Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולי עיבוד מפורטים לדימות דגימות רקמה עדינה באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM). שלוש שיטות עיבוד שונות, כלומר, האודיאתיל disilazana (HMDS) ייבוש כימי, ייבוש אוויר פשוט, וייבוש נקודה קריטית מתוארים להכנת קליפות בביצה נוקשה, עוברים בשלבים התפתחותיים מוקדם, ותרבויות פטרייתי בהתאמה.
Abstract
למרות שסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) משמשת רבות לניתוח במיוחד של דגימות ביולוגיות ולא ביולוגיות שונות, שיטות המעורבות בעיבוד דגימות ביולוגיות שונות כרוכות בשיטות ייחודיות. כל השיטות הקונבנציונליות שתוארו בספרות לעיבוד דגימות עדיין למצוא יישומים שימושיים, אבל שינויים עדינים בהכנה לדוגמה יכול לשנות את איכות התמונה, כמו גם, להציג פריטים. מכאן, באמצעות טכניקה ייחודית הכנה לדוגמה ספציפית לסוג של רקמה מנותח נדרש כדי לקבל תמונה באיכות טובה עם רזולוציה ultraקונסטרוקטיבית. המוקד של מחקר זה הוא לספק את הפרוטוקולים האופטימליים להכנת לדוגמה עבור עוברי הדמיה, קליפות בביצה נוקשה, ו פטרייתי תרבויות באמצעות SEM. המיטובים הבאים היו מומלצים להניב תוצאות טובות עבור שלושת הדגמים הביולוגיים העדינים שנחקרו. שימוש של תיקונים מתון כמו 4% פאראפורמלדהיד או 3% גלוטארלדהיד ואחריו התייבשות עם סדרת אתנול הוא הכרחי. פטרייתי תפטיר על בלוקים אגר שהתקבלו על ידי תרבויות שקופיות תשואות שלמות מבנית טובה יותר בהשוואה לתרבויות נלקח ישירות צלחות אגר. ייבוש כימי של העוברים עם HMDS מספק ייבוש מבלי להציג את המתח משטח המים בהשוואה הנקודה הקריטית ייבוש. HMDS מונע סדיקה הנגרמת על ידי הצטמקות כמו דגימות שבירות פחות במהלך הייבוש. עם זאת, עבור תרבות פטרייתיים, ייבוש נקודה קריטית מספק איכות תמונה מקובלת לעומת ייבוש כימי. קליפות בביצה ניתן לתמונה ללא שלבי הכנה מיוחדים מלבד כביסה יסודית וייבוש האוויר לפני ההרכבה. מתודולוגיות הכנה היו מתוקננת בהתבסס על איכות תמונה מקובלת שהושגו עם כל משפט.
Introduction
סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) אנליזה מבנית ותוספת הדמיה תאיים מיקרוסקופ אור ליצירת פרופיל תלת מימדי של prokaryotes, צמחים, ובעלי חיים. הרזולוציה המרחבית הגבוהה של ה-SEM הופכת אותו לאחת הטכניקות הרב-תכליתיות ורבת העוצמה ביותר הזמינות לבדיקה של מאפייני מיקרו-מבניים של דגימות בקנה מידה של מיקרומטר. דוגמאות מתייבשות נפתרות בפני מבנים טופוגרפיים ובעלי פרטים אינטנסיביים, המספקים את הבסיס לפיתוח מסקנות חוקיות בנוגע ליחסים פונקציונליים1,2,3 , ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. כאשר לפרש את התמונות SEM של דגימות ביולוגיות, זה אתגר גדול להבחין בין מבנים מקומיים ואת הפריטים שנוצרו במהלך העיבוד. SEM מופעל בדרך כלל בחללים גבוהים מאוד כדי למנוע כל התערבות של מולקולות גז המשפיעים על הראשי, משני או מפוזרים קורות אלקטרונים הנפלטים מן המדגם10,11. כמו כן, חומרים ביולוגיים רגישים לפגיעה בקרינה בשל המאפיינים הירודים או הלא-מבצעים שלהם. זה חיוני עבור דגימות שנטענו אל SEM להיות יבש לחלוטין וחופשי של כל מזהמים אורגניים כדי לסלק כל החוצה אפשרי בסביבה ואקום גבוהה10,11. כאשר דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר ממים, נדרשים טכניקות מורכבות נוספות כדי להבטיח שמבני הילידים יישמרו.
ההחלטה המתקבלת מבוססת על אופטימיזציה שיטות הכנה ספציפיים סוגי דגימה פרמטרים אינסטרומנטליים מנוצל. לכן, יש צורך להימנע משימוש בשלבי עיבוד כללית לכל סוגי הרקמות. כמה דגימות ביולוגיות ידרוש עיבוד מחמיר פחות כדי לשמר את המבנה שלהם בעוד זמן וטיפול יותר עשוי להיות צורך בסוגים עדינים של דגימות כדי למנוע את המבוא של חפצי ייבוש, כגון הצטמקות והתמוטטות. הכנה לדוגמה היא שלב קריטי בהדמיית SEM; ממצאי מחקרים מורמטרים מושפעים במידה ניכרת מהליכי הכנה לדגימה12,13. שלבי ההכנה המשותפים לדגימות ביולוגיות רבות הן קיבעון, התייבשות וציפוי במתכת כגון זהב, פלטינה או פלדיום כדי להמיר את משטחי הגוף שלהם כדי להיות מוליך לניתוח SEM. האופי והשילוב של השלבים המשמשים ישתנה בהתאם לסוג הרקמה, ולמטרות הספציפיות של המחקר. חיוב הצטברות, רגישות לואקום ולנזק קרן אלקטרוני להוות בעיות בעת עיבוד דגימות ביולוגיות עדין רך, המחייב שלבי עיבוד נוספים כדי לשמור על מבנה מקורי של האובייקט. באמצעות שיטות קונבנציונליות כגון אוסמיום tetroxide תיקון, והתייבשות לגרום הצטמקות ואת התמוטטות של רקמות עדינות14,15,16,17. מטרת המחקר היא להקים מתודולוגיות אלגנטיות הנגזרות משילוב רעיונות ממחקרים קודמים עם שינויים להכנה ותמונה של רקמות עדינות רכות (למשל, עוברי זוחלים, קליפת ביצה של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי).
בחירת שיטת תיקון מתאימה היא הצעד החשוב ביותר לניתוח מיקרוסקופי של דגימות ביולוגיות. תיקון הרקמות מיד לאחר בידוד מאורגניזם הוא חיוני כדי למנוע שינוי במבנה שלהם בשל התפרקות. קבע יעילה צריך לסיים תהליכים סלולריים על ידי הסטת התאים במהירות ושמירה על האפקט באופן הפיך כדי לייצב את מבנה המדגם כדי לעמוד בשני שלבי העיבוד הבאים ובדיקה תחת SEM17 , 18. למרות מספר שיטות הקיבעון הכימי והפיזי ידועים, קיבעון כימי הוא נפוץ יותר עבור דגימות ביולוגיות כדי למנוע כל שינוי הסלולר עקב אוטוליזיס, ריקבון, והשפעות ייבוש. קיימות ניסוחים כימיים מרובים קבע שנדונו בספרות17,19,20,21,22,23, תיקונים שפועלים על ידי מדהרפתקאות ו קרו קרוש ביולוגית, ואלה שפותרים על ידי הקרו מקושרת באמצעות החוצה. האלכוהול משמשים לטיפול במיקרוסקופיה ששמרו על מבנה האולטרסאונד בצורה מאוד גרועה ומשמשים בעיקר למיקרוסקופ אור ולא מומלץ לניתוח אלקטרון מיקרוסקופי. הקושרות בין התיקונים האחרים כמו פורמלדהיד, גלוטרלדהיד ואוסמיום tetroxide יוצרים מחתך מולקולרי ומולקולרי בין הקרו בתוך הרקמות, ומספקים שימור מצוין של מבנים אולטרה-מימריים11 ,24,25,26. דגימות ביולוגיות רגישות לטמפרטורה. הטמפרטורה בתחילת קיבעון מומלץ להיות 4 ° צ' כדי להפחית את הניידות לרוחב של חלבונים ממברנה, כדי להאט את הדיפוזיה של מולקולות התרבות, ולהאט את שיעור הקיבעון11. הזמן הנדרש לתיקון רקמות תלוי במידה רבה בגודל של המדגם ואת המהירות שבה הקיבעון מפזרת ומגיב עם המרכיבים של הדגימה. קיבעון לילה ב 4% פאראפורמלדהיד או 3% גלוטאלדהיד ב-PBS ב-4 ° c היא השיטה המועדפת עבור ניתוח SEM של דגימות המשמשות במחקר זה עבור מאפייני החדירה הרציפה שלהם, אשר מאפשרים דגימות עדינות קטנות יותר לעיבוד17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , 27. צעד לאחר קיבוע עם אוסמיום tetroxide מסולק לא רק בשל טבעו הרעיל אלא גם מצא ליישם שום יתרון נוסף כדי לשפר את איכות התמונה עבור דגימות שנותחו במחקר זה.
דגימות ביולוגיות מכילות נוזלים המפריעים לפעולת SEM; מכאן, הדגימות צריך להתייבש לפני הכנסתו לתא לדוגמה SEM. לאחר התייבשות מובטחת, את הממס יש להסיר מן הרקמה מבלי ליצור ממצאים לתוך הדגימות בשל מתח פני השטח/ייבוש. שלוש שיטות ייבוש שונות היו בשימוש נפוץ במהלך רקמות עיבוד עבור הדמיה SEM: ייבוש האוויר, במצב קריטי ייבוש, ו להקפיא הקפאה דגימות28,29,30,31. מחקרים מעטים מדווחים על שלוש שיטות הייבוש המייצרות תוצאות זהות עם דגימות רקמה בעלי חיים28,29,30,31. תרגול כללי המשמש לדגימות קטנות יותר הן התייבשות כימית על-ידי סדרת הריכוז העולה של אלכוהול ו-הבוחנים (HMDS), אך דגימות גדולות יותר מיובשות באמצעות מכשיר לייבוש בנקודה קריטית (CPD)32. בתהליך הייבוש, כוחות ניכרים הנוצרים בחללים קטנים העוברים דרך הדגימה באמצעות ממשק נוזלי/גז; זה יכול אפילו לגרום לקריסה מלאה של המבנים חלול33. כל דפורמציה המתרחשים בשל הטיפול יכול להיות טועה כתכונה מבנית יליד של הדגימה. לפיכך, התופעה הוכללת לעיבוד יש לסלק ותהליך ייבוש ייחודי צריך להיות מתוקננת עבור כל סוג של רקמה במיוחד כאשר דגימות רקמה עדינה מנותח.
בכמה מבחנים שנערכו באמצעות שילוב שונים של כל התהליכים הנ ל, אנו מתוקננת את השיטות שניתן להשתמש בהן עבור ניתוח SEM של שלוש רקמות עדינות: עוברי זוחלים, קליפות בביצים של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי. ביולוגים ומורפוללוגים התפתחותיים מתארים מורפולגנזה נורמלית ובלתי נורמלית במהלך התפתחות העובר בבעלי חוליות מייצגים. חקירות על המסלולים גנטי איתות תלוי בתיאור מורפולוגית של מבנים חדשניים. כדי למנוע כל שינוי פתאומי במבנה העובר בעלי חוליות במהלך ניתוח SEM, אנו ממליצים על ייבוש כימי בעקבות התייבשות. ייבוש כימי באמצעות HMDS היא שיטת הייבוש החדשה יחסית והיתרונות כוללים מהירות יחסית, קלות שימוש, אובדן עלות, ואת המומחיות מוגבלת וציוד צריך9. CPD היא טכניקת ייבוש בשימוש נפוץ באמצעות passaging CO2 על פני הדגימות בטמפרטורה מסוימת ולחץ. זיהינו כי HMDS מתאים לייבוש רקמות עדינות רכות ומאפשר דגימות גדולות יותר להיות מעובד בהשוואה נקודה קריטית ייבוש, אשר גרם דפורמציה נרחבת רקמות עובריים. מספר שיטות שימשו כדי להכין דגימות עבור הדמיה SEM כדי ללמוד את המאפיינים מורפולוגיים של פטריות34. דגימות פטרייתי הם בדרך כלל קבוע ב אוסמיום tetroxide ואחריו התייבשות אתנול ובנקודה קריטית ייבוש, אשר עשוי לספק תוצאות משביעות רצון, למרות ההשפעות הרעילות של אוסמיום tetroxide6,7,35 ולאבד חומרים פטרייתיים תוך שינוי פתרונות במהלך העיבוד מבטאים חסרונות. טכניקת ההכנה לדוגמה באמצעות ייבוש האוויר ללא קיבעון היתה גם התאמן36 אבל התוצאות של מבנים צומק ו התמוטט, ותצפית של דגימות כאלה יכול בקלות להיות מפורש בזמן אפיון המינים. Hypha פטרייתי מאבד את שלמות במגע עם נוזלים ואף ייבוש לא ניתן להשיג כדי לשחזר את המבנה. בשל השפעה זו, ייבוש ההקפאה משמש בדרך כלל לייבוש רקמות רכות כמו פטריות מיצליום. ייבוש ההקפאה עובד היטב חומרים נקיים, אבל הנוכחות של מלחים או הפרשה יהיה לטשטש פרטי השטח כי יזוהו רק בשלב הצפייה SEM. אנו מצמידים את שיטת תרבות השקופיות עם תיקון glutarאלדהיד ואת הנקודה הקריטית ייבוש כדי להניב פרטים מבניים של מיקוף פטרייתי שלמים ונבגים. למרות CPD ייבוש הצטמקות העוברים, זה הביא גם מבנים mycelial היטב כאשר ביחד עם קיבעון גלוטרלדהיד. קליפת המעטפת היא בעלת חשיבות עיקרית לעובר בעלי חיים בלתי-מכניים על-ידי הפעלת כיסוי הגנתי, אלא גם מתן יציבות מכנית, חדירות לגז ומים, ושמורת סידן לעובר המתפתח. כדורי הביצה של צב המים המתוקים מסווגים כ"קשיחים" המבוססים על המבנה שלהם, ובגלל זמינותם קיבלו תשומת לב משמעותית מהביולוגים1,2,3,4 , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , 37 , 38.
אנו לפרט שיטות פשוטות לבדיקה קלה של קרום קליפת הקליפה של צב צבוע שניתן להחיל על כל מיני ביצה נוקשה. מתודולוגיות הכנה הוערכו על בסיס איכות התמונה וכתוצאה מכך מופחתת חפצים פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הצב הצבוע (כריסמייס פיקטה) ביצים המשמשות במחקר זה נאספו במהלך עונת הקינון של מאי עד יוני 2015-16 מתחנת השדה של רייס קריק, oswego ניו יורק עם אישור המתקבל מהמחלקה הממלכתית של ניו יורק לסביבה שימור (DEC).
1. שיטת ייבוש כימית לעיבוד עוברים עבור SEM
- לאסוף ביצי צב מאתרי שדה במהלך עונת הקינון. הכינו את תאי הדגירה מראש, עשוי קופסאות פלסטיק עם מכסים (L x W x H) 6.7 ס"מ x 25.4 ס"מ x 10.2 ס"מ מלא בינוני מצעים מוכן עם תערובת לח של ורמיקוליט ו כבול איזוב (1:1 יחס). לעשות 4-6 חורים של כ 0.25 ס מ לאורך הצדדים של תיבות ועל המכסה כדי לאפשר האנטנה.
- להסיר בעדינות את האדמה מן הקן כדי לחשוף את הביצים. נגב את פני השטח של ביצי צב עם תמיסת יוד מדולל (1:25000) כדי לשלוט זיהום חיידקים במהלך הדגירה. מניחים את מצמד נפרד אחד מהשני, גודל המצמד של צב צבוע עשוי להשתנות מ 5-9 ביצים ומקום מקסימום של 8-9 ביצים לכל קופסא.
הערה: בזהירות לטפל בביצים במהלך איסוף, ניגוב, תיוג והצבת בתוך תיבות. מיקום ויישור של ביצים צריך להיות כמו שהם הונחו, כל תנועה לעכב התפתחות העובר. - לקבור באופן ידני את הביצים חצי במצעים, לכסות ולמקם את התיבה בתוך החממה להגדיר 30 ° c. דגירה הביצים עבור 10-17 ימים כדי להשיג את שלבים עובריים 12, 13, ו 18 בהתאמה בשימוש במחקר זה. הוסף מים מזוקקים כדי להרטיב חלקית את בינונית המצעים בכל יום אחר כדי למנוע התייבשות ולשמור על רמת הלחות להתפתחות נורמלית של העוברים.
הערה: דגירה והעוברים הזמני הם על פי שולחן התפתחותי מלא שפורסם מוקדם יותר39. - לתקן את העוברים על ידי ביצוע החתך הראשון בצד אחד של קרום קליפת הראש ואת החלמון ביחד, אנכית לציר ארוך באמצעות מספריים מחודדים. הכנס את המספריים לתוך החלמון בזהירות כדי להימנע מגזירת הדיסק העובריים. עכשיו חותכים את הצד הצדדי של הביצה לאורך הציר הארוך ולאחר מכן חותכים את הצד השני של הביצה לאורך הציר הקצר.
- לקלף לפתוח את הקטע מתוך העובר עם הצד בתוך למעלה באמצעות מלקחיים. חותכים את הצד הצדדי השני של קליפת הבית ומניחים את פיסת מגורש לתוך מלוחים באגירה פוספט (PBS ב-pH של 7.4).
הערה: ביצת הצב מלאה בחלמון ביצה מאוד צמיגי והצד השני של העובר דבק בקרום קליפת הביצה. הקרום הקליפת ביצה ליד העובר משתנה עם הדגירה מלבן שקוף לאטום, לבן גיר. הדבר מאפשר לאתר את העובר במרכז הציר הארוך ולהיראות כמקום מסויד כהה מבחוץ40,41. - השתמש stereomicroscope כדי לבודד את העוברים יחד עם קרום החלמון על ידי קילוף אותם מן קליפת הבית באמצעות מלקחיים. הסרת קרומים מתחלקים במיוחד באמצעות מלקחיים ומיקרו-מספריים. להעביר את העובר באמצעות כפית העובר כדי PBS טרי בצלחת פטרי כדי לשטוף כל דם או חלמון.
- השתמש בניקוי לוחות 12-טוב כדי לתקן את העוברים לילה ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS ב-4 ° צ' או ב 2-3% גלוטארלדהיד ב-PBS. מניחים אחד עד שלושה עוברים בכל טוב בהתאם לגודל של העוברים. להבטיח חדירה מלאה (דגימות יופיע לבן) עבור עוברים מבוגרים על ידי הרחבת זמן הקיבעון עבור 2-3 ימים. לשטוף את העוברים 3x עם PBS טרי עבור 5 דקות כל שטיפה.
הערה: הימנע מפגיעה במשטח של העובר באמצעות מוסיף פוליסטירן עם שבחרת שינוי פוליאסטר עבור הצלחות 12-היטב כדי להעביר דגימות מממס אחד למשנהו. - מייבשים דגימות באמצעות סדרה של ריכוז אתנול במים מזוקקים: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, ו 100% ולטפל דגימות עבור 1 h בכל פתרון התייבשות. חזור על השלב עם 100% אתנול פעמיים כדי להבטיח התייבשות מלאה. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, לאחסן דגימות ב-70% אתנול ב-20 ° צ' לתקופה ארוכה יותר.
- עוברים יבשים באמצעות סדרה של h, הבוחנים (HMDS) כדי 100% הריכוז של אתנול: 1:2, 2:1 ו 100%. השאר את הדגימות בכל פתרון במשך 20 דקות והשאר את קערת פטרי מכוסה חלקית במהלך התהליך.
הערה: בצע את כל השלבים הכרוכים ב-HMDS בתוך מכסה המנוע עם ציוד הגנה אישי הכרחי כמו HMDS הוא רעיל מאוד. - השאירו את העוברים בגמר 100% HMDS הפתרון מכוסה לחלוטין או בחלקו בתוך מכסה המנוע לילה לסייע אידוי של HMDS, השארת דגימות מוכן להרכבה ציפוי מכסה. מכסים את הצלחת כדי לחסל את האבק מתיישב על הדגימות.
הערה: הרקמה תיראה לבנה לאחר ייבוש ודגימות מיובשות חלקית ייראו צהובים בצבע, להשאיר את הרקמות האלה בתוך המנוע במשך זמן ארוך יותר. - לבחור את הגודל של האלומיניום והדבק דבק פחמן בכל גודל של המדגם ניתח. הר את הדגימות מיובשות בקפידה על stub אלומיניום סטנדרטי (12.7 מ"מ x 8 מ"מ) באמצעות הצמד מקל פחמן מוליך (12 מ"מ).
- להחדיר דגימות רכוב לתוך החדר של הקואטר מאטר להרכיב את הדגימה עם סרט דק מאוד של זהב כדי לחסל את אפקט הטעינה. לוחית זהב את הדגימות עבור 60-120 s ב 35 mA sputter.
- הר הספחים כדי הנקבוביות המתאימות-צלחות על ידי לחיזוק מאובטח של setscrews. העבר את מחזיק המדגם אל חדר המדגם של SEM באמצעות כלי החליפין לדוגמה. תמונה דגימות במצב ואקום גבוה עם מתח קרן מואץ של 10 kV ו פליטה הנוכחי 10 μA.
הערה: תמיד לובשים כפפות תוך כדי טיפול בדגימות, מחזיקי מדגם, ספחי הרכבה וכלי העברה כדי למנוע זיהום משומן מהידיים למערכת SEM. - בדיקת טכניקות חלופיות המפורטות להלן כדי להשוות את הרזולוציה של דגימות שהתקבלו מהליך לעיל.
- כלול קיבעון עם 1% אוסמיום tetroxide עבור 1 h בטמפרטורת החדר לאחר שלב 1.7.
- באופן חלקי או לחלוטין להסיר את HMDS בשלב 1.10 עבור אידוי מהיר במהירות של HMDS.
- עוברים תהליך לאחר שלב 1.8 באמצעות ייבוש נקודה קריטית (CPD) על-ידי ביצוע הצעדים הבאים 3.3-3.4.
2. הכנת קליפת ביצה עבור SEM באמצעות שיטת ייבוש אוויר
- לאסוף ולצבוע את הצב הנצבע (כריסמייס פיקטה) ביצים לתקן את העוברים כפי שצוין בשלבים 1.1-1.7.
- שמור קליפות בביצה במים מזוקקים לאחר קיבוע העובר בשלב 2.1. נקו את קליפות הביצה ביסודיות על ידי השרעות במים מזוקקים לפחות 1 h לסילוק חלמון וזיהום אלבומין.
- כדורי בביצה יבשים לאחר שטיפת מגבונים עדינים באוויר בלילה. לאחסן קליפות בביצים מיובשות בבקבוקים הדגימה נקי המסומנים על ידי מספר והבמה.
- הר, מעיל ודימוי הדגימות על ידי ביצוע הצעדים המפורטים בשלבים 1.11-1.13.
3. שיטת ייבוש נקודה קריטית להכנת תרביות פטרייתי ל-SEM
- הקמת תרביות שקופיות
- הכנת דקסטרוז אגר תפוחי אדמה (PDA) מדיה עבור תרבויות פטרייתי: להוסיף 39 g של כוח PDA ב 1 L של מים מזוקקים בבקבוקון Erlenmeyer אייר. מערבבים היטב על ידי מתערבל את הבקבוקון ואת התקשורת בשעה 121 ° c עבור 30 דקות. אפשר לפתרון המדיה להתקרר ולאחר מכן להוסיף את כלורמפנול אנטיביוטי (25 μg/mL) באמצעות מיקרופיפטה סטרילית.
הערה: לאחר עיקור, פתרון אגר צריך להיות חם וזה לא יהיה לחזק בקרוב. מגניב זה מספיק כדי שלא להפעיל את האנטיביוטיקה. - מערבבים את זה על ידי מתערבל ויוצקים לוחות (כ 10-12 מ ל של מדיה עבור כל 10 ס מ צלחת פטרי), בזהירות לערום ולתת לגבש.
- השתמש להב אזמל סטרילי לגזור בלוקים קטנים של אגר על 1/2 כדי 3/4 של סנטימטר. מסירים ומניחים בלוק אגר על שקופית זכוכית נקייה מיקרוסקופ.
- מניחים את השקופית בצלחת פטרי נקיה כדי למנוע זיהום ולשמר לחות במהלך הדגירה.
- הרם את השקופית מהחלק התחתון של צלחת פטרי באמצעות קיסם סטרילי ליצור מתח פני השטח בין הצלחת לבין השקופית כדי להסיר את שקופית הזכוכית מבלי לשבש את הצמיחה העדינה לאחר הדגירה.
- השתמש לולאה סטרילית או מחט להעביר חלק מן הפטריות מן הדגימה של כל אחד מארבעת הצדדים של גוש אגר בשקופית.
- מניחים שמיכות נקי על פני השטח של בלוק אגר לאחר החיסון. הוסיפו כמה טיפות של מים מזוקקים סטריליים לצלחת פטרי סביב השקופית כדי להבטיח לחות לפטריות ההולכות וגדלות.
- לאטום את הצלחת באופן חלקי באמצעות סרט פרפין ו מודקת את הצלחת ב 30 ° c למשך זמן מתאים (עבור המינים Fusarium מינים עבור 36 כדי 48 h).
- להסיר את השקופית מצלחת פטרי ולהפריד את מחליק בחוזקה מחסום אגר באמצעות מלקחיים סטרילי. לתקן את בלוקים אגר ב 3% גלוטאלדהיד ב PBS לילה ב 4 ° c.
- הכנת דקסטרוז אגר תפוחי אדמה (PDA) מדיה עבור תרבויות פטרייתי: להוסיף 39 g של כוח PDA ב 1 L של מים מזוקקים בבקבוקון Erlenmeyer אייר. מערבבים היטב על ידי מתערבל את הבקבוקון ואת התקשורת בשעה 121 ° c עבור 30 דקות. אפשר לפתרון המדיה להתקרר ולאחר מכן להוסיף את כלורמפנול אנטיביוטי (25 μg/mL) באמצעות מיקרופיפטה סטרילית.
- מייבשים את הדגימות על ידי עובר בסדרת אתנול: 10%, 25%, 50%, 75% ו 90% עם 15 דקות לכל שינוי. לעבד את דגימות עבור התייבשות סופית עם שני שינויים ב 100% אתנול לאורך 30 דקות כל אחד כדי להבטיח רוויה מלאה.
- ליבוש נקודה קריטית: המקום דגימות מיובשות בחדר של מנגנון CPD. לאטום את החדר על ידי פתיחת השסתומים כדי לאפשר שיתוף הנוזל2 ב ו האתנול החוצה, עד הנוזל שיתוף2 לחלוטין ממלא את החדר.
- לאטום ולחמם את התא לאט כדי להשיג נקודה קריטית כאשר הלחץ התאי עולה 1000 psi והטמפרטורה עולה על 31 ° c, הנוזל ואת השלב גז של CO2 הוא בשיווי משקל. באיטיות לנקז את CO2 מן החדר ואת המדגם כמו גז כדי למנוע השפעות של מתח פני השטח.
- בצע הרכבה, ציפוי זהב והדמיה של דגימות על-ידי ביצוע השלבים המפורטים בשלבים 1.11-1.13.
- לבצע ניתוח השוואתי על ידי ייבוש כימית הדגימות משלב 3.2 באמצעות HMDS באמצעות השלבים הבאים 1.9-1.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 הצג סריקת מיקרוגרפיה אלקטרונית של צב צבוע (כריסמייס picta) עוברים. ביצי צב צבוע שנאספו ומודחים על מצעים בינונית, רכוב על האלומיניום לאחר ייבוש כימיים שימשו הדמיה SEM (איור 1א-ה). מבט לרוחב של העובר שלב 12 מראה את מבנים הגולגולת; הגדולה הלסת התחתונה משתרע מעבר ללסת ומגביל בור מסומן היטב מדיום האף; חמש קשתות הלוע נצפו גם (איור 1F). החדש נוצר somites באזור הזנב האחורי של העובר הם בקלות קבוצה בת לעומת מקוטעת הגוף מקוטע. ניצנים forelimb מופיעים זמן רב יותר לעומת ניצנים הגפיים האחוריות ונקודות יותר מיותר מאשר ventrally. מוגדר היטב התרחבות של רכס שריון הוא ראה לאורך האזור כולו אגף בין הגפיים של העובר שלב 15 (איור 1G. בשלב 18, לצבים צבועים יש חוטם קצר, מקרין באצילות. המקור התחתון נח בתוך הלסת העליונה והוא מואר מעט עם קרס מסוף הנכנס לחריץ המרכזי של המקור העליון (איור 1H). הלסת העליונה של הצבים המצוירים מראה מראה לא מבוקר, היוצר מעין בצורת U-V האמצעי עם קצה קטן בכל צד, שן ביצה זעירה מתחילה להיווצר בקצה הלסת העליונה. ניצנים איבר שהופיעו יותר במהלך השלבים המוקדמים ביותר טופס מבנה כמו מחבט במהלך שלבים 13-14 עם הלוח הדיגיטלי במעורפל המצוין. לאורך השוליים האחוריים (איור 1I-J) ממוקם ברכס העור האפופי.
איור 2 מציג אנליזה מבנית במיוחד של כריסמייס פיקטה קליפת ביצה וממברנה פגז באמצעות הדמיה SEM. קליפות בביצים של צב צבוע הושגו כמתואר לעיל, היו חשופים לייבוש אוויר לאחר הכביסה עם מים מזוקקים כפולים (איור 2א, ב). קליפות בביצה רכוב על ספחי אלומיניום עם נייר דו צדדי פחמן (איור 2ג) היו תמונות באמצעות SEM. מבט לרוחב של המעטפת הראה שכבת קליפת ביצה חיצונית הצמדת בחוזקה את קרום פגז filamentous הפנימי (איור 2ד). המשטח החיצוני של קליפת הקליפה מורכב היטב מואמים יחידות פגז מינרליזציה, עשוי גושים כדורית/כדורי מסודרים בקבוצות בין יחידות מעטפת סמוכים ריכוז של שקעים מעוגלים קטנים או נקבוביות בגדלים שונים היו נצפו (איור 2E). גושים מכל קבוצה של יחידות מעטפת נפגשים בצומת חיבור, נקודת המרכז (איור 2F). המשטח החיצוני היה קלוף באופן ידני באמצעות מלקחיים כדי להתבונן על פני השטח של קרום המעטפת. שורות של שלטים מרכזיים נראו אשר מספקת את נקודת ההחזקה בין יחידות המעטפת לבין קרום סיבי רב שכבתי בבסיס (איור 2G).
איור 3 מראה את האפיון מורפולוגית של בידוד פטרייתי ascomycete מתרבויות שקופיות נצפתה באמצעות הדמיה SEM. ערכת הגדרת תרבות שקופיות שהוקמה (איור 3א) מראה גידול פטרייתי על גוש אגר בתוך יומיים של חיסון. מושבות גדל במהירות עם לבן כדי קרם בצבע אוויר תפטיר (איור 3ב). SEM הדמיה בעקבות לייבש נקודה קריטית ציפוי מוחלטת של פרוסות אגר חשף hyphae מעוקל מחט, אורז כמו נבגים. הקונדיפלהורדים נראו כתוצאה מהרחפת מהמחיצה האווירית (איור 3ג). מקרופדיה המיוצר על קצר, con, הסתעפות מעוגל בינוני, עם קצר, בוטה התאים הבזליים בתאי בסיס בעיקר septate (איור 3ד).
איור 4 מציג את התוצאות השוואתיות לעיבוד דגימות דומות באמצעות טכניקות חלופיות. מתשרים ראשי של שלב 15 עוברים ב-HMDS וייבוש על ידי אידוי הדרגתית להראות מבנים הגולגולת שהשתמרו היטב, כמעט לא הצטמקות או עיוות הוא ראה עם זמנים מורחבים של התאיידות איטית מ HMDS (איור 4א). עוברים לאחר קבוע עם אוסמיום tetroxide הראה שום הבדל באיכות התמונה מלבד הצטמקות קלה של רקמות בהשוואה לעיבוד איטי hmds (איור 4B). העוברים ייבוש על ידי הסרת hmds חלקית או לחלוטין מאפשר אידוי מהיר תוצאות עיוות מבניים הצטמקות (איור 4ג), בעוד התאיידות איטית נפתרה מבנים משטח מעולה של העובר ביים דומה ( איור 4 A). הממצאים שבייבוש נראו בעוברים שטופלו בטכניקת cpd הגורמת להתכווצות והריסה נרחבת של רקמות (איור 4ד, ה). פרוסות אגר מתרבויות שקופיות מציגות ייבוש לא מושלם של בידוד פטרייתי עם טיפול HMDS לעומת CPD (איור F). ייבוש השלם מושגת עם טיפול CPD של הפרוסות אגר עם מיובש היטב, הדגימה הלבנה מראה ללא שינוי תכונות מבניות ברזולוציה גבוהה של פטריות ונבגים (איור 4g-g). בלוקים אגר עם תרבויות פטרייתי מופיעים צומק וצהוב בצבע מה שהופך אותם לא מתאים הדמיה SEM (איור 4h-h).
איור 1 : סריקת מיקרוגרפים אלקטרונים של כריסמייס פיטה עוברים שהוכנו על ידי ייבוש כימי. (א) כריסמניס פיקטה, קינון במהלך עונת הרבייה בתחנת השדה רייס קריק, אוסוויגו, NY. (ב) קן בנוי היטב מבחוץ. (ג) אדמה פני השטח הוסר עם טיפול לחשיפה הביצים הניח. (ד) ביצים שהונחו לתוך חדר הדגירה עם מצעים בינוניים. (ה) עובר העוברים אל ספחי אלומיניום בעקבות ייבוש כימי, E4 מראה את העבר מצופה התיז אטר. (ו) לרוחב של העובר שלב 12 מראה מבני הפנים, הגפיים ניצנים ו מסוענים. (G) הגדרה היטב הרכס שריון ו משוט בצורת ניצנים נראים בשלב 15. (ח) מבנים של ראש הגולגולת בשלב 18 העובר מראה הלסת העליונה והתחתונה, הערה שן ביצה קטנה נוצר בקצה המקור העליון. (I) מראה מימין forelimb בשלב 13-14 והשקפה מקרוב של AER (J) בגבול הגייתי. סרגלי קנה מידה: F-H, 500 μm; I, 100 μm, ו-J, 10 μm. מפתחות: מגה בייט, אמצע המוח; np, בור האף; mxp, מקסימום הלסת העליונה; אבא, קשתות הלוע; h, לב; חליל, forelimb; s, somite; הגפיים האחוריות; t, קצה הזנב; cr, הרכס carapacial; et, שיני ביצה; oc, חלל אוראלי;. , לסת תחתונה; , מ, מסכילי, AER. הרכס האפטואני העורי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : ניתוח בדיקת אולטרה מבנית של ביצה מיובשים וקרום פגז של ביצי צב צבוע. (א) לאחר תיקון העוברים, שטפו קליפות הביצה במים מזוקקים להסרת חלמון ואלבומין. (ב) התייבשו במהלך הלילה לפחות בקליפות בביצים נקיות. (ג) הרכבה של קליפת ביצה על ספחי אלומיניום. (ד) השקפה מוקדית של רסיס פגז המראה שכבה חיצונית וקרום המעטפת הפנימית. (ה) השכבה החיצונית cal, מראה יחידות מעטפת כדורית (su) מסודרים קבוצות ונקבוביות לראות בין יחידות אלה (כוכביות). (F) תצוגה מוגדלת של גולה המציגה את נקודת המרכז (c) בין יחידות המעטפת. (G) הסרת שכבת cal, מראה את המשטח החיצוני של קרום המעטפת עם שקעים שמאל שבור מיחידות פגז. סרגלי קנה מידה: E, 100 μm; F, 10 μm, ו-G, 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : הכנת תרבות פטרייתיים עבור הדמיה SEM. (א) דיאגרמת סכמטית להצגת הכיוונון של תרבות השקופיות. (ב) מושבות פטרייתי בצבע לבן לראות על הבלוק אגר לאחר יומיים של דגירה ב 30 ° c. (ג) SEM תמונה המציגה קטע של תפטיר של fusarium solani, כוכביות שחור לסמן את המקמחט ב sporodochia, חץ הצבעה על phialide, ראשי חץ המכוונים לכיוון מיקרומחט, סרגל בקנה מידה, 10 μm. (ד) תמונה מוגדלת של septate chlamydospores, סרגל בקנה מידה 5 μm. מפתחות: ab, בלוק אגר; cs, coverslip; f, פטרייתי תרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : ניתוח השוואתי של טכניקות חלופיות לעיבוד דגימות דומות. (א) השקפה פרונטלית של ראש צב צבוע מיובש עם אידוי איטי של hmds (א), אחרי שלאחר תיקון עם אוסמיום tetroxide (ב), אידוי מהר מהיר של hmds (ג), ו cpd (D-E). כולל צעד פוסט קיבוע באמצעות אוסמיום tetroxide לא מראים שום הבדל גלוי באיכות התמונה לעומת הטיפול hmds ללא שלאחר קיבוע. דפורמציות נראים לאחר אידוי מהיר של HMDS, בעוד ייבוש הדרגתי עם אידוי איטי מספק מבנה טוב יותר משטח. דרגות שונות של הצטמקות ומבנים מכווצים נראים באזורים של המוח, העיניים וprominences הפנים בעוברים שטופלו CPD. (F) הרכבה של תרבויות שקופיות מעובד עם hmds (1), cpd (2) ו-cpd מצופה הדגימה המטופלת (3) על אלומיניום. (G-G) ייבוש מלאה לראות כמו לבנים בצבע לבן שלמים של הפרוסה עם החיסון פטרייתי מושגת על ידי CPD שמירה על מבנים של מיצליום ונבגים של Fusarium solani. (H-H) ייבוש לקוי של תרבות שקופית, הצטמקות ושלמות מבנית פגום לראות עם טכניקת השימור HMDS. סרגלי קנה מידה: A-E, 500 μm; G-H, 2 מ"מ, ו-G'-H, 20 μm. מפתחות: et, שן ביצה; אלוף, חלל אוראלי; e, עין; uj, הלסת העליונה; אל. ג'יי, לסת תחתונה כוכביות שחורות, מקרומחט ב sporodochia; חץ, פיצלידה; וראשי חץ, מיקרומחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בחדר העבודה שלנו, סוכני קיבעון שונים, התייבשות ושיטות ייבוש נבדקו כדי להכין שלוש דגימות ביולוגיות עדין שונות עבור הדמיה SEM: עוברים, קליפות בביצה, ופטריות בתרבויות. SEM משמש בדרך כלל עבור ניתוח פני השטח, כך חדירה מתוקנת היא פחות בנוגע, אבל זה חייב להיות מובן כי מבנים פנימיים קבוע לקוי יגרום כיווץ פנימה או/והתמוטט מבנים פני השטח. זמן קיבעון מורחב צריך גם להיחשב עבור דגימות רקמה גדולה יותר, החלפת הפתרון קבע כמה פעמים בהתאם למשך הקיבעון. בשל האינטראקציה האקטיבית בין הקיבעון לרקמה, התכונות האוסמוטי של תאים ישתנו במידה ניכרת. נוזלי הרקמה יהיה לדלל את הקבע ולכן אפקט אלדהיד התורמת האוסמאליות הכללית ניתן לזנוח ככל ההשפעות על נפח התאים מודאגים. גם, פורמלדהיד היה לחדור מהר יותר לתוך רקמות יעיל יותר כמו צולבות מקשר לעומת glutarאלדהיד. תערובת פורמלדהיד באגירה-גלוטרלדהיד דווחה גם לתיקון מגוון רחב של רקמות, אם כי עבור monolayers והשעיות תאים מדולל הפתרונות היו מתאימים יותר לתיקון15,16. עם זאת, את הפתרונות מדולל הם גם hypertonic ולכן אלהידס הם לא עצמם osmotically פעיל. עבור דגימות עדינות המשמשות במחקר זה, PBS ב-pH 7.4 שימש כרכב עבור סוכני תיקון, כמו מאגרי פוספט נחשבים דומים יותר לסביבות cytoplasmic של דגימות ביולוגיות ביותר. יתר על כן, האוסמלקיים מזוהה להיות בתוך הטווח הפיזיולוגי הנדרש עבור המדגם בעוד PBS מתנהג כרכב עבור סוכן התיקון. פוסט קיבעון עם אוסמיום tetroxide מומלץ לעתים קרובות עבור דגימות ביולוגיות שונות16,22,42 אבל כבר סולק עבור כל הדגימות הביולוגי המשמש במחקר זה. דוגמאות ללא אוסממיום tetroxide הניבו תמונות חדות ודגימות שתוקנו באוסממיום tetroxide הניבו תוצאות ברורים (איור 4א). אוסמיום tetroxide גורם עיוות של מבנים רקמת העלה ותשואות שימור הדגימה עניים לעומת glutarאלדהיד ותערובת פורמלדהיד43, וזה כבר הציע כי הצטברות של מולקולות אוסמיום יכול לעכב הסתננות של סוכני לחות וסוכני מעבר המשמשים ב-CPD, ואת ממיסים כמו HMDS המשמשים ייבוש כימי. ההשפעה היא ספציפית לרקמות וללא אוסמיום tetroxide לא תהיה כל השפעה על איכות התמונה עבור סוג של דגימות עדין שנותחו במחקר זה. עבור סוגים אחרים של השימוש ברקמות של אוסמיום tetroxide ניתן לחסל עם קיבעון ראשוני מורחב.
HMDS העובר צב יבש הראה משטחים משומרים היטב, ופחות עיוות או הצטמקות לעומת CPD (איור 4). CPD ממזער את הסיכוי לעיוות של מורפולוגיה התא וייצור ממצאים בשל המתח אפס או מינימלי משטח שנוצר במהלך התהליך. עם זאת, CPD יכול לגרום לסיכון פיזי פוטנציאלי עבור דגימות עדינות עדין. בשורה עם האבחנה שלנו, הרופאים הניבו הדמיה באיכות דומה או גבוהה יותר על ידי הפחתת מתח פני השטח שנגרם עקב ייבוש על בסיס מחקרים קודמים שפורסמו44,45,46,47. לעומת טיפול CPD, HMDS שמרו פרטים מבניים של העבודה האורגנית מצוין מצוין ב שסתומים חרוט וקונכיותב48 וסיפק ברזולוציה גבוהה של תכונות מבניות של הארגון הפנימי המורכב של mermithid נמטודות49 ורקמות פנימיות של חרקים28. לוחית הייבוש ממצאים נראו בכמויות גבוהות על הדגימות שהוכנו על ידי טכניקת CPD לעומת טכניקת HMDS. Blebs ממברנה וחפצי גלולה גדלו בתאי צוואר הרחם שהוכנו על ידי שימוש בטכניקה CPD50. HMDS מגיבה עם המים כדי לייצר הבוחנים ואמוניה, שניהם מתנדפים מהעצם. HMDS משמש בדרך כלל כרומטוגרפיה גז כדי ליצור מתחמים של תרכובות כגון סוכרים, חומצות אמינו, אלכוהול, ותרכובות רבות אחרות. זה לא ידוע אם HMDS מגיב עם כמה תרכובות אלה ברקמות. HMDS עשוי להצליב חלבונים ולהתקשות את הרקמה במהלך ייבוש התהליך28, למרות הסיבה המדויקת hmds מספק שימור טוב יותר של העוברים לא ניתן להסביר למעט ספציפיות רקמות. בהתבסס על תוצאות החקירה שלנו, CPD גרם הצטמקות נרחב לעומת HMDS, והוא הרבה יותר מתאים לעיבוד רקמות עובריים, במיוחד כדי לנתח מבנה פני השטח עבור עוברים מבוים מוקדם. המנגנון שבו עובד HMDS על ייבוש רקמות לא הובהר, למרות התייבשות איטית עם התאיידות הדרגתית בסביבה בלתי מוחלטת לחות יכולה להיות סיבה להשגת מבנה שטח מעולה של החיות.
חתיכות קטנות של בלוקים אגר עם מושבות פטרייתי מתרבויות שקופיות שהוקמו בעבר שימשו במחקר זה כדי למנוע בעיות עם שמירה על הנפיחות המקורית של מחצלת mycelial. CPD ייבוש של חתיכות אגר עם מושבות פטרייתי הביא אפקט כביסה, בעוד שינויים התיקונים, מאגרי, ו אתנול נמצאה להיות בחירה טובה יותר להתגבר על הקשיים עם ייבוש ההקפאה. HMDS שפועלת היטב עבור העוברים של כל השלבים לא היה מסוגל לפתור תרבויות פטרייתי, בעוד האוויר בייבוש עם HMDS היתה בעיה משמעותית: סלסול למעלה ולאבד את קשיחות מבנית. בעוד CPD עובד היטב לתרבויות פטרייתי, זה השפיע על נזק מיידי לעוברים במיוחד בשלבים המוקדמים בפיתוח, גרימת הצטמקות על פני השטח. ממצאים לא הטעינה או ייבוש נצפו כאשר HMDS ו-CPD שימשו לעוברים ופטריות בתרבויות, בהתאמה. לרקמות נוקשות כמו קליפת ביצה של צבים, אין צורך בעיבוד מיוחד למעט כביסה וייבוש אוויר בטמפרטורת החדר לפני ההרכבה להדמיה.
ללא קשר לשיטת ההכנה, יש להשתמש בצעדים הדרגתיים של מעבר האתנול כדי להקטין את הפוטנציאל לייבוש חפצים. בתחילה, הדגמים של HMDS ו-CPD נמצאו להיות ממצאים פני השטח עם הצטמקות בעקבות התייבשות ובפרוטוקולים ייבוש זמין בספרות. לאחר סדרה של סטנדרטיזציה, קבענו כי הממצאים היו תוצאה של התייבשות אלכוהול. זה קריטי להשתמש בתהליך התייבשות איטית באמצעות האתנול הדרגתי יותר מגביר במהלך התייבשות. כמו כן, משך כל איטרציה צריך להיות ארוך יותר לעוברים בהשוואה לתרבויות פטרייתי. עוד, צעד נוסף ב 100% אתנול מובטחת רוויה אחיד להשלים. HMDS ניתן להסיר לחלוטין או חלקית כדי לאפשר ייבוש אוויר של דגימות, אבל החשיפה המורחבת HMDS וייבוש אוויר הדרגתי על ידי אידוי נמצאו להיות יעילים עבור עוברים כדי למנוע הפרעה (איור 4א, ג) נגרמת על ידי משטח גדול מתח כפי שנצפה על הקובץ המצורף לתא מיקרוביאלית51. כאשר אתם מציעים את הפרטים שלכם בבית המלון, המלון מציע מבנה פנים מעולה ב52 , והוא רומז שרקמות עדינות רכות יכולות להפיק תועלת מתהליך הייבוש האיטי. איכות תמונה מקובלת עבור עוברים ניתן להשיג עם ייבוש כימי איטי על ידי הגדלת בהדרגה את הריכוז של HMDS לאתנול בעקבות התייבשות.
כל הדגימות היו רכוב על רכיבי אלומיניום באמצעות נייר דו צדדי הפחמן כדי לספק משטח מוליך, מעיל דק של לק הציפורן חסר צבע יכול לשמש גם אם המדגם זהה צריך להיות התמונה בכיוון שונה. ניתן להסיר דגימות בקלות מן הספחים כאשר לק ציפורניים משמש על משטח stub ומיקום דגימות במטוסים חלופיים ניתן לעומת באמצעות נייר דו צדדי פחמן. כאשר הדגימות אינן מוליכות, יש צורך להרחיב שכבה דקה של מתכת על הדגימות כדי להגביר את מוליכות המוליך. מטרת זהב שימש במחקר זה במהלך ציפוי מוחלטת, וזהב-פלדיום גם תשואות תוצאות דומות הימנעות טעינת אפקטים. מתח הקרן הנכון הוא תלוי לדוגמה, עבור דגימות קלות מצופה, הדמיה עם פליטת שדה SEM ב 2-5 kV יספק הגדרה טובה של מבנים פני השטח. עבור רקמות עם ציפוי נאותה, 5 kV בדרך כלל מספק אות טוב יותר ללא חדירה הקורה יותר. לדגימות שחסרות עומק ומצופות בזהב בלבד, הדמיה במתח גבוה יותר (10 kV) אפשרה הדמיה טובה יותר של טופוגרפיה של פני השטח.
הכנת רקמות עדינות עבור SEM תנוחות אתגרים ייחודיים, ומגוון של טכניקות הכנה לדוגמה ניתן להשתמש כדי להתגבר ולמזער חפצי הדמיה. אנו מספקים שיטות מקיפות לעיבוד שלוש דגימות שונות של רקמות ביולוגיות עדינות, עבור הדמיה SEM: עוברים, קליפות בביצה נוקשה, ותרבויות פטרייתי. בחקירה שלנו, שינויים עדינים לשיטות פופולריות זמין ממחקרים שפורסמו בעבר נעשו, וזיהינו את שיטות התייבשות וייבוש המתאימות ביותר הספציפיות לכל סוג רקמות עדין. ניתן להתאים פרוטוקולים אלה כדי לקבל איכות תמונה מקובלת SEM מדגימות ביולוגיות דומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד ר דניאל בbaldassarre, SUNY Oswego לדיונים מועילים והערות על כתב היד. מחקר זה היה נתמך על ידי רייס קריק מענקי שותף, Oswego; האתגר מענקים SUNY Oswego הקרן הלאומית למדע (NSF) מענקים קטנים PGL ו-JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
