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Biochemistry

स्क्रीनिंग छोटे अणु अवरोधकों के लिए NADH-युग्मित ATPase परख के एक अर्द्ध उच्च Throughput अनुकूलन

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

एक निकोटिनामिडे एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड (नाडीएच)-युग्मित एटीएस परख को छोटे अणु मायोसिन अवरोधकों की सेमीहाई थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है। यह गतिज परख एक 384-वेल माइक्रोप्लेट प्रारूप में चलाया जाता है जिसमें प्रति कुएं में केवल 20 डिग्री सेल्सियस की कुल अभिक्रिया मात्रा होती है। मंच लगभग किसी भी ADP उत्पादन एंजाइम के लिए लागू होना चाहिए.

Abstract

ATPase एंजाइमों एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट में संग्रहीत मुक्त ऊर्जा का उपयोग करने के लिए vivo में endergonic जैव रासायनिक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता है कि सहज नहीं हो जाएगा उत्प्रेरित. इन प्रोटीन अनिवार्य रूप से सेलुलर जीवन के सभी पहलुओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, चयापचय सहित, सेल विभाजन, पर्यावरण परिवर्तन और आंदोलन के लिए प्रतिक्रियाओं. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-युग्मित ATPase परख है कि छोटे अणु ATPase inhibitors के अर्द्ध उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है का वर्णन करता है. परख हृदय और कंकाल मांसपेशी मायोसिन द्वितीय के लिए लागू किया गया है, दो actin आधारित आणविक मोटर ATPasses, सिद्धांत का एक सबूत के रूप में. एटीपी का जल अपघटन परख में एंजाइमी अभिक्रियाओं द्वारा नाडएच के ऑक्सीकरण के साथ युग्मित होता है। सबसे पहले, ATPasse द्वारा उत्पन्न ADP pyruvate kinase (पीके) द्वारा एटीपी को पुनर्जीवित किया जाता है। पीके फॉस्फोनोलोपिरुटेट (पीईपी) के समानांतर में पाइरुटेट में संक्रमण को उत्प्रेरित करता है। बाद में, पाइरुटेट को लैक्टेट डिहाइड्रोजेनेज (एलडीएच) द्वारा लैक्टेट तक कम कर दिया जाता है, जो समानांतर में नाडाड के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करता है। इस प्रकार, एटीपी एकाग्रता में कमी सीधे NADH एकाग्रता में कमी करने के लिए सहसंबद्ध है, जो NADH के आंतरिक फ्लोरोसेंट में परिवर्तन के बाद है. जब तक PEP प्रतिक्रिया प्रणाली में उपलब्ध है, ADP एकाग्रता बहुत कम रहता है, अपने उत्पाद द्वारा ATPasse एंजाइम के निषेध से परहेज. इसके अलावा, एटीपी एकाग्रता लगभग स्थिर रहता है, रैखिक समय पाठ्यक्रम उपज. फ्लोरोसेंट लगातार निगरानी की जाती है, जो डेटा की गुणवत्ता के आसान आकलन के लिए अनुमति देता है और संभावित कलाकृतियों (जैसे, यौगिक वर्षा या थर्मल परिवर्तन से उत्पन्न होने वाले) को फ़िल्टर करने में मदद करता है।

Introduction

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मायोसिन मेकेनोकेमिकल ऊर्जा ट्रांसड्यूसर होते हैं जो हाइड्रोलीज़ एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) यूकैरियोट समेंटोकेलके फिलामेंट के साथ दिशात्मक गति उत्पन्न करते हैं 1,2. वे दोनों संरचनात्मक और गतिज रूप से उनके विभिन्न intracellular कार्यों के लिए अनुकूलित है, इस तरह के organelles के परिवहन के रूप में, मांसपेशियों में संकुचन या cytoskeletal तनाव की पीढ़ी1,2. मायोसिन सुपरफैमिली का प्रतिनिधित्व मानव जीनोम3,4में 12 अलग मायोसिन वर्गों से संबंधित 40 मायोसिन जीनों द्वारा किया जाता है . मायोसिन वर्गों के सदस्य विकारों के एक अत्यधिक विविध सेट में विभिन्न भूमिका निभाते हैं, जैसे कई कैंसर, न्यूरोलॉजिकल विकार, कंकाल मायोपैथी, और हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी5,6. इन आणविक मोटरों के शारीरिक और रोग संबंधी कार्यों को देखते हुए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि वे विभिन्नस्थितियोंके लिए औषध लक्ष्यों के रूप में तेजी से पहचाने जा रहे हैं। हाल ही में नए मायोसिन इनहिबिटर8,9,10 और उत्प्रेरक11की खोज में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है और मौजूदा 12 के गुणों में सुधार करने के लिए, 13 , 14 , 15.

निकोटिनामिडे एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड (नाडीएच)-युग्मित एटीएस परख का उपयोग लंबे समय से विभिन्न एंजाइमों की एटीएस गतिविधि को मापने के लिए किया गया है, जैसे कि सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम कै2+ पंप ATPasse16, डीएनए मरम्मत ATPasse Rad5417, AAA+ ATPase p9718 या microtubule मोटर kinesin19. परख एक एटीपी पुनर्जनन चक्र कार्यरत हैं. एटीपास द्वारा उत्पन्न एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) को पाइरुटेट काइनाज़ (पीके) द्वारा एटीपी में पुनर्जीवित किया जाता है, जो फॉस्फोनोनोलपाइरुवेट (पीईपी) के एक अणु को समानांतर में पिरुटेट में बदल देता है। इसके बाद, पाइरुटेट को लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) द्वारा लैक्टेट तक कम कर दिया जाता है। इसके बदले में, नाड के एक अणु को नाड में ऑक्सीकृत कर देता है। इसलिए, समय के एक समारोह के रूप में नाडाह एकाग्रता में कमी एटीपी हाइड्रोलिसिस दर के बराबर होती है। एटीपी पुनर्जनन चक्र एटीपी एकाग्रता लगभग स्थिर रहता है और PEP उपलब्ध है के रूप में लंबे समय के रूप में ADP एकाग्रता कम. रैखिक समय पाठ्यक्रमों में यह परिणाम है, यह आसान प्रारंभिक प्रतिक्रिया दरों का निर्धारण करने के लिए बनाने और ADP19द्वारा उत्पाद अवरोध से बचने में मदद करता है. हालांकि NADH-युग्मित ATPase परख पहले से ही एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप20के लिए अनुकूलित किया गया है , उच्च प्रतिक्रिया मात्रा ($150 $L) यह अपेक्षाकृत अभिकर्मकों की उच्च मांग के कारण महंगा बनाने, यह कम की बड़ी संख्या की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित प्रतिपादन यौगिकों. वैकल्पिक तरीकों, जैसे malachite हरी परख19,21, जो ATPase एंजाइम द्वारा उत्पादित फॉस्फेट का पता लगाने पर निर्भर करता है, miniaturization और उच्च throughput स्क्रीनिंग22 के लिए अधिक उपयुक्त साबित हो रहे थे , 23 , 24. हालांकि, एक समापन बिंदु परख कई कलाकृतियों (नीचे चर्चा) से प्रभावित होने की संभावना है, जो पूर्णकालिक पाठ्यक्रमों के अभाव में अनदेखा रह सकता है।

यहाँ, NADH-युग्मित ATPasse परख छोटे अणु inhibitors के अर्द्ध उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है. कंकाल और हृदय की मांसपेशी मायोसिन द्वितीय और मायोसिन अवरोधक ोंकोश8, पैरा-अमिनोबलबिस्टाइन13 और पैरा-नाइट्रोब्लेब्टिटिन12 का उपयोग परख की शक्ति को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है, जो नाडाह पर निर्भर करता है एक readout के रूप में फ्लोरोसेंट. इस प्रोटोकॉल किसी भी ADP उत्पादन एंजाइमों पर ध्यान केंद्रित परियोजनाओं स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल है.

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Protocol

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1. स्टॉक समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 1000 एमएम की अंतिम सांद्रता के लिए आसुत जल में क्रिस्टलीय डीटीटी को भंग करके डाइथियोथ्रेटोल (डीटीटी) स्टॉक समाधान तैयार की। 1 M NaOH समाधान के साथ 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें। अलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  2. 100 एमएम की अंतिम सांद्रता के लिए आसुत जल में क्रिस्टलीय एटीपी भंग करके एटीपी स्टॉक समाधान तैयार करें। 1 M NaOH समाधान के साथ 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें। अलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  3. 70 mM 3- (N-morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS), 10 एमएम MgCl2, 0.9 m एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (जेड-एमिनोएथिल ईथर)-एन, एन, एन, एन, एन, एन- टेट्राएसिटिक एसिड (ईटीटीए), और 3 एम एम एन3तैयार करें। 1 M NaOH समाधान के साथ 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 1x मायोसिन बफर तैयार करें जिसमें 10 एमएम एमओपी और 0.1 एम एम ईजीटीए शामिल हैं। 1 M NaOH समाधान के साथ 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) और डीटीटी जोड़ें (w/ और 1 mM, क्रमशः, उपयोग करने से पहले.
  5. 4 एमएम एमओपी, 0.1 एमएम एग्स्टा, 2 एमएम एमजीसीएल2और 3 एम एम एन3युक्त 1x एक्टिन बफर तैयार करें। 1 M NaOH समाधान के साथ 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बीएसए और DTT जोड़ें (w/ और 1 mM, क्रमशः, उपयोग करने से पहले.
  6. क्रिस्टलीय NADH को 10x NADH बफर में 5.5 उ.मी. की अंतिम सांद्रता के लिए भंग करके NADH स्टॉक समाधान तैयार करें। अलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  7. 50 एमएम की अंतिम सांद्रता के लिए 10x नाडाह बफर में क्रिस्टलीय पीईपी को भंग करके पीईपी स्टॉक समाधान तैयार करें। अलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  8. ग्लिसरोल और 10x NADH बफर (50%:50%) के मिश्रण में lyophilized LDH पाउडर भंग करके LDH शेयर समाधान तैयार करें 2000 U/mL के एक अंतिम एकाग्रता के लिए. किसी भी अविलेय प्रोटीन वर्तमान (7,197 x g, 20 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) को हटाने के लिए समाधान को केंद्रमेंफ्यूज। सुपरनेंट को एक साफ अपकेंद्रण ट्यूब में सावधानी से स्थानांतरित करें। अलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  9. ग्लिसरोल और 10x NADH बफर (50%:50%) के मिश्रण में lyophilized पीके पाउडर भंग करके पीके स्टॉक समाधान तैयार करें 10000 U/mL की एक अंतिम एकाग्रता के लिए. किसी भी अविलेय प्रोटीन वर्तमान (7,197 x g, 20 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) को हटाने के लिए समाधान को केंद्रमेंफ्यूज। सुपरनेंट को एक साफ अपकेंद्रण ट्यूब में सावधानी से स्थानांतरित करें। अलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  10. lyophilized हृदय और कंकाल मांसपेशी मायोसिन द्वितीय नमूने जोड़ने के द्वारा पुनर्गठन 100 $L आसुत पानी प्राप्त करने के लिए 10 mg/mL स्टॉक समाधान करने के लिए इसी $37.9 $M और $ 40.8 $M myosin सांद्रता (monomeric), क्रमशः. अधिक जानकारी के लिए, निर्माता के निर्देश देखें.
  11. परडी और स्पूडिच25द्वारा वर्णित के रूप में खरगोश मांसपेशी एसीटोन पाउडर से एफ-एक्टिन तैयार करें।

2. ATPase गतिविधियों और छोटे अणु अवरोधकों के निरोधात्मक प्रभाव को मापने

  1. यौगिक प्लेट तैयार कीजिए।
    1. उच्च गुणवत्ता वाले डाइमेथिलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में ब्याज के यौगिकों को भंग करें।
    2. DMSO में 10 एम एम यौगिक एकाग्रता से शुरू पंद्रह कदम धारावाहिक 1:2 कमजोर पड़ने बनाएँ.
    3. नमूने triplicates में एक 384 अच्छी तरह से polypropylene प्लेट के लिए स्थानांतरण (12.5 $L प्रत्येक) एक multichannel pipette का उपयोग कर. एक यौगिक के लिए यौगिक प्लेट पर दो पंक्तियों का उपयोग करें (तीन स्तंभों के बजाय) संभावित किनारे प्रभाव से प्रभावित कुओं की संख्या को कम करने के लिए. नकारात्मक नियंत्रण (DMSO केवल) के रूप में प्रत्येक यौगिक के लिए दूसरी पंक्ति में पिछले तीन कुओं का प्रयोग करें. यौगिक कमजोर पड़ने के लिए थाली पर पहली और अंतिम पंक्ति का उपयोग न करें।
    4. पहली पंक्ति के कुओं में शुद्ध DMSO स्थानांतरण (NADH अंशांकन के लिए आरक्षित).
    5. सकारात्मक नियंत्रण के लिए अंतिम पंक्ति का उपयोग करें.
      नोट: DMSO में 4 एम एम एकाग्रता पर पैरा-aminoblebbistatin यहाँ इस्तेमाल किया गया था.
  2. actin बफर में actin स्टॉक समाधान को कम करके प्रत्येक परख प्लेट (384-अच्छी काली दीवार polystyrene microplate) के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पतला actin समाधान के 4500 $L तैयार करें। actin फिलामेंट को तोड़ने के द्वारा चिपचिपापन और विषमता को कम करने के लिए एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग कर 30x ऊपर और नीचे pipeting द्वारा समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं। किसी भी सीपित प्रोटीन वर्तमान (7,197 x g, 20 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) को हटाने के लिए समाधान को केंद्रीकृत करें। ध्यान से एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में supernatant हस्तांतरण.
  3. LDH और पीके एंजाइमों ("एंजाइम मिश्रण") युक्त मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक परख प्लेट के लिए, एलडीएच विलयन के 171.4 डिग्री सेल्सियस, पीके विलयन का 171.4 डिग्री सेल्सियस और 3189.3 डिग्री सेल्सियस या 3252.9 डिग्री सेल्सियस मायोसिन बफर के लिए हृदय या कंकाल ीय मांसपेशी मायोसिन II के क्रमशः, 15 एमएल शंकु-गर्भीय अपकेंद्रण ट्यूब में संयोजित करें। एकत्रीकरण और वर्षा से बचने के लिए इस बिंदु पर कोई मायोसिन न जोड़ें।
  4. सभी substrates युक्त मास्टर मिश्रण तैयार ("सबस्ट्रेट मिश्रण"). प्रत्येक प्लेट के लिए, ए टी पी के 162.1 डिग्री सेल्सियस, पीईपी का 162.1 डिग्री सेल्सियस तथा नाडडीह विलयन का 15 एमएल शंकुकल अपकेंद्रित्र नली में 324.1 डिग्री सेल्सियस संयोजित किया जाता है। एकत्रीकरण और वर्षा से बचने के लिए इस बिंदु पर actin न जोड़ें.
  5. से शुरू अंशांकन के लिए NADH के सात कदम सीरियल 1:2 कमजोर पड़ने बनाएँ 250 डिग्री.
    1. एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मायोसिन बफर के 257.7 डिग्री सेल्सियस के साथ नाड स्टॉक समाधान के 12.3 डिग्री एल मिलाएं।
    2. अलीकोट 135 एमएल मायोसिन बफर के सात 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में।
    3. पहली ट्यूब से विलयन का 135 डिग्री सेल्सियस दूसरे में स्थानांतरित करें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण करें। 7वें ट्यूब तक पहुँचने तक दोहराएँ.
    4. नहीं-NADH नियंत्रण (केवल बफर) के रूप में पिछले ट्यूब का प्रयोग करें।
  6. एक 8 चैनल pipette का उपयोग करना, triplicates में परख प्लेट की पहली पंक्ति में NADH अंशांकन समाधान के 20 $L हस्तांतरण.
  7. एंजाइम मिश्रण करने के लिए कार्डियक या कंकाल मांसपेशी मायोसिन द्वितीय के 68 डिग्री एल जोड़ें। भंवर संक्षेप में.
  8. पहली पंक्ति को छोड़कर, एक स्वचालित मशीन का उपयोग कर परख प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में तैयार मायोसिन-एंजाइम मिश्रण के 8.4 डिग्री सेल्सियस वितरित करें।
  9. एक स्वचालित तरल हैंडलिंग एक 100 nL पिन उपकरण सिर के साथ सुसज्जित प्रणाली का उपयोग कर एंजाइम मिश्रण युक्त परख प्लेट करने के लिए यौगिक प्लेट से समाधान के 100 nL स्थानांतरण.
  10. एक माइक्रोप्लेट शेकर का उपयोग कर 1200 आरपीएम पर कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए परख प्लेट हिलाओ।
  11. सब्सट्रेट मिश्रण करने के लिए centrifuged actin समाधान के 4,052 $L जोड़ें. भंवर संक्षेप में.
  12. एक स्वचालित मशीन का उपयोग कर एंजाइमी प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए परख प्लेट (पहली पंक्ति को छोड़कर) के प्रत्येक अच्छी तरह से में actin-substrate मिश्रण के 11.6 $L वितरित करें।
  13. एक माइक्रोप्लेट शेकर का उपयोग कर 1200 आरपीएम पर कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए परख प्लेट हिलाओ।
  14. 30 s के लिए 101 x ग्राम पर परख प्लेट सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. सुनिश्चित करें कि प्लेट रीडर का आंतरिक तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हो गया है। प्लेट लोड और एक और 30 s के लिए हिला. इस मिलाते हुए कदम प्रत्येक अच्छी तरह से समान तरल सतह के आकार बनाने के लिए आवश्यक है और प्लेट माप तापमान तक पहुँचने के लिए समय की अनुमति देता है।
  16. 30 मिनट 45 s अंतराल में प्लेट स्कैनिंग के लिए NADH फ्लोरोसेंट रिकॉर्ड. एक 380 एनएम, 10 एनएम बैंडविड्थ उत्तेजना फिल्टर और एक 470 एनएम, 24 एनएम बैंडविड्थ उत्सर्जन फिल्टर एक 425 एनएम कट-ऑफ dichroic दर्पण के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग करें। माप उच्च एकाग्रता मोड में चलाएँ। चमक की संख्या का अनुकूलन, डिटेक्टर लाभ, प्लेट आयाम और माप ऊंचाई परपरख चलाने से पहले.
    नोट: अंतिम परख की स्थिति 300 एनएम कार्डियक/20 एनएम कंकाल मांसपेशी मायोसिन द्वितीय, 10 डिग्री सेल्सियस actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220M NADH, 1 एमएम पीईपी, 1 एमएम एटीपी युक्त एक बफर में 10 एमएम एमओपी (पीएच 7.0), 2 mCl MGCl2 , 0.15 एम एम ईजीटीए, 0.1 mg/mL बीएसए, 0.5% (v/v) DMSO और 1 mM DTT. कुल मात्रा 20 डिग्री सेल्सियस/ उच्चतम अंतिम यौगिक सांद्रता 50 डिग्री सेल्सियस 20 डिग्री मीटर पैरा-aminoblebbistatin में 0.5% DMSO सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और 0.5% DMSO अकेले नकारात्मक नियंत्रण है. सभी माप triplicates में किया जाता है.

3. डेटा का विश्लेषण करना

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से समय के खिलाफ मनाया फ्लोरोसेंट तीव्रता प्लॉट.
  2. ढलान और प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं के अवरोधन निर्धारित करने के लिए सरल रैखिक प्रतिगमन प्रदर्शन. ढलान एटीपी (NADH) खपत दर के लिए आनुपातिक है, जबकि अवरोधन माप की शुरुआत में NADH एकाग्रता के लिए आनुपातिक है (t $ 0 s).
  3. NADH की सांद्रता के विरुद्ध प्लेट की पहली पंक्ति के लिए प्राप्त अवरोधनों की प्लॉटिंग द्वारा NADH के लिए अंशांकन वक्र का निर्माण करें। सुनिश्चित करें कि अवरोधन रैखिक रूप से NADH एकाग्रता पर निर्भर करते हैं।
    नोट: अवरोधन ों का अनुमान है कि कच्चे फ्लोरोसेंट तीव्रता के औसत की तुलना में अधिक आत्मविश्वास के साथ ट र् 0 s पर वास्तविक फ्लोरोसेंट तीव्रता है।
  4. ढलान और NADH अंशांकन रेखा के अवरोधन प्राप्त करने के लिए सरल रैखिक प्रतिगमन प्रदर्शन.
    नोट: अवरोधन फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत का वर्णन करता है (कोई NADH वर्तमान), जबकि ढलान उस विशेष प्रयोग में एक 1 M NADH समाधान के extrapolated /सैद्धांतिक फ्लोरोसेंट तीव्रता से मेल खाती है.
  5. नाडएच अंशांकन लाइन की ढलान से शेष कुओं के लिए प्राप्त फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया की ढलान को विभाजित करें ताकि फ्लोरोसेंट परिवर्तन को एटीपी खपत दरों में परिवर्तित किया जा सके।
  6. अवरोध करनेवाला की एकाग्रता के खिलाफ एटीपी खपत दरों प्लॉट.
  7. निरोधात्मक स्थिरांकों का निर्धारण करने के लिए, खुराक-प्रतिक्रिया डेटा को एक साधारण एक-से-एक बाइंडिंग संतुलन मॉडल से संबंधित निम्नलिखित द्विघात समीकरण में फ़िट करने के लिए उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें:
    Equation 1
    जहां Y एटीपी खपत दर है, Yन्यूनतम एटीपी खपत दर int अवरोधक के अभाव में है, Yअधिकतम सैद्धांतिक एटीपी खपत दर पर है 100% निषेध, कश्मीरमैं निरोधात्मक स्थिरांक है , [E]t और [I]t एंजाइम (मायोसिन) और अवरोधक की कुल सांद्रता क्रमशः हैं।

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Representative Results

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स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए प्रयुक्त विशिष्ट प्लेट लेआउट मानचित्र चित्र 1में दर्शाया गया है। पहली और अंतिम पंक्तियाँ NADH अंशांकन और सकारात्मक नियंत्रण के लिए आरक्षित हैं (20 डिग्री सेल्सियस पैरा-aminoblebbistatin, 0.5% DMSO), क्रमशः. शेष पंक्तियों (बी से ओ) यौगिकों की निरोधात्मक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है। यहाँ, पंद्रह कदम धारावाहिक 1:2 DMSO में 10 लाख यौगिक एकाग्रता से शुरू कमजोर पड़ने तैयार कर रहे हैं और परख प्लेट के लिए यौगिक प्लेट से स्थानांतरित, इस तरह है कि उच्चतम अंतिम यौगिक एकाग्रता है 50 डिग्री (में 0.5% DMSO) परख प्लेट पर. दो पंक्तियों का उपयोग एक यौगिक (48 डेटापॉइंट/कम्पाउंड) के लिए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र प्राप्त करने के लिए किया जाता है। ध्यान दें कि प्लेट लेआउट नक्शे किसी दिए गए परियोजना के विशिष्ट उद्देश्यों का समर्थन करने के लिए फिर से डिजाइन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य यौगिकों की एक बड़ी संख्या के लिए एकल-बिंदु स्क्रीनिंग डेटा प्राप्त करने के लिए थे, एक एक एकल 384-अच्छी प्लेट पर 112 यौगिकों का परीक्षण कर सकता है सकारात्मक नियंत्रण और NADH अंशांकन के लिए एक ही लेआउट का उपयोग कर (प्रत्येक के लिए triplicates के साथ गणना यौगिक)। यह हमेशा एक यौगिक के लिए 3 datapoints की एक न्यूनतम करने के लिए सलाह दी जाती है (या प्रत्येक एकाग्रता के लिए) और एक यौगिक के लिए थाली के किनारों के साथ केवल कुओं का उपयोग कर से बचने के लिए, के रूप में इन datapoints बढ़त प्रभाव से प्रभावित हो सकता है. धार प्रभाव के महत्व का अनुमान लगाने के लिए, हमेशा केवल पहले नकारात्मक नियंत्रण के साथ एक पूर्ण प्लेट चलाते हैं।

फ्लोरोसेंट तीव्रता का चित्र 2कमें दर्शाए अनुसार नाडाद की सांद्रता पर रैखिक निर्भरता होती है। रैखिक फिट की ढलान प्रतिक्रिया दरों में फ्लोरोसेंट परिवर्तन परिवर्तित करने के लिए डेटा विश्लेषण के दौरान प्रयोग किया जाता है। ध्यान दें कि कच्चे फ्लोरोसेंट तीव्रता का पता लगाने के प्रत्येक अच्छी तरह से NADH अंशांकन के लिए प्राप्त रेखीय प्रतिगमन द्वारा पहले विश्लेषण किया जाता है (एक समान विश्लेषण में दिखाया गया है चित्र 2B, सी यौगिक डेटा के लिए). इन निशानों से फ्लोरोफोर की फोटोब्लीचिंग के कारण समय के साथ घातीय क्षय होने की संभावना है। हालांकि, photobleaching बहुत धीमी है और इसलिए, कच्चे डेटा रैखिक फिट बैठता है द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. इन की ढाल और अवरोधन क्रमशः फोटोब्लिंग की प्रारंभिक दर और ट े 0 े पर फ्लोरोसेंट तीव्रता के अनुरूप है। इन रैखिक फिट्स के अवरोधन का उपयोग कच्चे फ्लोरोसेंट के औसत के बजाय किया जाता है, जो कि NADH अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए t $ 0 s पर पढ़ता है क्योंकि अवरोधन अधिक डेटा के आधार पर अनुमान लगाया जाता है और इसलिए, संबद्ध त्रुटियाँ बहुत छोटी होती हैं।

चित्र ाााल, यह दर्शाता है कि मायोसिन के उपयोग की परवाह किए बिना या अवरोधक की उपस्थिति, समय पाठ्यक्रम माप की समय विंडो में रेखीय होते हैं. यहाँ सबसे अधिक (50 डिग्री सेल्सियस) और सबसे कम (0 डिग्री सेल्सियस) अवरोधक सांद्रता क्रमशः $100% और 0% निषेध के अनुरूप होती है। ध्यान दें कि कच्चे डेटा की मात्रा के कारण, वास्तविक विश्लेषण अराजक दिखाई अगर एक ही पैनल पर दिखाया जाएगा. इसलिए, इन पैनलों को बेहतर प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए सरल बनाया गया है। कच्चे फ्लोरोसेंट तीव्रता का औसत पढ़ता समानांतर प्रयोगों के सभी के लिए गणना की गई थी (प्रत्येक एकाग्रता के लिए triplicates) और NADH सांद्रता में परिवर्तित यहाँ. केवल 3 अवरोधक सांद्रता दिखाए जाते हैं। वास्तविक विश्लेषण में, प्रत्येक कच्चे फ्लोरोसेंट तीव्रता का पता लगाने (48/कम्पाउंड परीक्षण) पहले रैखिक प्रतिगमन द्वारा विश्लेषण किया है, और बाद में, ढलानों एटीपी खपत दरों में परिवर्तित कर रहे हैं.

यह हमेशा प्रदर्शित करने के लिए सलाह दी जाती है कि प्रतिक्रिया दर एंजाइम एकाग्रता के साथ रैखिक रूप से बदलती हैं, जैसा कि क्रमशः कंकाल और हृदय की मांसपेशी मायोसिन II के लिए चित्रा 2D और चित्रा2E में दिखाया गया है। रैखिक फिट बैठता है के आधार पर, एंजाइम के अंतिम परख एकाग्रता आसानी से अनुमान लगाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, 30-मिनट के समय पाठ्यक्रमों के लिए $5 x 10-8 Ms-1 की प्रतिक्रिया दर की अनुशंसा की जाती है. यदि प्रतिक्रिया मिश्रण (जैसे यहाँ actin) में एक उत्प्रेरक का उपयोग किया जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि अपेक्षित प्रभाव (सक्रियण) मौजूद है, उत्प्रेरक की उपस्थिति और अनुपस्थिति दोनों में प्रयोगों को चलाने की सिफारिश की जाती है। शर्तों और प्रक्रिया के रूप में बारीकी से संभव के रूप में अंतिम प्रोटोकॉल का पालन करना चाहिए. यहाँ, मायोसिन की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला पहले आठ microcentrifuge ट्यूबों में मायोसिन बफर में तैयार किया गया था. बाद में, LDH और पीके एंजाइमों का एक मिश्रण जोड़ा गया. अंत में, प्रतिक्रियाओं समानांतर में प्रत्येक ट्यूब के लिए सब्सट्रेट मिश्रण जोड़कर शुरू कर दिया गया, एक multichannel pipette का उपयोग कर. प्रतिक्रिया घोला जा सकता है तुरंत triplicates में परख प्लेट की एक पंक्ति में स्थानांतरित कर दिया गया. यदि actin अनुपस्थित था, actin बफर बजाय इस्तेमाल किया गया था. कोई अन्य पैरामीटर परिवर्तित किए गए थे (अंतिम परख स्थितियों के लिए प्रोटोकॉल में चरण 2.16 का नोट देखें).।

चित्र 2F एकाधिक नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं (आधा प्लेट प्रत्येक) के लिए प्राप्त एटीपी खपत दरों से पता चलता है। इन आंकड़ों की तुलना 'मान' या "स्क्रीनिंग विंडो गुणांक"26के आधार पर की जा सकती है, जो उच्च-थ्रूपुट परख की गुणवत्ता का अनुमान लगाने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सांख्यिकीय पैरामीटर है। यह दोनों साधन और खाते में मानक विचलन लेने के द्वारा सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की तुलना करता है:

Equation 2,

जहाँ र्ं द, च ् ् ् ़ ़ द , र् च च ्, च ्, ्) क्रमशः ऋणात्मक तथा धनात्मक नियंत्रणों के मानक विचलन तथा साधन हैं। दो आबादी अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं अगर 'मान 0.5 और 1 के बीच गिर जाता है. यहाँ प्राप्त एक $' 0ण्78 से पता चलता है कि परख को उत्कृष्ट26माना जा सकता है।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि परख का उपयोग निरोधात्मक स्थिरांकों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, छोटे अणु मायोसिन अवरोधक ब्लीबिस्टाटिन8 और दो एनालॉग, पैरा-नाइट्रोब्लेबिस्टाटिन12 और पैरा-अमिनोबलबिस्टाइन13 है यहाँ चुना गया है, जैसा कि चित्र 3क और चित्र 3खमें दिखाया गया है। Blebbistatin एक uncompetitive है, allosteric मायोसिन अवरोध करनेवाला27,28. ब्लीबिस्टाटिन का एक अणु मायोसिन के एक मोटर डोमेन को बांधता है और माइओसिन-एडीपी-फॉस्फेट संकुल27,28को स्थिर करके ATPase चक्र को अवरुद्ध करता है। इसलिए, blebbistatin डेरिवेटिव के निरोधात्मक प्रभाव यहाँ एक सरल, एक-से-एक बाध्यकारी मॉडल का उपयोग कर मॉडलिंग की थी (देखें कदम 3.7 प्रोटोकॉल में). ध्यान दें कि यह मॉडल लागू नहीं हो सकता है यदि एटीपी खपत दरों ने मायोसिन सांद्रता पर रैखिक निर्भरता नहीं दिखाई थी (चित्र 2D,Eदेखें )। ब्लीबिस्टाटिन, पैरा-नाइट्रोब्लेबिस्टाइन और पैरा-एम्बोनोबलबिस्टाइन की गतिज जलीय विलेयताक्रमशः426 डिग्री सेल्सियस, 3.6 डिग्री सेल्सियस और 9.3 डिग्री सेल्सियस होने की सूचना मिली है। संकेत में कोई असामान्यताओं पर या हमारे प्रयोगों में सूचित solubilities नीचे मनाया गया; तथापि, कई कलाकृतियों दिखाई दिया जब या तो blebbistatin या पैरानाइट्रोब्लेबिस्टाइन उनके रिपोर्ट घुलनशीलता मूल्यों के ऊपर इस्तेमाल किया गया था, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है. इसलिए, घुलनशीलता से अधिक सांद्रता पर दर्ज संकेत इन मामलों में डेटा विश्लेषण से बाहर रखा गया था. पैरा-aminoblebbistatin अत्यधिक घुलनशील है, और इसलिए, घुलनशीलता उस मामले में एक सीमित कारक नहीं था.

अंत में, यह हमेशा किसी भी सकारात्मक हिट के निरोधात्मक प्रभाव लक्ष्य ATPase एंजाइम के लिए विशिष्ट हैं कि क्या परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है. युग्मित प्रतिक्रिया प्रणाली दो अन्य एंजाइमों को रोजगार, LDH और पीके, और इनमें से एक के निषेध एक झूठी सकारात्मक संकेत में परिणाम होगा. एक असंबंधित ATPase एंजाइम के साथ ATPasse परख रनिंग इन झूठी सकारात्मक हिट बाहर फिल्टर करने के लिए मदद मिल सकती है (आगे की सिफारिशों के लिए, चर्चा देखें). पैरा-एमिनोबलबिस्टाइन और एपिरेज़, एक एटीपी हाइड्रोलाजिंग एंजाइम, जो एडीपी और अकार्बनिक फॉस्फेट29का उत्पादन करता है, का उपयोग इस प्रकार के नियंत्रण प्रयोग को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया गया, जैसा कि चित्र 5में दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्र 1 : परख प्लेट लेआउट. सात कदम धारावाहिक 1:2 NADH के कमजोर पड़ने से शुरू 250 डिग्री सेल्सियस एकाग्रता तैयार है और बाद में पंक्ति में वितरित एक अंशांकन के लिए trilicate में (काले से हरे रंग की ढाल). पंक्ति एक के पिछले तीन कुओं मायोसिन बफर केवल होते हैं (कोई NADH नियंत्रण, सफेद). अंतिम पंक्ति (P) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण (20 डिग्री सेल्सियस पैरा-अमिनोबलब्स्टिन; लाल) के लिए किया जाता है। एक विशिष्ट खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग के लिए दो पंक्तियों (जैसे, B और C) की आवश्यकता होती है. इसलिए, 7 खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोगों को एकल 384-वेल प्लेट पर समानांतर में चलाया जा सकता है (नीले से सफेद रंग की ग्रेडिएंट्स द्वारा प्रस्तुत)। हर नमूना triplicates के रूप में भरी हुई है. यहाँ, उच्चतम अंतिम यौगिक सांद्रता 50 डिग्री सेल्सियस पर शुरू (में 0.5% DMSO). हर दूसरी पंक्ति के अंतिम तीन कुओं नकारात्मक नियंत्रण के लिए आरक्षित हैं (कोई यौगिक, 0.5% DMSO केवल; सियान). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्रतिनिधि ATPasse डेटा. (ए) नाड की द्वि-गुणित तनुता श्रृंखला तैयार की गई और प्रत्येक मापन प्लेट की पहली पंक्ति में अंतरित की गई। फ्लोरोसेंट तीव्रता 30 मिनट के लिए दर्ज की गई थी और कच्चे डेटा सरल रैखिक प्रतिगमन द्वारा विश्लेषण किया गया था. प्रत्येक प्रतिगमन रेखा का अवरोधन नाडग की सांद्रता के विरुद्ध प्लॉट किया गया था। ध्यान दें कि किसी आदर्श मामले में, ट पर फ्लोरोसेंट तीव्रता ख् 0 े का उपयोग अंशांकन रेखा को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जबकि कच्चे फ्लोरोसेंट डेटा बहुत शोर है, intercepts में फ्लोरोसेंट तीव्रता का एक सटीक अनुमान दे $ 0 एस और उनके संबद्ध मानक त्रुटि (त्रुटि सलाखों के रूप में दिखाया गया है) बहुत छोटा है. (बी,सी) प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट तीव्रता कंकाल के निशान (बी) और हृदय (सी) मांसपेशी मायोसिन द्वितीय ATPase प्रतिक्रियाओं पैरा-aminoblebbistatin के विभिन्न स्तरों की उपस्थिति में दर्ज किए गए थे (इनसेट देखें) . सादगी के लिए, डेटा अंक और त्रुटि सलाखों के तीन स्वतंत्र माप और संबद्ध मानक विचलन, क्रमशः के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रतिक्रिया दरों को प्राप्त करने के लिए सरल रैखिक प्रतिगमन (ठोस रेखाएँ) निष्पादित की गई थी। ध्यान दें कि एक विशिष्ट खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग में माप प्लेट पर ट्रिपीलेट में 15 विभिन्न अवरोधक सांद्रता और नकारात्मक नियंत्रण शामिल है (चित्र 1देखें ) और रेखीय प्रतिगमन प्रत्येक फ्लोरोसेंट के लिए अलग-अलग किया जाता है तीव्रता ट्रेस. सादगी के लिए, केवल 3 अलग सांद्रता यहाँ दिखाए जाते हैं. (डी,) बासल (लाल) और actin सक्रिय (नीला) ATPase दरों विभिन्न कंकाल के लिए निर्धारित किया गया (डी) और हृदय () मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सांद्रता. ATPase दरों मायोसिन एकाग्रता पर रैखिक निर्भरता दिखा. (च) सकारात्मक (लाल) और नकारात्मक (नीले) नियंत्रण (आधा प्लेट प्रत्येक) एक 384-वेल परख प्लेट पर समानांतर में चला रहे थे और $-कारक (जेड) ATPasse परख की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए गणना की गई थी। 0.78 का एक $' मान बहुत अच्छी तरह से अलग सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ एक विश्वसनीय परख इंगित करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : खुराक प्रतिक्रिया घटता है और निरोधात्मक स्थिरांक ों का विश्लेषण. कार्डिएक () और कंकाल (बी) मांसपेशी मायोसिन II का उपयोग ब्लीब्सिटिन, पैरा-एमिनोबलबिस्टिन और पैरा-नाइट्रोब्लेब्टिटिनकी निरोधात्मक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए किया जाता था। ATPase दरों (नीले) कच्चे फ्लोरोसेंट डेटा के लिए सरल रैखिक प्रतिगमन लागू करने से प्राप्त किए गए थे. त्रुटि पट्टियाँ फिटिंग के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं और एक द्विघात समीकरण फिटिंग के दौरान भार कारकों के रूप में इस्तेमाल किया गया (देखें चरण 3.7 प्रोटोकॉल में) एक साधारण संतुलन बाइंडिंग मॉडल (लाल) का प्रतिनिधित्व. विलेयता से ऊपर प्राप्त आंकड़े कलाकृतियों से प्रभावित थे और विश्लेषण से बाहर थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : विलेयता से संबंधित कलाकृतियों. (ए) फ्लोरिसेंस की तीव्रता एक एपेटस परख में प्राप्त ब्लिस्टिटिन के लिए निशान, कंकालीय मांसपेशी मायोसिन द्वितीय का उपयोग करके रैखिक रूप से कम संकेत को दर्शाती है जो अवरोधक वर्तमान (नीला) की मात्रा के आधार पर कम होती है। हालांकि, जब blebbistatin घुलनशीलता से ऊपर इस्तेमाल किया गया था (50 डिग्री मीटर प्रारंभिक blebbistatin एकाग्रता), संकेत में वृद्धि मनाया गया था (लाल), सबसे अधिक संभावना चमकदार फ्लोरोसेंट blebbistatin क्रिस्टल13के गठन के कारण . (बी) पैरा-नाइट्रोब्लेबिस्टाइन के मामले में, जो ब्लीब्टिटिन12का एक गैर-फ्लोरोसेंट अनुरूप है, कच्चे फ्लोरोसेंट तीव्रता के निशान सामान्य (डेज़नेस) दिखाई दिए। हालांकि, निषेध का उच्चतम स्तर उम्मीद से बहुत कम था (सकारात्मक नियंत्रण के आधार पर). इसलिए, केवल विलेयता (नीले) से नीचे प्राप्त अभिक्रिया दरों को डेटा विश्लेषण में शामिल किया गया था। विलेयता (लाल) से ऊपर प्राप्त प्रतिक्रिया दर निर्धारित खुराक-प्रतिक्रिया वक्र (हरा) से अलग हो जाती है, क्योंकि वर्षण समाधान में शेष अवरोधक की मात्रा (संकेंद्रण) को सीमित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : के अवरोधक प्रभाव पैरा- कंकालीय मांसपेशी मायोसिन द्वितीय और apyrase ATPase परख में aminoblebbistatin. पैरा-aminoblebbistatin बाधा कंकाल मांसपेशी मायोसिन द्वितीय के साथ एक केमैं के साथ 1.7 डिग्री सेल्सियस, जबकि कोई निषेध का पता चला था जब apyrase29 एक ही युग्मित प्रतिक्रिया प्रणाली में एक ATPasse के रूप में इस्तेमाल किया गया था. यह प्रयोग स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि पैरा-aminoblebbistatin मायोसिन के लिए विशिष्ट है और पीके या LDH को बाधित नहीं करता है, इस प्रकार पता लगाया निरोधात्मक प्रभाव एक कलाकृति नहीं है. Apyrase 0.5 एनएम एकाग्रता पर इस्तेमाल किया गया था. कोई मायोसिन या actin मौजूद था, और प्रतिक्रिया 100 एम एम MOPS युक्त एक बफर में प्रदर्शन किया गया था (पीएच $ 7.0), 3 एम एम CaCl2, 2 एम एम MgCl2, 3 एमएम एन एन3, 1 एमएम डीटीटी, और 0.1% बीएसए. प्रोटोकॉल में कोई अन्य संशोधन नहीं किए गए थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम

केवल नकारात्मक नियंत्रण के साथ कई प्लेटें चलाने के द्वारा प्लेट लेआउट का अनुकूलन (कोई अवरोध करनेवाला के साथ ATPasse प्रतिक्रिया). प्रतिक्रिया दरों में पैटर्न के लिए ध्यान से परिणामों का निरीक्षण करें। उदाहरण के लिए, ये "गैर-बाध्यकारी" प्लेटों के हाइड्रोफिलिक सतह कोटिंग में किनारे प्रभाव और/या खामियों से उत्पन्न हो सकते हैं। यदि एक पैटर्न मनाया जाता है, तो कलाकृतियों को कम करने के लिए प्लेट प्रकार और/या प्लेट लेआउट बदलें। उदाहरण के लिए, एक ठेठ खुराक प्रतिक्रिया वक्र (16 triplicates के साथ सांद्रता, 48 कुल अंक) या तो तीन कॉलम या एक 384 अच्छी तरह से थाली पर दो पंक्तियों में व्यवस्थित किया जा सकता है. इन व्यवस्थाओं से क्रमशः 6 और 4 डेटापॉइंट प्राप्त होते हैं, जो कि किनारे के प्रभावों से प्रभावित होते हैं. इसलिए, पंक्ति व्यवस्था हमेशा पसंद किया जाता है।

संशोधन और समस्या निवारण

ध्यान दें कि प्रेक्षित फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाएं प्रतिक्रिया के पूर्ण समय-पाठ्यक्रम में रेखीय होनी चाहिए। थर्मल परिवर्तनों के कारण या संतुलन तक पहुँचने के कारण अंतिम कुछ मिनटों में गैर-रेखीयता पहले कुछ मिनटों में हो सकती है। यदि गैर रेखीय ताने-रेखित मौजूद हैं, तो कोई भी प्रतिक्रिया पैरामीटर समायोजित कर सकता है (उदा., मायोसिन को पतला कर सकते हैं, माप तापमान बदल सकते हैं) या केवल विश्लेषण को डेटा के रैखिक भाग तक सीमित कर सकते हैं।

गैर linearities भी प्रतिक्रियाओं की शुरुआत में मौजूद हो सकता है अगर ATPase एंजाइम के लिए अवरोध करनेवाला की बाइंडिंग धीमी है (मिनट से अधिक होने वाली). इस मामले में, एंजाइम अवरोधक परिसर जमा होने के रूप में प्रतिक्रिया समय के साथ धीमा होने की उम्मीद है। इस समस्या से बचने के लिए आवश्यक के रूप में सब्सट्रेट मिश्रण जोड़ने से पहले परख प्लेट इनक्यूबेट करें।

परख शर्तों को इस तरह से चुना जाना चाहिए कि प्रतिक्रियाओं का रेखीय भाग 15 मिनट से अधिक लंबा हो। लघु रैखिक भागों कम उपयोगी datapoints के अनुरूप (और lt;20, पूरी प्लेट की स्कैनिंग के रूप में $ 45 सेकंड लेता है). इसलिए, रैखिक बहुत उच्च मानक त्रुटियों के साथ कम विश्वसनीय ढलानों (प्रतिक्रिया दरों) उपज फिट बैठता है. दूसरी ओर, यह गतिज प्राप्त करने के लिए अनुशंसित नहीं है $120 मिनट से अधिक समय तक पढ़ता है। इस तरह के प्रयोगों विलायक वाष्पीकरण के कारण प्रोटीन विकृतीकरण या एकाग्रता परिवर्तन से प्रभावित हो सकता है। इन मानदंडों मायोसिन एकाग्रता का समायोजन करके सबसे आसानी से पूरा किया जा सकता है.

यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि पीके और एलडीएच द्वारा उत्प्रेरित अभिक्रियाएँ युग्मित प्रतिक्रिया प्रणाली में सीमित दर नहीं हैं। नियंत्रण प्रयोगों ब्याज की ATPasse के बिना या एक शक्तिशाली ATPase अवरोध करनेवाला के उच्च स्तर पर प्रदर्शन कोई (या थोड़ा) गतिविधि दिखाएगा. हालांकि, LDH और पीके सक्रिय हैं और सही ढंग से काम करते हैं, तो ADP के अलावा एक त्वरित संकेत कमी में परिणाम होगा. इस नियंत्रण प्रयोग में नाडाध खपत की दर बहुत अधिक होने की आशा है, इसलिए एडीपी के अतिरिक्त द्वारा प्रतिक्रिया शुरू किए जाने के बाद जितनी जल्दी हो सके पता लगाना शुरू करना महत्वपूर्ण है।

यह हमेशा डेटा विश्लेषण से अवरोध करनेवाला की घुलनशीलता के ऊपर प्राप्त किसी भी मनाया ATPase दरों को बाहर करने के लिए सिफारिश की है। के रूप में घुलनशीलता तापमान पर निर्भर करता है, यौगिक की शुद्धता, और समाधान की संरचना में मतभेद, यह अत्यधिक परिस्थितियों है कि अत्यधिक वास्तविक स्थितियों के समान हैं के तहत इसे मापने के लिए सिफारिश की है (तापमान, बफर, आदि) के तहत जो ATPase परख किया जाता है. विलेयता के ऊपर छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग करने का प्रयास करने से वर्षा हो सकती है जो परिणामों को प्रभावित कर सकती है (चित्र 4देखें)। वर्षा यौगिक की सांद्रता को विलेयता पर या उसके निकट सीमित करती है। इसलिए, अधिक अवरोधक जोड़कर ATPase दरों को और कम नहीं किया जा सकता है। एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण है कि पता चलता है का उपयोग करना $100% निषेध, इसलिए, संकेत में ऐसी विसंगतियों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं, भले ही घुलनशीलता अज्ञात है. सकारात्मक नियंत्रण की प्रेक्षित अभिक्रिया दर और अधिकतम अवरोध स्तर (Iअधिकतम) से संबंधित अभिक्रिया दर के बीच एक बड़ा अंतर फिटिंग द्वारा निर्धारित हमेशा समस्या का एक अच्छा संकेत है। धीरे-धीरे विश्लेषण से अधिक से अधिक डेटा को छोड़कर और / या सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर के रूप में मैंअधिकतम और यह फिटिंग प्रक्रिया के दौरान तय रखने जब तक एक बेहतर फिट प्राप्त की है ऐसे मामलों में सिफारिश की है. अवरोधक वर्षा भी मजबूत प्रकाश प्रकीर्णन में परिणाम हो सकता है और भी अवरोध करनेवाला के ऑप्टिकल गुण बदल सकते हैं, प्रतिक्रियाओं की शुरुआत में असामान्य रूप से उच्च मनाया संकेत तीव्रता के लिए अग्रणी और / कच्चे डेटा हमेशा ध्यान से निरीक्षण किया जाना चाहिए, और प्रभावित सांद्रता विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए.

विधि की सीमाएं

एक कम कारोबार संख्या के साथ ATPases के लिए अंतिम परख एकाग्रता (उदाहरण के लिए, हृदय की मांसपेशी मायोसिन द्वितीय) उच्च होना चाहिए (कई सौ एनएम) परख के समय खिड़की के भीतर औसत दर्जे का प्रतिक्रिया दर प्राप्त करने के लिए (30 डिग्री 120 मिनट). इसलिए, यह खुराक प्रतिक्रिया घटता के विश्लेषण के लिए द्विघात बाइंडिंग मॉडल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. अन्य बाइंडिंग मॉडल (hyperbolic, हिल) आमतौर पर ऐसे डेटा के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके अलावा, ATPase की एकाग्रता औसत दर्जे का निरोधात्मक स्थिरांकों की सीमा के लिए एक कम सीमा सेट क्योंकि खुराक प्रतिक्रिया घटता अभ्यास में प्रयोगात्मक त्रुटियों की उपस्थिति के कारण अविवेच्य हो अगर कश्मीरमैं के करीब है या कम से कम ATPase की एकाग्रता.

यौगिक potencys में अंतर हमेशा खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों प्रदर्शन और निरोधात्मक स्थिरांक ों का निर्धारण करके परिमाणित किया जाना चाहिए. हालांकि एकल बिंदु स्क्रीनिंग डेटा सिद्धांत में इन मतभेदों को दर्शाता है, प्रतिक्रियाओं की गैर linearity, प्रयोगात्मक त्रुटि के साथ यह बेहद मुश्किल इस तरह के एक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कर देगा. एकल बिंदु स्क्रीनिंग प्रयोगों सक्रिय और निष्क्रिय के बीच भेद करने के लिए एक उपयुक्त अवरोध करनेवाला एकाग्रता और एक पूर्व निर्धारित सीमा प्रतिक्रिया स्तर का चयन करके उच्च विश्वास के साथ भी अपेक्षाकृत कमजोर inhibitors पर कब्जा करने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए यौगिकों.

निरोधात्मक स्थिरांकों के बीच अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं स्थापित करने के लिए सबसे अच्छा nonlinear प्रतिगमन के लिए समीकरण को फिर से लिखने के लिए pKमैं (-logKI) के बजाय K I के लिए, के रूप में पी केमैं है निर्धारित करने के द्वारा किया जाता है आम तौर पर वितरित, जबकि कश्मीरमैं 30नहीं है. पी.के.I के लिए अनिश्चितता सममित है, जबकि यह केI31के लिए सममित नहीं है। विश्वास अंतराल pKI और t-परीक्षण या प्रसरण के विश्लेषण के लिए गणना की जा सकती है (ANOVA) pKI माप के साधन काफी अलग हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, सावधानी इस तरह के सांख्यिकीय परीक्षण करते समय लिया जाना चाहिए के रूप में वे homoscedasticity मान (समूहों में डेटा का एक ही विचरण). एक जटिल घुलनशीलता मुद्दों के कारण एक पूर्ण खुराक प्रतिक्रिया वक्र प्राप्त नहीं किया जा सकता है जब पीकेI के साथ जुड़े उच्च विचरण की उम्मीद कर सकते हैं. इस मामले में, अन्य उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण बराबर प्रसरण नहीं मान (उदा., वेल्च के टी-परीक्षण) का उपयोग किया जाना चाहिए।

किसी भी यौगिक बाधा पीके या LDH NADH-युग्मित ATPasse परख में एक झूठी सकारात्मक संकेत देना होगा. इन झूठी सकारात्मक के कुछ एक असंबंधित ADP उत्पादन एंजाइम के साथ परख चलाने के द्वारा पहचाना जा सकता है. इस मामले में, असली सकारात्मक हिट के लिए कोई अवरोध की उम्मीद की जा सकती है, जब तक अवरोधक दोनों एंजाइमों के लिए एक एटीपी एनालॉग बाध्यकारी है. इस तरह के एक विश्लेषण को प्रदर्शित करने के लिए, हम पैरा-aminoblebbistatin और apyrase, एक एटीपी hydrolyzing एंजाइम myosines से संबंधित नहीं का उपयोग कर एक ATPasse परख प्रदर्शन किया (चित्र 5देखें). वैकल्पिक रूप से, ब्याज की एंजाइम के लिए विशिष्ट एक अलग कार्यात्मक परख, या एक अलग ATPasse परख पीके और LDH रोजगार नहीं असली और झूठी सकारात्मक हिट के बीच भेद करने के लिए चलाया जा सकता है (जैसे, malachite हरी परख).

सभी कुओं में फ्लोरोसेंट तीव्रता की गतिजता के मापन और विश्लेषण के लिए प्लेट रीडर को $90 से भी कम समय में पूरी प्लेट को स्कैन करने के लिए पर्याप्त रूप से आवश्यक होता है।

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व

"परंपरागत" अवशोषण आधारित readout16,17,18,19,20, संशोधित NADH-युग्मित ATPase परख यहाँ प्रस्तुत करने के लिए विरोध NADH फ्लोरोसेंट पर निर्भर करता है. यह परख और अधिक संवेदनशील बनाता है, उपयोगकर्ता उत्तेजना प्रकाश तीव्रता को कम करने के लिए अनुमति देता है और इस तरह NADH या photochemical अपघटन के खिलाफ inhibitors की रक्षा.

हालांकि परख आम तौर पर नमूनों की बड़ी संख्या से निपटने के लिए उपयुक्त नहीं माना गया है32, छोटी प्रतिक्रिया मात्रा यहाँ हासिल (20 डिग्री एल) एक 384-अच्छी तरह से प्रारूप में यह अर्द्ध उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल बनाता है, विशेष रूप से यदि निरोधात्मक स्थिरांकों का निर्धारण माना जाता है।

वैकल्पिक तरीके आमतौर पर ATPasse एंजाइम द्वारा उत्पादित अकार्बनिक फॉस्फेट का पता लगाने पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, ATPasse के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और बाद में, मुक्त अकार्बनिक फॉस्फेट अपनी रेडियोधर्मिता के आधार पर मापा जा सकता है। परख संवेदनशील है; तथापि, इसके लिए रेडियोधर्मी पदार्थों से निपटने की आवश्यकता होती है और शेष एटीपी को अकार्बनिक फॉस्फेट से अलग किया जाना चाहिए (उदा., चारकोल पर एटीपी के अधिशोषण द्वारा)33। उपर्युक्त मालकाचिते हरी परख में, फॉस्फेट अम्लीय परिस्थितियों के तहत मॉलिब्डेट के साथ प्रतिक्रिया करता है और परिणामस्वरूप फॉस्फोमोलिब्डेट जटिल मालकाइट ग्रीन डाई को बांधता है जिससे अवशोषण स्पेक्ट्रम19,21, 22,23,24. इस विधि भी ATPase प्रतिक्रिया के शमन की आवश्यकता है; इसलिए, यह ज्यादातर एक समापन बिंदु-आस्पर के रूप में प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से उच्च थ्रूपुट प्रारूप में। NADH-युग्मित परख में ATPase प्रतिक्रिया की सतत निगरानी के विपरीत, एक समापन बिंदु परख बस रैखिक समय पाठ्यक्रम मानता है और गैर रेखीयता के लिए अग्रणी कलाकृतियों प्रकट नहीं कर सकते. मलकाइट ग्रीन या गठित परिसर के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों से भी कलाकृतियोंको 21हो सकता है . इसके अलावा, मलकाइट हरी परख फॉस्फेट संदूषण24के प्रति बहुत संवेदनशील है। इसके विपरीत, NADH-युग्मित परख ADP के रूप में एडीपी संदूषण के प्रति संवेदनशील नहीं है (जो हमेशा एटीपी नमूनों में विभिन्न स्तरों पर मौजूद है) जल्दी से प्रतिक्रिया की शुरुआत में पीके द्वारा एटीपी के लिए बदल जाता है. उत्पादों को शमन या पृथक्करण की कोई आवश्यकता नहीं है। एटीपास दरों की माप के लिए एक अन्य फ्लोरोमितीय परख पहले से ही एटीपी हाइड्रोलिसिस को न्यूक्लिओसाइड फॉस्फोरिलेस34द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया के युग्मन द्वारा विकसित की गई है . हालांकि, कि परख एक एटीपी पुनर्जनन चक्र का उपयोग नहीं करता है, इसलिए प्रारंभिक प्रतिक्रिया दरों का निर्धारण और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है.

भविष्य के आवेदन या विधि के निर्देश

ATPase गतिविधि पर निर्भर कई एंजाइमों संभावित दवा लक्ष्य के रूप में पता लगाया गया है. इनमें किनेसिन35 और डाइनिन परिवारों से संबंधित साइटोस्केलेटल मोटर प्रोटीन36 और डीएनए हेलीकेस37शामिल हैं, जिनमें से सभी विविध संकेतन पथों में टर्मिनल प्रभावक हैं। यहाँ वर्णित परख आसानी से दवा की खोज और विकास परियोजनाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिसमें किसी भी एंजाइम को शामिल किया गया है जिसमें एडीपी एक प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन ड्रग एएनएस096833 (सीएएम) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

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References

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स्क्रीनिंग छोटे अणु अवरोधकों के लिए NADH-युग्मित ATPase परख के एक अर्द्ध उच्च Throughput अनुकूलन
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Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

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