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Biochemistry

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.

Abstract

Las enzimas ATPase utilizan la energía libre almacenada en el trifosfato de adenosina para catalizar una amplia variedad de procesos bioquímicos endergónicos in vivo que no ocurrirían espontáneamente. Estas proteínas son cruciales para esencialmente todos los aspectos de la vida celular, incluyendo el metabolismo, división celular, respuestas a los cambios ambientales y movimiento. El protocolo presentado aquí describe un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) que se ha adaptado a la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores ATPase de moléculas pequeñas. El ensayo se ha aplicado a la miosina cardiaca y esquelética de miosina II, dos ATPases de motor molecular a base de actina, como prueba de principio. La hidrólisis de ATP se acopla a la oxidación de NADH por reacciones enzimáticas en el ensayo. En primer lugar, el ADP generado por el ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK). PK cataliza la transición de fosfoenolpiruvato (PEP) al piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH), que cataliza la oxidación de NADH en paralelo. Por lo tanto, la disminución de la concentración de ATP está directamente correlacionada con la disminución de la concentración de NADH, que es seguida por el cambio a la fluorescencia intrínseca de NADH. Mientras la PEP esté disponible en el sistema de reacción, la concentración de ADP sigue siendo muy baja, evitando la inhibición de la enzima ATPase por su propio producto. Además, la concentración de ATP se mantiene casi constante, produciendo cursos de tiempo lineales. La fluorescencia se monitorea continuamente, lo que permite una fácil estimación de la calidad de los datos y ayuda a filtrar los artefactos potenciales (por ejemplo, derivados de precipitaciones compuestas o cambios térmicos).

Introduction

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Las miosinas son transductores de energía mecanoquímicos que hidrolizan trifosfato de adenosina (ATP) para generar movimientodireccional a lo largo de los filamentos del citoesqueleto de actina en eucariotas 1,2. Se han adaptado tanto estructural como cinéticamente a sus diversas funciones intracelulares, como el transporte deorgánulos, la contracción muscular o la generación de tensión citoesquelética 1,2. La superfamilia de miosina está representada por genes de miosina de 40 euros pertenecientes a 12 clases distintas de miosina en el genoma humano3,4. Los miembros de las clases de miosina desempeñan diversos papeles en un conjunto muy diverso de trastornos, como varios tipos de cáncer, trastornos neurológicos, miopatías esqueléticas y cardiomiopatía hipertrófica5,6. Dado el gran número de funciones fisiológicas y patológicas de estos motores moleculares, no es de extrañar que se estén volviendo cada vez más reconocidos como objetivos farmacológicos para una variedad de condiciones7. Recientemente se han realizado progresos significativos en el descubrimiento de nuevos inhibidores de la miosina8,9,10 y activadores11,y para mejorar las propiedades de los existentes12, 13 , 14 , 15.

El ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha utilizado durante mucho tiempo para medir la actividad ATPase de varias enzimas, como la bomba sarcoplasmática reticulum Ca2+ ATPase16, la reparación de ADN ATPase Rad5417, la AAA+ ATPase p9718 o la quinesina motora microtúbula19. El ensayo emplea un ciclo de regeneración ATP. El difosfato de adenosina (ADP) generado por la ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK), que transforma una molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH). Eso, a su vez, oxida una molécula de NADH a NAD. Por lo tanto, la disminución en la concentración de NADH en función del tiempo es igual a la tasa de hidrólisis ATP. El ciclo de regeneración de ATP mantiene la concentración de ATP casi constante y la concentración de ADP baja siempre y cuando PEP esté disponible. Esto da como resultado cursos de tiempo lineales, por lo que es fácil determinar las tasas de reacción inicial y ayuda a evitar la inhibición del producto por ADP19. Aunque el ensayo ATPase acoplado a NADH ya se ha adaptado a un formato de 96 pozos20,los altos volúmenes de reacción (-150 l) lo hacen relativamente caro debido a la alta demanda de reactivos, lo que lo hace menos apto para un cribado rápido de grandes Compuestos. Los métodos alternativos, como el ensayo verde de malaquita19,21, que se basa en la detección del fosfato producido por la enzima ATPase, se demostraron más adecuados para la miniaturización y el cribado de alto rendimiento22 , 23 , 24. Sin embargo, es más probable que un ensayo de punto final se vea afectado por varios artefactos (que se describen a continuación), que pueden permanecer sin descubrir se descubierta en ausencia de cursos de tiempo completo.

Aquí, el ensayo ATPase acoplado a NADH se ha optimizado para la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores de moléculas pequeñas. La miosina muscular esquelética y cardíaca II y los inhibidores de la miosina blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 y para-nitroblebbistatin12 se utilizan para demostrar el poder del ensayo, que se basa en NADH fluorescencia como una lectura. Este protocolo es susceptible de cribado de proyectos centrados en cualquier enzima que produzca ADP.

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Protocol

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1. Preparación de soluciones de stock y reactivos

  1. Preparar la solución de material de ditilothreitol (TDT) disolviendo la TDT cristalina en agua destilada a una concentración final de 1000 mM. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Aliquot y almacenar a -20oC.
  2. Prepare la solución de stock ATP disolviendo ATP cristalino en agua destilada a una concentración final de 100 mM. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Aliquot y almacenar a -20oC.
  3. Preparar 10x nadh tampón que contenga 70 mM 3-(N-morpholino)ácido propanesulfónico (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM etilenglicol-bis (éter de aminoetilo)-N,N,N,N,N-tetraacético ácido (EGTA), y 3 mM NaN3. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Conservar a 4oC.
  4. Prepare 1 búfer de miosina que contenga 10 mM MOPS y 0,1 mM EGTA. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Conservar a 4oC. Añadir albúmina sérica bovina (BSA) y TDT a una concentración final de 0,1% (p/v%) y 1 mM, respectivamente, antes de su uso.
  5. Prepare 1 tampón de actina que contenga 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2y 3 mM NaN3. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Conservar a 4oC. Añadir BSA y TDT a una concentración final de 0,1% (p/v%) y 1 mM, respectivamente, antes de su uso.
  6. Prepare la solución de stock NADH disolviendo NADH cristalino en un búfer NADH de 10x a una concentración final de 5,5 mM. Aliquot y almacenar a -20oC.
  7. Prepare la solución de stock PEP disolviendo PEP cristalino en búfer NADH 10x a una concentración final de 50 mM. Aliquot y almacenar a -20oC.
  8. Preparar la solución de material LDH disolviendo polvo LDH liofilizado en una mezcla de glicerol y tampón NADH 10x (50%:50%) a una concentración final de 2000 U/mL. Centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína no disuelta presente (7.197 x g, 20 oC, 10 min). Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio con cuidado. Aliquot y almacenar a -20oC.
  9. Preparar la solución de stock PK mediante la disolución de polvo PK liofilizado en una mezcla de glicerol y 10x buffer NADH (50%:50%) a una concentración final de 10000 U/ml. Centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína no disuelta presente (7.197 x g, 20 oC, 10 min). Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio con cuidado. Aliquot y almacenar a -20oC.
  10. Reconstituir las muestras de miosina ii cardiaca y esquelética liofilizada añadiendo 100 l de agua destilada para obtener soluciones de stock de 10 mg/ml correspondientes a concentraciones de miosina (monoméricas) de 37,9 m y 40,8 m (monoméricas), respectivamente. Para obtener más información, consulte las instrucciones del fabricante.
  11. Preparar F-actin a partir de polvo de acetona muscular conejo como se describe por Pardee y Spudich25.

2. Medición de las actividades de ATPase y los efectos inhibitorios de los inhibidores de moléculas pequeñas

  1. Prepare la placa compuesta.
    1. Disolver compuestos de interés en dimetilsulfóxido de alta calidad (DMSO).
    2. Cree diluciones seriales 1:2 de quince pasos a partir de una concentración compuesta de 10 mM en DMSO.
    3. Transfiera las muestras a una placa de polipropileno de 384 pocillos en triplicados (12,5 l cada una) utilizando una pipeta multicanal. Utilice dos filas en la placa compuesta para un compuesto (en lugar de tres columnas) para minimizar el número de pozos potencialmente afectados por los efectos de borde. Utilice los últimos tres pozos de la segunda fila para cada compuesto como control negativo (solo DMSO). No utilice la primera y la última fila de la placa para diluciones compuestas.
    4. Transfiera DMSO puro a los pozos de la primera fila (reservado para la calibración NADH).
    5. Utilice la última fila para el control positivo.
      NOTA: Para-aminoblebbistatin a 4 mM de concentración en DMSO se utilizó aquí.
  2. Preparar 4500 ml de solución de actina diluida de 20 m para cada placa de ensayo (microplaca de poliestireno de pared negra de 384 pocillos) diluyendo la solución de material de actina en tampón de actina. Mezcle bien la solución pipeteando 30 veces arriba y abajo utilizando una pipeta de 5 ml para reducir la viscosidad y la heterogeneidad rompiendo filamentos de actina. Centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína precipitada presente (7.197 x g, 20oC, 10 min). Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.
  3. Preparar la mezcla maestra que contiene enzimas LDH y PK ("mezcla de enzimas"). Para cada placa de ensayo, combine 171,4 l de solución de LDH, 171,4 l de solución PK y 3189,3 l o 3252,9 l de tampón de miosina para ensayos que involucren miosina muscular cardiaca o esquelética II, respectivamente, en un tubo centrífugo cónico de 15 ml. No agregue miosina en este punto para evitar la agregación y la precipitación.
  4. Preparar la mezcla maestra que contiene todos los sustratos ("mezcla de sustratos"). Para cada placa, combine 162,1 l de ATP, 162,1 ml de PEP y 324,1 l de solución de NADH en un tubo centrífugo cónico de 15 ml. No agregue actina en este punto para evitar la agregación y la precipitación.
  5. Cree diluciones seriales 1:2 de siete pasos de NADH para calibración a partir de 250 m.
    1. Mezclar 12,3 l de solución de nadh con 257,7 l de tampón de miosina en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Alícuota 135 l de tampón de miosina en siete tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Transfiera 135 ml de solución desde el primer tubo al segundo y mezcle mediante pipeteo. Repita el proceso hasta llegar altubo 7.
    4. Utilice el último tubo como control no-NADH (solo búfer).
  6. Mediante una pipeta de 8 canales, transfiera 20 ml de las soluciones de calibración NADH a la primera fila de la placa de ensayo en triplicados.
  7. Añadir 68 ml de cardiaco o 4,2 ml de miosina muscular esquelética II a la mezcla enzimática. Vórtice brevemente.
  8. Excepto la primera fila, dispensar 8,4 ml de la mezcla de miosina-enzima preparada en cada pocificador de la placa de ensayo utilizando un dispensador automatizado.
  9. Transfiera 100 nL de soluciones de la placa compuesta a la placa de ensayo que contiene la mezcla enzimática utilizando un sistema automatizado de manipulación de líquidos equipado con un cabezal de herramienta de pasador de 100 nL.
  10. Agitar la placa de ensayo durante 1 min a temperatura ambiente a 1200 rpm utilizando una coctelera de microplaca.
  11. Añadir 4.052 ml de la solución de actina centrifugada a la mezcla de sustrato. Vórtice brevemente.
  12. Dispensar 11,6 ml de mezcla de actina-sustrato en cada pocelo de la placa de ensayo (excepto primera fila) para iniciar la reacción enzimática utilizando un dispensador automatizado.
  13. Agitar la placa de ensayo durante 1 min a temperatura ambiente a 1200 rpm utilizando una coctelera de microplaca.
  14. Centrifugar la placa de ensayo a 101 x g durante 30 s.
  15. Asegúrese de que la temperatura interior del lector de placas se ha estabilizado a 25 oC. Cargue el plato y agite durante otros 30 s. Este paso de agitación es necesario para que la forma de la superficie líquida sea similar en cada pocil y permite tiempo para que la placa alcance la temperatura de medición.
  16. Registre la fluorescencia NADH durante 30 minutos escaneando la placa en intervalos de 45 s. Utilice un filtro de excitación de ancho de banda de 380 nm y 10 nm y un filtro de emisión de ancho de banda de 470 nm y 24 nm junto con un espejo dicroico de corte de 425 nm. Ejecute la medición en modo de alta concentración. Optimice el número de destellos, la ganancia del detector, las dimensiones de la placa y la altura de medición antes de ejecutar los ensayos.
    NOTA: Las condiciones finales del ensayo son 300 nM cardiaca/20 nM de miosina muscular esquelética II, 10 M de actina, 40 U/ml LDH, 200 U/mL PK, 220 M NADH, 1 mM de PEP, 1 mM de ATP en un tampón que contiene 10 mM MOPS (pH a 7,0), 2 mM MCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO y 1 mM de TDT. El volumen total es de 20 l/bueno. La concentración de compuesto final más alta es de 50 M. 20 m para-aminoblebbistatin en 0.5% DMSO sirve como el control positivo y 0.5% DMSO solo es el control negativo. Todas las mediciones se realizan en triplicados.

3. Análisis de datos

  1. Trazar la intensidad de fluorescencia observada contra el tiempo para cada pocal.
  2. Realice una regresión lineal simple para determinar la pendiente y la interceptación de las respuestas de fluorescencia para cada poca. La pendiente es proporcional a la tasa de consumo de ATP (NADH), mientras que la intercepción es proporcional a la concentración de NADH al principio de la medición (t a 0 s).
  3. Construir una curva de calibración para NADH trazando las interceptaciones obtenidas para la primera fila de la placa contra la concentración de NADH. Asegúrese de que las interceptaciones dependen linealmente de la concentración de NADH.
    NOTA: Las interceptaciones estiman las intensidades reales de fluorescencia en t a 0 s con mucha más confianza que la media de la intensidad de fluorescencia bruta que se lee en t a 0 s.
  4. Realice una regresión lineal simple para obtener la pendiente y la interceptación de la línea de calibración NADH.
    NOTA: La interceptación describe la señal de fondo de fluorescencia (sin NADH presente), mientras que la pendiente corresponde a la intensidad de fluorescencia extrapolada/teórica de una solución NADH de 1 M en ese experimento en particular.
  5. Divida la pendiente de la respuesta de fluorescencia obtenida para el resto de los pozos por la pendiente de la línea de calibración NADH para convertir los cambios de fluorescencia en tasas de consumo de ATP.
  6. Trazar las tasas de consumo de ATP contra la concentración del inhibidor.
  7. Para determinar las constantes inhibitorias, utilice el software estadístico adecuado para ajustar los datos de dosis-respuesta a la siguiente ecuación cuadrática correspondiente a un modelo de equilibrio vinculante simple uno a uno:
    Equation 1
    donde Y es la tasa de consumo de ATP, Ymin es la tasa de consumo de ATP int la ausencia de inhibidor, Ymax es la tasa de consumo de ATP teórica en 100% inhibición, KI es la constante inhibitoria , [E]t y [I]t son la concentración total de la enzima (miosina) e inhibidor, respectivamente.

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Representative Results

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El mapa de diseño de placa típico utilizado para los experimentos de cribado se muestra en la Figura1. La primera y la última fila están reservadas para la calibración de NADH y el control positivo (20 m para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respectivamente. Las filas restantes (B a O) se utilizan para probar la actividad inhibitoria de los compuestos. Aquí, las diluciones seriales 1:2 de quince pasos a partir de una concentración compuesta de 10 mM en DMSO se preparan y transfieren de la placa compuesta a la placa de ensayo, de modo que la concentración compuesta final más alta es de 50 m (en 0,5% DMSO) en la placa de ensayo. Se utilizan dos filas para obtener una curva de dosis-respuesta para un compuesto (48 puntos de datos/compuesto). Tenga en cuenta que los mapas de diseño de placas se pueden rediseñar para admitir los objetivos específicos de un proyecto determinado. Por ejemplo, si el objetivo fuera obtener datos de cribado de un solo punto para un gran número de compuestos, se podrían probar 112 compuestos en una sola placa de 384 pocillos utilizando el mismo diseño para el control positivo y la calibración nadH (calculando con triplicados para cada compuesto). Siempre se recomienda tener un mínimo de 3 puntos de datos para un compuesto (o para cada concentración) y evitar el uso de sólo los pozos a lo largo de los bordes de la placa para un compuesto, ya que estos puntos de datos pueden estar influenciados por efectos de borde. Para estimar la importancia de los efectos de borde, ejecute siempre una placa completa con control negativo solo primero.

Las intensidades de fluorescencia tienen una dependencia lineal de la concentración de NADH como se muestra en la Figura 2A. La pendiente del ajuste lineal se utiliza durante el análisis de datos para convertir los cambios de fluorescencia en tasas de reacción. Tenga en cuenta que la traza de intensidad de fluorescencia en bruto obtenida para cada pozo de la calibración NADH se analiza primero por regresión lineal (un análisis similar se muestra en la Figura 2B,Cpara los datos compuestos). Se espera que estos rastros muestren una desintegración exponencial con el tiempo debido al fotoblanqueo del fluoróforo. Sin embargo, el fotoblanqueo es muy lento y, por lo tanto, los datos sin procesar pueden ser analizados por ajustes lineales. La pendiente y la interceptación de estos ajustes corresponden a la tasa inicial de fotoblanqueo y a la intensidad de la fluorescencia en t a 0 s, respectivamente. Las interceptaciones de estos ajustes lineales se utilizan en lugar de la media de las lecturas de fluorescencia en bruto en t a 0 s para construir la curva de calibración NADH porque las interceptaciones se estiman sobre la base de más datos y, por lo tanto, los errores asociados son mucho más pequeños.

La Figura 2B,C demuestra que independientemente de la miosina utilizada o la presencia del inhibidor, los cursos de tiempo son lineales en la ventana de tiempo de las mediciones. Las concentraciones de inhibidores más altas (50 m) y más bajas (0 M) aquí corresponden a una inhibición del 100% y del 0%, respectivamente. Tenga en cuenta que, debido a la cantidad de datos sin procesar, el análisis real parecería caótico si se muestra en un solo panel. Por lo tanto, estos paneles se han simplificado para visualizar mejor el proceso. El promedio de las lecturas de intensidad de fluorescencia en bruto se calculó para todos los experimentos paralelos (triplicados para cada concentración) y se convirtió en concentraciones de NADH aquí. Solo se muestran 3 concentraciones de inhibidores. En el análisis real, cada traza de intensidad de fluorescencia en bruto (48/compuesto probado) se analiza primero por regresión lineal, y posteriormente, las pendientes se convierten en tasas de consumo de ATP.

Siempre es aconsejable demostrar que las tasas de reacción cambian linealmente con la concentración de enzimas, como se muestra en la Figura 2D y la Figura2E para la miosina muscular esquelética y cardíaca II, respectivamente. Sobre la base de los ajustes lineales, la concentración final del ensayo de la enzima se puede estimar fácilmente. Por ejemplo, se recomienda una tasa de reacción de 5 x 10-8 Ms-1 para los cursos de tiempo de 30 minutos. Si se utiliza un activador en las mezclas de reacción (como actina aquí), se recomienda ejecutar los experimentos tanto en presencia como en ausencia del activador para asegurarse de que el efecto esperado (activación) está presente. Las condiciones y el procedimiento deben seguir el protocolo final lo más cerca posible. Aquí, primero se preparó una serie de dilución de miosina en tampón de miosina en ocho tubos de microcentrífuga. Posteriormente, se añadió una mezcla de enzimas LDH y PK. Finalmente, las reacciones se iniciaron añadiendo mezcla de sustrato a cada tubo en paralelo, utilizando una pipeta multicanal. Las mezclas de reacción se transfirieron inmediatamente a una fila de la placa de ensayo en triplicados. Si actin estaba ausente, se utilizó el búfer de actina en su lugar. No se ha cambiado ningún otro parámetro (véase la nota del paso 2.16 en el protocolo para las condiciones finales del ensayo).

La Figura 2F muestra las tasas de consumo de ATP obtenidas para múltiples reacciones de control negativas y positivas (media placa cada una). Estos datos se pueden comparar en función del valor Z' o "coeficiente de ventana de cribado"26,que es un parámetro estadístico ampliamente utilizado para estimar la calidad de los ensayos de alto rendimiento. Compara los controles positivos y negativos teniendo en cuenta tanto las medias como las desviaciones estándar:

Equation 2,

donde los controles estándar y positivos son las desviaciones estándar y los controles positivos, respectivamente, son los valores de n, p y n, p . Las dos poblaciones están bien separadas si el valor Z' cae entre 0,5 y 1. Una Z' a 0,78 obtenida aquí muestra que el ensayo puede considerarse como excelente26.

Para demostrar que el ensayo se puede utilizar para determinar las constantes inhibitorias, el inhibidor de la miosina de molécula pequeña blebbistatin8 y dos análogos, para-nitroblebbistatin12 y para-aminoblebbistatin13 tienen ha sido elegido aquí, como se muestra en la Figura 3A y la Figura 3B. Blebbistatin es un inhibidor de la miosina alostérica no competitivo27,28. Una molécula de blebbistatin se une a un dominio motor de la miosina y bloquea el ciclo ATPase mediante la estabilización del complejo de miosina-ADP-fosfato27,28. Por lo tanto, los efectos inhibitorios de los derivados de blebbistatin se modelaron utilizando un modelo de unión simple, uno a uno aquí (ver paso 3.7 en el protocolo). Tenga en cuenta que este modelo puede no haber sido aplicable si las tasas de consumo de ATP no habían mostrado dependencia lineal de la concentración de miosina (consulte la figura 2D,E). Se ha informado de que la solubilidad acuosa cinética de blebbistatin, para-nitroblebbistatin y para-aminoblebbistatin es de 426 m, 3,6 m y 9,3 m, respectivamente13. No se observaron anomalías en la señal en o por debajo de las solubilidades notificadas en nuestros experimentos; sin embargo, varios artefactos aparecieron cuando se utilizó blebbistatin o para-nitroblebbistatin por encima de sus valores de solubilidad reportados, como se muestra en la Figura4. Por lo tanto, la señal registrada en concentraciones superiores a la solubilidad fue excluida del análisis de datos en estos casos. Para-aminoblebbistatin es altamente soluble, y por lo tanto, la solubilidad no fue un factor limitante en ese caso.

Por último, siempre se recomienda probar si los efectos inhibitorios de cualquier golpe positivo son específicos de la enzima ATPase objetivo. El sistema de reacción acoplado emplea otras dos enzimas, LDH y PK, y la inhibición de una de ellas resultaría en una señal falsa positiva. Ejecutar el ensayo ATPase con una enzima ATPasa no relacionada puede ayudar a filtrar estos falsos golpes positivos (para más recomendaciones, ver discusión). Para-aminoblebbistatin y apyrase, una enzima hidrolizante ATP que produce ADP y fosfato inorgánico29,se utilizaron aquí como ejemplo para demostrar tal experimento de control, como se muestra en la Figura5.

Figure 1
Figura 1 : Diseño de la placa de ensayo. Se preparan las diluciones seriales 1:2 de siete pasos de NADH a partir de una concentración de 250 m y posteriormente se dispensan en la fila A en triplicado para la calibración (degradado de color negro a verde). Los últimos tres pozos de la fila A contienen solo búfer de miosina (sin control NADH, blanco). La última fila (P) se utiliza para el control positivo (20 m para-aminoblebbistatin; rojo). Un experimento de dosis-respuesta típico requiere dos filas (por ejemplo, B y C). Por lo tanto, 7 experimentos de dosis-respuesta se pueden ejecutar en paralelo en una sola placa de 384 pocillos (representada por degradados de color azul a blanco). Cada muestra se carga como triplicados. En este caso, las concentraciones compuestas finales más altas comienzan en 50 m (en 0,5% DMSO). Los últimos tres pozos de cada segunda fila están reservados para el control negativo (sin compuesto, 0.5% DMSO solamente; cian). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Datos representativos de ATPase. (A) Se preparó una serie de dilución doble de NADH y se transfirió a la primera fila de cada placa de medición. La intensidad de la fluorescencia se registró durante 30 minutos y los datos brutos fueron analizados mediante una simple regresión lineal. La interceptación de cada línea de regresión se trazaba contra la concentración de NADH. Tenga en cuenta que, en un caso ideal, la intensidad de la fluorescencia a t a 0 s podría utilizarse simplemente para obtener la línea de calibración. Sin embargo, mientras que los datos de fluorescencia en bruto son muy ruidosos, las interceptaciones dan una estimación precisa de la intensidad de la fluorescencia en t - 0 s y su error estándar asociado (mostrado como barras de error) es muy pequeño. (B,C) Se registraron trazas representativas de intensidad de fluorescencia de las reacciones esqueléticas (B) y cardiacas (C ) miosina muscular II ATPase en presencia de varios niveles (ver inserciones) de para-aminoblebbistatin. Para simplificar, los puntos de datos y las barras de error representan el promedio de tres mediciones independientes y la desviación estándar asociada, respectivamente. Se realizó una regresión lineal simple (líneas sólidas) para obtener tasas de reacción. Tenga en cuenta que un experimento de dosis-respuesta típico se compone de 15 concentraciones de inhibidores diferentes y control negativo en los triplicados en la placa de medición (ver Figura 1) y la regresión lineal se realiza individualmente para cada fluorescencia intensidad. Para simplificar, aquí solo se muestran 3 concentraciones diferentes. (D,E) Se determinaron las tasas de ATPasa basal (roja) yactivada por actina (azul) para varias concentraciones de miosina muscular (D) y cardiacas (E). Las tarifas ATPase muestran la dependencia lineal de la concentración de miosina. (F) Los controles positivos (rojo) y negativos (azul) (media placa cada uno) se ejecutaron en paralelo en una placa de ensayo de 384 pocillos y el factor Z (Z)) se calculó para evaluar la calidad del ensayo ATPase. Un valor Z' de 0,78 indica un ensayo fiable con controles positivos y negativos muy bien separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Curvas dosis-respuesta y análisis de constantes inhibitorias. Las miosinas musculares cardiacas (A) y esqueléticas (B) se utilizaron para probar la actividad inhibitoria de blebbistatin, para-aminoblebbistatin y para-nitroblebbistatin. Las tasas atola (azul) se obtuvieron aplicando regresión lineal simple a los datos de fluorescencia en bruto. Las barras de error representan el error estándar de ajuste y se utilizaron como factores de ponderación durante el ajuste de una ecuación cuadrática (véase el paso 3.7 en el protocolo) que representa un modelo de unión de equilibrio simple (rojo). Los datos obtenidos anteriormente solubilidad fueron influenciados por artefactos y excluidos del análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Artefactos relacionados con la solubilidad. (A) Los rastros de intensidad de fluorescencia de blebbistatin obtenidos en un ensayo ATPase utilizando miosina muscular esquelética II muestran una señal decreciente lineal dependiendo de la cantidad de inhibidor presente (azul). Sin embargo, cuando la blebbistatin se utilizó por encima de la solubilidad (concentración inicial de blebbistatina de 50 m), se observó un aumento en la señal (rojo), probablemente debido a la formación de cristales de blebbistatina brillantemente fluorescentes13. (B) En el caso de para-nitroblebbistatin, que es un análogo no fluorescente de blebbistatin12, los rastros de intensidad de fluorescencia en bruto parecían normales (disminuyendo). Sin embargo, el nivel más alto de inhibición fue mucho menor de lo esperado (basado en el control positivo). Por lo tanto, sólo las tasas de reacción obtenidas por debajo de la solubilidad (azul) se incluyeron en el análisis de datos. Las tasas de reacción obtenidas por encima de la solubilidad (rojo) difieren de la curva dosis-respuesta determinada (verde), ya que la precipitación limita la cantidad (concentración) del inhibidor restante en solución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Efectos inhibidores de para- aminoblebbistatin en los ensayos de miosina muscular esquelética II y ATPase apirasa. Para-aminoblebbistatin inhibió la miosina muscular esquelética II con una KI de 1,7 m, mientras que no se detectó inhibición cuando se utilizó apyrase29 como ATPase en el mismo sistema de reacción acoplado. Este experimento demuestra claramente que la paraminoblebbistatin es específica de la miosina y no inhibe la PK o la LDH, por lo que el efecto inhibitorio detectado no es un artefacto. Apyrase se utilizó a una concentración de 0,5 nM. No hubo miosina ni actina, y la reacción se realizó en un tampón que contiene 100 mM MOPS (pH a 7,0), 3 mM De CaCl2, 2 mM MgCl2, 3 mM NaN3, 1 mM de TDT y 0,1% de BSA. No se realizaron otras modificaciones en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Pasos críticos en el protocolo

Optimice el diseño de la placa ejecutando varias placas con control negativo solamente (reacción ATPase sin inhibidor). Inspeccione los resultados cuidadosamente en busca de patrones en las tasas de reacción. Por ejemplo, estos pueden surgir de efectos de borde y / o imperfecciones en el recubrimiento de superficie hidrófila de placas "no vinculantes". Si se observa un patrón, cambie el tipo de placa y/o el diseño de placa para minimizar los artefactos. Por ejemplo, una curva de dosis-respuesta típica (16 concentraciones con triplicados, 48 puntos en total) se puede organizar en tres columnas o dos filas en una placa de 384 pocillos. Estas disposiciones producen 6 y 4 puntos de datos, respectivamente, que probablemente se vean afectados por los efectos de borde. Por lo tanto, siempre se prefiere la disposición de fila.

Modificaciones y solución de problemas

Tenga en cuenta que las respuestas de fluorescencia observadas deben ser lineales durante todo el curso de tiempo de la reacción. Las no linealidades pueden ocurrir en los primeros minutos debido a cambios térmicos o en los últimos minutos debido a la consecución del equilibrio. Si existen no linealidades, se pueden ajustar los parámetros de reacción (por ejemplo, diluir la miosina, cambiar la temperatura de medición) o simplemente limitar el análisis a la parte lineal de los datos.

Las no linealidades también pueden estar presentes al principio de las reacciones si la unión del inhibidor a la enzima ATPase es lenta (que ocurre durante minutos). En este caso, se espera que la reacción se ralentice con el tiempo a medida que se acumula el complejo enzima-inhibidor. Incubar la placa de ensayo antes de añadir la mezcla de sustrato según sea necesario para evitar este problema.

Las condiciones del ensayo deben elegirse de tal manera que la parte lineal de las reacciones sea superior a 15 minutos. Las piezas lineales más cortas corresponden a puntos de datos menos útiles (<20, ya que el escaneo de toda la placa tarda 45 segundos). Por lo tanto, los ajustes lineales producen pendientes menos fiables (tasas de reacción) con errores estándar mucho más altos. Por otro lado, no se recomienda obtener lecturas cinéticas de más de 120 minutos. Tales experimentos podrían verse afectados por la desnaturalización de proteínas o cambios en la concentración debido a la evaporación del disolvente. Estos criterios se pueden cumplir más fácilmente ajustando la concentración de miosina.

Es importante asegurarse de que las reacciones catalizadas por PK y LDH no son la limitación de velocidad en el sistema de reacción acoplado. Los experimentos de control realizados sin la ATPase de interés o a altos niveles de un potente inhibidor de ATPase no mostrarían actividad (o poca). Sin embargo, la adición de ADP daría lugar a una disminución rápida de la señal si LDH y PK están activos y funcionan correctamente. Se espera que la tasa de consumo de NADH sea muy alta en este experimento de control, por lo que es crucial comenzar la detección tan pronto como sea posible después de que la reacción haya sido iniciada por la adición de ADP.

Siempre se recomienda excluir del análisis de datos cualquier tasa atPasa observada obtenida por encima de la solubilidad del inhibidor. Como la solubilidad depende de la temperatura, pureza del compuesto y diferencias en la composición de la solución, se recomienda medirla en condiciones muy similares a las condiciones reales (temperatura, tampón, etc.) que se lleva a cabo el ensayo ATPase. Intentar utilizar inhibidores de moléculas pequeñas por encima de la solubilidad puede dar lugar a precipitaciones que podrían influir en los resultados (ver Figura 4). La precipitación limita la concentración del compuesto en o cerca de la solubilidad. Por lo tanto, las tasas de ATPase no se pueden reducir aún más añadiendo más inhibidores. El uso de un buen control positivo que muestra una inhibición del 100 %, por lo tanto, puede ayudar a identificar tales anomalías en la señal, incluso si se desconoce la solubilidad. Una gran diferencia entre la tasa de reacción observada del control positivo yla tasa de reacción perteneciente al nivel máximo de inhibición (I max) determinada por el ajuste es siempre una buena indicación del problema. Excluyéndose gradualmente más y más datos del análisis y/o utilizando el control positivo comomáximo y manteniéndolo fijo durante el proceso de ajuste hasta que se obtenga un mejor ajuste en tales casos. La precipitación de los inhibidores también puede dar lugar a una fuerte dispersión de la luz y también puede cambiar las propiedades ópticas del inhibidor, lo que conduce a intensidades de señal observadas anormalmente altas al comienzo de las reacciones y/o al aumento de las señales con el tiempo. Los datos sin procesar siempre deben ser cuidadosamente inspeccionados, y las concentraciones afectadas deben excluirse del análisis.

Limitaciones del método

La concentración final del ensayo para ATPases con un número de rotación bajo (por ejemplo, miosina muscular cardíaca II) debe ser alta (varios cientos de nM) para alcanzar tasas de reacción medibles dentro del período de tiempo del ensayo (30-120 minutos). Por lo tanto, podría ser importante utilizar el modelo de unión cuadrática para el análisis de curvas dosis-respuesta. Otros modelos de encuadernación (hiperbólicos, Hill) normalmente no son adecuados para el análisis de dichos datos. Además, la concentración de la ATPase establece un límite inferior al rango de constantes inhibitorias medibles porque las curvas de respuesta a la dosis se vuelven indistinguibles en la práctica debido a la presencia de errores experimentales si la KI está cerca o menor que la concentración de la ATPase.

Las diferencias en las potencias compuestas siempre deben cuantificarse realizando experimentos de dosis-respuesta y determinando las constantes inhibitorias. Aunque los datos de cribado de un solo punto reflejan estas diferencias en teoría, la no linealidad de las respuestas, junto con el error experimental, haría extremadamente difícil realizar un análisis de este tipo. Los experimentos de cribado de un solo punto deben diseñarse para capturar incluso los inhibidores relativamente débiles con alta confianza eligiendo una concentración de inhibidores adecuada y un nivel de respuesta umbral predefinido para distinguir entre activos e inactivos Compuestos.

Establecer que las diferencias entre las constantes inhibitorias son estadísticamente significativas se realiza mejor reescribiendo la ecuación para la regresión no lineal para determinar pKI (-logKI) en lugar de KI, como pKI es normalmente distribuido, mientras que KI no es30. La incertidumbre para pKI es simétrica, mientras que no es simétrica para KI31. Los intervalos de confianza se pueden calcular para pKI y la prueba t o el análisis de varianza (ANOVA) se pueden utilizar para determinar si los medios de mediciones de pKI son significativamente diferentes. Sin embargo, se debe tener cuidado al realizar dicha prueba estadística, ya que asumen homoscedasticidad (misma varianza de datos en grupos). Uno puede esperar mayor varianza asociada con pKI cuando no se puede obtener una curva de dosis-respuesta completa debido a problemas de solubilidad compuesta. En este caso, se deben utilizar otras pruebas estadísticas apropiadas que no asuman varianzas iguales (por ejemplo, la prueba t de Welch).

Cualquier compuesto que inhiba PK o LDH daría una señal falsa positiva en el ensayo ATPase acoplado a NADH. Algunos de estos falsos positivos se pueden identificar ejecutando el ensayo con una enzima que produce ADP no relacionada. En este caso, no se puede esperar ninguna inhibición de los golpes positivos reales, a menos que el inhibidor sea una unión análoga ATP a ambas enzimas. Para demostrar este análisis, realizamos un ensayo ATPase utilizando para-aminoblebbistatin y apirasa, una enzima hidrolizante ATP no relacionada con las miosinas (ver Figura 5). Alternativamente, se puede ejecutar un ensayo funcional diferente específico de la enzima de interés, o un ensayo ATPasa diferente que no emplea PK y LDH para distinguir entre golpes positivos reales y falsos (por ejemplo, el ensayo verde de malaquita).

La medición y el análisis de la cinética de la intensidad de la fluorescencia en todos los pozos requieren un lector de placas lo suficientemente rápido como para escanear toda la placa en menos de 90 a 60 segundos.

Importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos

En oposición a la lectura "tradicional" basada en la absorbancia16,17,18,19,20, el ensayo modificado acoplado a NADH ATPase presentado aquí se basa en la fluorescencia NADH. Esto hace que el ensayo sea más sensible, permitiendo al usuario reducir la intensidad de la luz de excitación y así proteger la NADH o los inhibidores contra la descomposición fotoquímica.

Aunque el ensayo se ha considerado generalmente como no adecuado para el manejo de un gran número de muestras32, los pequeños volúmenes de reacción logrados aquí (20 l) en un formato de 384 pozos lo hacen apto para aplicaciones de cribado de rendimiento semi-alto, especialmente si se considera la determinación de constantes inhibitorias.

Los métodos alternativos suelen basarse en la detección del fosfato inorgánico producido por la enzima ATPase. Por ejemplo, la ATP se puede utilizar como sustrato para el ATPase y, posteriormente, el fosfato inorgánico liberado se puede medir en función de su radiactividad. El ensayo es sensible; sin embargo, requiere la manipulación de sustancias radiactivas y el ATP restante debe separarse del fosfato inorgánico (por ejemplo, mediante la adsorción de ATP en el carbón vegetal)33. En el ensayo verde malaquita antes mencionado, el fosfato reacciona con molibdato en condiciones ácidas y el complejo de fosfomolibdato resultante une el tinte verde malaquita causando un cambio en su espectro de absorción19,21, 22,23,24. Este método también requiere el enfriamiento de la reacción ATPase; por lo tanto, se utiliza principalmente como un ensayo de punto final, especialmente en formato de alto rendimiento. A diferencia de la monitorización continua de la reacción ATPase en el ensayo acoplado a NADH, un ensayo de punto final simplemente asume cursos de tiempo lineales y no puede revelar artefactos que conducen a no linealidades. Los compuestos que interactúan con el verde malaquita o el complejo formado también pueden conducir a artefactos21. Por otra parte, el ensayo verde malaquita es muy sensible a la contaminación por fosfato24. Por el contrario, el ensayo acoplado a NADH no es sensible a la contaminación ADP, ya que ADP (que siempre está presente en varios niveles en muestras ATP) se transforma rápidamente a ATP por PK al principio de la reacción. No hay necesidad de temple o separación de los productos. Otro ensayo fluorométrico para la medición de las tasas atalaha ha sido desarrollado mediante el acoplamiento de la hidrólisis ATP a la reacción catalizada por nucleósido fosforilasa34. Sin embargo, ese ensayo no utiliza un ciclo de regeneración ATP, por lo tanto, la determinación de las tasas de reacción inicial puede ser mucho más difícil.

Futuras aplicaciones o direcciones del método

Muchas enzimas que dependen de la actividad de ATPase se han explorado como posibles objetivos farmacológicos. Estos incluyen proteínas motoras citoesqueléticas pertenecientes a las familias de kinesina35 y dinneina36 y las helicases de ADN37,todas las cuales son los efectores terminales en diversas vías de señalización. El ensayo descrito aquí se puede optimizar fácilmente para proyectos de descubrimiento y desarrollo de fármacos que impliquen cualquier enzima que catifique una reacción en la que ADP es un producto.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

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Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas
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Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

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