימוש או נוכחות של המעכב, קורסי הזמן הם ליניאריים בחלון הזמן של המידות. הגבוה ביותר (50 μM) וריכוזי המעכב הנמוכים ביותר (0 μM) מתאימים ל-~ 100% ו -0% מעכבות, בהתאמה. שים לב שבגלל כמות הנתונים הגולמיים, הניתוח בפועל יופיע כאוטי אם יוצג בלוח בודד. לכן, פאנלים אלה היו פשוטים יותר כדי להמחיש טוב יותר את התהליך. הממוצע של עוצמת הקרינה הגולמית מחושב על כל הניסויים המקבילים (מטריפיטים לכל ריכוז) ומומר לריכוזי NADH כאן. רק 3 ריכוזי מעכבי מוצגים. בניתוח האמיתי, כל מעקב של עוצמת הקרינה הגולמית (שנבדק 48/תרכובת) מנותח על-ידי רגרסיה לינארית תחילה, ולאחר מכן המדרונות מומרים לתעריפי צריכת ה-ATP.

תמיד מומלץ להדגים כי שיעורי התגובה לשנות ליניארי עם ריכוז האנזים, כפי שמוצג באיור 2D ואיור2d עבור שריר השלד רירן II של השריר, בהתאמה. בהתבסס על הסדר הליניארי, ניתן להעריך בקלות את הריכוז הסופי של האנזים. לדוגמה, שיעור תגובה של ~ 5 x 10-8 Ms-1 מומלץ לקורסי זמן 30 דקות. אם משתמשים בactivator בתערובות הריאקציה (כגון אקטין כאן), מומלץ להריץ את הניסויים הן בנוכחותם והן בהעדר הactivator כדי להבטיח שהאפקט הצפוי (הפעלה) יהיה קיים. התנאים וההליך חייבים לפעול בהתאם לפרוטוקול הסופי באופן הדוק ככל האפשר. כאן, סדרת דילול של רירן היה מוכן במאגר רירן בשמונה צינורות מיקרוצנטריפוגה תחילה. לאחר מכן נוספו שילוב של אנזימי LDH ו-PK. לבסוף, התגובות נכתבו על ידי הוספת תערובת מצע לכל צינור במקביל, באמצעות צינור רב-ערוצי. תערובות התגובה הועברו באופן מיידי לשורה אחת של צלחת ה, בטריפליטים. במקום זאת, נעשה שימוש במאגר אקטין. לא השתנו פרמטרים אחרים (עיין בהערה של שלב 2.16 בפרוטוקול לתנאי שינוי סופי).

איור 2F מציג שיעורי צריכת ATP שהתקבלו עבור תגובות שליליות וחיוביות מרובות של בקרה (חצי צלחת כל אחד). נתונים אלה יכולים להיות מושווים על בסיס ערך Z או "סינון מקדם חלון"26, שהוא פרמטר סטטיסטי בשימוש נרחב כדי להעריך את האיכות של assays התפוקה הגבוהה. הוא משווה את הפקדים החיוביים והשליליים על-ידי לקיחת הן את האמצעים והן את הסטיות הסטנדרטיות בחשבון:

Equation 2,

כאשר σn, σp ו- μn, μp הם הסטיות הסטנדרטיות ואמצעי השליטה השלילית והחיובית, בהתאמה. שתי האוכלוסיות מופרדות היטב אם ערך Z מתפרק בין 0.5 ל -1. A Z = 0.78 התקבל כאן מראה כי הבקשה יכולה להיחשב26מעולה.

כדי להדגים את האפשרות ניתן להשתמש כדי לקבוע קבועים מעכבות, את המולקולה הקטנה רירן מעכב בליביוסטטין8 ושני מקבילים, פארא-ניטרוגליצרין בליביוסטטין12 ו -פארא-האמילבלאת סטטין13 יש נבחר כאן, כפי שמוצג באיור 3A ואיור 3a. בלייבסטטין הוא מדכא רירן מאוד לא תחרותי, מעכב27,28. מולקולה אחת של בלייבסטטין נקשר לתחום מנוע אחד של רירן וחוסם את מחזור atpase על ידי ייצוב מורכבות רירן-ADP-פוספט27,28. לכן, השפעות העכבות של נגזרות בלייסטטין היו מודלים באמצעות מודל מחייב יחיד ליחיד כאן (ראה שלב 3.7 בפרוטוקול). שים לב כי ייתכן שמודל זה לא היה ישים אם תעריפי צריכת ה-ATP לא הראו תלות לינארית ברירן הריכוז (ראה איור 2D,E). מסיסות קינטית מימית של בלייביוסטטין, פארא-ניטרוגליצרין בלייסטטין ו -פארא-מאמילבלסטטין שדווחו להיות 426 μM, 3.6 μM ו 9.3 μm, בהתאמה13. לא נצפו חריגות באות או מתחת לsolubilities שדווחו בניסויים שלנו; עם זאת, מספר חפצים הופיעו כאשר או בליבסטטין או פארא-ניטרוגליצרין בלייסטטין שימש מעל ערכי מסיסות דיווחו שלהם, כפי שמוצג באיור 4. לכן, האות שנרשם בריכוזים גבוה יותר מאשר המיסיסות לא נכלל בניתוח הנתונים במקרים אלה. פארה-אמיאובליביוסטטין הוא מסיס מאוד, ולכן, מסיסות לא היה גורם מגביל במקרה זה.

לבסוף, מומלץ תמיד לבדוק אם השפעות העכבות של כל הכניסות החיוביות הן ספציפיות לאנזים ATPase המיועד. מערכת התגובה בשילוב מעסיקה שני אנזימים אחרים, LDH ו-PK, ו עיכוב של אחד מהם יביא אות חיובי כוזב. הפעלת היישום ATPase עם אנזים ATPase לא קשור עשוי לסייע לסנן כניסות חיוביות שווא אלה (לקבלת המלצות נוספות, ראה דיון). פארה-אמיאובליביוסטטין וapyrase, משתמש ב-ATP הידרוליזציה של האנזים הייצור של ADP ו-אורגניים פוספט של29, השתמשו כאן כדוגמה להדגים ניסוי שליטה כזה, כפי שמוצג באיור 5.

Figure 1
איור 1 : הצלחת שיטת הפריסה. 1:2 מדיעות סדרתיות של שבעה שלבים של NADH החל מ 250 הריכוז μM מוכן ולאחר מכן מחולק לשורה A ב טרילקאט עבור כיול (שחור כדי צבע ירוק הדרגתי). שלוש הבארות האחרונות של השורה A מכילים מאגר רירן בלבד (אין בקרת NADH, לבן). השורה האחרונה (P) משמשת עבור השליטה החיובית (20 μM פארא-האמילבלביוסטטין; אדום). ניסוי טיפוסי לתגובה במינון דורש שתי שורות (לדוגמה, B ו-C). לכן, 7 ניסויים במינון התגובה יכול להיות מופעל במקביל על אחת 384-באר הצלחת (מיוצגת על ידי כחול ללבן מעברי צבע). . כל דגימה נטענת כטרילקטים כאן, ריכוזי המתחם הסופי הגבוה ביותר להתחיל ב 50 μM (ב 0.5% DMSO). שלוש הבארות האחרונות של כל שורה שנייה שמורות לפקד השלילי (ללא מתחם, 0.5% DMSO בלבד; ציאן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : נתוני ATPase הנציג. (א) סדרת דילול דו-קיפול של nadh הוכנה והועברה לשורה הראשונה של כל לוחית מדידה. העוצמה הפלואורסצנטית הוקלטה במשך 30 דקות והנתונים הגולמיים נותחו על-ידי רגרסיה ליניארית פשוטה. היירוט של כל קו רגרסיה הותווה כנגד הריכוז של NADH. שים לב שבמקרה אידיאלי, העוצמה הפלואורסצנטית ב-t = 0 s יכולה פשוט לשמש להשגת קו הכיול. עם זאת, בעוד נתוני הזריחה הגולמית הוא רועש מאוד, מיירט לתת הערכה מדויקת של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ב-t = 0 ואת שגיאת התקן המשויכת שלהם (מוצג כמו קווי שגיאה) הוא קטן מאוד. (ב,ג) מייצג הכוח הפלואורסצנטית שרידים של השלד (ב) ו לב (C) שרירים רירן II תגובות atpase נרשמו בנוכחות של רמות שונות (ראה insets) של פארא-אמילביוסטטין. עבור פשטות, נקודות נתונים וקווי שגיאה מייצגים את הממוצע של שלוש מדידות עצמאיות ואת סטיית התקן המשויכת, בהתאמה. רגרסיה ליניארית פשוטה בוצעה (קווים מלאים) כדי לקבל שיעורי תגובה. לתשומת לבך, ניסוי מינון טיפוסי מורכב מ -15 ריכוזי מעכבי שונים ושליטה שלילית בטריליטים על צלחת המדידה (ראה איור 1) והרגרסיה הלינארית מבוצעת בנפרד עבור כל זריחה בעוצמה מעקב. עבור פשטות, רק 3 ריכוזים שונים מוצגים כאן. (ד,ה) בסיס (אדום) ו actin מופעל (כחול) שיעורי ATPase נקבע עבור השלד שונים (D) ו לב (E) שרירים רירן II ריכוזי. תעריפי ATPase מציגים תלות ליניארית בריכוז הרירן. (ו) שולטת (F) חיובית (אדומה) ושלילית (כחול) (חצי צלחת כל אחד) הופעל במקביל לצלחת ה384-היטב ומקדם Z (z) חושבה כדי להעריך את האיכות של שיטת ATPase. ערך Z של 0.78 מצביע על שיטת הערכה אמינה עם פקדים חיוביים ושליליים מופרדים היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : מינון התגובה עקומות וניתוח של קבועים מעכבות. לב (א) ו השלד (ב) שרירים רירן II של שימשו כדי לבדוק את פעילות העכבות של בלוביוסטטין, פארא-האמילובלבלסטטין ו פארא-ניטרוסטטין. שיעורי ATPase (כחול) הושגו על-ידי החלת רגרסיה ליניארית פשוטה לנתוני הזריחה הגולמית. קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של התאמה ושימשו כגורמי שקלול במהלך התאמת משוואה ריבועית (ראה שלב 3.7 בפרוטוקול) המייצג מודל מחייב שיווי משקל פשוט (אדום). נתונים שהושגו מעל מסיסות הושפעו מפריטים שאינם נכללים בניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : מסיסות-חפצים הקשורים. (A) העוצמה הפלואורסצנטית עקבות עבור בלוסטטין מושגת בתוך הרירן השלד ATPase באמצעות שריר שרירים II להראות ליניארי האות הפוחתת בהתאם לכמות של מעכב ההווה (כחול). עם זאת, כאשר בלייסטטין נעשה שימוש מעל מסיסות (50 μM הראשונית ריכוז בליאוסטטין), עלייה באות נצפתה (אדום), סביר להניח בשל היווצרות של גביש פלורסנט בוהק בלאוסטטין13. (ב) במקרה של פרה-ניטרוסטטין, שהוא אנלוגי שאינו פלורסנט של בלייבסטטין12, העקבות הגולמיים של הקרינה הפלואורסצנטית נראתה נורמלית (יורדת). עם זאת, רמת העיכוב הגבוהה ביותר הייתה נמוכה בהרבה מהצפוי (בהתבסס על השליטה החיובית). לכן, רק שיעורי התגובה המתקבלים מתחת לסיסות (כחול) נכללו בניתוח נתונים. שיעורי התגובה הושגו לעיל מסיסות (אדום) הסטות מתוך עקומת המינון הנחושה התגובה (ירוק), כמו משקעים מגביל את הכמות (ריכוז) של המעכב שנותר בפתרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : השפעות מעכבות של פארא- הרירן בשריר שריר השלד השני וapyrase ATPase assays. פארא-האמילבלביוסטטין מעכבות שריר השלד רירן II עם KI של 1.7 μm, תוך עיכוב לא זוהה כאשר Apyrase29 שימש atpase באותה מערכת תגובה מצמידים. ניסוי זה מוכיח בבירור כי פארא-מאמילביוסטטין הוא ספציפי רירן ואינו מעכב את PK או ldh, ולכן ההשפעה המעכבות שאותרו אינו חפץ. Apyrase שימש בריכוז 0.5 ננומטר. לא רירן או אקטין היה נוכח, ואת התגובה בוצעה במאגר המכיל 100 מ"מ (pH = 7.0), 3 מ"מ cacl2, 2 מ"מ mgcl2, 3 מ"מ נאן3, 1 מ"מ dtt, ו 0.1% bsa. לא נעשו שינויים אחרים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול

למטב את פריסת צלחת על ידי הפעלת כמה צלחות עם שליטה שלילית בלבד (התגובה ATPase ללא מעכב). בדוק את התוצאות בקפידה עבור דפוסים בשיעורי התגובה. לדוגמה, אלה עשויים לנבוע מאפקטי קצה ו/או פגמים בציפוי המשטח של הידרופיפילית של צלחות "לא מחייבות". אם תבנית מסוימת נצפתה, שנה את סוג הלוח ו/או את פריסת הצלחת כדי למזער את הממצאים. לדוגמה, עקומת מינון טיפוסית (16 ריכוזים עם טריליטים, 48 נקודות בסך הכל) יכול להיות מסודר בשלוש עמודות או שתי שורות על צלחת 384-באר. סידורים אלה מניבים 6 ו-4 נקודות נתונים, בהתאמה, שעלולות להיות מושפעות מאפקטי קצה. לכן, סידור השורות מועדף תמיד.

שינויים ופתרון בעיות

לתשומת לבך, התגובות הקרינה הצפות חייב להיות ליניארי לאורך כל הזמן מסלול התגובה. הקצוות הבלתי-שינמיים עשויים להתרחש בדקות הראשונות עקב שינויים תרמיים או בדקות האחרונות עקב הגעה לשיווי האיזון. אם קיימות שאינן קוטביות, ניתן להתאים את פרמטרי התגובה (לדוגמה, לדלל רירן, לשנות את טמפרטורת המדידה) או פשוט להגביל את הניתוח לחלק הליניארי של הנתונים.

בתחילת התגובות ניתן להציג קצוות לא-לינאטיים אם הכריכה של המעכב לאנזים ATPase איטית (המתרחשת על פני דקות). במקרה זה, התגובה צפויה להאט במהלך הזמן כמו מצטבר מורכבות אנזים מעכבי. מודקת את לוחית החישוב לפני הוספת לערבב מצע לפי הצורך כדי למנוע בעיה זו.

יש לבחור את תנאי השיטת הפעולה באופן שהחלק הליניארי של התגובות ארוך מ-15 דקות. חלקים ליניאריים קצרים מקבילים לנקודות נתונים שימושיות פחות (< 20, כאשר הסריקה של הצלחת כולה אורכת ~ 45 שניות). לכן, ליניארי מתאים תשואה פחות אמין מדרונות (שיעורי התגובה) עם שגיאות סטנדרטיות הרבה יותר גבוה. מצד שני, זה לא מומלץ לקבל הקינטי קורא יותר מ ~ 120 דקות. ניסויים כאלה עשויים להיות מושפעים הדנטורציה חלבונים או שינויי ריכוז עקב אידוי הממס. קריטריונים אלה יכולים להיות מתקיימים בקלות רבה יותר על ידי התאמת הריכוז רירן.

חשוב להבטיח כי התגובות לזרז על ידי PK ו LDH אינם הגבלת קצב במערכת התגובה מצמידים. בקרת ניסויים שבוצעו ללא ATPase של עניין או ברמות גבוהות של מעכבי ATPase חזק יהיה להראות לא (או מעט) פעילות. עם זאת, התוספת של ADP תגרום לירידה באות מהירה אם LDH ו-PK פעילים ויפעלו כראוי. שיעור הצריכה של NADH צפוי להיות גבוה מאוד בניסוי זה שליטה, אז זה חיוני כדי להתחיל בזיהוי בהקדם האפשרי לאחר התגובה הופעלה על ידי תוספת של ADP.

מומלץ תמיד להוציא את כל התעריפים הנצפים ATPase שהתקבלו מעל מסיסות המעכב מניתוח הנתונים. כמו מסיסות תלוי בטמפרטורה, טוהר של המתחם, והבדלים בהרכב של הפתרון, מומלץ מאוד למדוד אותו בתנאים כי הם דומים מאוד לתנאים בפועל (טמפרטורה, מאגר, וכו ') תחת אשר מבוצעת היצע ATPase. ניסיון להשתמש מעכבי מולקולות קטנות מעל מסיסות עלול לגרום משקעים שיכולים להשפיע על התוצאות (ראה איור 4). משקעים מגביל את ריכוז התרכובת באמצעות מסיסות או בקרבתה. משום כך לא ניתן לצמצם את תעריפי ATPase באמצעות הוספת מעכב יותר. באמצעות שליטה חיובית טובה המציגה ~ 100% עיכוב, לכן, יכול לעזור לזהות חריגות כאלה באות, גם אם מסיסות אינו ידוע. הבדל גדול בין שיעור התגובה הנצפה של השליטה החיובית ושיעור התגובה השייכים לרמת העכבות המקסימלית (אניmax) שנקבע בהתאמה הוא תמיד אינדיקציה טובה לבעיה. בהדרגה, למעט יותר ויותר נתונים מהניתוח ו/או שימוש בפקד החיובי כ-max ולשמור אותו קבוע במהלך תהליך ההתאמה עד לקבלת התאמה טובה יותר מומלץ במקרים כאלה. משקעים מעכבי עלול גם לגרום לפיזור אור חזק ועשוי גם לשנות את המאפיינים האופטיים של המעכב, המוביל לעוצמות אות גבוהות שנצפו באופן חריג בתחילת התגובות ו/או הגדלת האותות לאורך זמן. נתונים גולמיים חייבים תמיד להיבדק בקפידה, והריכוזים המושפעים חייבים להיות מושמטים מהניתוח.

מגבלות השיטה

הריכוז הסופי של שיטת ATPases עם מספר מחזור נמוך (למשל, שריר הלב רירן II) חייב להיות גבוה (כמה מאות ננומטר) כדי להשיג שיעורי תגובה מדידה בתוך חלון הזמן של המנה (30-120 דקות). לכן, ייתכן שיהיה חשוב להשתמש במודל הכריכה הריבועית לניתוח עקומות של מינון-תגובה. מודלים מחייבים אחרים (היפרבוליות, Hill) אינם מתאימים בדרך כלל לניתוח של נתונים אלה. יתר על כן, הריכוז של atpase מגדיר מגבלה נמוכה יותר לטווח של קבועים מעכבות מדידה, מכיוון שעקומות התגובה המינון לקבל להבדיל בפועל עקב נוכחות של שגיאות ניסיוני אם KI הוא קרוב או פחות מ ריכוז הatpase.

הבדלים ביכולות הפוטנטיות צריכות להיות תמיד כמות על-ידי ביצוע ניסויי מינון-תגובה וקביעת קבועי העכבות. למרות שנקודה אחת הקרנת נתונים משקפת הבדלים אלה בתאוריה, הלא מיניאריות של התגובות, יחד עם השגיאה הניסיונית יהיה קשה מאוד לבצע ניתוח כזה. בנקודה אחת ניסויים ההקרנה צריך להיות מתוכנן כדי ללכוד אפילו את מעכבי חלשים יחסית עם ביטחון גבוה על ידי בחירת ריכוז מעכב המתאים ורמת התגובה הסף מוגדר מראש כדי להבחין בין פעיל ולא פעיל תרכובות.

קביעה כי ההבדלים בין הקבועים מעכבות הם משמעותיים סטטיסטית מבוצע באופן הטוב ביותר על ידי כתיבת מחדש את המשוואה עבור רגרסיה לא לינארית כדי לקבוע pKi (-logkאני) במקום Ki, כמו pkאני בדרך כלל מופץ, בעוד KI הוא לא30. אי הוודאות עבור pKi הוא סימטרי, בעוד זה לא סימטרי עבור KI31. ניתן לחשב מרווחי ביטחון עבור pKI ו-t-test או ניתוח של סטיה (ANOVA) כדי לקבוע אם האמצעי של מדידות pKI שונים באופן משמעותי. עם זאת, יש לנקוט זהירות בעת ביצוע מבחן סטטיסטי כזה כאשר הם מניחים הומוסטיות (אותה סטיה של נתונים בקבוצות). אחד יכול לצפות שונות גבוהה יותר המשויכים pKI כאשר לא ניתן להשיג עקומת מינון מלאה של תגובה עקב בעיות מסיסות מורכבות. במקרה זה, יש להשתמש במבחנים סטטיסטיים מתאימים אחרים שאינם מניחים ששונויות שוות (למשל, מבחן t של וולש).

כל משטח של PK או LDH מעכבים, יעניק אות חיובי כוזב לתוך המבנה של המבנה. חלק מתוצאות חיוביות שווא אלה ניתן לזהות על ידי הפעלת הערך עם האנזים הפקת ADP לא קשור. במקרה זה, לא ניתן לצפות בעיכוב בכניסות חיוביות אמיתיות, אלא אם כן המעכב הוא איגוד אנלוגי של ATP לשני האנזימים. כדי להפגין ניתוח כזה, בוצעו בשימוש בשיטת ה-ATPase באמצעות הapyrase באמצעות פארה-אמיאובליבלאז, אנזים הידרוליזציה של ATP שאינו קשור ליוסינוסים (ראה איור 5). לחילופין, מערך פונקציונלי שונה הספציפי לאנזים הריבית, או שיטת ATPase שונה שאינה מפעילה את ה-PK ו-LDH ניתן להפעיל כדי להבדיל בין להיטים חיוביים אמיתיים ושקריים (למשל, שיטת הליכית הירוקה).

מדידה וניתוח של קינטיקה של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בכל הבארות דורשים קורא צלחת מהיר מספיק כדי לסרוק את כל הצלחת בתוך פחות מ ~ 90-60 שניות.

משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות

בניגוד לבדיקה "מסורתית" המבוססת על מבוססי בדיקה16,17,18,19,20, השינוי המתוקן ביחד atpase שהוצג כאן מסתמך על זריחה nadh. דבר זה הופך את השיטת הרגישות לרגישה יותר, ומאפשרת למשתמש להפחית את עוצמת האור העירור ובכך להגן על NADH או על מעכבי נגד פירוק פוטוכימי.

למרות הטיפול שנחשב בדרך כלל לא מתאים לטפל במספר גדול של דגימות32, כמויות התגובה הקטנות שהושגו כאן (20 μl) בפורמט 384-היטב הופך אותו לקלה עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה למחצה ההקרנה, במיוחד אם הקביעה של קבועים מעכבות נחשבת.

שיטות חלופיות בדרך כלל להסתמך על גילוי של פוספט אורגניים המיוצר על ידי האנזים ATPase. לדוגמה, [γ-32P] ATP ניתן להשתמש כמצע עבור ATPase ולאחר מכן, ניתן למדוד את הפוספט האורגני המשוחרר על בסיס הרדיואקטיביות שלה. השיטת הינה רגישה; עם זאת, זה דורש טיפול של חומרים רדיואקטיביים ו-ATP הנותרים חייב להיות מופרדים מן הפוספט אורגניים (למשל, על ידי ספיחה של ATP על פחם)33. בשנת הנזכרת הנ ל הירוק המלכית, פוספט מגיב עם molybdate תחת תנאים חומצי והמורכב phosphomolybdate שנוצר נקשר את הצבע הירוק מלכיט גרימת משמרת בספקטרום הקליטה שלה19,21, 22,23,24. שיטה זו דורשת גם הקוצ'ינג של תגובת ATPase; לפיכך, היא משמשת בעיקר כיישום נקודות-קצה, במיוחד בתבנית תפוקה גבוהה. בניגוד לניטור המתמשך של תגובת ה-ATPase בתוך הזמן המקביל, שיטת נקודת הקצה פשוט מניחה קורסי זמן ליניאריים ואינם יכולים לחשוף פריטים המובילים לקצוות שאינם מנוגדים. תרכובות אינטראקציה עם מלכיט ירוק או המורכב שנוצר עשוי להוביל גם חפצים21. יתרה מזאת, השיטת המלכית הירוקה רגישה מאוד לזיהום פוספט24. לעומת זאת, השינוי בשילוב הNADH אינו רגיש לזיהום ADP כ-ADP (שתמיד נוכח ברמות שונות בדגימות ATP) משתנה במהירות ל-ATP בתחילת התגובה. אין צורך בקוצ'ינג או הפרדה של המוצרים. עוד שיטת פלואורומטרי למדידת התעריפים ATPase כבר פותחה על ידי צימוד ה-ATP הידרוליזה כדי לזרז את התגובה על ידי נוקלאוטיו זוליקלז34. עם זאת, שיטת היצירה אינה מנצלת מחזור ATP, ולכן הקביעה של שיעורי התגובה הראשונית יכולה להיות הרבה יותר מאתגרת.

יישומים בעתיד או כיוונים של השיטה

אנזימים רבים המתבססים על פעילות ATPase נחקרו כמטרות התרופות הפוטנציאליות. אלה כוללים חלבונים מוטוריים ציטולדים השייכים קינזין35 ו דינאין משפחות36 ואת ה-DNA הליסים37, כולם הם מסופים הטרמינל במסלולים איתות מגוונות. האפשרות המתוארת כאן יכולה להיות ממוטבת בקלות לגילוי סמים ולפרויקטי פיתוח הכרוכים באנזים כלשהו המזרז תגובה שבה ADP הוא מוצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ המכון הלאומי על התעללות בסמים NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).

Tags

ביוכימיה סוגיה 150 שיטת ATPase NADH קרינה פלואורסצנטית חצי תפוקה גבוהה הקרנה מעכבות קבוע רירן
הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, … More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter