Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

En nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-koblet ATPase analysen har blitt tilpasset semihigh gjennomstrømning screening av små molekyl myosin hemmere. Denne kinetisk analysen kjøres i et 384-brønn mikroplate format med totalt reaksjons volum på bare 20 μL per brønn. Plattformen bør være aktuelt for nesten alle ADP produserende enzym.

Abstract

ATPase enzymer utnytte den frie energien som er lagret i adenosin trifosfat å katalysere et bredt utvalg av endergon biokjemiske prosesser in vivo som ikke ville oppstå spontant. Disse proteinene er avgjørende for i hovedsak alle aspekter av mobilnettet liv, inkludert metabolisme, celledeling, tiltak mot miljømessige endringer og bevegelse. Protokollen som presenteres her beskriver en nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-kombinert ATPase analysen som har blitt tilpasset semi-høy gjennomstrømming screening av små molekyl ATPase hemmere. Analysen har blitt brukt til CARDIAC og skjelettlidelser muskel myosin II ' s, to utgangen-baserte molekylær motor ATPases, som et bevis på prinsippet. Hydrolyse av ATP er koplet til oksidasjon av NADH ved enzymatisk reaksjoner i analysen. Først genereres ADP av ATPase til ATP ved pyruvat kinase (PK). PK katalyserer overgangen av phosphoenolpyruvate (PEP) til pyruvat parallelt. Deretter reduseres pyruvat til melkesyre dehydrogenase (LDH), som katalyserer oksidasjon av NADH parallelt. Dermed er reduksjonen i ATP konsentrasjon direkte korrelert til nedgangen i NADH konsentrasjon, som etterfølges av endring i iboende fluorescens av NADH. Så lenge PEP er tilgjengelig i reaksjonssystemet, er ADP-konsentrasjonen fortsatt svært lav, og unngår hemming av ATPase-enzymet ved sitt eget produkt. Videre forblir ATP konsentrasjonen nesten konstant, noe som gir lineær tid kurs. Fluorescens overvåkes kontinuerlig, noe som gjør det mulig for enkel estimering av kvaliteten på dataene og bidrar til å filtrere ut potensielle artefakter (for eksempel som følge av sammensatte nedbørsmengder eller termiske endringer).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Myosins er mekanokjemiske energi-transdusere som hydrolyserer adenosin trifosfat (ATP) til å generere retningsbestemt bevegelse langs filamenter av utgangen cytoskeleton i Landplantenes1,2. De har både strukturelt og Kinetically tilpasset sine ulike intracellulære funksjoner, slik som transport av organeller, muskel sammentrekning eller generering av cytoskjelettkomponenter penning1,2. Den myosin overfamilie er representert ved ~ 40 myosin gener som tilhører ~ 12 distinkte myosin klasser i den menneskelige Genova3,4. Medlemmer av myosin klassene spille ulike roller i et svært mangfoldig sett av lidelser, for eksempel flere kreftformer, nevrologiske lidelser, skjelettlidelser myopatier, og hypertrofisk kardiomyopati5,6. Gitt det store antall fysiologiske og patologiske funksjoner av disse molekylære motorene, er det ikke overraskende at de blir stadig mer anerkjent som narkotika mål for en rekke forhold7. Betydelig fremgang har blitt gjort nylig i oppdagelsen av nye myosin hemmere8,9,10 og aktivator11, og for å forbedre egenskapene til eksisterende12, 13 på alle , 14 priser og priser , 15av dem.

Den nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-kombinert ATPase analysen har lenge vært brukt til å måle ATPase aktiviteten av ulike enzymer, slik som sarcoplasmic retikulum ca2 + Pump ATPase16, DNA reparasjon ATPASE Rad5417, AAA + ATPase p9718 eller mikrotubulinettverket motoren kinesin19. Analysen sysselsetter en ATP gjenfødelse syklus. Adenosin uridindifosfatglukuronosyltransferase (ADP) generert av ATPase, genereres på ATP ved pyruvat kinase (PK), som forvandler ett molekyl av phosphoenolpyruvate (PEP) til pyruvat parallelt. Deretter reduseres pyruvat til melkesyre dehydrogenase (LDH). Det i sin tur oksiderer ett molekyl av NADH til NAD. Derfor tilsvarer reduksjonen i NADH-konsentrasjonen som en funksjon av tid ATP hydrolyse rate. ATP gjenfødelse syklusen holder ATP konsentrasjonen nesten konstant og ADP konsentrasjon lavt så lenge PEP er tilgjengelig. Dette resulterer i lineær tid kurs, noe som gjør det enkelt å bestemme de første reaksjons hastigheter og bidrar til å unngå produkt hemming av ADP19. Selv om den NADH-sammenkoblede ATPase-analysen allerede er tilpasset et 96-format20, gjør høy reaksjons volumene (~ 150 μL) det relativt dyrt på grunn av den høye etterspørselen av reagenser, noe som gir det mindre mottagelig for rask screening av et stort antall Forbindelser. Alternative metoder, slik som malakitt grønne analysen19,21, som er avhengig av påvisning av fosfat produsert av ATPase enzymet, ble påvist mer egnet for miniatyrisering og høy gjennomstrømming screening22 , 23 andre , 24. imidlertid er et endepunkt analysen mer sannsynlig å bli påvirket av flere gjenstander (omtalt nedenfor), som kan forbli uoppdaget i fravær av heltidskurs.

Her har NADH-koplet ATPase analysen er optimalisert for semi-høy gjennomstrømming screening av små molekyl hemmere. Skjelettlidelser og hjerte muskel myosin II og myosin hemmere blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 og para-nitroblebbistatin12 brukes til å demonstrere kraften i analysen, som er avhengig av NADH fluorescens som en avlesning. Denne protokollen er mottagelig for screening prosjekter fokusert på alle ADP produsere enzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. klargjøre lager løsninger og reagenser

  1. Forbered dithiotreitol (DTT) lagerløsning ved å oppløse krystallinsk DTT i destillert vann til en endelig konsentrasjon på 1000 mM. Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH-oppløsning. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  2. Forbered ATP lagerløsning ved å oppløse krystallinsk ATP i destillert vann til en endelig konsentrasjon av 100 mM. Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH-oppløsning. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  3. Forbered 10x NADH buffer som inneholder 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPPER), 10 mM MgCl2, 0,9 mm etylen glykol-BIS (β-aminoethyl Eter)-N, N, n ', N′-Tetraacetic acid (EGTA), og 3 mm Nan3. Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH-oppløsning. Oppbevares ved 4 ° c.
  4. Forbered 1x myosin buffer som inneholder 10 mM MOPPER og 0,1 mM EGTA. Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH-oppløsning. Oppbevares ved 4 ° c. Tilsett storfe serum albumin (BSA) og DTT til en endelig konsentrasjon på 0,1% (w/v%) og 1 mM, henholdsvis før bruk.
  5. Forbered 1x utgangen buffer som inneholder 4 mM MOPPER, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, og 3 mm Nan3. Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH-oppløsning. Oppbevares ved 4 ° c. Legg BSA og DTT til en endelig konsentrasjon på 0,1% (w/v%) og 1 mM, henholdsvis før bruk.
  6. Forbered NADH lagerløsning ved å oppløse krystallinsk NADH i 10x NADH buffer til en endelig konsentrasjon på 5,5 mM. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  7. Forbered PEP lager løsningen ved å oppløse krystallinsk PEP i 10x NADH buffer til en endelig konsentrasjon på 50 mM. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  8. Forbered LDH lagerløsning ved å oppløse lyofilisert LDH pulver i en blanding av glyserol og 10x NADH buffer (50%: 50%) til en endelig konsentrasjon av 2000 U/mL. Sentrifuger løsningen for å fjerne eventuelle uoppløste protein til stede (7 197 x g, 20 ° c, 10 min). Overfør supernatanten til et rent sentrifugerør nøye. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  9. Forbered PK lagerløsning ved å oppløse lyofilisert PK pulver i en blanding av glyserol og 10x NADH buffer (50%: 50%) til en endelig konsentrasjon av 10000 U/mL. Sentrifuger løsningen for å fjerne eventuelle uoppløste protein til stede (7 197 x g, 20 ° c, 10 min). Overfør supernatanten til et rent sentrifugerør nøye. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  10. Rekonstituer lyofilisert hjerte-og Skjelettmuskel myosin II-prøver ved å tilsette 100 μL destillert vann for å oppnå 10 mg/mL lager løsninger tilsvarende ~ 37,9 μM og ~ 40,8 μM myosin konsentrasjoner (monomere), henholdsvis. Se produsentens instruksjoner hvis du vil ha mer informasjon.
  11. Forbered F-utgangen fra kanin muskel aceton pulver som beskrevet av Pardee og Spudich25.

2. måling av ATPase aktiviteter og hemmende effekter av små molekyl hemmere

  1. Forbered sammensatte plate.
    1. Oppløse forbindelser av interesse i høy kvalitet dimetylsulfoksid (DMSO).
    2. Lag femten-trinns seriell 1:2 fortynninger starter fra 10 mM sammensatte konsentrasjon i DMSO.
    3. Overfør prøvene til en 384-brønn med polypropylen i triplicates (12,5 μL hver) ved bruk av en flerkanals pipette. Bruk to rader på den sammensatte platen for ett sammensatt (i stedet for tre kolonner) for å minimere antall brønner som potensielt påvirkes av kanteffekter. Bruk de tre siste brønnene i den andre raden for hver forbindelse som negativ kontroll (bare DMSO). Ikke bruk den første og siste raden på tallerkenen for sammensatte fortynninger.
    4. Overfør ren DMSO inn i brønnene i den første raden (reservert for NADH kalibrering).
    5. Bruk den siste raden for positiv kontroll.
      Merk: para-aminoblebbistatin ved 4 mm konsentrasjon i DMSO ble brukt her.
  2. Forbered 4500 μL av 20 μM fortynnet utgangen løsning for hver analysen plate (384-brønn svart-vegg polystyren mikroplate) ved å fortynne utgangen lagerløsning i utgangen buffer. Bland løsningen grundig ved å pipettering opp og ned 30x ved hjelp av en 5 mL pipette for å redusere viskositet og heterogenitet ved å bryte utgangen filamenter. Sentrifuger løsningen for å fjerne eventuell utløst protein tilstede (7 197 x g, 20 ° c, 10 min). Overfør supernatanten forsiktig inn i et rent sentrifugerør.
  3. Forbered Master Mix inneholder LDH og PK enzymer ("enzym Mix"). For hver analyse plate kombinerer du 171,4 μL av LDH-løsning, 171,4 μL av PK-oppløsning og 3189,3 μL eller 3252,9 μL av myosin buffer for analyser som involverer hjerte-eller Skjelettmuskel myosin II, i et 15 mL konisk sentrifugerør. Ikke Legg til noen myosin på dette punktet for å unngå aggregering og utfelling.
  4. Forbered Master Mix som inneholder alle underlag ("substrat Mix"). For hver plate kan du kombinere 162,1 μL av ATP, 162,1 μL av PEP og 324,1 μL av NADH-oppløsning i et 15 mL konisk sentrifugerør. Ikke Legg til utgangen på dette tidspunktet for å unngå aggregering og utfelling.
  5. Opprett sju-trinns seriell 1:2-fortynninger av NADH for kalibrering med start fra 250 μM.
    1. Bland 12,3 μL av NADH lagerløsning med 257,7 μL av myosin buffer i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
    2. Alikvot 135 μL av myosin buffer i syv 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
    3. Overføring 135 μL av oppløsning fra det første røret inn i den andre og bland med pipettering. Gjenta til du har nådd 7th røret.
    4. Bruk det siste røret som no-NADH-kontroll (bare buffer).
  6. Ved hjelp av en 8-kanals pipette overfører du 20 μL av NADH kalibreringsløsninger til den første raden i analyse platen i triplicates.
  7. Tilsett 68 μL av hjerte-eller 4,2 μL av Skjelettmuskel myosin II til enzym miksen. Vortex kort.
  8. Bortsett fra den første raden, dispensere 8,4 μL av den tilberedte myosin-blandingen i hver brønn av analysen plate ved hjelp av en automatisert dispenser.
  9. Transfer 100 nL av løsninger fra den sammensatte platen til analysen plate som inneholder enzym blanding ved hjelp av et automatisert væske håndteringssystem utstyrt med en 100 nL PIN verktøy hodet.
  10. Rist analysen plate i 1 min ved romtemperatur ved 1200 RPM ved hjelp av en mikroplate shaker.
  11. Tilsett 4 052 μL av sentrifugert utgangen løsning på underlaget mix. Vortex kort.
  12. Dispensere 11,6 μL av utgangen i hver brønn av analyse platen (unntatt første rad) for å starte enzymatisk reaksjonen ved hjelp av en automatisert dispenser.
  13. Rist analysen plate i 1 min ved romtemperatur ved 1200 RPM ved hjelp av en mikroplate shaker.
  14. Sentrifuger analysen plate på 101 x g for 30 s.
  15. Påse at den innvendige temperaturen på plate leseren er stabilisert ved 25 ° c. Legg i platen og rist for en annen 30 s. Dette risting trinnet er nødvendig for å gjøre formen på væskeoverflaten lignende i hver brønn og gir tid til platen for å nå måle temperatur.
  16. Record NADH fluorescens i 30 min skanning platen i 45 s intervaller. Bruk en 380 Nm, 10 NM båndbredde eksitasjon filter og en 470 NM, 24 NM båndbredde utslipp filter i forbindelse med en 425 NM cut-off dichroic speil. Kjør målingen i høy konsentrasjon modus. Optimaliser antall blink, detektor forsterkning, plate dimensjoner og måle høyde før du kjører analysene.
    Merk: endelige analysen forholdene er 300 nM CARDIAC/20 nM skjelettlidelser muskel myosin II, 10 μM utgangen, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP i en buffer som inneholder 10 mM MOPPER (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO og 1 mM DTT. Det totale volumet er 20 μL/brønn. Den høyeste endelige sammensatte konsentrasjonen er 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatin i 0,5% DMSO fungerer som den positive kontrollen og 0,5% DMSO alene er den negative kontrollen. Alle målinger utføres i triplicates.

3. analysere data

  1. Plot den observerte fluorescens intensitet mot tid for hver brønn.
  2. Utfør enkel lineær regresjon for å bestemme stigningstallet og skjæringspunktet for de fluorescens svarene for hver brønn. Stigningstallet er proporsjonal med forbruksraten ATP (NADH), mens skjæringspunktet er proporsjonalt med NADH-konsentrasjonen ved begynnelsen av målingen (t = 0 s).
  3. Konstruere en kalibrering kurve for NADH ved å plotte fanger innhentet for den første raden av platen mot konsentrasjonen av NADH. Sørg for at avskjærer avhenge lineært på NADH konsentrasjon.
    Merk: avskjærer anslå den virkelige fluorescens intensitet på t = 0 s med mye mer tillit enn gjennomsnittet av den rå fluorescens intensitet leser på t ≈ 0 s.
  4. Utfør enkel lineær regresjon for å få skråningen og skjæringspunktet for NADH kalibreringslinjen.
    Merk: skjæringspunktet beskriver fluorescens bakgrunns signal (ingen NADH til stede), mens skråningen tilsvarer den ekstrapolert/teoretiske fluorescens intensiteten til en 1 M NADH-løsning i det aktuelle eksperimentet.
  5. Del opp stigningstallet for fluorescens svar for resten av brønnene ved skråningen av NADH kalibreringslinjen for å konvertere fluorescens endringer til ATP-forbruks rater.
  6. Tegn opp ATP forbruk priser mot konsentrasjonen av inhibitor.
  7. For å bestemme hemmende konstanter, bruk passende statistisk programvare for å tilpasse dose responsdata til følgende kvadratisk ligning som tilsvarer en enkel en-til-en bindende likevekt modell:
    Equation 1
    der y er ATP forbruks rate, Ymin er ATP forbruks rate int fraværet av inhibitor, ymax er den teoretiske ATP forbruksraten på 100% hemming, Kjeg er hemmende konstant , [E]t og [I]t er den totale konsentrasjonen av enzymet (myosin) og hemmer, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den typiske plate layout kart som brukes for screening eksperimenter er vist i figur 1. Den første og siste radene er reservert for NADH kalibrering og positiv kontroll (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), henholdsvis. De resterende radene (B til O) brukes til å teste hemmende aktivitet av forbindelser. Her femten-trinns seriell 1:2 fortynninger starter fra 10 mM sammensatte konsentrasjon i DMSO er forberedt og overført fra den sammensatte platen til analysen plate, slik at den høyeste endelige sammensatte konsentrasjonen er 50 μM (i 0,5% DMSO) på analysen plate. To rader brukes til å få en dose respons kurve for en forbindelse (48 datapoints/sammensatte). Merk at platen layout kartene kan re-designet for å støtte de konkrete målene for et gitt prosjekt. For eksempel, hvis målet var å få ett-punkts screening data for et stort antall forbindelser, kunne man teste 112 forbindelser på en enkelt 384-brønn plate med samme layout for positiv kontroll og NADH kalibrering (beregning med triplicates for hver sammensatte). Det er alltid anbefalt å ha minimum 3 datapoints for ett sammensatt (eller for hver konsentrasjon) og for å unngå å bruke bare brønnene langs kantene av platen for en forbindelse, da disse datapoints kan være påvirket av kanteffekter. For å anslå betydningen av kanteffekter, alltid kjøre en full plate med negativ kontroll bare først.

Fluorescens intensitet har en lineær avhengighet av konsentrasjonen av NADH som vist i figur 2a. Skråningen av den lineære passformen brukes under dataanalyse for å konvertere fluorescens endringer til reaksjons ratene. Merk at den rå fluorescens intensitet spor innhentet for hver brønn av NADH kalibrering analyseres av lineær regresjon først (en lignende analyse er vist i figur 2b, C for sammensatte data). Disse sporene forventes å vise eksponentiell forfall over tid på grunn av photobleaching av fluoroforen. Imidlertid, photobleaching er meget langsom og derfor, det ømt punktdata kan analysert av lineær monterer. Stigningstallet og skjæringspunktet for disse passer til den innledende frekvensen av photobleaching og fluorescens intensitet på t = 0 s, henholdsvis. Fanger av disse lineære passer brukes i stedet for gjennomsnittet av den rå fluorescens leser på t = 0 s for å konstruere NADH kalibrering kurve fordi avskjærer er anslått basert på mer data, og derfor de tilhørende feilene er mye mindre.

Figur 2b,C viser at uavhengig av myosin som brukes eller tilstedeværelsen av inhibitor, er tids kursene lineære i tidsvinduet for målingene. Den høyeste (50 μM) og lavest (0 μM) hemmer konsentrasjonene her tilsvarer henholdsvis ~ 100% og 0% hemming. Merk at på grunn av mengden av rådata, vil den faktiske analysen vises kaotisk hvis det vises på et enkelt panel. Derfor har disse panelene blitt forenklet for å bedre visualisere prosessen. Gjennomsnittet av den rå fluorescens intensiteten leses ble beregnet for alle parallelle eksperimenter (triplicates for hver konsentrasjon) og konvertert til NADH konsentrasjoner her. Bare 3 hemmere konsentrasjoner vises. I den virkelige analysen, hver rå fluorescens intensitet spor (48/sammensatte testet) analyseres av lineær regresjon først, og deretter, bakkene er konvertert til ATP forbruk priser.

Det er alltid lurt å vise at reaksjonen priser endres lineært med enzymet konsentrasjon, som vist i figur 2D og figur2e for skjelettlidelser og CARDIAC muskel myosin II ' s, henholdsvis. Basert på den lineære passer, den endelige analysen konsentrasjon av enzymet kan lett anslås. For eksempel, en reaksjons rate på ~ 5 x 10-8 MS-1 anbefales for 30-min tid kurs. Hvis en aktivator brukes i reaksjonen blandinger (for eksempel utgangen her), anbefales det å kjøre eksperimenter både i nærvær og fravær av aktivator for å sikre at den forventede effekten (aktivering) er til stede. Vilkårene og prosedyren må følge den endelige protokollen så tett som mulig. Her ble en fortynning rekke myosin fremstilt i myosin buffer i åtte mikrosentrifugen rør først. Deretter ble det tilsatt en blanding av LDH og PK-enzymer. Til slutt ble reaksjonene startet ved å legge substrat Mix til hvert rør parallelt, ved hjelp av en flerkanals pipette. Reaksjons mikser ble umiddelbart overført til en rad av analysen plate i triplicates. Hvis utgangen var fraværende, ble utgangen buffer brukt i stedet. Ingen andre parametere ble endret (se notatet til trinn 2,16 i protokollen for endelige analysen forhold).

Figur 2F viser ATP forbruk priser innhentet for flere negative og positive kontroll reaksjoner (halv plate hver). Disse dataene kan sammenlignes basert på Z-verdien eller "screening vindu koeffisient"26, som er en mye brukt statistisk parameter for å anslå kvaliteten på høy gjennomstrømming analyser. Den sammenligner positive og negative kontroller ved å ta både midler og standardavvik i betraktning:

Equation 2,

der σn, σp og μn, μp er standardavvik og midler for henholdsvis negative og positive kontroller. De to befolkningsgruppene er godt adskilt hvis Z-verdien faller mellom 0,5 og 1. A Z ' = 0,78 innhentet her viser at analysen kan betraktes som utmerket26.

For å demonstrere at analysen kan brukes til å bestemme hemmende konstanter, det lille molekylet myosin inhibitor blebbistatin8 og to analoger, para-nitroblebbistatin12 og para-aminoblebbistatin13 har blitt valgt her, som vist i figur 3a og figur 3b. Blebbistatin er en utkonkurrert, nukleosid myosin inhibitor27,28. Ett molekyl av blebbistatin binder seg til en motor domene av myosin og blokkerer ATPase syklus ved å stabilisere myosin-ADP-fosfat kompleks27,28. Derfor ble den hemmende effekten av blebbistatin derivater modellert ved hjelp av en enkel, en-til-en bindende modell her (se trinn 3,7 i protokollen). Vær oppmerksom på at denne modellen kanskje ikke kan brukes hvis ATP-forbruks ratene ikke hadde vist lineær avhengighet av myosin konsentrasjon (se figur 2D,E). Den kinetisk vandige løselighet av blebbistatin, para-nitroblebbistatin og para-aminoblebbistatin har blitt rapportert å være 426 μm, 3,6 μm og 9,3 μm, henholdsvis13. Ingen unormalt i signalet ble observert ved eller under de rapporterte solubilities i våre eksperimenter; men flere gjenstander dukket opp når enten blebbistatin eller para-nitroblebbistatin ble brukt over sine rapporterte løselighet verdier, som vist i Figur 4. Derfor ble signalet som ble registrert ved konsentrasjoner høyere enn løselighet ekskludert fra dataanalysen i disse tilfellene. Para-aminoblebbistatin er svært oppløselig, og derfor er løselighet ikke en begrensende faktor i så fall.

Til slutt, det er alltid anbefalt å teste om den hemmende effekten av noen positive treff er spesifikke for målet ATPase enzymet. Den sammenkoblede reaksjons system sysselsetter to andre enzymer, LDH og PK, og hemming av en av disse vil resultere i en falsk positiv signal. Kjører ATPase analysen med en urelaterte ATPase enzym kan bidra til å filtrere ut disse falske positive treff (for ytterligere anbefalinger, se diskusjon). Para-aminoblebbistatin og apyrase, en ATP hydroloserende enzym som produserer ADP og uorganisk fosfat29, ble brukt her som et eksempel for å demonstrere en slik kontroll eksperiment, som vist i figur 5.

Figure 1
Figur 1 : Analyse plate layout. Sju-trinns seriell 1:2 fortynninger av NADH fra 250 μM-konsentrasjonen er klargjort og deretter utlevert til rad A i tre eksemplarer for kalibrering (svart til grønn fargegradering). De tre siste brønnene i rad A inneholder bare myosin buffer (ingen NADH-kontroll, hvit). Den siste raden (P) brukes for den positive kontrollen (20 μM para-aminoblebbistatin; rød). Et typisk eksperiment med dose respons krever to rader (f.eks. B og C). Derfor kan 7 dose reaksjons eksperimenter kjøres parallelt på en enkelt 384-brønn plate (representert ved blå til hvit fargegraderinger). Hver prøve er lastet som triplicates. Her starter de høyeste avsluttende konsentrasjonene på 50 μM (i 0,5% DMSO). De tre siste brønnene på annenhver rad er forbeholdt den negative kontrollen (ingen sammensatte, 0,5% DMSO bare; cyan). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representative ATPase-data. (A) en to-fold fortynning serie av NADH ble utarbeidet og overført til den første raden av hver måling plate. Fluorescens intensitet ble registrert i 30 min og rådata ble analysert ved enkel lineær regresjon. Skjæringspunktet for hver regression linje ble plottet mot konsentrasjonen av NADH. Vær oppmerksom på at i et ideelt tilfelle kan fluorescens intensitet ved t = 0 s bare brukes til å få kalibreringslinjen. Men mens den rå fluorescens data er svært støyende, de avskjærer gi et nøyaktig anslag over fluorescens intensitet på t = 0 s og deres tilknyttede standard feil (vist som feil barer) er svært liten. (B,C) Representative fluorescens intensitet spor av skjelett (B) og CARDIAC (C) muskel myosin II ATPase reaksjoner ble registrert i nærvær av ulike nivåer (se inn inn) av para-aminoblebbistatin. For enkelhets skyld representerer datapunkt og feilfelt gjennomsnittet av tre uavhengige målinger og tilhørende standardavvik. Enkel lineær regresjon ble utført (solid linjer) for å oppnå reaksjons rater. Merk at et typisk eksperiment for dose respons består av 15 forskjellige hemmer konsentrasjoner og negativ kontroll i triplicates på måle platen (se figur 1) og lineær regresjon utføres individuelt for hver fluorescens og intensitet. For enkelhets skyld, bare 3 forskjellige konsentrasjoner er vist her. (D,E) Basal (rød) og utgangen (blå) ATPase ratene ble fastsatt for ulike skjelett (D) og CARDIAC (E) muskel myosin II konsentrasjoner. ATPase-ratene viser lineær avhengighet av myosin konsentrasjon. (F) positive (røde) og negative (blå) kontroller (halv plate hver) ble kjørt parallelt på en 384 brønn analyse plate og z-faktoren (z ') ble beregnet for å vurdere kvaliteten på ATPase-analysen. En Z ' verdi på 0,78 indikerer en pålitelig analysen med svært godt separert positive og negative kontroller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Dose-respons kurver og analyse av hemmende konstanter. CARDIAC (A) og skjelett (B) muskel myosin II ' s ble brukt til å teste hemmende aktivitet av blebbistatin, para-aminoblebbistatin og para-nitroblebbistatin. ATPase priser (blå) ble innhentet ved å bruke enkel lineær regresjon til rå fluorescens data. Feilfelt representerer standard feil av montering og ble brukt som vekting faktorer under montering av en kvadratisk ligning (se trinn 3,7 i protokollen) som representerer en enkel likevekt bindende modell (rød). Data innhentet over løselighet ble påvirket av artefakter og utelukket fra analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Løselighet-relaterte artefakter. (A) fluorescens intensitet spor for blebbistatin innhentet i en ATPase analysen bruker skjelettlidelser muskel myosin II viser lineært synkende signal avhengig av mengden av inhibitor stede (blå). Men når blebbistatin ble brukt over løselighet (50 μM innledende blebbistatin konsentrasjon), en økning i signalet ble observert (rød), mest sannsynlig på grunn av dannelsen av lyst fluorescerende blebbistatin krystaller13. (B) i tilfelle av para-nitroblebbistatin, som er en ikke-fluorescerende analog av blebbistatin12, den rå fluorescens intensitet spor dukket opp normal (synkende). Imidlertid var det høyeste nivået av hemming mye lavere enn forventet (basert på positiv kontroll). Derfor ble bare reaksjons ratene som ble oppnådd under løselighet (blå) inkludert i dataanalysen. Reaksjons rater innhentet over løselighet (rød) avviker fra den bestemte dose reaksjons kurven (grønn), ettersom nedbøren begrenser mengden (konsentrasjonen) av hemmer som gjenstår i løsningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Hemmende effekter av para- aminoblebbistatin i skjelettlidelser muskel MYOSIN II og Apyrase ATPase analyser. Para-aminoblebbistatin hemmet Skjelettmuskel myosin II med en Ki av 1,7 μM, mens ingen hemming ble oppdaget da apyrase29 ble brukt som en ATPase i det samme sammenkoblede reaksjonssystemet. Dette eksperimentet viser tydelig at para-aminoblebbistatin er spesifikk for myosin og HEMMER ikke PK eller LDH, dermed oppdaget hemmende effekten er ikke en gjenstand. Apyrase ble brukt ved 0,5 nM konsentrasjon. Ingen myosin eller utgangen var til stede, og reaksjonen ble utført i en buffer som inneholder 100 mM MOPPER (pH = 7,0), 3 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 3 mm Nan3, 1 mm DTT og 0,1% BSA. Ingen andre endringer ble gjort i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiske trinn i protokollen

Optimaliser plate layout ved å kjøre flere plater med negativ kontroll bare (ATPase reaksjon uten inhibitor). Inspiser resultatene nøye for mønstre i reaksjons rater. For eksempel kan disse oppstå fra kanteffekter og/eller ufullkommenheter i hydrofile overflatebelegg av "ikke-bindende" plater. Hvis et mønster er observert, endre platetype og/eller plate layout for å minimere artefakter. For eksempel kan en typisk dose respons kurve (16 konsentrasjoner med triplicates, 48 poeng totalt) enten være ordnet i tre kolonner eller to rader på en 384-brønn plate. Disse ordningene gir henholdsvis 6 og 4 datapoints, som sannsynligvis påvirkes av kanteffekter. Derfor foretrekkes rad ordningen alltid.

Modifikasjoner og feilsøking

Merk at de observerte fluorescens svarene må være lineære gjennom hele tiden-løpet av reaksjonen. Ikke-linearities kan forekomme i de første minuttene på grunn av termiske endringer eller i de siste minuttene på grunn av nådd likevekt. Hvis ikke-linearities er til stede, kan man enten justere reaksjons parametre (f.eks. fortynne myosin, endre måle temperatur) eller ganske enkelt begrense analysen til den lineære delen av dataene.

Ikke-linearities kan også være til stede i begynnelsen av reaksjonene dersom bindingen av inhibitor til ATPase enzymet er langsom (forekommer over minutter). I dette tilfellet er reaksjonen ventes å avta over tid som enzymet-inhibitor kompleks akkumuleres. Ruge analysen plate før du legger underlaget Mix som er nødvendig for å unngå dette problemet.

Analysen forhold må velges på en slik måte at den lineære delen av reaksjonene er lengre enn 15 minutter. Kortere lineære deler tilsvarer mindre nyttige datapoints (< 20, som skanning av hele platen tar ~ 45 sekunder). Derfor, den lineære passer gir mindre pålitelige bakker (reaksjons rater) med mye høyere standard feil. På den annen side er det ikke anbefalt å få kinetisk leser lenger enn ~ 120 minutter. Slike eksperimenter kan påvirkes av protein denaturering eller konsentrasjon endringer på grunn av løsemiddel fordampning. Disse kriteriene kan oppfylles lettest ved å justere myosin konsentrasjon.

Det er viktig å sikre at reaksjonene som katalysert av PK og LDH ikke er hastighets begrensning i det sammenkoblede reaksjonssystemet. Kontroll eksperimenter utført uten ATPase av interesse eller på høye nivåer av en potent ATPase hemmer ville vise ingen (eller lite) aktivitet. Imidlertid vil tillegg av ADP resultere i en rask signal reduksjon hvis LDH og PK er aktive og fungerer på riktig måte. Frekvensen av NADH forbruk ventes å være svært høy i denne kontrollen eksperimentet, så det er avgjørende å starte oppdagelsen så snart som mulig etter at reaksjonen er initiert av tilsetning av ADP.

Det er alltid anbefalt å utelukke eventuelle observerte ATPase priser innhentet over løselighet av inhibitor fra dataanalyse. Som løselighet avhenger av temperatur, renhet av det sammensatte, og forskjeller i sammensetningen av løsningen, er det sterkt anbefalt å måle det under forhold som er svært lik de faktiske forholdene (temperatur, buffer, etc.) under ATPase-analysen utføres. Forsøk på å bruke små molekyl hemmere over løselighet kan føre til utfelling som kan påvirke resultatene (se Figur 4). Nedbør begrenser konsentrasjonen av sammensatte på eller nær løselighet. Derfor kan ikke ATPase-satsene reduseres ytterligere ved å legge til mer inhibitor. Ved hjelp av en god positiv kontroll som viser ~ 100% hemming, derfor kan bidra til å identifisere slike uregelmessigheter i signalet, selv om løselighet er ukjent. En stor forskjell mellom den observerte reaksjonshastigheten til den positive kontrollen og reaksjons raten som tilhører maksimal hemming nivå (IMax) bestemmes av montering er alltid en god indikasjon på problemet. Gradvis ekskludere flere og flere data fra analysen og/eller ved hjelp av positiv kontroll som jegMax og holde den fast under tilpasningsprosessen til en bedre passform er innhentet anbefales i slike tilfeller. Hemmer nedbør kan også føre til sterk lysspredning og kan også endre de optiske egenskapene til inhibitor, som fører til unormalt høyt observert signal intensitet i begynnelsen av reaksjoner og/eller økende signaler over tid. Rådata må alltid være nøye inspisert, og de berørte konsentrasjonene må utelukkes fra analysen.

Begrensninger for metoden

Den endelige analysen konsentrasjon for ATPases med et lavt omsetningstall (f. eks, CARDIAC muskel myosin II) må være høy (flere hundre nM) for å oppnå målbar reaksjon priser innen tidsvinduet i analysen (30 − 120 minutter). Derfor kan det være viktig å bruke kvadratisk bindings modellen for analyse av dose respons kurver. Andre bindende modeller (hyperbolske, Hill) er vanligvis ikke egnet for analyse av slike data. Videre konsentrasjonen av ATPase setter en nedre grense for omfanget av målbare hemmende konstanter fordi dose respons kurvene blir umulig å skille i praksis på grunn av tilstedeværelsen av eksperimentelle feil hvis Ki er nær eller mindre enn konsentrasjonen av ATPase.

Forskjeller i sammensatte potencies bør alltid kvantifisert ved å utføre dose respons eksperimenter og bestemme de hemmende konstantene. Selv om enkelt punkt screening data reflekterer disse forskjellene i teorien, den ikke-linearitet av svarene, sammen med den eksperimentelle feilen ville gjøre det ekstremt vanskelig å utføre en slik analyse. Enkelt punkt screening eksperimenter bør være utformet for å fange selv de relativt svake hemmere med høy selvtillit ved å velge en passende inhibitor konsentrasjon og en forhåndsdefinert terskel responsnivå for å skille mellom aktive og inaktive Forbindelser.

Etablere at forskjellene mellom de hemmende konstantene er statistisk signifikant er best utføres ved å skrive ligningen for ikke-lineær regresjon for å bestemme pKi (-logKi) i stedet for Ki, som pKjeg er normalt distribueres, mens Kjeg er ikke30. Usikkerheten for pKjeg er symmetrisk, mens det ikke er symmetrisk for KI31. Sikkerhets intervaller kan beregnes for pKi og t-test eller analyse av varians (anova) kan brukes til å avgjøre om midlene til pKjeg målinger er signifikant forskjellig. Forsiktighet må imidlertid utvises når du utfører en slik statistisk test når de antar homoscedasticity (samme varians for data i grupper). Man kan forvente høyere varians forbundet med pKjeg når en full dose-respons kurve ikke kan oppnås på grunn av sammensatte løselighet problemer. I dette tilfellet bør andre egnede statistiske tester som ikke antar lik varians (f.eks. Welch t-test) brukes.

Eventuelle sammensatte hemme PK eller LDH ville gi en falsk positiv signal i NADH-koplet ATPase analysen. Noen av disse falske positiver kan identifiseres ved å kjøre analysen med en urelaterte ADP produserende enzym. I dette tilfellet kan ingen hemming for reelle positive treff forventes, med mindre hemmer er en ATP analog binding til begge enzymer. For å demonstrere en slik analyse utførte vi en ATPase-analyse ved hjelp av para-aminoblebbistatin og apyrase, et ATP-hydroloserende enzym som ikke var relatert til myosines (se figur 5). Alternativt, en annen funksjonell analysen spesifikke for enzymet av interesse, eller en annen ATPase analysen ikke ansette PK og LDH kan kjøres for å skille mellom reelle og falske positive treff (f. eks den malakitt grønne analysen).

Måling og analyse av Kinetics av fluorescens intensitet i alle brønner krever en plate leser som er rask nok til å skanne hele platen på mindre enn ~ 90 − 60 sekunder.

Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende/alternative metoder

Motsetning til den "tradisjonelle" absorbansen-baserte avlesning16,17,18,19,20, den modifiserte NADH-kombinert ATPase analysen presenteres her er avhengig av NADH fluorescens. Dette gjør analysen mer følsom, slik at brukeren kan redusere eksitasjon lys intensitet og dermed beskytte NADH eller hemmere mot fotokjemisk nedbryting.

Selv om analysen er generelt betraktet som ikke egnet for håndtering av et stort antall prøver32, oppnådde de små reaksjons volumene her (20 μL) i et 384-brønn format som gjør det mottagelig for screening-applikasjoner med halvhøy gjennomstrømming, spesielt Hvis bestemmelse av hemmende konstanter vurderes.

Alternative metoder er vanligvis avhengige av påvisning av uorganisk fosfat produsert av ATPase enzymet. For eksempel kan [γ-32P] ATP brukes som et substrat for ATPase og deretter kan frigjort uorganisk fosfat måles basert på radioaktivitet. Analysen er følsom; det krever imidlertid håndtering av radioaktive stoffer, og de resterende ATP må skilles fra uorganisk fosfat (f. eks, ved absorpsjon av ATP på trekull)33. I den ovennevnte malakitt grønne analysen, reagerer fosfat med molybdat under Sure tilstander og den resulterende phosphomolybdate komplekse binder malakitt grønne fargestoff forårsaker et skifte i sin absorpsjon spektrum19,21, 22,23,24. Denne metoden krever også brå slukking av ATPase-reaksjonen; Derfor er det mest brukt som et endepunkt-analysen, spesielt i høy gjennomstrømming format. I motsetning til kontinuerlig overvåking av ATPase reaksjonen i NADH-sammenkoblede analysen, en endepunkt analysen bare forutsetter lineær tid kurs og kan ikke avsløre gjenstander som fører til ikke-linearities. Forbindelser i samspill med malakitt grønne eller komplekse dannet kan også føre til gjenstander21. Videre er malakitt grønne analysen svært følsom for fosfat forurensning24. I kontrast er NADH-koblet analysen ikke er følsom for ADP forurensning som ADP (som alltid er til stede på ulike nivåer i ATP prøver) er raskt forvandlet til ATP av PK i begynnelsen av reaksjonen. Det er ikke behov for slukke eller separasjon av produktene. En annen fluorometric analysen for måling av ATPase priser har allerede blitt utviklet ved å kopling ATP hydrolyse til reaksjonen katalysert av nukleosid fosforylase34. Men at analysen ikke benytter en ATP gjenfødelse syklus, derfor bestemmelse av første reaksjons rater kan være mye mer utfordrende.

Fremtidige søknader eller retninger av metoden

Mange enzymer som er avhengige av ATPase aktivitet har blitt utforsket som potensielle narkotika mål. Disse inkluderer cytoskjelettkomponenter motor proteiner som tilhører kinesin35 og dynein familier36 og DNA helicases37, som alle er terminalen effekt Orer i ulike signalering trasé. Analysen beskrevet her kan enkelt optimaliseres for narkotika oppdagelse og utviklingsprosjekter som involverer noen enzym katalyserende en reaksjon der ADP er et produkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag og nasjonalt Institutt for narkotikamisbruk NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17, (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125, (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12, (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6, (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8, (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39, (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43, (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299, (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351, (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1, (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53, (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71, (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277, (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24, (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321, (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7, (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169, (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327, (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279, (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12, (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31, (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161, (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52, (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307, (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266, (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7, (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11, (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter